Localisation et duree des potentialites medullo

/. Embryol. exp. Morph. Vol. 27, 3, pp. 603-614, 1972
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Printed in Great Britain
Localisation et duree des
potentialites medullo-surrenaliennes des cretes
neurales chez Fembryon de Poulet
Par ALAIN CHEVALLIER 1
Laboratoire de Zoologie de V Universite Scientifique et Medicale
de Grenoble (Directeur: Professeur P. Sengel)
SUMMARY
The localization and duration of the capacity of neural crest cells
to differentiate into medullary cells of the adrenal gland
The capacity of the neural crest cells to differentiate into medullary cells of the adrenal
gland has been tested for different levels of the cephalo-caudal axis of the chick embryo and at
different stages.
The procedure consisted in associating a fragment of neural crest cells containing spinal
cord with a section of an embryo containing the prospective cortical territory. The latter was
previously deprived in ovo of presumptive medullar adrenal cells by localized X-irradiation
of its spinal cord.
The portion of the spinal cord which has the capacity to give off medulloblasts is located
not only within the prospective adrenal area (somite levels 18-22), but also within a region
extending over a length of six somites in front and seven somites behind the presumptive zone.
This capacity, which is restricted in space, is also limited in time. It is possessed by the
portion of spinal cord defined above from 6 h before the migration of the first neural crest
cells and lasts roughly for 24 h after the beginning of migration. Furthermore, the experiments
indicate that the differentiation of neural crest cells into medullocytes requires the inductive
influence of the cortical cells.
INTRODUCTION
L'origine des cellules chromaiflnes de la glande medullo-surrenale a etc
demontree chez les Oiseaux a Faide de techniques experimentales variees.
Les experiences d'ablations chirurgicales in ovo de Hammond & Yntema
(1947) ou de Strudel (1953) ont montre que l'excision d'un troncon de tube
neural, au niveau de la region presomptive des glandes surrenales et a un
stade precedant l'emigration des cretes neurales, est suivi d'un moindre
developpement ou d'une absence complete de la partie medullo-surrenalienne
de la glande. L'implantation d'une portion de tube neural marque a la thymidine
tritiee dans un embryon hote non marque a permis a Weston (1963) de mettre
en evidence la destination des cellules de la crete neurale, notamment au
1
Adresse deVauteur: Laboratoire de Zoologie de l'Universite Scientifique et Medicale de
Grenoble, 38-Saint-Martin-d'Heres, France.
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A. CHEVALLIER
niveau de la future glande surrenale. Enfin, la methode des greffes heterospecifiques entre la Caille et le Poulet utilisee par Le Douarin & Teillet (1970,
1971) a precise que les cellules medullaires sont issues normalement des cretes
neurales dont le niveau correspond a celui des somites 18 a 24 de l'embryon
de Poulet.
Cette origine localisee de la glande surrenale du Poulet est un facteur
favorable pour l'etude de la regionalisation et, de facon generate, de la determination des cretes neurales. Les questions que Ton peut se poser sont les
suivantes:
(1) Toutes les cellules des cretes neurales sont-elles capables de se differencier
en cellules surrenales medullaires, quel que soit le niveau dont elles proviennent ?
(2) Toutes les cellules, issues d'un meme niveau, sont-elles capables de
donner des medulloblastes pendant les quelques 24 h que dure, selon Weston
& Butler (1966), l'emigration? Autrement dit, les cellules qui sont les dernieres
a quitter le tube neural possedent-elles lesmemes potentialites de differenciation
que celles qui emigrent les premieres ?
L'etude systematique de cette capacite et de sa duree a ete rendue possible
par la mise au point d'une technique d'irradiation et d'explantation combinees
dont les resultats sont rapportes ici.
MATERIEL ET METHODES
Les experiences ont ete faites sur des embryons de Poulet de race Leghorn
blanche, dont l'age s'echelonne de 30 h a 4 jours d'incubation (du stade 10
au stade 24 de Hamburger & Hamilton, 1951). Les operations consistent
a preparer, d'un cote, le troncon d'embryon contenant le futur territoire
cortical recepteur, prive de cellules a potentialites surrenales medullaires et, de
l'autre, le troncon de tube neural donneur dont on veut tester la capacite a
fournir des medulloblastes; enfin a associer ces deux fragments sur la membrane
chorio-allantoidienne.
(A) Preparation du territoire cortical recepteur
La realisation de ce territoire exige tout d'abord la connaissance du moment
exact ou les premieres cellules des cretes neurales quittent le tube neural et
migrent en direction du futur territoire cortical. Ce territoire doit en effet etre
preleve avant que ces cellules n'arrivent a destination. Ce moment, qui marque
le debut de la migration, a ete appele le stade t0 et correspond a une duree
d'incubation de plus en plus longue au fur et a mesure que Ton passe de la
region cephalique a la region caudale de l'embryon. Pour un niveau transversal donne, le debut de cette migration suit de peu la formation des somites
(Fig. 1). Au niveau de la zone surrenalienne presomptive (niveau des somites
18 a 22), les cellules de la crete neurale commencent leur migration au stade
de 20 paires de somites (Fig. 1). En consequence, pour obtenir un territoire
Potentialites medullo-surrenaliennes des cretes neurales
605
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
Stade en paires de somites
Fig. 1. Graphique indiquant a quel stade (/„) commence, pour un niveau donne,
la migration des cretes neurales. Le stade est indique en abcisses par le nombre de
paires de somites; le niveau transversal ou debute, a un stade donne, la migration,
est defini en ordonnees par le numero du somite correspondant. La courbe (t0)
montre que la migration des cretes neurales commence, a un niveau donne, lorsque
les somites de ce niveau achevent leur individualisation. La droite en pointille
indique le niveau du dernier somite forme en fonction du stade. (A) Zone dans
laquelle les cretes neurales ont commence a migrer. (B) Zone dans laquelle les
cretes neurales sont encore entierement contenues dans le tube neural. (ZP) Zone
presomptive des glandes surrenales.
* Chaque cercle represente le resultat de l'examen histologique d'un embryon.
cortical pur (prive de medulloblastes), il faut Fisoler du tube neural avant ce
stade. Le plus simple parait etre l'excision du tube neural in ovo sur des
embryons ayant moins de 20 paires de somites. Cependant, si Ton pratique
cette excision du tube neural au niveau de la zone surrenalienne presomptive,
la glande medullo-surrenale se developpe tout de meme, au moins en partie,
dans 20 % des cas environ. Cette regulation des deficiences est vraisemblablement due a la migration oblique des medulloblastes en provenance des niveaux
anterieurs et posterieurs a la lacune neurale (cf. Le Douarin & Teillet, 1970).
Pour eviter cette colonisation regulatrice du territoire cortical par les cellules
des cretes neurales d'un autre niveau, l'excision du tube neural n'est plus
pratiquee in ovo, mais sur une portion de tronc comprenant les somites 18 a 22
et la zone surrenalienne presomptive. Cette portion de tronc est explantee,
avant le stade de 20 paires de somites, sur la membrane chorio-allantoidienne
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A. CHEVALLIER
d'un embryon de 8 jours d'incubation. Malheureusement, cet explant est trop
jeune pour effectuer une differenciation correcte de son territoire cortical. Par
contre, le developpement complet et harmonieux de ce dernier a etc obtenu
dans environ 60 % des cas, a partir d'explants preleves sur des embryons de
72 h d'incubation. C'est done seulement a partir de ce stade que le troncon
d'embryon devra etre explante sur la membrane chorio-allantoidienne. Mais
la destruction du tube neural devant etre effectuee 24 h auparavant (avant le
debut de la migration des cellules des cretes neurales au niveau considere), il
a fallu recourir a sa destruction in ovo par une irradiation localisee aux
rayons X.
En fin de compte, le territoire cortical recepteur a ete prepare en deux temps:
(a) Un ecran de tantale perce d'une fente est depose sur un embryon de 16
a 19 paires de somites. II permet de localiser Firradiation sur le tube neural, sur
une longueur de 15 somites environ entre le niveau du somite 13 et le niveau
presomptif du somite 27 ou 30 suivant le stade de l'embryon (Fig. 2 A). Cette
irradiation de 15000 rad a pour effet de rendre le tube neural completement
necrotique au bout de 24 h, comme on peut l'observer sur des coupes histologiques de controle. (b) Vingt-quatre heures apres l'irradiation, l'embryon
irradie est opere sur un fond de paraffine dans du liquide physiologique de
Tyrode. Les vestiges du tube neural necrose sont elimines, puis le troncon
d'embryon contenant le territoire cortical presomptif est detache du reste de
l'embryon, par deux incisions longitudinales effectuees a la limite entre les
somites et les lames laterales et par deux sections transversales, faites aux
niveaux des somites 17-18 et 22-23 (Fig. 2B).
(B) Preparation du tube neural donneur
Les embryons ages de 36 a 96 h d'incubation ont ete places sur un fond de
paraffine dans du liquide physiologique de Tyiode. Le troncon de tube neural
a ete excise a des niveaux differents pour chacune des series experimentales
(Fig. 2C).
Dans une premiere serie d'experiences, le troncon, d'une longueur correspondant a celle de six somites, a ete preleve au stade t0 (moment precis ou
commence la migration des cellules des cretes neurales) a divers niveaux, qui
s'echelonnent le long de l'axe cephalo-caudal de l'embryon des somites 2-7 aux
somites 30-35 inclus. Le troncon preleve au niveau des somites 18-22, niveau
de la zone presomptive des glandes surrenales, constitue, avec le recepteur
cortical, une association temoin. Le troncon preleve en avant ou en arriere de
cette zone permet de tester la capacite du tube neural heterotopique a fournir
des medulloblastes.
Dans une deuxieme serie d'experiences, le tube neural a toujours ete preleve
au niveau de la zone presomptive, mais a des moments variables par rapport
au debut de la migration des cretes neurales (stade tQ), s'echelonnant de 6 h
avant a 32 h apres le stade t0.
Potentialites medullo-surrenaliennes des cretes neurales
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+ 24 heures
D
Fig. 2. Schema operatoire.
(A) Embryon de Poulet de 17 paires de somites, protege par un ecran de tantale (e)
dont la fente (/) localise I'irradiation aux rayons X sur le tube neural depuis le niveau
du 13eme somite jusqu'au voisinage du niveau du 27eme somite presomptif.
(B) Portion de tronc contenant le futur territoire cortical, preleve 24 h apres I'irradiation et dont le tube neural necrose a ete excise.
(C) Embryon de 25 paires de somites sur lequel a ete preleve un troncon de tube
neural (a) compris entre le niveau du 17eme et celui du 24eme somite.
(D) Association, en greffe sur la membrane chorio-allantoiidienne (mca), du territoire
cortical presomptif et du troncon de tube neural. On teste ainsi la capacite du tube
neural a fournir des medulloblastes.
Dans une troisieme serie d'experiences, on a combine les deux variables
etudiees precedemment (niveau et stade) en prelevant le troncon de tube
neural a quatre niveaux (celui des somites 6-11, 12-17, 25-30, 30-35), entre
6 h avant et 32 h apres le stade t0, pour chaque niveau considere.
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(C) Association sur la membrane chorio-allantoidienne
Le territoire cortical recepteur et le tube neural donneur ainsi prepares sont
transplants sur la membrane chorio-allantoidienne d'un embryon de 8 jours
d'incubation. Une fente, pratiquee dans cette membrane, et dans laquelle on
glisse les deux explants jusqu'a mi-longueur, permet de les maintenir associes
de telle sorte que le tube neural reste loge a l'emplacement de Tancien tube
neural irradie (Fig. 2D).
Histologie
Les associations ont ete fixees soit au melange de Bouin soit au formol
neutre a 4 %, au bout d'un temps total d'incubation de 10 a 12 jours, coupees
a 10 /on et colorees a l'argent selon la methode de Bodian modifi.ee par
Ungewiter (1951), qui permet de detecter aisement les cellules chromaffines
medullo-surrenaliennes.
RESULTATS
(1) Explantations temoins
Dans la premiere serie d'experiences, l'irradiation prealable du tube neural
n'a pas ete effectuee. Le troncon d'embryon explante sur la membrane chorioallantoidienne conserve son propre tube neural intact. Ce temoin permet de
controler la qualite de la methode et de tester la capacite des tissus a s'autodifferencier en greffe chorio-allantoidienne. Les resultats obtenus (Tableau 1)
montrent que, parmi les cas ou Ton a pu observer la differenciation d'une glande
surrenale et qui s'elevent a 35 sur 65, la plupart (soit 33 cas, 94 %), presente
une differenciation complete avec cellules corticales et cellules medullaires.
Dans la deuxieme serie d'experiences, le tube neural a ete irradie. Le troncon
d'embryon, dont on a laisse en place le tube neural necrose, a ensuite ete
explante sur la membrane chorio-allantoidienne, sans addition de tube neural
sain. Dans ces conditions, la composante corticale de la glande est capable de
s'autodifferencier a partir d'un stade tres precoce (des 72 h d'incubation et
dans certains cas des le stade de 14 paires de somites). La composante medullaire
cependant n'a ete observee dans aucun des 31 explants de ce type (Tableau 1).
Dans la troisieme serie d'experiences, l'adjonction d'un troncon de tube
neural sain, homologue du tube neural irradie elimine a abouti a la differenciation d'une glande surrenale complete (32 cas sur 35) (Tableau 1).
(2) Capacite du tube neural a fournir des medulloblastes au stade t0
en fonction des differents niveaux de prelevement
Ces niveaux s'echelonnent pratiquement de somite en somite, de celui des
somites 2-7 a celui des somites 30-35, comme le montre la Fig. 3. L'examen
histologique montre que seules les associations dont le tube neural a ete
preleve entre les somites 11 et 30 ont differencie cordons corticaux et cellules
Potentialites medullo-surrenaliennes des cretes neurales
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4
6
8
3 10
1 »2
Z 14
6
1'
v
| 18
|
20 - Z P
s ^2
« 24
5 26
28
30
32
34
i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i I I i i I i i
I i i I i i I i i I
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46
Stadc en paires dc somites
Fig. 3. Differentiation de l'association d'un territoire cortical presomptif recepteur
et d'un troncon de tube neural, en fonction du stade et du niveau de prelevement
du tube neural.
Le stade du tube neural est indique en abcisses par le nombre de paires de somites
de l'embryon donneur. Le niveau de prelevement du tube neural est defini en
ordonnees par le numero du somite correspondant. La droite S indique le niveau du
dernier somite forme, en fonction du stade. La courbe t0 marque le debut de la
migration des cellules des cretes neurales pour un stade donne (v. Fig. 1).
Chaque trait vertical represente ainsi le resultat d'une association entre un
territoire cortical recepteur et un troncon de tube neural d'une longueur equivalente
a 5 ou 6 somites (longueur du trait). Ce trait est en pointille s'il s'est developpe une
glande surrenale incomplete sans cellules medullaires, en trait plein si Ton a obtenu
le developpement d'une glande complete, avec cordons corticaux et cellules
medullaires.
L'examen du graphique montre que les associations ont abouti au developpement
d'une glande surrenale complete lorsque le tube neural a ete preleve a un niveau
correspondant a celui des somites 12 a 29 inclus et qu'a I'interieur de ces limites le
tube neural a ete capable de fournir des cellules medullaires depuis environ 6 h
avant le stade t0 jusqu'a 24 h apres ce stade.
medullaires (Figs. 4-6). Au-dela de ces limites, les associations n'ont pas
differencie de cellules medullaires, mais seulement des cordons corticaux
(Figs. 7-9). II convient de preciser que les associations dont le tube neural
a ete preleve, en avant ou en arriere de la zone presomptive, mais a 1'interieur
des limites indiquees plus haut (e'est-a-dire niveaux 12 et 29), ont differencie
des glandes surrenales completes dans une proportion moindre que celle qui
a ete obtenue avec le tube neural preleve au niveau de la zone presomptive
elle-meme (Tableau 2).
39
EMB
27
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Potentialites medullo-surrenaliennes des cretes neurales
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Tableau 1. Developpement de la glande surrenale dans des explants temoins, ou
le tube neural a ete soit laisse en place intact (A), soit irradie et laisse en place
(B), soit irradie, elimine et remplace par un trongon de tube neural homologue (C).
Nombre d'explantations
Presentant une glande surrenale
Differents types
d'explantations
realisees
A
B
C
Total
Suffisamment differenciees pour etre
etudiees histologiquement
Complete
cortex
+ medulla
65
52
62
35
31
35
33
0
32
Formee uni- Formee uniquement de quement de
cordons
cellules
corticaux medullaires
2
31
3
0
0
0
Tableau 2. Association de territoire cortico-surrenalien et d'un troncon de tube
neural d'une longueur correspondant a 5 ou 6 somites, preleve a differents stades
et a differents niveaux de Vaxe cephalo-caudal
Niveau anterieur et
posterieur du troncon
de tube neural associe
(en numero de somite)
Stade de l'embryon donneur de tube neural exprime en heures par rapport
au stade t0, qui correspond au debut de la migration des cretes neurales
-6ha-2h
Stade t0
+2ha+llh
+ 1 2 h a + 24h + 2 5 h a + 32h
0/10
0/6*
4/6
2/3
0/5
3/7
3/4
30/32
3/7
0/10
2/3
9/14
3/6
0/5
4/9
3/6
0/5
0/7
* Nombre d'associations ayant forme une glande surrenale complete (cortex + medulla) sur nombre total
d'associations dans lesquelles des cordons corticaux se sont differencies.
2-7 a 6-11
7-12 a 12-17
18-22
23-28 a 25-30
30-35
Figs. 4 a 6. Resultat de l'association d'un territoire cortical presomptif et d'un
troncon de tube neural (A0 preleve a un niveau correspondant aux somites 18 a 22
chez un embryon de 18 paires de somites. La glande surrenale (S) s'est differenciee
de facon complete avec cellules corticales (c) et cellules medullaires (ra). Impregnation
a l'argent. Fig. 4, x 38; Fig. 5, x 190; Fig. 6, x480.
Figs. 7 a 9. Resultat de l'association d'un territoire cortical presomptif et d'un
troncon de tube neural (/V) preleve a un niveau correspondant aux somites 5 a 10
chez un embryon de 8 paires de somites. Dans ce cas, seule la portion corticale (c)
de la glande (S) s'est differenciee. Impregnation a 1'argent. Fig. 7, x38; Fig. 8,
xl90; Fig. 9, x480.
39-2
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(3) Capacite du tube neural a fournir des medulloblastes enfonction
de son age au moment du prelevement
(a) Tube neural preleve au niveau de la zone presomptive des glandes surrenales
Le tube neural de la zone presomptive surrenalienne a ete capable de fournir
des cellules medullaires lorsqu'il a ete preleve sur des embryons ayant de 14
a 35 paires de somites. Les associations realisees avec un tube neural preleve
sur des embryons plus ages, ont toujours ete exemptes de cellules medullaires.
La duree de cette capacite, exprimee par rapport au stade t0 pour le niveau
considere, a done ete comprise entre 6 h avant et 24 h apres ce stade (Tableau 2).
(6) Tube neural preleve en-deca et au-dela de la zone presomptive des glandes
surrenales
Les associations dont le tube neural a ete preleve a un niveau correspondant
a celui des somites 12-17 et 25-30, ont abouti a la differenciation de glandes
surrenales completes, possedant cordons corticaux et cellules medullaires. Cette
capacite a fournir des medulloblastes a dure environ 30 h, de 6 h avant le
stade t0 a 24 h apres ce stade, et ceci dans des proportions sensiblement egales
a celles qui ont ete obtenues avec le tube neural de la zone presomptive 18-22.
Par contre, le tube neural des zones correspondant au niveau des somites
6-11 et 30-35, n'a jamais fourni de medulloblastes, qu'on le preleve au stade
t0 ou 6 h avant ce stade (Tableau 2).
CONCLUSION
On sait que chez l'embryon de Poulet, les medulloblastes derivent normalement - et cela des un stade tres precoce, comme il ressort des experiences de
marquage de Weston (1963) - des cellules issues des cretes neurales dont le
niveau correspond a celui de la region presomptive des glandes surrenales
(Le Douarin & Teillet, 1970, 1971). Mais on sait aussi maintenant qu'il est
possible d'obtenir experimentalement la differenciation de cellules medullaires
a partir de troncons de tube neural preleve de part et d'autre de cette zone
presomptive des glandes surrenales. En effet, un tube neural preleve jusqu'a
6 somites en avant et 7 somites en arriere de cette region est capable de fournir
des medulloblastes, lorsqu'il est associe a un territoire cortical presomptif.
Cette capacite peut expliquer la regulation des deficiences observees in ovo
par Hammond & Yntema (1947) et par Strudel (1953), apres excision du tube
neural de la zone presomptive, avant le stade t0. En dehors de cette zone moyenne,
le tube neural est incapable de fournir des cretes neurales a potentialites
surrenales medullaires. On peut done affirmer qu'au moment ou les cellules
des cretes neurales commencent leur migration, elles n'ont plus toutes des
potentialites equivalentes le long de l'axe cephalo-caudal de l'embryon. Cette
potentialite medullo-surrenalienne est aussi limitee dans le temps. Elle est
Potentialites medullo-surrenaliennes des cretes neurales
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acquise, pour toute la region du tube neural competent, des 6 h avant le stade
t0 et persiste 24 h apres ce stade, sans que Ton puisse savoir de facon precise,
si le tube neural ne fournit plus de cellules au-dela de ces 24 h, comme le
pensent Weston & Butler (1966), ou si celles-ci ont perdu leur potentialite
medulloblastique.
La determination des cellules des cretes neurales est done precoce, puisqu'elle
est acquise avant meme le debut de la migration des premieres cellules. Mais
cette premiere determination n'est cependant pas suffisante pour permettre
une differenciation totale et definitive en cellules surrenales medullaires. II faut
encore que ces cellules migratrices subissent Faction morphogene du territoire,
ou en fin de compte elles aboutissent. C'est ainsi que le tissu cortico-surrenal
exerce une action determinante, puisque seules les cellules qui viennent au
contact des cordons corticaux, soit dans la morphogenese normale, soit de
facon experimentale, ont la possibility effective de se differencier en cellules
surrenales medullaires.
RESUME
La capacite des cellules de la crete neurale a se differencier en cellules medullaires de la
glande surrenale a ete testee pour divers niveaux de l'axe cephalo-caudal de l'embryon de
Poulet et a differents stades.
La technique consiste a associer sur la membrane chorio-allantoidienne un troncon de
tube neural contenant les cellules de la crete neurale avecun troncon d'embryon contenant
le futur territoire cortical recepteur. Ce dernier est prealablement prive in ovo de cellules a
potentialites medullo-surrenales par l'irradiation localisee aux rayons X de son tube
neural.
La portion de tube neural capable de fournir des medulloblastes se situe non settlement
au niveau de la zone presomptive des glandes surrenales (niveau des somite 18-22), mais
aussi sur une region s'etendant de six somites en avant a sept somites en arriere de la zone
presomptive.
Cette capacite, restreinte dans l'espace, Test aussi dans le temps. Elle est acquise, pour
toute la region du tube neural capable de donner des medulloblastes, des 6h avant la
migration des premieres cellules des cretes neurales et persiste environ 24 h apres le debut
de la migration.
De plus, Faction inductrice des cordons corticaux semble determinante pour aboutir a
la differenciation complete de ces cellules migratrices en cellules medullo-surrenaliennes.
Ce memoire correspond a la these de specialite (Biologie animale) qui a ete soutenue par
l'auteur le 16 octobre 1970 devant l'Universite Scientifique et Medicale de Grenoble.
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A. CHEVALLIER
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(Manuscrit recu le 18 Janvier 1972)