étude du profil immunogénique des fibres

RACHA METLEJ
ÉTUDE DU PROFIL IMMUNOGÉNIQUE DES
FIBRES RÉVERTANTES
DANS LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Microbiologie-Immunologie
pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.)
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2012
c
Racha Metlej, 2012

Résumé
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire
récessive liée au chromosome X. Elle se manifeste par une dégénérescence musculaire
progressive, menant finalement à la perte de la marche et à la mort. Elle est causée par
une mutation au niveau du gène dmd codant pour une protéine, la dystrophine. Cette
mutation altère le cadre de lecture normal du gène causant la perte de l’expression de
la dystrophine, essentielle pour la protection des muscles contre la dégénérescence suite
à l’effort. Par contre, la majorité des patients DMD ainsi que la souris mdx (modèle
animal de la DMD), expriment de rares fibres musculaires révertantes qui expriment la
dystrophine. Cette expression est due à une mutation somatique qui restore le cadre de
lecture normal du gène et mène à la synthèse d’une dystrophine recombinante.
Il a été suggéré que la dystrophine exprimée par les fibres révertante puisse induire
une tolérance immunologique, conduisant à l’accumulation des fibres révertantes. Alter-
nativement, ces rares fibres révertantes peuvent provoquer une réponse auto-immune
qui limiterait les approches thérapeutiques visant à réexprimer la dystrophine. Dans
mon étude, j’ai cherché à vérifier si la dystrophine néoformée provoque une réponse
immunitaire dans la souris mdx.
Tout d’abord, j’ai examiné, par immunohistochimie, les Tibialis antérieurs (TA) de
souris mdx (souris dystrophiques) et Rag/mdx (dystrophiques et lymphopéniques) afin
de comparer le nombre de fibres révertantes entre les souris immunocompétentes et les
souris immunodéficientes. Cette étude permettait donc d’évaluer l’influence du système
immunitaire sur la présence des fibres révertantes.
Ensuite, j’ai tenté de vérifier, in vivo, la présence d’une réaction immunitaire cellu-
laire envers la dystrophine. Des splénocytes de souris mdx et 10J ont alors été transférés
par injection intra-veineuse dans des souris Rag et Rag/mdx. Les muscles de ces dernières
ont été examinés par marquage immunohistochimique afin de détecter la présence d’in-
filtration de cellules immunitaires autour des fibres révertantes.

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Enfin, pour étudier la réponse humorale, j’ai examiné les sérums de souris mdx
par immunohistochimie et Western-Blot, afin de vérifier si des anticorps contre la dys-
trophine étaient présents.
Mes travaux ont montré que les souris immunodéficientes avaient un nombre plus
élevé de fibres dystrophine-positives, ce qui suggère que le système immunitaire est im-
pliqué dans l’élimination des fibres révertantes chez les souris mdx immunocompétentes.
En plus, la détection d’une infiltration de lymphocytes T dans les muscles de souris
Rag/mdx, contenant des fibres révertantes, vient appuyer notre hypothèse. Cependant,
le sérum de souris mdx ne contenait pas d’anticorps contre la dystrophine. Ces résultats
suggèrent que les fibres révertantes n’induisent pas une tolérance immunitaire envers la
dystrophine néoformée et qu’au contraire, elles induisent l’activation du système immu-
nitaire. Cette activation se traduit par une réponse à médiation cellulaire et n’implique
probablement pas une réponse à médiation humorale.

Abstract
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an X-linked recessive neuromuscular dis-
ease. It is characterized by progressive muscle degeneration, eventually leading to loss
of ambulation and death. It is caused by a mutation in the dmd gene which encodes
for the dystrophin protein. This mutation alters the normal reading frame of the gene
causing the loss of dystrophin expression, essential for the protection of muscles from
degeneration, following an effort. However, the majority of DMD patients and mdx mice
(animal model of DMD) have rare revertant muscle fibers that express dystrophin. This
expression is due to a somatic mutation, which restores of the normal reading frame of
the gene and leads to the synthesis of a recombinant dystrophin. It was suggested that
the dystrophine expressed by the revertant fibers could induce immunological toler-
ance, leading to the accumulation of revertant fibers. Alternatively, these rare revertant
fibers could induce an autoimmune response that limits the success of therapeutical
approaches to induce the expression of dystrophin. The aim of my study was to verify
whether the newly formed dystrophin triggers an immune response in the mdx mouse.
The Tibialis anterior (TA) muscle of mdx (dystrophic) and Rag/mdx (dystrophic,
lymphopenic) mice were first examined by immunohistochemical staining to compare
the number of revertant fibers present in immunocompetent and immunodeficient mice.
This study allowed us to evaluate the influence of the immune system on the presence
of revertant fibers. The presence of a potential cellular immune response against dys-
trophin was then investigated in vivo. Splenocytes from mdx and 10J mice were trans-
ferred intravenously into Rag and Rag/mdx. The muscules of these mice were examined
by immunohistochemical staining to detect the presence of immune cellular infiltration
around the revertant fibers.
Finally, to study the humoral response, I examined sera from mdx mice using im-
munohistochemical staining and Western blotting to check for antibodies against dys-
trophin.
My research showed that immunodeficient mice had a significantly higher number

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of dystrophin-positive fibers, suggesting that the immune system is involved in the
elimination of revertant fibers in immunocompetent mdx mice. In addition, T cells
obtained from mdx mice and injected in Rag/mdx mice infiltrated muscles of Rag/mdx
mice containing revertant fibers supporting the hypothesis that mdx mice do make a
cellular immune response against the dystrophin revertant fibers. However, the mdx
mouse serum did not contain any antibodies against dystrophin. These results suggest
that revertant fibers do not induce an immune tolerance to the newly formed dystrophin,
but on the contrary, they trigger the activation of the immune system. This activation
results in a cell-mediated immunity but not a humoral immunity.