les acides aminés et les protéines

1
LES ACIDES AMINÉS ET LES
PROTÉINES
A- LES PROPRIÉTÉS ACIDO-BASIQUES DES ACIDES AMINÉS ET DES PEPTIDES
1
Dosage des acides aminés
On dose une solution d’un acide aminé par NaOH N/10 et par HCl N/10. La prise d'essai est de
20 mL et la courbe de dosage est donnée ci-dessous.
1°) Calculer le titre de la solution d'acide aminé.
2°) Donner les valeurs des pKA de l'acide aminé déterminables à partir de cette courbe.
3°) Indiquer quel est acide aminé, sachant qu'il appartient à la liste suivante : alanine, cystéine, acide
glutamique, leucine, lysine, tyrosine. Justifier la réponse.
4°) Donner les domaines de prédominance des espèces acide-base de cet acide aminé.
5°) Définir le point isoélectrique et le déterminer à partir de la courbe de dosage.
pH
6
mL
HCl N/104
2
4
4
2
0
2
4
4
6
4
8
4
10
4
12
14
16
mL
NaOH N/10
Une solution à pH 12 contenant les 5 acides aminés ci-dessous est déposée sur une colonne de résine
échangeuse d'anions équilibrée au même pH.
Acide glutamique (pHi = 3,1)
Asparagine (pHi = 5,45)
Acide aspartique (pHi = 2,95)
Histidine (pHi = 7,6)
Arginine (pHi = 10,75)
On élue ces acides aminés par une solution dont le pH varie progressivement de 12 à 1,5. Quel est l'ordre
d'élution des acides aminés ?
3
Propriétés spectroscopiques
La présence d'un noyau aromatique dans leur structure confère aux acides aminés aromatiques des
propriétés d'absorption de la lumière dans le proche U.V..
Dans le cas de la phénylalanine, le maximum d'absorption obtenu se situe à 260 nm environ et est
2
pratiquement indépendant du pH du milieu (spectre : voir Fig. 1).
Dans le cas de la tyrosine, le maximum d'absorption se situe à une longueur d'onde différente suivant que la
solution de tyrosine (75 mg.L-1) est préparée dans l'eau ou dans un milieu NaOH
0,1 M (spectres : voir Fig. 2).
1°) Écrire les domaines de prédominance des espèces acide-base de la tyrosine et de la
phénylalanine. Essayer d'interpréter l'observation faite ci-dessus.
Cette variation de l'absorption en fonction du pH peut être utilisée pour déterminer
expérimentalement la valeur du pKA de la chaîne latérale de la tyrosine.
On prépare pour cela 2 solutions de tyrosine à la concentration de 75 mg.L-1 en milieu tampon bicarbonate
l'une à pH 9,5 et l'autre à pH 10,5 (ces valeurs encadrent le pK A de la chaîne latérale de la tyrosine). Les
spectres d'absorption de ces deux solutions sont présentés sur la Fig. 2.
2°) Indiquer quelles sont les espèces acide-base de la tyrosine présentes dans chacune des 2
solutions à une concentration ≥ 10% du total.
3°) Sachant que, lorsque deux espèces, ici, Φ-OH et Φ-O-, présentes en solution absorbent la lumière
simultanément à une longueur d'onde donnée, l’absorbance lue s'exprime ainsi
λ .c
A = εΦ+ ελΦ-O- . cΦ-O- .
OH
Φ-OH
à quelle longueur d'onde sera-t-il judicieux de se placer pour calculer le plus simplement possible, à partir de
l’absorbance lue, les concentrations de Φ-OH et Φ-O- présentes dans chacune des 2
solutions ?
4°) Calculer ces concentrations de Φ-OH et Φ-O- et en déduire la valeur de pKA de la chaîne latérale
de la tyrosine.
A (U.A.)
A(U.A.)
Fig. 1
1,0
1,0
0,8
0,8
Fig. 2
(a) Tyrosine dans la soude
(b) Tyrosine dans l'eau
(c) Tyrosine à pH 10,5
(d) Tyrosine à pH 9,5
a
a
dc
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
b
240
pK = 10,1 HO
4
260
280
CH2
250
270
pK
=
2,2
COO-
c
d
b
290
CH
NH3 + pK = 9,1
Le diagramme ci-dessous représente la courbe de neutralisation du trichlorate (forme la plus acide) de
l'hexapeptide (A) ou (B).
(A) Phe - Gly - Lys - Phe - Gly - Lys
(B) Phe - Gly - Arg - Phe - Gly - Arg
3
Données : pKA des groupements des acido-basiques des chaînes latérales des acides aminés :
Asp
Glu
His
Tyr
Lys
Cys
Arg
3,9
4,1
6
10,1
10,5
8,3
12,5
pH
12
10
8
6
4
2
0
1
2
3
a) Relever les pKA et les attribuer aux différentes fonctions acido-basiques.
b) Relever et justifier les nombres d'équivalents versés pour neutraliser les fonctions.
c) S'agit-il de l'hexapeptide (A) ou (B) ?
5
4
Équivalents de
-
OH ajoutés
Soit le peptide P : Asp-Leu-Lys-Met-Trp-Cys-Ser-Val
1°) Comment migrera-t-il lors d’une électrophorèse à pH 7 ? à pH 12 ?. Justifiez votre réponse en
précisant quels sont les résidus d’acides aminés chargés dans les deux cas.
2°) Peut-on détecter ce peptide par une mesure d’absorbance ? Pourquoi ?
B- DÉTERMINATION DES STRUCTURES
6
Méthode du finger-print
L'analyse d'une protéine naturelle purifiée donne les résultats suivants :
* Le traitement court par le PITC, permet de caractériser le PTH-Ala.
* Une incubation brève avec une carboxypeptidase détache une leucine.
* Après hydrolyse trypsique, les peptides libérés sont séparés par la méthode du finger-print
(électrophorèse à pH 6,4 suivie d'une chromatographie dans un sens perpendiculaire, réalisée à l'aide
d'une phase mobile organique). Après révélation, on obtient 4 taches numérotées 1,2,3 et 4
correspondant à 4 peptides différents.
4
3
4
2
1
chromatographie
(dépôt
- électrophorèse) à pH 6,4 +
* Après élution de ces taches et hydrolyse totale et détermination de la composition en acides
aminés, on obtient les résultats suivants :
- peptide "a" : 3 Ser, 4 Leu, 1 Ala, 1 Met, 1 Tyr
- peptide "b" : 5 His, 2 Ser, 1 Arg, 1 Thr, 1 Pro, 1 Leu
- peptide "c" : 1 Ala, 5 Glu, 2 Cys, 4 Asp, 1 Lys, 1 Leu
- peptide "d" : 1 Tyr, 1 Arg, 2 Thr, 3 Val, 1 Phe
1°) Quel est l'emplacement de ces peptides sur le finger-print ?
2°) Parmi ces peptides, l'un a un pH isoélectrique de 6,4 et un autre de 4,5. De quels peptides s'agit-il ?
3°) a) Quel est le peptide contenant le résidu N-terminal ?
b) Quel est le peptide contenant le résidu C-terminal ?
7
Soit un octapeptide P dont on veut déterminer la structure primaire. Pour cela, on réalise un certain
nombre d’expériences. Pour chacune d’entre elles, il est demandé de rappeler l’action des réactifs utilisés et
d’en tirer le maximum de conclusions.
1°) L’action brève de l’aminopeptidase libère un Asp. Une hydrolyse HCl 6N à chaud sur le peptide
restant permet d’obtenir un mélange des acides aminés suivants en proportions stoechiométriques : Arg,
Gly, Glu, Val, Leu, Lys.
2°) La chymotrypsine est sans action sur ce peptide P.
3°) L’action de la trypsine sur P permet de libérer deux tripeptides A et B et un dipeptide C. L’action
courte de l’aminopeptidase sur l’hydrolysat trypsique permet de libérer Asp, Gly et Leu.
4°) Une hydrolyse chlorhydrique sur C fournit un mélange de Asp et Arg.
5°) La même expérience sur A ne permet d’identifier que Gly et Glu.
6°) Le peptide A mige vers l’anode lors d’une électrophorèse à pH = 7.
Quelle structure de P pouvez-vous déduire de l’ensemble de ces résultats ?
8
Soit un peptide P dont on veut déterminer la structure :
1°) On fait agir l’aminopeptidase sur ce peptide pendant un temps très court : elle détache la valine.
On hydrolyse le peptide restant en milieu acide. Les acides aminés obtenus sont analysés et dosés par
chromatographie. On obtient : Ala, Asp, Cystine, Gly et Tyr . Tous les acides aminés sont à la même
concentration sauf la tyrosine qui est à une concentration double et la cystine qui est à la concentration
moitié de celle des autres. Par ailleurs, l'action de la carboxypeptidase pendant un temps très court libère
Gly. Que peut-on déduire de ces résultats ?
2°) On traite le peptide par la chymotrypsine puis l’aminopeptidase pendant un temps très court :
celle-ci détache l’alanine et la valine.
3°) Le séquençage d'Edman, appliqué au peptide P, permet de mettre en évidence et dans l'ordre,
Val, Asp puis Tyr. Quelle est la séquence du peptide initial ?
5
9
Un peptide est composé de 30 résidus d'acides aminés. Sa composition, déterminée après hydrolyse
acide, est la suivante :
Gly
Ala
Val
Leu
3
3
3
3
Ser
Thr
Cys
Ile
2
1
1
1
Phe
Pro
Tyr
Met
2
2
1
1
Glu
Lys
Arg
3
1
2
Traité par la trypsine, il donne 4 peptides A, B, C et D dont les séquences sont déterminées
indépendamment.
1°) La composition en acides aminés du peptide A est la suivante : 2 Ala, Tyr, Ile et Lys. Quelle est la
nature de l'extrémité C-terminale de ce peptide ?
Un traitement au PITC donne un PTH-Ile et l'action de la chymotrypsine libère deux peptides : un dipeptide et
un tripeptide.
- À l'aide de ces résultats, déterminer la ou les séquences du peptide A.
- Quelle autre méthode permettrait de résoudre entièrement cette séquence ?
2°) Les séquences de peptides B, C et D sont obtenues partiellement par la méthode récurrente
d'Edman. Les résultats obtenus sont les suivants :
B (10 aa) : Met - Ala- Ser - (4) - Leu - Thr - Arg
C (12 aa) : Gly - Trp - Leu - (4) - Pro - Gly - Phe - Ser - Arg
D ( 3 aa) : Val - Glu - Leu
L'action de la chymotrypsine sur le peptide initial libère 5 peptides dont les séquences sont les suivantes :
E (8 aa) : Leu - Pro - Gln - Cys - Val - Pro - Gly - Phe
F (7 aa) : Val - Glu - Leu - Thr - Arg - Ile - Tyr
G (5 aa) : Met - Ala - Ser - Gly - Phe
H (5 aa) : Ala - Ala - Lys - Gly - Trp
I (5 aa) : Ser - Arg - Val - Glu – Leu
- Quelle est la séquence initiale ?
10
Un octapeptide I absorbe la lumière ultraviolette à 280 nm. L'hydrolyse acide donne Ala, Met, Leu,
Arg, Val, Lys, Gly. L'action de la carboxypeptidase donne Val. L'action courte de l'aminopeptidase donne Leu.
L'hydrolyse trypsique donne 2 peptides II et III et un acide aminé libre.
L'analyse du peptide II donne les résultats suivants :
Ce peptide n'absorbe pas à 280 nm. L'hydrolyse acide totale donne Lys, Leu, Ala.
1°) Quelle est la séquence du peptide II ?
L'analyse du peptide III donne les résultats suivants :
Ce peptide absorbe à 280 nm. L'action du bromure de cyanogène donne 2 peptides IIIa et IIIb. Le peptide IIIa
absorbe à 280 nm. L'hydrolyse acide de IIIb donne Arg et Gly.
2°) Quelle est la séquence du peptide III ?
3°) Quelle est la séquence du peptide I ?
11
(examen juin 2002) Pour déterminer la structure primaire d’un pentapeptide P, on réalise les
expériences suivantes. Pour chacune d’entre elles, vous préciserez clairement le rôle de chacun des réactifs
utilisés et vous indiquerez les conclusions que l’on peut tirer du résultat obtenu :
1°) L’hydrolyse acide totale aboutit au mélange d’acides aminés suivant : Arg, Glu, Leu, Met à la même
concentration. De plus, l’action ménagée du réactif d’Edman libère un PTH-Leu.
2°) L’action de la trypsine sur ce peptide permet la formation d’un dipeptide P 1 et d’un tripeptide P2. De plus,
l’action ménagée du réactif d’Edman sur P1 libère un PTH-Leu.
3°) L’action du bromure de cyanogène sur P2 libère un acide aminé et un dipeptide P3 qui absorbe la lumière
à 280 nm. Quels sont les acides aminés qui absorbent la lumière à 280 nm ? Comment les appelle-t-on ?
4°) Quelle est la séquence du peptide P ? Quelle l’expérience proposez-vous pour lever l’ambiguïté ?
6
12
(examen juin 2005) L’analyse d’acides aminés réalisée après hydrolyse acide totale d’un hexapeptide
P donne un mélange équimoléculaire de Met, Lys, Gly, Arg, Tyr.
1°) L’action de la chymotrypsine libère 3 dipeptides
- quelle réaction catalyse la chymotrypsine ?
- quelle conclusion pouvez-vous en tirer sur la structure du peptide P ?
2°) L’action de la trypsine libère 2 tripeptides. L’analyse d’acides aminés réalisée après hydrolyse acide totale
d’un de ces tripeptides donne un mélange équimoléculaire de Lys, Gly, Tyr.
- quelle réaction catalyse la trypsine ?
- quelles conclusions pouvez-vous en tirer sur la structure du peptide P ?
3°) L’action du bromure de cyanogène libère un pentapeptide et de l’arginine.
- quelle est l’action du bromure de cyanogène ?
- conclusion et structure finale du peptide P ?
C - TECHNIQUES DE SÉPARATION - CONFORMATION
13
On a isolé une protéine naturelle jouant un rôle important dans le transfert des électrons au cours de
la respiration. Un microdosage effectué montre la présence de fer (Fe2+) dans cette métalloprotéine. La
quantité trouvée est : 17,1 ng de fer pour 54 µg de protéine. (On rappelle le poids atomique du fer : 56). Quel
est le PM minimum de la protéine ?
14
On étudie une protéine en microscopie électronique : sur les images, cette protéine apparaît
approximativement sphérique avec un diamètre moyen de 100 Å. Déterminer le poids moléculaire de cette
protéine sachant que son volume spécifique est 0,74 cm3.g-1
15
Électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (SDS-PAGE)
On a isolé une protéine P de masse moléculaire 100 000 à l'état natif. On réalise une électrophorèse de cette
protéine ainsi que de protéines connues sur gel de polyacrylamide dénaturant (SDS) dont le résultat présenté
ci-contre :
1°) En déduire le nombre des sous-unités constitutives de la protéine active et la masse moléculaire de ces
sous-unités.
Ligne de dépôt
A295
0,288
Sérum albumine
(67 000)
Protéine P
0,192
Chymotrypsinogène
(27 000)
0,1
Cytochrome C
(12 500)
0
pH
2
4
On titre par la soude une solution de cette protéine à 2 mg.mL
spectrophotométrie à 295 nm. On obtient la courbe ci-dessus.
6
-1
8
10
12
et on suit le titrage des tyrosines par
7
2°) Donner le pKA des différentes tyrosines et le nombre de résidus tyrosine correspondant à chaque pK A
sachant
que
le
coefficient
d'absorbance
de
la
tyrosine
à
295
nm
est
:
-1
-1
 = 1 200 M .cm et que la cuve de mesure a 1 cm d'épaisseur.
16
Chromatographie d'exclusion de gel
Une colonne de chromatographie par tamis moléculaire est chargée avec un mélange de 3 protéines
connues, la sérum albumine bovine (de PM 67 000), la glycéraldéhyde-phosphate deshydrogénase (PM 117
000), l'aldolase de levure (PM 147 000) et d'une protéine nouvellement isolée dont on veut évaluer le poids
moléculaire. Le diagramme d'élution obtenu est donné sur la figure ci-dessous.
[protéine]
Vo
10
15
20
25
30 Volume d'éluant en mL
1°) Rappeler le principe de la chromatographie d'exclusion de gel.
2°) Sachant que le volume d'exclusion (volume d'élution d'une macromolécule non retardée) est V o =
5 ml et que l'on peut tracer une droite
Ve
 f (PM)
Vo
de type y = ax + b
Ve étant le volume d'élution de chaque protéine, attribuer les pics à chacune des protéines du mélange et
estimer le poids moléculaire de la protéine inconnue.
17
Les protéines traitées par le SDS deviennent des polyanions. Soumises à une électrophorèse sur gel
de polyacrylamide à pH = 7, elles migrent toutes, quelle qu'ait été leur charge initiale, vers l'anode.
1°) On mesure la distance de migration, d, de 4 protéines dont on connaît le poids moléculaire.
Porter le log de PM en fonction de d.
Que remarquez-vous ?
Ovalbumine
Trypsine
Myoglobine
Cytochrome C
PM
43 000
23 300
17 200
13 500
log PM
4,63
4,36
4,23
4,13
d (mm)
37,6
59,5
70,0
79,0
2°) Pour les protéines suivantes, dans les mêmes conditions d'électrophorèse, on a trouvé :
8
Lysozyme
Sérumalbumine
d (mm)
77,5
21,5
Anhydrase carbonique
Pepsine
d (mm)
52,0
45,0
À l’aide du graphique précédent, déterminer le poids moléculaire de ces protéines.
3°) Le poids moléculaire de l'hémoglobine est de 64 000. On a trouvé après électrophorèse, une seule
bande dont la distance de migration est de 73 mm (PM = 104,2 = 15 800). Expliquer ce résultat.
18
On cherche à localiser les ponts disulfures reliant les chaînes A et B d'une protéine. L'étude de la
séquence a montré que la chaîne A possède 7 résidus cystéine en position 16, 18, 21, 27, 30, 37 et 50. La
chaîne B a 2 résidus cystéine en position 47 et 69. Le dosage des thiols de la protéine native révèle trois SH
libres.
La méthode utilisée pour localiser les ponts disulfures est la suivante : la chymotrypsine agissant sur la
protéine native libère 4 fragments. Le fragment X contient 2 résidus de cystéine correspondant aux résidus
30 de la chaîne A et 47 de la chaîne B. Le fragment Y contient 4 résidus de cystéine, 3 de la chaîne A et 1 de la
chaîne B.
Le fragment Y est coupé par la trypsine en 2 fragments a et b.
Le fragment a contient les cystéines 16 et 21 de la chaîne A. Le fragment b contient les résidus 18 de la
chaîne A et 69 de la chaîne B.
1°) Indiquer le nombre de ponts disulfures.
2°) Représenter sur un schéma les chaînes A et B, les résidus cystéine et les ponts disulfures.
19
* Une protéine A contient du Fer (Masse Atomique = 56) dans une proportion de 0,35% en masse.
Pour déterminer son poids moléculaire, on mélange à A une protéine B de poids moléculaire 50 000 et une
protéine C de poids moléculaire 75 000. Le mélange de ces trois protéines est déposé sur une colonne de gel
(tamis
moléculaire)
excluant
les
composés
de
poids
moléculaire
supérieur
à
70 000. La protéine A est retrouvée dans une fraction sortie de la colonne entre la fraction contenant B et la
fraction contenant C.
1°) Quel est l'ordre des protéines A, B et C à la sortie de la colonne ?
2°) Quel est le poids moléculaire de A et combien d'atomes de fer la protéine A contient-elle ?
Justifier en détaillant votre calcul.
* L'ultracentrifugation de la protéine A dans un milieu contenant de l'urée 8M montre un seul pic
correspondant à un poids moléculaire égal au quart de celui de A. On obtient le même résultat en milieu
urée 8M en présence de -mercaptoéthanol.
L'électrophorèse de la protéine A en milieu urée 8M montre 2 bandes de charges différentes I et II.
3°) Quel est le nombre de sous-unités de la protéine A ?
4°) Sont-elles identiques ou différentes ?
5°) Quel type de liaison existe entre les sous-unités ?
Chromatographie
8
La fraction correspondant à la bande I est séparée et étudiée, après
7 8 9
hydrolyse trypsique, par la méthode des Finger-Print (électrophorèse à
8
8
8
pH 6,4 suivie d'une chromatographie ascendante en solvant organique).
5
8
6
4
8
8
Après coloration des peptides à la ninhydrine, on obtient la carte ci8
810
8 83 8
contre. Parmi les peptides représentés, quel est le numéro correspondant
2 8 8 88118
12
888
au peptide
x8888
8 1 8 8 8888
88
6°) le plus basique ?
- Électrophorèse
+88
x8888
8 8 8 8 8888
7°) le plus polaire ?
x8888
8 8 8 8 8888
88
888
x88 88 trypsique 9 comprend 10 acides aminés. L'étude de sa structure permet d'obtenir
8 8 8 8du peptide
* La séquence
8
8
8 8 suivants
les résultats
8 x8:
8 88 8 88
8
8 8
8 8
8
9
- La méthode d'Edman donne un PTH-Leucine.
- L'action de la chymotrypsine libère 3 peptides α, β et γ. Ces trois peptides sont séparés et étudiés.
- le peptide α donne avec le réactif d'Edman un PTH-Leucine puis un PTH- Leucine. Ce peptide a une
réaction positive au réactif des groupements phénol. Son analyse en acides aminés après hydrolyse
chlorhydrique (HCl 6N, 110°C, 22 h sous vide) montre qu'il contient en outre 2 valines.
- Le peptide β montre une réaction positive aux groupements guanidium de l'Arginine. Le réactif
d'Edman permet d'obtenir un PTH-Thréonine puis un PTH-Glutamine.
- Le peptide γ absorbe la lumière à 280 nm. L'analyse des acides aminés de ce peptide après
hydrolyse révèle uniquement la présence de valine.
8°) Quelle est la séquence des peptides α, β et γ ?
9°) Quelle est la séquence du peptide 9 ?
20
Les protéines P1, P2 et P3 ont les caractères suivants :
P1
P2
P3
pHi
5,6
7,8
6,5
PM
22 000
22 000
60 000
Quelles sont les méthodes qui permettront leur séparation en une étape :
- électrophorèse
- chromatographie par échange d'ions
- chromatographie par perméation de gel
- isoélectrofocalisation
- électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS ?
ENZYMOLOGIE
21
(Examen Juin 2006)
La malate déshydrogénase catalyse la réduction de l’oxaloacétate en malate en présence de NADH. La
réaction globale peut s’écrire :
Oxaloacétate + NADH + H+ → malate + NAD+
1- Quelle expérience doit-on réaliser pour mesurer avec approximation la vitesse maximale (Vmax)
de la réaction et le KM de cette enzyme. Indiquez les unités dans lesquelles sont généralement exprimées ces
deux paramètres.
2- Dans les conditions de phase stationnaire, donnez l’expression de l’équation de Michaelis-Menten.
L’activité de cette enzyme extraite de la pomme de terre a été mesurée en présence de différentes
concentrations d’oxaloacétate avec une quantité d’enzyme constante.
3- Quel(s) graphique(s) va-t-on pouvoir tracer ? Indiquez sur ce(s) graphique(s) les différentes
constantes que vous pouvez déterminer.
22
Une enzyme, à la concentration [Eo] = 10 -9 M, catalyse la transformation d’un substrat S en produit P.
Des mesures de la vitesse initiale Vi pour différentes concentrations en substrat ont été effectuées et les
valeurs sont présentées dans le tableau ci-dessous :
0,2 0,3
0,4
[S] x 104 M
-1
0,18
0,24
0,30
Vi (µM.min )
0,5 0,8
1
0,33 0,40 0,45
2
4
40
45
0,52 0,59 0,60 0,60
10
Sans aucun tracé de courbe et sans utiliser l’équation de Michaelis-Menten :
1 - Estimer les valeurs de la vitesse maximale Vmax et de la constante de Michaelis K M.
2 - Estimer les nouvelles valeurs de Vmax et KM si la concentration initiale en enzyme est
[Eo] = 2 x 10 -9 M. Justifier votre réponse.
23
(Examen Mai 2006)
1 - La mesure par spectrophotométrie de l’activité en fonction du temps de la citrate synthase
extraite de la pomme de terre, donne une vitesse de 0.2 unités d’absorbance par minute. Sachant que le
coefficient d’extinction moléculaire (m) du substrat à sa longueur d’onde d’absorption maximale (longueur
d’onde à laquelle ont été faites les mesures d’absorption précédemment réalisées) est de 20 000 M -1.cm-1,
que le volume de la cuve de spectrophotométrie est de 3 mL et que la longueur du trajet optique est de 1cm,
exprimez la vitesse de cette réaction enzymatique en µmol min-1 en justifiant vos calculs.
2 - L’ajout, en plus de la citrate synthase et de son substrat, d’une molécule inconnue dans la cuve de
réaction réduit par 2 la vitesse maximale (Vmax) observée, mais ne modifie pas le K M de l’enzyme pour son
substrat.
Comment définiriez-vous cette molécule inconnue vis-à-vis de la citrate synthase et de son substrat ?
Pourquoi ?
24
Une lactase sert de matériel expérimental. Aux concentrations données de lactose, les vitesses
initiales de la réaction sont les suivantes :
[lactose] M
50 x 10-4
20 x 10-4
10 x 10-4
7 x 10-4
5 x 10-4
V (moles de lactose hydrolysé par
min et par mg d’enzyme)
155 x 10-6
103 x 10-6
68,5 x 10-6
53,0 x 10-6
40,6 x 10-6
1 – Déterminer graphiquement les constantes de l’équation de Michaelis (K M et Vmax) relatives à ce
système.
2 – Sachant que la masse moléculaire de cette lactase est 135 000, calculer l’activité moléculaire
spécifique en moles de substrat hydrolysé par mole d’enzyme et par minute.
25
On considère la réaction enzymatique suivante :
-galactosidase
S
P
0n mesure la vitesse de la réaction exprimée en moles de produit par minute et par gramme d’enzyme en
fonction de la concentration du substrat exprimée en M. On obtient les valeurs suivantes :
V
S
8
0,65 x 10-2
12,5
1,1 x 10-2
20
2,2 x 10-2
25
3,3 x 10-2
33
6,6 x 10-2
1 - Tracer cette cinétique en utilisant la représentation de Linewaever-Burk.
2 - Déterminer graphiquement KM et Vmax de l’enzyme. Justifier votre réponse.
3 - Tracer les courbes correspondant à la cinétique de la réaction lorsqu’on ajoute au milieu un
analogue structural du substrat, de concentration I1 ou I2 avec I2 > I1. Expliquer.
11
26
Soit une enzyme E fonctionnant avec le FAD comme coenzyme. La variation de la vitesse de réaction
en fonction de la concentration donne, selon les conditions expérimentales les courbes (a) et (b). Parmi les
propositions suivantes, quelles sont celles qui pourraient expliquer les résultats obtenus ?
1 – Variation de [FAD]
2 – Variation de [E]
3 – Présence d’un inhibiteur compétitif
4 – Présence d’un inhibiteur non compétitif
V
a
b
[S]