DISS.ETH NO: 23008 LONG-TERM CORTICOLIMBIC ABNORMALITIES FOLLOWING IMMUNE AND NUTRITIONAL DISTURBANCES IN THE EARLY ENVIRONMENT A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich) presented by MARIE ANAIS LABOUESSE Diplôme d’ingénieur AgroParisTech (Paris, France) born on 27.09.1986 citizen of France accepted on the recommendation of: Prof. DVM. Wolfgang Langhans, examiner Prof. Dr. Urs Meyer, co-examiner Prof. Dr. Christoph Kellendonk, co-examiner Prof. Dr. Patricio O’Donnell, co-examiner 2015 Summary Summary The early environment is attaining increasing attention with respect to its role in determining the susceptibility towards neurodevelopmental disorders such as schizophrenia. Environmental insults that disrupt the fetal immune milieu have received wide appreciation in this context. The early environment also holds critical relevance for numerous other disorders with environmental etiologies, including obesity and its related neuropsychiatric comorbidities. The latter may be driven to a great extent by the profound environmental shifts occurring in the modern world, including changes in the human diet. Human studies are not able to establish causality for such associations and are limited in their capacity to unravel the underlying cellular and molecular mechanisms. The elucidation of the neuronal consequences of early environmental adversities in animal models may help to increase our understanding of the etiology of neuropsychiatric disturbances in general, and of schizophrenia and obesity-related comorbidities in particular. Corticolimbic circuits may be critically involved in some of the functional aberrations manifest in these patient populations, which include, among others, cognitive impairments and reward-related abnormalities. The present dissertation thus aimed at identifying possible corticolimbic dysfunctions in two epidemiologically informed animal models of early environmental insults. Adolescence is a nutritionally vulnerable developmental stage, displaying amplified caloric needs and a tendency for poor nutritional choices. In our first line of research, we developed a mouse model of adolescent high fat diet (HFD) exposure to explore: (i) the susceptibility of late-maturing brain regions towards the negative consequences of adolescent HFD feeding and (ii) the possible neuronal mechanisms implicated in these effects. The first series of experiments revealed that adolescence is a vulnerable window for the emergence of prefrontal cognitive impairments induced by HFD treatments, but not for the development of obesity. Given the role of the prefrontal γ-aminobutyric acid (GABA) system in the regulation of cognition, we examined the histological integrity of GABA neuronal types. We identified early and specific reductions in the immunoreactivity for reelin, an extracellular matrix protein implicated in the maturation of forebrain structures. We also showed that reelin overexpression prevented the emergence of cognitive deficits induced by HFD exposure. Our findings thus strongly suggest that the reelin protein represents a critical neuronal source mediating the link between adolescent HFD and prefrontal-related functions. We next explored the possible implication of epigenetic regulatory networks in the observed prefrontal disturbances. Using genome-wide microRNA (miRNA) assays, we identified wide-spread expression changes in the prefrontal miRNome following HFD exposure. These findings provide support for a possible role of non-coding RNAs such as miRNAs in the regulation of cognitive impairments following early life nutritional stress. In a xiii Summary last series of investigations, we examined novel links between excessive HFD intake and behavioral dysfunctions. We showed that HFD exposure targeting the peripubertal window elicited disturbances in accumbal dopamine markers and simultaneous changes in prepulse inhibition of the acoustic reflex, an operational measure of sensorimotor gating. Our findings thus reveal the elevated sensitivity of the mesolimbic dopamine system towards the negative consequences of adolescent HFD. Fetal brain development is a complex and delicate process that is highly sensitive to inflammatory disturbances. Maternal infection during pregnancy is an established risk factor for neurodevelopmental disorders such as schizophrenia. In our second line of research, we employed a mouse model of prenatal immune activation using the viral mimic polyriboinosinic-polyribocytidilic acid (PolyI:C) with the aims of (i) further characterizing the long-term behavioral impairments elicited by the immunological manipulation and (ii) identifying possible molecular mediators of these effects. The first series of experiments revealed that prenatal immune activation induced marked anomalies in reward-related behaviors in the form of reduced place preference for sucrose, and concomitant increased place preference for cocaine. These findings provide an important extension to this model by identifying behavioral phenotypes reminiscent of those found in patients with schizophrenia, including deficits in processing of natural rewards and heightened propensity for drug use. Maternal infection could thus represent one possible etiological factor implicated in the emergence of reward-related abnormalities in this patient population. In our last experimental investigations, we addressed the possible role of DNA-methylation epigenetic regulation in the emergence of GABAergic impairments and related prefrontal cognitive anomalies following maternal infection. We show that prenatal immune activation in mice increased promoter hypermethylation of the glutamate decarboxylase (GAD) 1 and 2 genes. These effects were associated with reduced expression of the corresponding mRNA transcripts and correlated with cognitive dysfunctions. Our findings suggest that epigenetic modifications at presynaptic GABAergic targets may represent an important mechanism whereby maternal infection during pregnancy can induce long-term behavioral impairments in the offspring. Together, the experimental investigations presented in this thesis provide several lines of evidence illustrating the vulnerability of the developing brain to early life environmental adversities. Our animal models could thus represent important preclinical platforms allowing to gain further insights into the neuronal and physiological mechanisms underlying these associations and ultimately provide novel targets for the treatment of neuropsychiatric disturbances with environmental etiologies. xiv Résumé Résumé D’importants travaux de recherche au cours des dernières années ont permis de montrer que l’environnement au sein duquel se développe le cerveau joue un rôle crucial dans la prédisposition aux maladies neuro-développementales, et ce depuis le début de la vie embryonnaire jusqu’à la fin de l’adolescence. Par exemple, les agressions environnementales qui perturbent le système immunitaire pendant la gestation sont associées à un risque plus important de contracter un trouble psychiatrique comme la schizophrénie ou l’autisme. La qualité de l’environnement durant les premiers âges de la vie a également une influence majeure sur l’évolution de maladies chroniques telles que l’obésité (ainsi que sur les comorbidités neuropsychiatriques qui y sont associées). Cependant, les études chez l’Homme ne permettent pas d’établir de relation de cause à effet entre ces évènements; elles ne permettent également pas d’identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués. Les modèles animaux sont en effet plus adaptés à ce type d’étude, contribuant ainsi amplement à la compréhension détaillée des effets fonctionnels et structuraux engendrés par les agressions environnementales aux débuts de la vie. À cet égard, les circuits corticolimbiques sont particulièrement intéressants étant donné leur implication systématique dans l’apparition de déficits comportementaux caractéristiques des patients schizophrènes, et de façon distincte (et plus modérée) des patients obèses. Parmi ces déficits comportementaux on notera que les troubles de la cognition et les dysfonctionnements au sein du système de la récompense sont des exemples notoires. Ce travail de thèse a donc eu pour objectif d’identifier des anomalies structurales et fonctionnelles dans les circuits corticolimbiques de deux modèles animaux d’agressions environnementales; ces modèles animaux modélisent chacun des facteurs de risques reconnus comme ayant des effets délétères importants chez l’Homme. L’adolescence est une période développementale particulièrement vulnérable, durant laquelle la qualité nutritionnelle des régimes alimentaire a tendance à se dégrader, alors que les besoins caloriques augmentent. Dans un premier aspect de notre recherche, nous avons développé un modèle murin de régime hyperlipidique (HL) pendant l’adolescence afin d’explorer: (i) la susceptibilité des régions immatures du cerveau aux conséquences néfastes des régimes HL et (ii) les mécanismes neuronaux potentiellement impliqués. Dans une première série d’expériences, nous montrons que l’adolescence est une période vulnérable aux effets négatifs des régimes HL, notamment pour le développement de troubles cognitifs préfrontaux (tels que la flexibilité cognitive), mais pas pour le développement de l’obésité. Nous avons ensuite examiné l’intégrité des neurones sécrétant de l’acide γ-aminobutyrique (GABA) dans le cortex préfrontal, le GABA étant notoirement impliqué dans la régulation des facultés cognitives. Nous y avons observé une baisse de l’immunoréactivité pour la protéine reelin, une protéine de la matrice extracellulaire jouant un rôle important dans la maturation xv Résumé des structures prosencéphaliques. Nous avons ensuite montré que la surexpression de reelin prévient l’apparition des déficits cognitifs induits par un régime HL. Nos résultats mettent ainsi en évidence que la protéine reelin contribue de façon essentielle à l’apparition des troubles cognitifs survenant à la suite de régimes HL. Dans une étude parallèle, nous avons également envisagé la possibilité d’un mécanisme épigénétique contribuant aux modifications transcriptionnelles du cortex préfrontal après un régime HL. Des dosages large-spectre de microARN (miARN) ont ainsi permis d’identifier des changements importants dans les niveaux d’expression des miARN préfrontaux à la suite d’un traitement HL. Les ARN non-codants tels que les miARN seraient donc potentiellement impliqués dans l’apparition de troubles cognitifs faisant suite à un stress nutritionnel pendant l’adolescence. Dans notre dernière série d’expériences, nous avons examiné plus en détails les troubles comportementaux pouvant découler d’un régime HL. Nos études montrent qu’un régime HL pendant l’adolescence génère des anomalies importantes dans le système dopaminergique au sein du noyau accumbens, et conduit simultanément à des changements dans le test de l’inhibition par préimpulsion, un mécanisme cérébral sensorimoteur permettant de filtrer le surplus d’informations. Ces derniers résultats révèlent la sensibilité accrue du système dopaminergique mésolimbique aux effets néfastes des régimes HL. Le développement fétal du cerveau est un processus complexe et délicat, hautement sensible aux perturbations inflammatoires. Une infection maternelle pendant cette période est un facteur de risque avéré pour les désordres neurodéveloppementaux tels que la schizophrénie. Pour le second aspect de notre recherche nous avons utilisé un modèle murin d’activation immunitaire prénatale en employant un imitateur viral, l’acide polyriboinosinique-polyribocytidilique (PolyI:C) dans le but (i) de caractériser plus en détails les dysfonctionnements comportementaux à long terme déclenchés par la manipulation immune et (ii) d’identifier les médiateurs moléculaires impliqués. Premièrement, nous avons montré qu’une activation immunitaire prénatale mène à des anomalies comportementales significatives dans le circuit de la récompense, traduites par une préférence de place conditionnée décrue pour le sucrose, mais accrue pour la cocaïne. Ces nouveaux résultats sont similaires à des observations faites chez des patients schizophrènes, chez lesquels il y a des déficits comparables dans le système neuronal répondant aux récompenses dites « naturelles », et une propension plus grande à consommer des drogues. Une infection pendant la grossesse pourrait donc constituer un facteur important dans l’émergence des troubles comportementaux liés au système de la récompense chez les patients schizophrènes. Dans une deuxième série d’expériences, nous avons examiné la possibilité d’une régulation épigénétique du système GABAergique faisant suite à une infection maternelle. Nous montrons qu’une activation immunitaire prénatale conduit à l’hyperméthylation des promoteurs des gènes de la glutamate decarboxylase (GAD) 1 et 2, xvi Résumé ainsi qu’à une expression réduite des ARNm correspondants. Ces phénomènes moléculaires sont également corrélés à l’apparition de troubles cognitifs. D’après nos résultats, des modifications épigénétiques ciblant le système GABAergique pourraient donc constituer un mécanisme par lequel l’infection maternelle pendant la gestation engendre des troubles comportementaux à long terme. Dans l’ensemble, les études expérimentales présentées dans cette thèse constituent une série de preuves importante indiquant qu’un cerveau en développement est particulièrement vulnérable aux agressions environnementales survenant aux débuts de la vie. Nos modèles murins représentent donc des outils de recherche précliniques essentiels pour améliorer la compréhension des mécanismes neuronaux et physiologiques impliqués. Au long terme, ils devraient également permettre d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement de troubles neuropsychiatriques ayant une étiologie environnementale. xvii