Bases fondamentales Comment Shigella trouve-t-elle son Gap ? Gianfranco Grompone, Philippe Sansonetti, Guy Tran Van Nhieu Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Inserm U389 – Institut Pasteur, 28, rue du docteur Roux, 75015 Paris <[email protected]> Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. Shigella, l’agent responsable de la dysenterie bacillaire, envahit l’épithélium colique en utilisant un système de sécrétion de type III lui permettant d’injecter des effecteurs bactériens, les protéines Ipa, au sein de la membrane et du cytosol de la cellule épithéliale. Une signalisation complexe faisant intervenir des petites GTPases de la famille Rho ainsi que la tyrosine kinase Src provoque des profonds remaniements du cytosquelette d’actine aboutissant à l’internalisation de la bactérie dans une poche de macropinocytose. Après l’entrée, Shigella se déplace de cellule en cellule grâce à la polymérisation de l’actine à l’un de ses pôles, ce qui assure sa dissémination dans le tissu. L’invasion est suivie par un processus inflammatoire aigu, recrutant des polynucléaires qui détruisent la barrière épithéliale. Les jonctions intercellulaires communicantes GAP potentialisent l’invasion et la colonisation de la bactérie dans les cellules épithéliales. Les processus d’entrée et de dissémination de Shigella sont favorisés par une communication intercellulaire induite par la bactérie et dépendante des connexines. L’entrée de Shigella dans la cellule induit la libération d’ATP dans le milieu extracellulaire, ce qui, par un effet paracrin, favorise l’entrée d’autres bactéries dans les cellules voisines. Mots clés : shigellose, dysenterie bacillaire, Shigella L Tirés à part : G. Grompone e genre Shigella représente des entérobactéries responsables d’un certain nombre de pathologies entériques chez l’homme, allant de la diarrhée sporadique à l’infection aiguë de l’intestin caractérisée par de la fièvre, des crampes intestinales et par la présence de sang dans les selles (syndrome dysentérique) [1]. Quatre espèces différentes constituent le genre Shigella : S. flexneri (comprenant 6 sérotypes) majoritairement présente dans les pays en voie de développement, S. sonnei (comprenant 1 sérotype) surtout présente dans les pays industrialisés, S. dysenteriae (comprenant 16 sérotypes) et S. boydii (comprenant 8 sérotypes). Les deux premières espèces sont responsables de la forme endémique de la maladie. S. dysenteriae inclut le sérotype 1 ou « bacille de Shiga » capable de produire une puissante cytotoxine (« shigatoxin »), à l’origine d’épidémies meurtrières dans les régions les plus pauvres de la planète. S. boydii demeure une espèce confinée à l’Asie, responsable d’un certain nombre de cas sporadiques de la maladie. En termes de santé publique, la shigellose est présente majoritairement dans les pays en voie de développement avec environ 160 millions de cas par an contre Hépato-Gastro, vol. 13, n° 2, mars-avril 2006 139 Bases fondamentales Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. 1,5 millions seulement dans les pays industrialisés et affecte principalement les enfants entre 1 et 5 ans. Le nombre de décès peut aller de 740 000 à 1 million par an [2]. Parmi les facteurs qui contribuent au développement de la shigellose, le manque d’hygiène joue un rôle capital puisque la maladie se transmet par le contact entre personnes et l’ingestion d’aliments contaminés. Une fois ingérée par l’hôte, la bactérie envahit la muqueuse colique où elle entraîne une réaction inflammatoire intense, principale responsable de la destruction tissulaire. Schéma physiopathologique de l’infection par S. flexneri L’invasion et la colonisation de l’épithélium intestinal par Shigella sont une étape clé pour l’établissement de la maladie et le déclenchement du processus d’inflammation. À l’instar d’autres germes entéroinvasifs, Shigella envahit la muqueuse colique au niveau de l’épithélium folliculaire à travers les cellules M. [3]. Contrairement aux entérocytes, les cellules M. sont dépourvues de mucus, de glycocalyx et de microvillosités et sont donc accessibles aux micro-organismes Shigella C B B C Abl Cdc42 Crk Rac Src cortactine Arp2/3 Arp2/3 Shigella Figure 1. Cascade de signalisation induite après contact entre Shigella et la cellule épithéliale aboutissant à la formation d’une poche de macropinocytose. L’appareil de sécrétion de type III permet l’activation des tyrosines kinases de la famille Abl, ce qui entraîne la phosphorylation de la protéine Crk, et l’activation ultérieure des petites GTPases Cdc42 et Rac. Le complexe Arp2/3 est recruté comme conséquence de cette activation, ce qui assure la nucléation de l’actine (représentée par les ronds verts) au niveau du foyer d’entrée. La signalisation induite par l’appareil de sécrétion de type III permet aussi le recrutement local de la protéine Src et l’amplification de l’action des GTPases par l’activation de la cortactine. 140 Hépato-Gastro, vol. 13, n° 2, mars-avril 2006 ATP Shigella Shigella P2 PLC Hémicanal IP3 fermé A PLC Ca2+ Hémicanal ouvert IP3 Ca2+ B HCx26 D R/Ro = 20 % HeLa D R/Ro = 20 % Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. le cytosol de la cellule cible. Avant l’interaction avec la cellule eucaryote, ces effecteurs sont associés à des protéines chaperones afin d’éviter leur dégradation protéolytique, et assurer ainsi le contrôle de leur translocation. L’interaction entre Shigella et la cellule épithéliale induit des réarrangements massifs du cytosquelette d’actine aboutissant à l’internalisation de la bactérie par la formation d’une poche de macropinocytose. Dans les étapes précoces de l’interaction, l’association entre l’effecteur IpaB et le récepteur à l’acide hyaluronique, CD44, permet le ciblage de microdomaines lipidiques intervenant dans la mise en place d’une plateforme de signalisation conduisant à des remaniements du cytosquelette. La formation de la poche de macropinocytose permettant l’entrée de Shigella dans la cellule épithéliale obéit à une signalisation multifactorielle, médiée par les effecteurs IpaB, IpaC, IpaA et IpgD [4]. D’une part, la partie carboxyterminale d’IpaC induit la nucléation et la polymérisation de l’actine par l’activation des petites GTPases de la famille Rho (Cdc42 et Rac). D’autre part, le recrutement et l’engagement du proto-oncogène c-src qui phosphoryle la cortactine (une protéine de liaison à présents au niveau du lumen. De plus, elles possèdent une activité phagocytaire inhérente leur permettant d’échantillonner les antigènes de la face luminale et de les présenter aux macrophages associés aux cellules M. Shigella tire partie de cette route d’entrée en induisant l’apoptose des macrophages par l’activation de la caspase 1. Ceci établit une véritable stratégie de groupe pour l’agent pathogène : les premières bactéries en contact avec les macrophages sont sacrifiées afin d’induire l’inflammation par la sécrétion d’IL-1b et IL-18. En réponse à cette sécrétion de cytokines, un efflux massif de polynucléaires se produit, entraînant la destruction de la barrière épithéliale et l’invasion massive de nouvelles bactéries à partir des lésions tissulaires. Shigella possède un plasmide de virulence qui code pour les déterminants de son invasion et de sa dissémination dans les cellules épithéliales. L’invasion de Shigella est déterminée par l’activité d’un appareil de sécrétion de type III, codé par un ou deux opérons, mxi et spa, au sein d’un îlot de pathogénicité de 30 kb présent dans le plasmide de virulence. Cet appareil de sécrétion forme une structure en aiguille qui permet l’injection d’effecteurs bactériens dans la membrane et 5 min 5 min Figure 2. Modèle représentant l’effet paracrin de l’ATP dans l’entrée de Shigella dans les cellules épithéliales. A) dans les cellules non communicantes HeLa, Shigella induit des réponses calciques isolées après une première signalisation via la PLC et l’IP3 ; B) dans les cellules exprimant la connexine 26 de façon stable (Hcx26), l’effet paracrin médié par l’ATP via les récepteurs purinergiques (P2) amplifie la fréquence des réponses calciques et favorise l’entrée d’autres bactéries au niveau des cellules adjacentes. Hépato-Gastro, vol. 13, n° 2, mars-avril 2006 141 Bases fondamentales Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. l’actine) et régule négativement l’activation de Rho, assurent une amplification de cette réponse membranaire (figure 1). Finalement, la complétion du processus d’entrée dépend de la fermeture de la poche de macropinocytose, ce qui est assuré par la dépolymérisation de l’actine grâce à la liaison de l’effecteur IpaA au domaine amino-terminal de la vinculine (une protéine associée au cytosquelette qui coordonne la formation de plaques d’adhérence cellulaire). Une fois internalisée, Shigella lyse la vacuole de phagocytose et se multiplie librement dans le cytosol. Lors de cette phase de multiplication, elle se déplace de manière intracellulaire grâce à l’assemblage et à la polymérisation de l’actine via l’action de la protéine IcsA, située à un pôle de la bactérie. Shigella peut ainsi induire la formation d’extensions cellulaires vers les cellules voisines, qui permettent sa dissémination après lyse des membranes des cellules donneuses et receveuses. L’appareil de sécrétion de type III, de même que les protéines IpaB et IpaC sont nécessaires à la dissémination de la bactérie, ce qui suggère que les processus d’invasion et de colonisation de l’épithélium intestinal utilisent des voies communes [5]. De plus, il a été observé que les cadhérines, des récepteurs des jonctions adhérentes dépendantes du Ca2+ dans les cellules épithéliales, sont requises pour la dissémination de Shigella [6]. L’invasion des cellules épithéliales par la bactérie induit une réponse inflammatoire liée à la sécrétion d’IL8 après activation du facteur transcriptionnel NF-jB. Récemment, un système d’alarme via des récepteurs cytosoliques de la famille Nod capables d’induire NF-jB en réponse à une présence bactérienne intracellulaire a été identifié [7]. Nod1 est prévalent au niveau des cellules épithéliales intestinales et reconnaît spécifiquement des muropeptides appartenant aux peptidoglicanes de bactéries à Gram-négatif exclusivement, tandis que Nod2 reconnaît le muramyl-dipeptide, structure commune à tous les peptidoglicanes [8, 9]. Rôle de la communication intercellulaire dépendante des connexines dans l’entrée et la dissémination de Shigella dans les cellules épithéliales Les cellules qui composent l’épithélium intestinal communiquent par l’intermédiaire de jonctions intercellulaires communicantes GAP, constituées de protéines transmembranaires comme les connexines. Elles s’oligomérisent en hexamères afin de constituer un hémicanal ou connexon. Lorsque ces structures rentrent en contact avec un connexon présent dans une cellule adjacente, elles forment un canal ouvert, à travers lequel diffusent des seconds messagers comme l’AMPc, 142 le Ca2+ou l’inositol 1,4,5-triphosphate (IP3), impliqué dans le relargage du Ca2+ stocké dans le réticulum endoplasmique [10]. Ces connexons peuvent se retrouver sans partenaire dans la cellule adjacente et constituer ainsi des hémicanaux constitutivement fermés. La plupart des données existantes concernant le rôle des connexines proviennent d’études réalisées sur les astrocytes et les cellules nerveuses, même si leur existence a été décrite dans plusieurs tissus épithéliaux, comme par exemple pour la connexine 26 et 43. Il a été montré récemment que les hémicanaux répondent à des inhibitions métaboliques ou à des augmentations du taux local d’IP3, entraînant leur ouverture [10]. Le rôle de ces hémicanaux demeure mal caractérisé dans les entérocytes. Récemment, il a été montré que la dissémination de Shigella dans les cellules épithéliales non communicantes de type HeLa était significativement favorisée lorsque la connexine 26 est exprimée de façon stable dans cette lignée. De même, la dissémination de Shigella au sein des cellules polarisées de type Caco-2 se voit significativement réduite par un traitement à l’AGA (acide a-glycyrrhétinique), un inhibiteur des jonctions communicantes GAP. Ces résultats suggèrent qu’un second messager diffuse à travers les canaux à connexines et favorise la dissémination de Shigella dans les cellules épithéliales [11]. Shigella induit des réponses calciques dans la cellule épithéliale Il a été montré que Shigella induisait des réponses calciques dans les cellules HeLa et dans des transfectants exprimant la connexine 26. Dans les cellules HeLa, la bactérie induit des réponses calciques lentes et isolées (figure 2A). Ces réponses sont dépendantes du système de sécrétion de type III, puisqu’un mutant non invasif ne produit pas d’effet significatif. Dans les cellules couplées, on observe aussi ce type de réponse, sur lesquelles se « surajoutent » des oscillations rapides du Ca2+ intracellulaire, rappelant les réponses induites par des agonistes dépendant du calcium (figure 2B). Ces réponses sont inhibées par l’AGA (acide a-glycyrrhétinique) ou le carbénoxolone, des inhibiteurs des jonctions gap et des hémicanaux, indiquant qu’elles sont dépendantes de canaux formés par la connexine 26. L’ATP, sécrété par les hémicanaux à connexine 26, favorise les réponses calciques ainsi que l’invasion et la dissémination de Shigella dans les cellules couplées L’invasion de Shigella dans les cellules exprimant la connexine 26 induit la libération d’ATP dans le milieu Hépato-Gastro, vol. 13, n° 2, mars-avril 2006 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. extracellulaire. Par ailleurs, l’addition d’ATP dans le milieu de culture à une concentration agoniste induisant une réponse calcique maximale dans les cellules HeLa (10 lM) stimule à la fois l’invasion et la dissémination de Shigella, dans des cellules non connectées. Enfin, la suramine, un inhibiteur des récepteurs purinergiques, inhibe les oscillations rapides et oscillantes observées dans des cellules exprimant la connexine 26, ainsi que l’invasion de Shigella dans ces cellules. Ces résultats étaient inattendus, car la connexine 26 n’avait pas été décrite comme pouvant former des hémicanaux. Afin de conforter ces résultats, il a été montré que les cellules exprimant la connexine 26 peuvent incorporer un marqueur fluorescent, le Jaune de Lucifer, en absence de calcium extracellulaire, un traitement décrit comme provoquant l’ouverture des hémicanaux. De manière cohérente avec l’existence d’hémicanaux à connexine 26, cette incorporation est inhibée par l’AGA ou le carbénoxolone et n’est pas observée dans les cellules HeLa. En utilisant des tests similaires, il a été montré que Shigella induit l’ouverture des hémicanaux à connexine 26. De manière remarquable, l’ouverture des hémicanaux induite par Shigella se fait à des concentrations de calcium physiologiques. Cette ouverture est inhibée par l’U73122, un inhibiteur de la PLC, ainsi qu’avec des concentrations de Fura-2 interférant avec les réponses calciques : ceci suggère que l’ouverture des hémicanaux dépend de l’IP3 et de l’augmentation du calcium intracellulaire induite durant l’invasion des cellules par Shigella. Cependant, des agonistes du calcium tels l’ATP ou l’histamine n’induisent pas l’ouverture des hémicanaux à connexine 26, ce qui suggère un mécanisme spécifique de la bactérie. L’ATP constitue un second messager à action paracrine rapide car : 1) il possède un gradient de sécrétion positif (environ 10mM dans le milieu intracellulaire contre 10nM à l’extérieur de la cellule) ; 2) il est le ligand de récepteurs purinergiques membranaires spécifiques, de type ionotropes (P2X) ou métabotropes (P2Y), ces derniers induisent une transduction du signal via les protéines G hétérotrimériques ; 3) il est rapidement dégradé car il est la cible d’ectonucléotidases présentes dans le milieu extracellulaire. Nous proposons donc le modèle suivant dans lequel l’invasion des cellules exprimant la connexine 26 conduit à une augmentation de l’IP3 et du calcium intracellulaire. Cette augmentation permet l’ouverture des hémicanaux et la sécrétion d’ATP dans le milieu extracellulaire, qui stimule les réponses calciques ainsi que l’invasion dans les cellules adjacentes par voie paracrine (figure 2). Conclusion Le dialogue moléculaire conduisant au détournement des fonctions cellulaires de la cellule épithéliale en faveur des bactéries pathogènes entéro-invasives comme Shigella demeure un champ d’investigations riche et qui s’ouvre aujourd’hui à de nouvelles perspectives. Le rôle des jonctions intercellulaires communicantes GAP dans l’entrée et la dissémination de Shigella est un clair exemple du caractère dynamique de ce phénomène et du besoin de la mise en place d’approches pluridisciplinaires permettant l’analyse moléculaire et tissulaire des processus inflammatoires. Références 1. Hale TL. Bacillary dysentery. Topley and Wilson’s microbiology and microbial infections. B. Infections. Vol. 3. London. In : Hausler WJ, Sussman M, eds, 1998. 2. Kotloff KL, Winickoff J-P, Ivanoff B, Clemens JD, Swerdlow DL, Sansonetti PJ, et al. Global burden of Shigella infections : implications for vaccine development and implementation of control strategies. Bull World Health Organ 1999 ; 77 : 651-66. 3. Sansonetti PJ. Rupture, invasion and inflammatory destruction of the intestinal barrier by Shigella, making sense of prokaryote-eukaryote cross-talks. FEMS Microbiology Reviews 2001 ; 25 : 3-14. 4. Tran Van Nhieu G, Bourdet-Sicard R, Dumenil G, Blocker A, Sansonetti PH. Bacterial signals and cell responses during Shigella entry into epithelial cells. Cell Microbiol 2000 ; 2 : 187-93. 5. Schuch R, Sandlin RC, Maurelli AT. A system for identifying postinvasion functions of invasion genes : requirements for the Mxi-Spa type III secretion pathway of Shigella flexneri in intercellular dissemination. Mol Microbiol 1999 ; 34 : 675-89. 6. Sansonetti PJ, Mounier J, Prevost MC, Mege RM. Cadherin expression is required for the spread of Shigella flexneri between epithelial cells. Cell 1994 ; 76 : 829-39. 7. Girardin SE, Philpott DJ, Lemaitre B. Sensing microbes by diverse hosts. Workshop on pattern recognition proteins and receptors. EMBO Rep 2003 ; 4 : 932-6. 8. Girardin SE, Boneca IG, Carneiro LA, Antignac A, Jehanno M, Viala J, et al. Nod1 detects a unique muropeptide from gram-negative bacterial peptidoglycan. Science 2003 ; 300 : 1584-7. 9. Girardin SE, Boneca IG, Viala J, Chamaillard M, Labigne A, Thomas G, et al. Nod2 is a general sensor of peptidoglycan through muramyl dipeptide (MDP) detection. J Biol Chem 2003 ; 278 : 8869-72. 10. Willecke K, Eiberger J, Degen J, Eckardt D, Romualdi A, Guldenagel M, et al. Structural and functional diversity of connexin genes in the mouse and human genome. Biol Chem 2002 ; 383 : 725-37. 11. Tran Van Nhieu G, Clair C, Bruzzone R, Mesnil M, Sansonetti P, Combettes L. Connexin-dependent inter-cellular communication increases invasion and dissemination of Shigella in epithelial cells. Nat Cell Biol 2003 ; 5 : 720-6. Hépato-Gastro, vol. 13, n° 2, mars-avril 2006 143