Récepteurs Nucléaires et Signalisation
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Récepteurs Nucléaires et Signalisation UE Signalisation M1 Université Paris V-Paris VII Biologie Cellulaire, Physiologie et Pathologie Jeudi 7 Octobre 2004, 14-16h Salle Lavoisier A Rue des St Pères Marc LOMBES INSERM U 6XX Faculté de Médecine Paris -SUD 63, rue Gabriel Péri 94270 Le Kremlin Bicêtre Tel 01 44 85 63 19 Email: [email protected] Plan I- La superfamille des récepteurs nucléaires La plus grande famille de facteurs de transcription des eucaryotes Alignement Définition des domaines fonctionnels Arbre phylogénétique Organisation génomique II- Les récepteurs nucléaires Structure hétérooligomériques et protéines associées Le domaine N terminal Le domaine de liaison au ligand (LBD) Le domaine de liaison à l’ADN (DBD) Localisation subcellulaire Modifications post-traductionnelles (phosphorylation, sumoylation, ubiquitinylation..) III- La régulation hormono-dépendante de la transcription La machinerie transcriptionnelle basale (TFIID, les TAFs) Les corégulateurs; coactivateurs et corépresseurs HAT HDAC CONCLUSION Plan I- La superfamille des récepteurs nucléaires La plus grande famille de facteurs de transcription des eucaryotes Alignement Définition des domaines fonctionnels Arbre phylogénétique Organisation génomique II- Les récepteurs nucléaires Structure hétérooligomériques et protéines associées Le domaine N terminal Le domaine de liaison au ligand (LBD) Le domaine de liaison à l’ADN (DBD) Localisation subcellulaire Modification post-traductionnelles (phosphorylation, sumoylation, ubiquitinysation..) III- La régulation hormono-dépendante de la transcription La machinerie transcriptionnelle basale (TFIID, les TAFs) Les corégulateurs; coactivateurs et corépresseurs HAT HDAC CONCLUSION Histoire des récepteurs nucléaires Les récepteurs des hormones stéroïdes Purification dans les années 1980 Récepteurs des oestrogènes, de la progestérone, des glucocorticoïdes Clonage moléculaire des récepteurs nucléaires A partir de 1985 Récepteurs GR, PR, ER, MR, AR ecdystérone Récepteurs des hormones thyroïdiennes Récepteurs de la vitamine D Récepteurs de l’acide rétinoïque Identification des récepteurs orphelins Récepteurs PPAR ( lipides, nouveaux ligands) Récepteurs apparentés ERR Vrais récepteurs orphelins Nurr1 Mécanisme d’action des hormones stéroïdes immunophilline Cellule cible hsp70 hsp90 CoIn RNA CoF Pol II p Transcription gènes induits SUMO HRE SR Hormone stéroïde Protéines spécifiques Effets Physiologiques Homologie des récepteurs stéroïdiens NTD DBD LBD 777 hGR 100 100 100 984 <15 hMR 94 57 934 <15 hPR 90 50 919 hAR <15 76 50 595 hERa <15 58 24 477 hERb <15 29 23 La superfamille des récepteurs nucléaires Arbre phylogénétique des RN La plus grande famille de facteurs transcriptionnels chez les eucaryotes 6 groupes Plusieurs sous-groupes (d’après le comité de nomenclature des récepteurs nucléaires,Cell, 1999) Classification des récepteurs nucléaires (Olefsky et al, J Biol Chem, 2001) Classification des récepteurs nucléaires en fonction de leur ligand Ligands: Endocrine Receptors Adopted Orphan Receptors High-affinity hormonal lipids Low-affinity dietary lipids ER a,b PR AR GR MR RAR a,b,g TR a,b VDR EcR RXR a,b,g PPAR a,b,g LXR a,b,g PXR/SXR CAR Orphan Receptors Unknown SF-1 LRH-1 DAX-1 SHP TLX PNR NGFI-B a,b,g ROR a,b,g ERR a,b,g RVR a,b,g GCNF TR2,4 HNF-4 COUP-TF a,b,g (Chawla et al, Science, 2001) Structure et Domaines Fonctionnels des Récepteurs Stéroïdiens A/B N Liaison à l'ADN Liaison du ligand Dimérisation Liaison de l'Hsp90 Transactivation Repression Localisation nucléaire Liaison au TFIIB C DNA D E Ligand F C Récepteurs Stéroïdiens : du gène à la protéine gène 5’ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3!’ TGA ATG ARNm NTD DBD LBD Récepteur Domaines fonctionnels AF1 NLS1 Liaison à l’ADN Liaison du ligand Dimerisation Liaison à la hsp90 AF2 Transactivation NLS2 Signal localisation nucléaire Comparaison des gènes des différents récepteurs stéroïdiens humains hMR: Un gène pour différentes isoformes et variants P2 GENE 1b P1 1a 2 A hMR1a hMR1a hMRa 1a C 4 5 D E 6 F 7 G 8 9 H hMRdel10 hMRD hMRD5 hMRD hMRD5,6 ATG 2 TGA 34 5 6 7 8 9 hMRb 1b hMR PROTEINES DBD LBD NH2 ATG 1a 2 TGA 34 5 678 9 1b COOH 1 603 670 hMRins DBD 984 LBD COOH NH2 1a 12 bp ATG 2 34 5 6 7 8 1 TGA 9 1b hMRdel10 603 670 984 DBD COOH NH2 1a 1b 3 hMRins hMR1b hMR1b mRNA B TGA 2 3 47 8 9 1 hMRD5,6 603 670 807 DBD NH2 COOH 1 603 670 Plan I- La superfamille des récepteurs nucléaires La plus grande famille de facteurs de transcription des eucaryotes Aligenement Définition des domaines fonctionnels Arbre phylogénétique Organisation génomique II- Les récepteurs nucléaires Structure hétérooligomériques et protéines associées Le domaine N terminal Le domaine de liaison au ligand (LBD) Le domaine de liaison à l’ADN (DBD) Localisation subcellulaire Modification post-traductionnelles (phosphorylation, sumoylation, ubiquitinysation..) III- La régulation hormono-dépendante de la transcription La machinerie transcriptionnelle basale (TFIID, les TAFs) Les corégulateurs; coactivateurs et corépresseurs HAT HDAC CONCLUSION Mécanisme d’action des hormones stéroïdes immunophilline Cellule cible hsp70 hsp90 CoIn RNA CoF Pol II p Transcription gènes induits SUMO HRE SR Hormone stéroïde Protéines spécifiques Effets Physiologiques Protéines associées aux récepteurs stéroïdiens Protéine Récepteur Propriétés Hsp90 RA, RE, RG, RM, RP Ubiquitaire, abondante, bien conservée; phosphorylée, lie l’ATP, fonction de chaperon Hsp70 RE, RG, RP Ubiquitaire, abondante, bien conservée, lie l’ATP, ATPase, fonction de chaperon P60 RP de poulet Ubiquitaire, phosphorylée, fonction inconnue P59/HBI59/FKBP59/FKBP52 RA, RE, RG, RP Ubiquitaire, conservée, lie le FK506 rapamycine, activité PPIase P54 RP de poulet Ubiquitaire, fonction inconnue P50 RP de poulet FKBP56 de poulet, fonction inconnue Cyp40 RE et RG Ubiquitaire, conservée, lie la CsA, activité de PPIase P23 RG et RP de poulet Ubiquitaire, conservée, phosphorylée, fonction inconnue Protéines associées aux récepteurs stéroïdiens Interaction cyclique et dynamique D’après Pratt, 1991 Le Domaine de Liaison à L’ADN Région centrale NTD DBD DBD LBD Modèle d’interaction des récepteurs avec l’ADN Les éléments de réponse aux hormones hGR S G CH Y A E D S G V L T C V L C Zn2+ C C G S boite boite P K IR D R I K D I N C D C N P R 2+ Zn A G A C C K V FFKRAVEGQHNYL RYRKCLQAGMNLE Récepteurs P-box Demi-site TR, RAR, VDR, RXR, CEGCKG AGGTCA ER CEGCKA AGGTCA GR, MR, PR, AR CGSCKV AGAACA PPAR, NGF-1, NURR-1, TR2, TR2R1, EAR1, RevErba Liaison aux séquences palindromiques sous forme de dimères Homodimères Hétérodimères ERa/ERb HRE GR/MR GRE: AGAACAnnnTGTTCT AR/GR ERE: AGGTCAnnnTGACCT PRA/PRB Définition des éléments de réponse hormonale Structure cristallographique d’un dimère de DBD et un GRE palindromique Dimère de DBD Vue latérale Double brin d’ADN Vue verticale Protéines régulées par les hormones stéroïdiennes au niveau transcriptionnel OESTROGENES GLUCOCORTICOIDES OVALBUMINE CONALBUMINE APO VLDL VITELLOGENINE PROLACTINE TYROSINE AMINOTRANSFERASE TRYPTOPHANE OXYGENASE PEPCK GH ACTH MMTV PROGESTERONE MINERALOCORTICOIDES AVIDINE UTEROGLOBINE ALDOLASE a2U GLOBULINE ENAC Na,K-ATPase Sgk K-ras Fra2 GILZ NDRG2 Organisation des éléments de réponse hormonale 1. Eléments isolés Exemples GRE h Métallothionine ERE r Prolactine GRE h GH 2. Eléments associés GRE MMTV, ERE c Vitellogénine GRE rb Utéroglobine 3. Groupes d’éléments GRE r PEPCK ERE c Ovalbumine PRE c Lysozyme 4. Eléments multiples dissociés ERE rPR Le Domaine de Liaison à l’hormone Domaine C terminal NTD DBD LBD LBD Structure tridimensionnelle du domaine de liaison à l’hormone H9 H10 H7 H5 H6 S 2 H2 H9 H12 H3 H1 H8 H4 H10 H2 H7 H3 W-loop H1 H8 H4 H10 H4 S1 H11 H9 H1 H8 H7 H12 H11 W-loop H11 H12 Domaine de liaison de l’hormone en l’absence de ligand Domaine de liaison de l’hormone en présence d’un agoniste Domaine de liaison de l’hormone en présence d’un antagoniste Création d’une interphase de Liaison aux cofacterus Modélisation du LBD Cristallographie, drug design, génération nouveaux ligands Le Domaine N terminal Domaine «!immunologique!» ou transactivateur NTD NTD DBD LBD Le Domaine N Terminal des récepteurs stéroïdiens A/B Domain 1 DBD 169 450 595 600 680 rMR Fuse 2000 AF-1b AF-1a 1 165 456 546 556 Hovland 1997 76 262 Hollenberg 1988 t1 187 ... hPRB AF-1 AF-3 / BUS 1 650 core 244 420 486 ... hGR Les domaines d’activation fonctionnelle Les AF NTD AF-1 Ligand-Indépendante CONSTITUTIVE D inge B D H LBD AF-2 Ligand-Dépendante Comparaison des domaines N et C Terminaux des récepteurs stéroïdiens NTD non structuré Acquisition d’une conformation structurée d’interphase de liaison avec d’autres partenaires LBD très structuré après liaison du ligand Interaction spécifique avec de multiples partenaires à travers leurs motifs LXXLL Mécanisme d’action des hormones stéroïdes immunophilline Cellule cible hsp70 hsp90 CoIn RNA CoF Pol II p Transcription gènes induits SUMO HRE SR Hormone stéroïde Protéines spécifiques Effets Physiologiques Les Signaux de Localisation Nucléaire Localisation intracellulaire des SR: ER, PR: nucléaire en absence d’hormone MR, GR, AR: cytoplasmiques en absence d’hormone 0 5’ 10’ 15’ EGFP-hMR Navette nucléo-cytoplasmique: import dans le noyau ATP-dépendant export dans le cytoplasme énergie-indépendant NTD DBD LBD Nuclear Localisation Signal NLS1 Nuclear Export Signal NES NLS2 NES Modifications post-traductionnelles des récepteurs nucléaires 1-Phosphorylations 2-Ubiquitination 3-Sumoylation 4-Autres acétylations, méthylations etc... Activation des récepteurs stéroïdiens et Phosphorylation 1-Phosphorylation Basale 2-Phosphorylation Ligand-dépendant 3-Phosphorylation DNA-dépendant P P P P P P hsp90 P hsp90 SR hsp70 SR SR hsp90 hsp90 SR P P AGAACAnnnTGTTCT hsp90 hsp90 hsp70 Phosphorylation: modification des propriétés fonctionnelles des récepteurs Dialogue avec d’autres voies de signalisation Sumoylation et Ubiquitinylation Modification post-traductionnelle des protéines Greffage covalent de groupements Ubiquitine et SUMO SUMO : Small Ubiquitin-like related Modifier SUMOYLATION ≠ UBIQUITINYLATION Sumoylation et Ubiquitinylation SUMO : une famille de protéines apparentées à l’ubiquitine Ubiquitine GG SUMO-1 GG SUMO-2 GG SUMO-3 GG 18% 66% ubiquitine Nedd 8 95% SUMO-1 Extension N-term Processus de conjugaison Hydrolase UBLs conjugaison Ubls Matures Maturation Activating Enzyme E1 ATP Conjugating enzyme E2 S S Ligase E3 (S) X Ubiquitine UBA1 ATP SUMO GG Ubc1-8 10,11,13 APC, SCF, HECT, UBOX... S S X GG AOS1/ UBA2 Ubc9 PIAS, Pc2 RanBP2 Ulp/SENP Substrat Ubiquitinylation Ubiquitine X Peptides Dégradation par le protéasome 26S Processus ATP dépendant Inhibition spécifique possible Les différentes voies de sumoylation Siz/PIAS Johnson and Gupta, Cell (2001) SUMOGG RanBP2 Pichler et al, Cell (2002) 3 voies distinctes E3 ligase Pc2 Kagey et al, Cell (2003) SUMOGG SUMOGG KX KX Substrat E1, E2 SUMO, ATP Site consensus de sumoylation : YKXE Facteurs de Transcription AR PR Structure et intégrité GR du Genome MR Top I p53 Top II p73a ScPCNA c-Jun Dnmt3b CREB WRN HSF1 BLM ? HSF2 SpRad22 (Rad52) AP-2 SpRhp (Rad51) Lef-1 TDG Tcf4 SALL1 IRF-1 C/EBP SREBP DmTtk69 DmDorsal DmBicoid ? Sp3 c-Myb Pdx1 ARNT APA-1 Stat1, -4 GATA-2 Elk-1 Cytoplasme Noyau Corps Nucléaires PML Sp100 HIPK2 Daxx TEL, TEL-AML1 Complexe du Pore Nucléaire RanGAP1 RanBP2 Proteines Virales Co-Facteurs de Transcription GRIP1 SRC-1 p300 DJ-1 TIF1a HDAC1 HDAC4 PIASxa PIASxb PIAS1 PIASy CtBP1/2 Pc2 EBV-BZLF1 BPV-E1 CMV-IE1/IE2 TULV N AdV-E1B 55K Transduction du Signal IkBa Mdm2 DmCamKII DdMEK1 Smad4/DPC4 Smad3 Axin Cytoplasme Yeast Septins GLUT1, -4 Facteurs de Transcription AR PR Structure et intégrité GR du Genome MR Top I p53 Top II p73a ScPCNA c-Jun Dnmt3b CREB WRN HSF1 BLM ? HSF2 SpRad22 (Rad52) AP-2 SpRhp (Rad51) Lef-1 TDG Tcf4 SALL1 IRF-1 C/EBP SREBP DmTtk69 DmDorsal DmBicoid ? Sp3 c-Myb Pdx1 ARNT APA-1 Stat1, -4 GATA-2 Elk-1 Cytoplasme Noyau Corps Nucléaires PML Sp100 HIPK2 Daxx TEL, TEL-AML1 Complexe du Pore Nucléaire RanGAP1 RanBP2 Substrats des PIAS Substrats de RanBP2 Substrats de Pc2 Proteines Virales Co-Facteurs de Transcription GRIP1 SRC-1 p300 DJ-1 TIF1a HDAC1 HDAC4 PIASxa PIASxb PIAS1 PIASy CtBP1/2 Pc2 EBV-BZLF1 BPV-E1 CMV-IE1/IE2 TULV N AdV-E1B 55K Transduction du Signal IkBa Mdm2 Mdm2 DmCamKII DdMEK1 Smad4/DPC4 Smad3 Axin Cytoplasme Yeast Septins GLUT1, -4 La sumoylation : rôles décrits Transport nucléo-cytoplasmique Structures et dynamiques nucléaires Sp100, HDAC4, CREB, SRC-1… PML, HDAC, Top, Dnmt3... SUMOGG SUBSTRAT Compétition avec d’autres modifications post-traductionnelles IkBa, PCNA (Ubiquitinylation) Sp3 (Acétylation) Régulation de la transcription NR, STAT, HDAC, p53... Plan I- La superfamille des récepteurs nucléaires La plus grande famille de facteurs de transcription des eucaryotes Alignement Définition des domaines fonctionnels Arbre phylogénétique Organisation génomique II- Les récepteurs nucléaires Structure hétérooligomériques et protéines associées Le domaine N terminal Le domaine de liaison au ligand (LBD) Le domaine de liaison à l’ADN (DBD) Localisation subcellulaire Modification post-traductionnelles (phosphorylation, sumoylation, ubiquitination..) III- La régulation hormono-dépendante de la transcription La machinerie transcriptionnelle basale (TFIID, les TAFs) Les corégulateurs; coactivateurs et corépresseurs HAT HDAC CONCLUSION Etapes de l’assemblage du complexe de préinitiation TFIID= PIC TBP+ TAF 30a 250 80 IIB 150 110 TAF TBP IIA TBP IIJ IIF RNA Pol II IIE Initiation de la Transcription IIH TATA box TATA box Assemblage séquentiel, dynamique, combinatoire et spécifique d’une cellule et d’un promoteur Mécanismes de régulation de la transcription p/CAF SRC1 CBP TAF IIB IIJ IIF IIA TBP RNA pol II Décompaction chromatienne TATA box IIH Initiation de la IIE Transcription Ac Recrutement de coactivateurs p/CAF SRC1 CBP/p300 Ac Acétylation des histones Ac Agoniste Ac Ac SMRT Recrutement de corépresseurs HRE HDAC Désacétylation NCoR TATA box Antagoniste Condensation chromatienne Repression de la transcription Compaction chromatienne, acétylation et régulation de la transcription D’après Aranda et Pascual, 2001 Différentes étapes intervenant dans la régulation transcriptionnelle Les corégulateurs Les coactivateurs Les corépresseurs (D’après Glass et Rosenfeld, Genes and Dev, 2000) Diversité et complexité du mécanismes d’action des récepteurs nucléaires Ligand : agoniste, antagoniste, antagoniste partiel Tissu cible!: expression tissu-spécifique du RN, enzymes activateurs ou inhibiteurs Protéines de liaison (plasmatique ou intracellulaire Récepteur!: cytoplasmique, nucléaire Isoformes (même gène), isotypes (gènes distincts), variants protéiques Dimérisation, homo- ou hétérodimère Effet dominant négatif Eléments de réponse!: Consensus vs non –consensus Simple, complexe, négatif Nbre de copie, positionnement, proximité d’autres éléments coopérativité Activité transcriptionnelle : Transactivation, transrépression Activité promoteur-spécifique, cellule-spécifique Cross-talk Intérêt muliple : Fondamental: étude structure fonction, mécanismes moléculaires Clinique!: mutation (gain ou perte de fonction) Implications physiopathologiques (cancer, développement!..) Thérapeutique: nouveaux ligands agonistes ou antagonistes spécifiques
