Interférence de la résistance aux bêtalactamines avec la virulence

270 La Lettre de l’Infectiologue - Tome XVI - nos 8-9 - octobre-novembre 2001
MISE AU POINT
treptococcus pneumoniae est un cocci à Gram posi-
tif, présent à l’état commensal dans les voies respi-
ratoires supérieures dès la prime enfance. Cet agent
pathogène est principalement responsable d’otites, de pneu-
monies, de septicémies et de méningites. Il est la cause la plus
fréquente de pneumonies communautaires. La prévalence des
infections sévères à pneumocoques (bactériémie) est plus
importante chez les enfants de moins de 2 ans (1,6 ‰), les per-
sonnes de plus de 60 ans (0,7 ‰) et les personnes immunodé-
ficientes (10‰) que dans le reste de la population (0,05 ‰) (1).
Malgré l’existence de thérapeutiques anti-infectieuses dispo-
nibles et efficaces, le taux de mortalité des pneumopathies pneu-
mococciques admises en réanimation reste toujours supérieur
à 20 % (2).
LA VIRULENCE CHEZ S. PNEUMONIAE
Facteurs de virulence
La virulence est liée aux caractéristiques “intrinsèques” de la
bactérie, et réside dans la capacité d’une souche à échapper aux
systèmes de défense de l’hôte, à se multiplier et à exprimer une
invasivité locale ou systémique (3). En revanche, le pouvoir
pathogène d’une souche de pneumocoque, probablement sous
contrôle génétique partiel de l’hôte, s’exprime par la création
de lésions tissulaires caractéristiques, secondaires à la réaction
inflammatoire engendrée par la libération et l’activation des
différents composants bactériens. Les facteurs de pathogéni-
cité peuvent ainsi entraîner une réponse inflammatoire intense
et délétère pour l’hôte.
Le pneumocoque possède de nombreux facteurs de virulence
qui peuvent être regroupés en fonction du type de réponse qu’ils
vont induire chez l’hôte ou de leurs rôles au cours de l’infec-
tion. Dans le premier groupe, il y a d’une part les éléments de
surface du pneumocoque intact (capsule, PspA [Pneumococ-
cal surface protein A]…) qui entravent la phagocytose via
l’inhibition du complément et, d’autre part, les facteurs qui
s’expriment lors de la destruction ou de la lyse du pneumo-
coque (pneumolysine, acides téichoïques et lipotéichoïques) et
qui, par le biais de l’activation du complément, concourent aux
réponses inflammatoires et immunitaires de l’hôte (4). Dans le
second groupe, il y a les facteurs de virulence “intrinsèques”
(capsule, PspA, pneumolysine), les facteurs de pathogénicité
(paroi et éléments associés : acides téichoïques et lipotéi-
choïques, peptidoglycane) et les facteurs contribuant à la viru-
lence (autolysine majeure LytA, neuraminidases, adhésines,
IgA protéase, etc.) (5).Afin d’étudier l’impact de ces molécules
dans la virulence, des mutants déficients isogéniques dérivés
d’une souche virulente ont été étudiés dans des modèles murins
de bactériémie (6). Le rôle des divers facteurs de virulence est
résumé dans le tableau I.
Interférence de la résistance
aux bêtalactamines avec la virulence expérimentale
chez Streptococcus pneumoniae
! V. Rieux*, E. Azoulay-Dupuis*
* INSERM, EMI-U 9933, hôpital Bichat-Claude Bernard, 75018 Paris.
RÉSUMÉ. Streptococcus pneumoniae colonise le nasopharynx, induit des pathologies sévères souvent mortelles et devient de plus en plus résis-
tant aux bêtalactamines. L’étude de 122 isolats cliniques révèle l’incompatibilité des souches à être à la fois résistantes à la pénicilline G
(péni-R) et virulentes dans le modèle murin de septicémie. La transformation d’un isolat clinique virulent et sensible par des fragments d’ADN
correspondant au domaine de la transpeptidase des protéines liant la pénicilline G (PLP) 2b et/ou 2x d’une souche péni-R a permis la sélec-
tion respective des transformants isogéniques 23.2b, 23.2x et 23.2b.2x. Ces transformants ont acquis un niveau de résistance restreint, mais
confirmé par l’analyse des séquences des PLP 2b et 2x, et ils sont beaucoup moins virulents que la souche d’origine. La perte d'affinité des
PLP 2b et 2x vis-à-vis de la pénicilline G est donc corrélée à une perte de virulence importante qui ne peut être expliquée par un changement
de sérotype ou de vitesse de croissance. Toutefois, après passage in vivo, des revertants virulents de 23.2b et 23.2b.2x ont été sélectionnés.
L’étude du revertant virulent 23.2b révèle la présence de nouvelles mutations au niveau du domaine de la transpeptidase de la PLP 2b et
suggère, pour qu’il y ait retour à la virulence, la présence de mutations compensatoires extérieures à ce domaine.
Mots-clés : Streptococcus pneumoniae - Virulence - Modèle murin de septicémie - Résistance aux bêtalactamines - PLP.
S

La Lettre de l’Infectiologue - Tome XVI - nos 8-9 - octobre-novembre 2001 271
MISE AU POINT
Situation du sujet
Le sérotype capsulaire, reflet de la composition de la capsule,
joue également un rôle très important dans la virulence : des
études épidémiologiques, cliniques et fondamentales montrent
que le sérotype capsulaire des souches de pneumocoque est
impliqué dans trois types de relation : une relation sérotype/site
d’infection chez l’homme (14), une relation sérotype/sensibi-
lité aux antibiotiques (15, 16) et, pour finir, une relation séro-
type/virulence expérimentale (15,17).Suivant le sérotype, l’éta-
blissement de ces relations permet de définir deux groupes : les
souches de sérotypes 6, 9, 14, 19 et 23, plus fréquemment
retrouvés à l’état de portage oropharyngé chez l’enfant et
l’adulte en présence d’un terrain immunodéprimé sévère,
sont dans l’immense majorité des cas de sensibilité diminuée
(péni-I, CMI : ≥0,12 et ≤1µg/ml) ou résistantes (péni-R,
CMI ≥2µg/ml) à la pénicilline G et souvent avirulentes dans
un modèle murin de septicémie. Toutefois, ces sérotypes sont
responsables chez l’enfant de moins de 3 ans d’otites moyennes
aiguës et de pathologies invasives, bactériémies et méningites.
À l’inverse, les souches de sérotype 1, 3, 4, 5, 7 provoquent
plutôt des pathologies systémiques et pulmonaires chez l’adulte.
Elles sont majoritairement sensibles à la pénicilline G (péni-S,
CMI < 0,06 µg/ml) et virulentes chez la souris.
Cette répartition préférentielle nous a conduits à penser qu’il
pouvait exister une relation directe entre la résistance à la péni-
cilline G et la virulence expérimentale.
RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX
Mise en évidence, étude d’une collection d’isolats cliniques (18)
Afin de mettre en évidence cette relation et d’en définir les
modalités, nous avons étudié les relations existant entre le séro-
type capsulaire, la sensibilité à la pénicilline G et la virulence
expérimentale de 122 isolats cliniques. Les isolats provenaient
d’hémoculture, de prélèvements de sinus, de gorge, d’oreille
moyenne, de liquide céphalo-rachidien, de liquide broncho-
alvéolaire, et de patients âgés de 15 à 90 ans.
Au regard de la virulence et de la sensibilité à la pénicilline G
(figure 1), il s’est avéré que les 32 souches virulentes
(virulence : DL100 ≤105UFC/souris) de la collection étaient
péni-S, alors que parmi les 90 souches avirulentes restantes,
49 étaient péni-S et 41 péni-I ou péni-R.
Le classement des souches en fonction du sérotype (figure 2)
a révélé que les souches de sérotype 1, 3 et 4 étaient toutes
péni-S et plus des trois quarts étaient virulentes ; les souches
de sérotype 6 étaient les seules à présenter des souches viru-
lentes/péni-S, avirulentes/péni-S, /péni-I ou /péni-R ; enfin, les
souches de sérotype 9, 14, 19 et 23 étaient toutes avirulentes
et, dans un peu plus de la moitié des cas, péni-I ou péni-R.
Cette étude met en exergue l’existence d’une relation entre la
sensibilité à la pénicilline G et la virulence expérimentale, et
montre l’incompatibilité des souches de pneumocoque à être à
Facteur déterminant pour la virulence et la pathogénicité
Capsule polysaccharidique Échappement au système immunitaire de l’hôte :
- gêne considérablement l’opsonophagocytose (± efficace suivant le sérotype)
- forte diminution de l’activation de la voie alterne du complément (sans anticorps)
Protéines de surface : Inhibition ou réduction de l’activité du complément (voie alterne) en agissant sur deux protéines du complément :
PspA (8) le fragment C3b (cas de la PspA) ou le facteur H
Protéine liant le facteur H (9) Activité antiphagocytaire
Pneumolysine Effets cytotoxiques (lyse cellulaire, inhibition ou réduction de l’action du système immunitaire spécifique et non spécifique)
Activation de la voie classique du complément au profit de la bactérie
Amplification de la réaction inflammatoire (altération tissulaire)
Paroi cellulaire : Activation de la voie alterne du complément
Peptidoglycane Induction de réactions inflammatoires puissantes
Acides téichoïques/lipotéichoïques Attachement aux cellules hôtes activées (PAF récepteur)
Phosphorylcholine Production de cytokine IL-1 par les monocytes
contribuant à la virulence et à la pathogénicité
Neuraminidase Colonisation du nasopharynx
Participation à la cytotoxicité cellulaire induite par l’action du complément médiée par la pneumolysine
IgA protéase Colonisation et portage oropharyngé
Peptide-perméases : AmiA, PlpA (10) Adhésion aux cellules épithéliales et endothéliales de l’hôte
Adhésines : PsaA (11), CbpA (12) Colonisation du nasopharynx
Hyaluronase Invasion systémique
Sérine protéase Œdèmes et invasion systémique
Radicaux libres (H2O2)Lésions pulmonaires
Autolysines (LytA principalement) Libération dans le milieu extérieur de la pneumolysine, des fragments pariétaux, de la neuraminidase,
de l’IgA protéase et des radicaux libres. Toutefois, la libération de pneumolysine par LytA vient d’être
remise en cause par l’équipe de Briles (13), au moins pour une souche de sérotype 3.
Tableau I. Rôle des facteurs de virulence (4, 5, 7).

272 La Lettre de l’Infectiologue - Tome XVI - nos 8-9 - octobre-novembre 2001
MISE AU POINT
la fois résistantes et virulentes. Cependant, cette étude ne remet
pas en cause la virulence des souches liée à la nature du sérotype
capsulaire et à sa capacité à échapper à l’opsonophagocytose.
L’extrême diversité des phénotypes péni-S/Vir, péni-S/Avir
et péni-I ou -R/Avir observés avec les souches de sérotype
6 suggère fortement que l’acquisition de résistance aux bêta-
lactamines peut entraîner une perte de virulence expérimentale.
Construction d’un mutant résistant à la pénicilline (19)
Afin de valider cette nouvelle hypothèse, nous avons construit
un mutant résistant à la pénicilline G, identifié les cibles des
bêtalactamines qui étaient altérées [perte d’affinité d’une ou
plusieurs protéines liant la pénicilline (PLP)], et évalué le niveau
de virulence du mutant généré.
Après transformation génétique d’un isolat clinique péni-S et
virulent de sérotype 6B (souche réceptrice 23477, CMI :
0,06 µg/ml et DL50 :2,0 ± 0,6 log10 UFC/souris) par l’ADN
génomique d’un isolat clinique hautement résistant de sérotype
19A (CMI : 8 µg/ml), un transformant péni-I (mutant 473A,
CMI : 0,125 µg/ml) a été obtenu. Les mutations responsables
de cette acquisition de résistance étaient localisés au niveau des
PLP 2b et 2x, car ces PLP avaient perdu en partie leur affinité
vis-à-vis des bêtalactamines chez le mutant 473A comparé à la
souche sauvage 23477.
Les conséquences d’introduction des allèles péni-R dans le
génome de la souche 23477 ont été examinées grâce à l’étude
de la virulence dans le modèle murin de septicémie par infec-
tion intrapéritonéale. L’étude de la mortalité (figure 3) a
montré qu’à chaque inoculum, hormis celui de 107UFC/sou-
ris, les groupes de souris infectés par le mutant 473A avaient
un taux de mortalité significativement plus faible que ceux
infectés avec la souche sauvage 23477. Par exemple, pour un
inoculum de 103UFC/souris, il y avait respectivement 10 et
80 % de mortalité.
Ces résultats permettent de confirmer l’existence de la relation
résistance/virulence. En effet, l’acquisition d’un faible niveau
de résistance, due au transfert des allèles mutés pbp2b et pbpX
dans le génome de la souche virulente 23477, entraîne une
très forte réduction de la virulence expérimentale qui se traduit
par une augmentation significative de la DL50 de 4 log10
UFC/souris.
9
8
7
6
5
4
3
2
10,01 CMI (mg/l)
log10DL100
0,1 1 10
10
Sérotype 1, 3, 4 9, 14, 19, 23 Autres6
Figure 1. Relation entre la virulence expérimentale et la sensibilité
à la pénicilline G de 122 isolats cliniques de S. pneumoniae dans le
modèle murin de septicémie.
Souche virulente : log10 DL100 ≤10
5
UFC/souris ; péni-S :
CMI < 0,12 mg/l ; péni-I : CMI ≥0,12 et ≤1mg/l ; péni-R :
CMI ≥2 mg/l.
V- : avirulent ; V+ : virulent ; S : sensible ; I : intermédiaire ; R : résistant à la pénicilline G.
V- (S)
V- (I)
V- (R)
V+ (S) 13
311
5412
12 16 22
Sérotypes 1, 3, 4
(n = 16) Sérotype 6 (n = 32) Sérotypes 9, 14, 19, 23 (n = 50)
Figure 2. Relation entre la virulence expérimentale dans le modèle murin de septicémie et la sensibilité à la pénicilline G des isolats cliniques
de S. pneumoniae regroupés par sérotypes.

La Lettre de l’Infectiologue - Tome XVI - nos 8-9 - octobre-novembre 2001 273
MISE AU POINT
Analyse du mutant 473A (19)
Pour approfondir l’étude de la relation résistance-virulence, nous
avons analysé les séquences partielles des allèles péni-R, construit
des mutants isogéniques dérivés de la souche 23477, évalué l’im-
pact de l’introduction de chaque allèle sur la résistance aux bêta-
lactamines et la virulence dans le modèle murin de septicémie ; enfin,
nous avons étudié la stabilité des mutants après passage in vivo.
Pour cela, les fragments d’ADN des gènes pbp2b et pbpX pro-
venant du mutant 473A et correspondant respectivement aux
domaines de la transpeptidase des PLP 2b et 2x ont été ampli-
fiés par PCR. Il s’agit d’allèles minimaux mutés dans la mesure
où les gènes des PLP ne sont pas complets, seul le domaine
cible des bêtalactamines étant présent. Ils ont ensuite été utili-
sés pour la détermination des séquences et comme source
d’ADN lors de la transformation génétique de la souche 23477
qui a conduit à la construction des simples mutants (23.2b et
23.2x) et du double mutant (23.2b.2x) isogéniques. La pipéra-
cilline et le céfotaxime ont été utilisés respectivement comme
agent sélectif des fragments pbp2b et pbpX, car ces bêtalacta-
mines sont plus à même de sélectionner spécifiquement les PLP
2b et 2x mutées. Puis les niveaux de résistance et de virulence
des mutants isogéniques ont été étudiés grâce à la détermina-
tion de leur CMI et de leur DL50. Pour finir, la stabilité de ces
souches pour ces phénotypes a été étudiée après passage in vivo.
En effet, si des bactéries virulentes apparaissent, il est possible
de les sélectionner, car les souris inoculées éliminent la majo-
rité des bactéries avirulentes sans empêcher la multiplication
progressive des bactéries virulentes (20). Le passage in vivo
permet dans notre cas la sélection de revertants virulents. À la
mort des animaux, la CMI et la DL50 des bactéries prélevées
dans le sang des animaux ont été évaluées.
!Étude des séquences nucléotidiques. L’analyse des
séquences des PLP 2b et 2x provenant du mutant 473A montre
que les allèles minimaux mutés sont très différents des allèles
sauvages (figures 4A et B). En effet, l’étude de la séquence de
la PLP 2b altérée montre l’existence de trois mutations faux
sens incluant la mutation (Thr-445 "Ala) (21, 22) qui jouxte
le motif SXN du site actif (23).Dans le fragment minimal muté
de la PLP 2x, 130 substitutions sont répertoriées et révèlent une
structure de gène dit mosaïque (24) se traduisant par la substi-
tution de 18 acides aminés, dont la mutation 338 (Thr "Pro),
qui est située dans le motif SerThrMetLys du site actif incluant
la sérine active du site catalytique. Ces mutations majeures
empêchent la liaison à la pénicilline G et, de ce fait, sont impli-
quées dans l’acquisition de la résistance.
Figure 3. Virulence de la souche
sauvage 23477 et de son dérivé 473A
dans le modèle murin de septicémie.
Cinq souris sont infectées par voie
intrapéritonéale à chaque inocu-
lum. La mortalité est suivie durant
10 jours. Pour chaque inoculum,
100 % de mortalité correspond à un
cinquième du disque. Avec ce type
de présentation, plus le cercle est
complet, plus la souche est virulente.
Le vide correspond aux animaux
survivants.
A
B
473A
23477
300 650
4 4
4 5
5 4
AF
5
6
2
T
I
TL
S385VVK S442SN K614TG
473A
23477
290 614
3 3
1 2
8 0
LK
3 3
3 4
8 3
PT
3 3 3
6 6 7
6 9 1
VVT
3
8
4
G
4
0
5
K
4
9
8
V
I
5
9
5
F
Y
6
1
2
V
S
5
1
4
H
N
5
3
1
K
S
5 5 5
6 6 7
5 7 6
TNN
VDSIE M IAI R Q
4
4
6
G
A
S395SNS337TMK K547SG
Figure 4. Séquences des PLP 2b (A)
et 2x (B)de la souche sauvage 23477
et de son dérivé 473A.
Seuls les acides aminés mutés
(numérotés verticalement) et les
boîtes d’homologie SXXK, SXN,
KT(S)G correspondant au site actif
des PLP 2b et 2x sont présentés.
107
106
105
104
103
2,0 ± 0,6
(n = 10)
Souche sauvage
23477 Dérivé 473 A
DL50
(log10 UFC/souris)
Inoculum
(UFC/souris)
6,0 ± 0,6
(n = 6)

274 La Lettre de l’Infectiologue - Tome XVI - nos 8-9 - octobre-novembre 2001
MISE AU POINT
L’analyse des séquences provenant des simples mutants a éga-
lement été réalisée : elle a montré que les allèles minimaux
mutés étaient identiques à ceux utilisés lors des transformations
génétiques, ce qui validait la construction des mutants isogé-
niques.
!Étude de la sensibilité aux bêtalactamines, détermina-
tion de la CMI. Lorsqu’ils ont été introduits séparément, les
allèles minimaux mutés étaient tous les deux responsables
d’une acquisition restreinte de résistance à la pénicilline G
(tableau II).Avec les antibiotiques spécifiques, les écarts entre
le niveau de résistance de la souche sauvage et des mutants
étaient beaucoup plus marqués : la présence de l’allèle pbp2b
s’accompagnait d’une augmentation de la CMI à la pipéracil-
line d’un facteur 4 et celle de l’allèle pbpX d’une multiplica-
tion par 16 de la CMI du céfotaxime correspondant à la souche
sauvage.
Quel que soit l’antibiotique étudié, l’introduction de l’allèle
pbpX dans le génome du mutant 23.2b permet de restaurer le
niveau de résistance de la souche 473A. Ce résultat confirme
qu’aucune autre PLP n’est altérée dans le mutant 473A.
!Étude de la virulence expérimentale, détermination de la
DL50.L’introduction de chaque allèle péni-R est associée à une
perte de virulence significativement importante (figure 5A). La
DL50 du double mutant est identique à celle du mutant 473A.
La perte de virulence associée à l’acquisition de résistance reste
effective avec les mutants isogéniques et confirme les résultats
obtenus lors de la première construction.
Cette perte de virulence n’est pas imputable à un changement
de sérotype capsulaire ou à une variation de la vitesse de crois-
sance in vitro, car ces deux paramètres sont identiques à ceux
de la souche sauvage.
Tableau II. Sensibilité aux bêtalactamines de la souche sauvage 23477
et des mutants isogéniques.
Souche CMI (mg/l)
Pipéracilline Céfotaxime Pénicilline G
23477, souche sauvage 0,03
réceptrice
23.2b, mutant avec allèle 0,06
pbp2b muté*
23.2x, mutant avec allèle 0,03 0,25 0,06
pbpX muté
23.2b.2x, double mutant 0,25 0,25 0,125
473A, souche donatrice 0,25 0,25 0,125
* La transformation a été réalisée à partir de fragments minimaux mutés
amplifiés par PCR à partir du mutant 473A.
DL50 = 5,7 ± 1,0 DL50 = 4,4 ± 0,2 DL50 = 6,0 ± 0,6
DL50 = 1,9 ± 0,2 DL50 = 4,1 ± 0,6 DL50 = 1,9 ± 0,1
23.2b 23.2x
Simples mutants
23.2b.2x
A
B
107
106
105
104
103
Inoculum
(UFC/souris)
Double mutant
23.2b 23.2x
Simples mutants
23.2b.2x
Double mutant
Figure 5. Taux de mortalité
de la souche sauvage 23477
et de ses dérivés péni-R iso-
géniques avant (A) et après
passage in vivo (B) dans
le modèle murin de septi-
cémie.