Diversité et caractérisation du potentiel de production de

USTHB‐FBS‐4th International Congress of the Populations & Animal Communities “Dynamics & Biodiversity of the terrestrial & aquatic Ecosystems""CIPCA4"TAGHIT (Bechar) – ALGERIA, 19‐21 November, 2013 Diversité et caractérisation du potentiel de production de biomolécules des
espèces du genre Bacillus isolées d’éponges marines de la côte Algéroise.
1
ABDERRAHMANI A., 1YAICI L., 1GUENOUN- TOBAL S., 1ABDELLAZIZ L., 1NATECHE F.,
1
AMZIANE M., DJENANE Z., 2BECHET M., 2CHOLLET M., 2JACQUES P.
1
-Laboratoire de Biologie Cellulaire et moléculaire. Equipe de Microbiologie. Faculté des Sciences
Biologiques. Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene. BP32.El Alia. Alger. Algérie.
2-
Laboratoire ProBioGEM. Polytech Lille. USTL1. Avenue Paul Langevin. Villeneuve d’Ascq. 59655. Lille.
France.
Email : [email protected]
Résumé
Une recherche d’espèces bactériennes du genre Bacillus dans des échantillons d’éponges marines
prélevées au niveau des côtes d’Alger a permis sur la base des caractères anatomiques, biochimiques et
moléculaires d’isoler et d’identifier 14 souches se répartissant comme suit : B. thuringiensis (3) Geobacillus
thermoglucosidasius (2) B.pumilus (1) B. firmus (1) B. subtilis (2) Brevibacillus sp. (1), B. cereus (2), B.
amyloliquefaciens (1), B. licheniformis (1). La caractérisation du potentiel de production s’est faite par la
recherche de molécules de type lipopeptides par polymérase chaine réaction (PCR) en utilisant des amorces
dégénérées. Les résultats obtenus montrent une grande diversité de lipopeptides produits puisque les 4
familles (surfactines, iturines, fengycines et kurstakines) sont retrouvées chez les différentes espèces.
Mots clés : Eponges, Bacillus, PCR, amorces dégénérées, lipopeptides.
Abstract
A search of bacterial species of the genus Bacillus in samples of marine sponges collected from the coast of
Algiers allowed on the basis of anatomical characters, biochemical and molecular isolate and identify 14
strains distributed as follows: B. thuringiensis (3) Geobacillus thermoglucosidasius (2) B.pumilus (1)
B.firmus (1) B. subtilis (2) Brevibacillus sp. (1), B. cereus (2), B. amyloliquefaciens (1) and B. licheniformis
(1). Characterization of the potential production is done by looking for lipopeptides synthetases type by
polymerase chain reaction (PCR) using degenerate primers. The results show a wide variety of products of 4
lipopeptides families (surfactins, iturins, fengycins and kurstakins).
Keywords: Sponges, Bacillus, PCR, degenerate primers, lipopeptides.
1. Introduction
Les éponges marines sont une source importante de souches de Bacillus productrices de molécules
bioactives aux propriétés antimicrobiennes, cytotoxiques et antitumorales présentant un intérêt
pharmaceutique et biotechnologique (SCHMITZ, 1994; FENICAL, 1996). Jusqu’à présent, près de
10000 molécules ont été isolées de la flore microbienne des éponges marines. Parmi ces molécules,
les lipopeptides constituent un groupe de composés présentant une large gamme d’applications dans
les processus industriels, environnementaux et thérapeutiques (ONGENA et JACQUES, 2007). Ces
lipopeptides constituent un groupe de biosurfactants contenant une partie peptidique hydrophile et
une autre, lipidique hydrophobe (JACQUES, 2011). Quatre familles de lipopeptides sont connues :
surfactines, iturines, fengycines et kurstakines qui différent entre elles par la composition du peptide
41 USTHB‐FBS‐4th International Congress of the Populations & Animal Communities “Dynamics & Biodiversity of the terrestrial & aquatic Ecosystems""CIPCA4"TAGHIT (Bechar) – ALGERIA, 19‐21 November, 2013 et par la longueur de la chaine lipidique. Ces molécules sont synthétisées par une voie
originale puisqu’elle n’implique pas les ribosomes. Cette voie met en jeu des complexes
enzymatiques multimodulaires appelés NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthetase).
Différentes techniques sont utilisées pour mettre en évidence la production de ces lipopeptides. La
spectrométrie de masse de type MALDI ToF (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of
flight) permet de détecter les lipopeptides sous leur forme protonée [M+H] +, sodique [M+Na]+, et
potassique [M+K]+ dans l’intervalle [500-1550] et la réaction en chaine de la polymérase par
utilisation d’amorces dégénérées pour la détection des gènes de la synthétase.
2. Matériel et Méthodes
Eponges
Les éponges marines ont été récoltées au niveau de 4 plages de la côte Algéroise : Zeralda, Tipaza
et Ain Taya et Ketani (Alger) à une profondeur de 10 à 15m. Les échantillons ont été placés dans
des flacons stériles remplis de l’eau et transportés au laboratoire.
Isolement des bactéries
Les tissus d’éponges sont lavés et coupés puis écrasés dans un mortier. L’extrait obtenu est mis
dans un tube à essai et conservé dans la glace. Pour éliminer les formes végétatives, un chauffage
de l’extrait à 80°C pendant 30 min est effectué. Différentes concentrations (10-1, 10-2, 10-3 et 10-4)
ont été préparés et 100µL ont été étalés sur boites de Petri milieu TSA (Trypticase Soja Agar).
Pour chaque dilution, 3 boites ont utilisées.
Identification des bactéries
Elle a été entamée par une étude microscopique à l’état frais et après coloration de Gram. Seules les
bactéries sous forme de bacilles, sporulant et à Gram positif sont retenues. L’étude biochimique
basée sur la galerie classique avec les caractères suivants : type respiratoire, catalase, nitrate
réductase, production d’indole, fermentation du glucose et du mannitol, a été complétée par
l’utilisation des galeries Api 50CHB (BioMérieux, Marcy l’Etoile, France).
Techniques moléculaires
La technique de PCR a été utilisée pour la recherche des gènes NRPS des souches de Bacillus, et
pour l’identification moléculaire de certaines souches. Elle s’effectue sur des ADNs extraits de
souches cultivées en milieu liquide.
Conditions PCR
L’extraction a été réalisée à partir de 1ml de culture incubé pendant une nuit à 30°C dans le milieu
Luria Broth (LB) à l’aide du Kit Wizard Genomic DNA en suivant les instructions du
fournisseur (Promega Corp., Madison, USA). La concentration d’ADN a été déterminée à l’aide
d’un spectrophotomètre Nanodrop™ 1000 et utilisée directement pour amplification par PCR.
La concentration d’ADN utilisée pour les PCR est comprise entre 10 et 30 ng/µL Le programme
PCR comprend une étape de dénaturation initiale de 3min à 94 °C, suivie de 30 cycles avec une
dénaturation de 1min, une hybridation de 30 s à 45°C pour les amorces Abl1-F/Tbl1-R et S1-F/S2R, 30s à 43°C pour As1-F/Ts2-R, Am1-F/Tm1-R, Af2-F/Tf1-R et 40s à 44,4°C pour les amorces
Aks-F/Tks-R (Tab. I). L’étape suivante est une élongation à 72°C pendant 2 min pour tous les
couples d’amorces, et enfin une élongation finale de 10 min à 72°C.
Le mélange réactionnel est constitué de : 1.5µL de chaque amorce (20µM), 12.5µL de Master Mix
(Fermentas GmbH, St-Leon-Rot, Germany), 8µL d’H2O et 1.5µL d’ADN (10-30 ng/µL) pour un
volume final de 25µL.
Dix µL du produit amplifié par PCR est analysé par électrophorèse sur gel d’agarose (1%) après
fixation avec du bromure d’éthidium. Le gel est visualisé avec “ Illuminator Ultraviolet andDigital
42 USTHB‐FBS‐4th International Congress of the Populations & Animal Communities “Dynamics & Biodiversity of the terrestrial & aquatic Ecosystems""CIPCA4"TAGHIT (Bechar) – ALGERIA, 19‐21 November, 2013 Recorder’’ (Geldoc Bio-Rad, Hercules, USA). Seules les bandes dont la taille correspond à la taille
attendue sont retenues.
Tableau I : Caractéristiques des amorces utilisées
Lipopeptides et
Amorces Séquences Gène de synthétase et
souche bactérienne Taille des fragments
attendue (bp) Surfactine* As1-F/Ts2-R 5’CGCGGMTACCGVATYGAGC 3’ 5’ATBCCTTTBTWDGAATGTCCGCC 3’ surfA et surfB B.subtilis 168 419, 422, 425, 431. Fengycine* Af2-F/Tf1-R 5’ GAATAYMTCGGMCGTMTKGA 3’ 5’GCTTTWADKGAATSBCCGCC 3’ fenA et fenC B.subtilis F29-3 443, 452, 455 Mycosubtiline* Am1-F/Tm1-R 5’CAKCARGTSAAAATYCGMGG 3’ 5’CCDASATCAAARAADTTATC 3’ mycA mycB et mycC B.subtilis ATCC6633 416, 419 Bacillomycine* Abl1-F/Tbl1-R 5’ GATSAWCARGTGAAAATYCG 3’ 5’ ATCGAATSKCCGCCRARATCRAA 3’ BmycA,BmycB,BmycC 428, 431, 434 B.subtilis AU95 Kurstakine **
Ak-F/Tk-R 5’TCHACWGGRAATCCAAAGGG3’ 5’CCACCDKTCAAAKAARKWATC3’ krs1(gramicidineC),
krs2(NRPS) krs3(bacitracine 1) 539, 796, 1122, 1152,
1161, 1173. ARNr 16S
Jacobs, (2007)
1513-1514
Amorces
5’AGAGTTTATC(T,C)TGGCTCAG3’)
universelles
(5’GG(A,C)TACCTTACGA(T,C)TTC3’)
S1- F /S2-R
*Tapi et al. ; 2010, ** :Abderrahmani et al. ; 2011.
Clonage et séquençage
Les bandes retenues sont purifiées avec QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany) et
clonées sur le vecteur pGEM-T Easy (Promega). Le mélange de ligation contient 5µL de tampon
de T4 DNA, 1µL du vecteur pGEM-T Easy(50ng/L, 2µL du produit PCR, 1µL de la ligase deT4
DNA et1µL d’H2O pour un volume final de 10 µL. Le mélange est incubé une nuit à 16 °C puis
utilisé dans la transformation d’E. coli JM109 selon le protocole du producteur.
Le milieu de culture est additionné d’ampicilline à une concentration finale de 100µg/mL pour la
sélection des colonies résistantes. Les plasmides ont été extraits à l’aide du Qiaquick plasmid
extraction (Qiagen, Hilden, Germany). Une analyse de restriction du plasmide a été effectuée en
utilisant l’enzyme EcoRI (Fermentas, Germany) pour rechercher la présence des fragments.
Le séquençage des fragments clonés a été effectué chez MWG Eurofins, Martinsried (Allemagne).
Les échantillons ont été préparés selon les recommandations de l’entreprise. Les produits clonés
sont séquencés en utilisant les amorces pUC-M13-R/F dans le système ABI PRISM. Les séquences
obtenues sont comparées par BLAST (Basic Local Alignment Search Tools), logiciel mis en ligne
par le National Center for Biotechnology Information (NCBI), (USA).
La détermination de l’organisation en modules et domaine des synthétases NRPS et la prédiction
des monomères activés par chaque domaine d’adénylation. L’analyse bioinformatique utilise
différents outils disponibles sur le web, NRPS Predictor et NRPS/PKS (ANSARI et al. 2004;
RAUSH et al. 2005). La comparaison des structures des peptides obtenus est réalisée tel que
recommandé par CABOCHE et al., 2008en utilisant la banque de données NORINE (http://
bioinfo.lifl.fr/norine,).
,
3. Résultats et discussion
3.1. Identification des souches
La caractérisation macroscopique a permis de distinguer des colonies rondes ; plates ou bombées, à
bords réguliers ou non, opaques et de couleurs blanches ou beige.
43 USTHB‐FBS‐4th International Congress of the Populations & Animal Communities “Dynamics & Biodiversity of the terrestrial & aquatic Ecosystems""CIPCA4"TAGHIT (Bechar) – ALGERIA, 19‐21 November, 2013 L’étude microscopique réalisée aussi bien à l’état frais qu’après double coloration de Gram, a
permis de constater que toutes les souches se présentent sous formes de bâtonnets de taille variable
(fins, moyens et gros) droits à extrémités arrondies et arrangés en cellules isolées, regroupés en
paires ou en chaînettes, à Gram positif, sporulées et mobiles ou immobiles.
Les tests physiologiques montrent que toutes les souches possèdent une catalase, aérobies
facultatives ou aérobies strictes. Les résultats des tests biochimiques sont regroupés en 3 catégories:
caractères positifs, négatifs et variables chez les 14 souches (Tab. II).
L’analyse de ces résultats par le logiciel API WEB a donné l’identification suivante : B.
thuringiensis (3 souches), Geobacillus thermoglucosidasius (2) B.pumilus (1), B.firmus (1)
B.subtilis (3) Brevibacillus sp. (1), B.cereus (1), B. amyloliquefaciens (1) et B. licheniformis (1).
Tableau II : Caractères biochimiques des souches étudiées.
Caractères positifs
Caractères négatifs
Croissance sur BN
Croissance sur GN
Croissance sur KCN
RNase
Glucose
Fructose
Maltose
Tréhalose
Citrate de Simmons
Indole, H2S
Oxydase, LDC
Phe et Trp désaminase
Arabinose, Inositol
Xylose, Galactose
Sorbose, Lactose
Mélibiose, Rhamnose
Raffinose, Mannitol
Dulcitol, Inuline
Caractères variables
Rouge de méthyle
Lécithinase, Uréase
Galactose, Mannose,
Saccharose, Cellobiose,
Salicine,Amidon
Glycérol, DNase
Réduction des nitrates
Lipase, ADH, ODC
Action sur :
Esculine, Chitine, Caséine,
Gélatine, Sérum Coagulé.
Une identification moléculaire a concerné quatre souches à l’aide des amorces universelles S1-F/
S1-R (eubactéries). Les quatre fragments ont été purifiés, séquencés puis analysés par BlastN. Cette
analyse a permis de noter une concordance parfaite entre les 2 méthodes.
Détection des gènes NRPS par PCR
Le screening des gènes codant pour des synthétases a été réalisé chez quatorze souches avec cinq
couples d’amorces dégénérées spécifiques de gènes de lipopeptides: As1-F/Ts2-R pour la
recherche des gènes des synthétases de la surfactine, Am1-F/Tm1-R pour les gènes de la
mycosubtiline, Af2/Tf1 pour les gènes de la fengycine et Abl1-F/Tbl1-R pour les gènes de la
bacillomycine, Aks-F/Tks-R pour les gènes de la kurstakine.
Sur les quatorze souches testées, huit ont donné une réponse positive avec les amorces spécifiques
des gènes de synthétases de surfactine puisque les amplicons (420 pb) observés sur le gel
correspondent aux tailles obtenues in silico tandis que pour le couple Am1-F/Tm1-R, cinq ADNs
seulement ont répondu positivement avec des fragments de 420pb.
Pour les amorces Abl1-F/Tbl1-R, 8 ont donné une réponse positive avec des amplicons d’une
taille de 430 pb environ, alors que pour les amorces Aks-F/Tks-R seulement 3 souches ont donné
une réponse positive puisque les amplicons observés sur gel correspondent aux tailles obtenues in
silico (environ 1100 pb)
Enfin, avec les amorces Af2-F/Tf1-R l’analyse de gels permet de relever que 5 souches montrent
des bandes à la taille et à l’intensité attendues d’environ 450bp. On note par ailleurs la présence
chez toutes les souches, des bandes de différentes tailles, non attendues car non obtenues in silico.
Les différents amplicons ont été clonés et séquencés. L’analyse par Blast des séquences obtenues
montrent que pour B.thuringiensis (Tableau III), les 3 fragments obtenus codent pour des sythétases
de B. subtilis et B.thuringiensis. Pour les autres espèces, les résultats concordent avec la littérature.
44 USTHB‐FBS‐4th International Congress of the Populations & Animal Communities “Dynamics & Biodiversity of the terrestrial & aquatic Ecosystems""CIPCA4"TAGHIT (Bechar) – ALGERIA, 19‐21 November, 2013 Tableau III : Résultats de l’analyse par BLAST des séquences obtenues avec B. thuringiensis.
Amorces
Abl1-F
/Tbl1-R
Am1-F/
Tm1-R
Aks-F/
Tks-R
Taille des
Amplicons
(bp)
425
Numéro
d’accession à la
banque Gene des
protéines obtenus
avec le Blast X
ZP04130611.1
425
ZP06875170.1
1162
ZP-04114816.1
Blast X et BlastN
Peptide synthétase [Bacillus
thuringiensis serovar sotto
str.TO 4001
Surfactine synthétase
(Bacillus subtilis
subsp.spizizenii ATCC 6633).
Peptide synthétase de
B.thurigiensis var.
pondicheriensis
Identité du gène
correspondant par
BlastX (%) et E value
86 4e-80
86 4e-77
99 0.0
L’analyse bioinformatique par les logiciels NRPS prédiction de NRPS/PKS des séquences
nucléiques montre que les synthétases sont constituées de modules lesquels sont composés de
domaines.
4. Discussion
Sur la base de la morphologie des colonies, la forme bacillaire, le Gram positif, la production d’une
endospore, la mobilité des souches, la catalase, l’absence de production d’indole, les souches ont été
rattachées au genre Bacillus et principalement au groupe I de la classification de GORDON et al.,
1973.
L’analyse par le logiciel APIWEB des résultats des galeries API 50 CHB a permis de confirmer
l’appartenance des 14 souches au groupe Bacillus et d’arriver a l’espèce pour 13 souches d’ entre elles
exceptée la souche appartenant au genre Brevibacillus.
L’identification moléculaire réalisée sur les 4 souches a permis de confirmer l’identification par le logiciel
APIWEB mais n’a pas permis de distinguer B. cereus et B. thuringiensis. Ces résultats confirment
l’observation faite par ABDERRAHMANI en 2011 concernant l’utilisation de l’ARN 16S dans
l’identification des bactéries du groupe cereus.
Le genre Bacillus est connu pour sa capacité à produire des composés peptidiques et particulièrement les
lipopeptides tels que les iturines et fengycines connus pour leurs propriétés antifongiques. Les amorces
dégénérées utilisées pour la détection génotypique ont amplifié des fragments chez les différentes souches
correspondant à des gènes de synthétases de lipopeptides. Il est intéressant de noter, qu’une même souche
peut contenir différents gènes pour différents puisque des gènes codant pour des synthétases différentes ont
été détectés chez B. subtilis (surfactine et fengycine) et B. thuringiensis (kurstakine et surfactine). Ces
résultats sont confortés par ceux obtenus par XIONG et al. (2008) chez B. subtilis et par ceux de
ABDERRAHMANI et al., (2011) chez B. thuringiensis.
Dans certaines réactions PCR, des fragments amplifiés ne correspondent à ceux attendus. Il a été constaté
que les amorces de nature dégénérée, hybrident d’autres fragments non spécifiques qui pourraient avoir une
taille proche ou totalement différente de celle attendue. Le séquençage alors des amplicons est alors le
moyen ultime d’identifier la nature de ce fragment (TAPI, 2010).
5. Conclusion
Ces résultats montrent la diversité de la flore bactérienne et particulièrement des espèces du genre Bacillus
des éponges marines.
Concernant les lipopeptides produits, nous avons noté la présence chez les différentes souches différents
gènes de synthétases de lipopeptides. Par ailleurs, nous avons remarqué qu’une souche peut contenir deux
voire trois gènes de synthétase différentes.
Il serait intéressant de compléter cette étude par une recherche de la production de ce type de molécules par
spectrométrie de masse et de la corréler avec les résultats la PCR afin de sélectionner les souches
coproduisant deux ou plusieurs lipopeptides.
45 USTHB‐FBS‐4th International Congress of the Populations & Animal Communities “Dynamics & Biodiversity of the terrestrial & aquatic Ecosystems""CIPCA4"TAGHIT (Bechar) – ALGERIA, 19‐21 November, 2013 6. Références bibliographiques
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