étude du profil immunogénique des fibres

RACHA METLEJ
ÉTUDE DU PROFIL IMMUNOGÉNIQUE DES
FIBRES RÉVERTANTES
DANS LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Microbiologie-Immunologie
pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.)
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2012
c
Racha
Metlej, 2012
Résumé
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire
récessive liée au chromosome X. Elle se manifeste par une dégénérescence musculaire
progressive, menant finalement à la perte de la marche et à la mort. Elle est causée par
une mutation au niveau du gène dmd codant pour une protéine, la dystrophine. Cette
mutation altère le cadre de lecture normal du gène causant la perte de l’expression de
la dystrophine, essentielle pour la protection des muscles contre la dégénérescence suite
à l’effort. Par contre, la majorité des patients DMD ainsi que la souris mdx (modèle
animal de la DMD), expriment de rares fibres musculaires révertantes qui expriment la
dystrophine. Cette expression est due à une mutation somatique qui restore le cadre de
lecture normal du gène et mène à la synthèse d’une dystrophine recombinante.
Il a été suggéré que la dystrophine exprimée par les fibres révertante puisse induire
une tolérance immunologique, conduisant à l’accumulation des fibres révertantes. Alternativement, ces rares fibres révertantes peuvent provoquer une réponse auto-immune
qui limiterait les approches thérapeutiques visant à réexprimer la dystrophine. Dans
mon étude, j’ai cherché à vérifier si la dystrophine néoformée provoque une réponse
immunitaire dans la souris mdx.
Tout d’abord, j’ai examiné, par immunohistochimie, les Tibialis antérieurs (TA) de
souris mdx (souris dystrophiques) et Rag/mdx (dystrophiques et lymphopéniques) afin
de comparer le nombre de fibres révertantes entre les souris immunocompétentes et les
souris immunodéficientes. Cette étude permettait donc d’évaluer l’influence du système
immunitaire sur la présence des fibres révertantes.
Ensuite, j’ai tenté de vérifier, in vivo, la présence d’une réaction immunitaire cellulaire envers la dystrophine. Des splénocytes de souris mdx et 10J ont alors été transférés
par injection intra-veineuse dans des souris Rag et Rag/mdx. Les muscles de ces dernières
ont été examinés par marquage immunohistochimique afin de détecter la présence d’infiltration de cellules immunitaires autour des fibres révertantes.
iii
Enfin, pour étudier la réponse humorale, j’ai examiné les sérums de souris mdx
par immunohistochimie et Western-Blot, afin de vérifier si des anticorps contre la dystrophine étaient présents.
Mes travaux ont montré que les souris immunodéficientes avaient un nombre plus
élevé de fibres dystrophine-positives, ce qui suggère que le système immunitaire est impliqué dans l’élimination des fibres révertantes chez les souris mdx immunocompétentes.
En plus, la détection d’une infiltration de lymphocytes T dans les muscles de souris
Rag/mdx, contenant des fibres révertantes, vient appuyer notre hypothèse. Cependant,
le sérum de souris mdx ne contenait pas d’anticorps contre la dystrophine. Ces résultats
suggèrent que les fibres révertantes n’induisent pas une tolérance immunitaire envers la
dystrophine néoformée et qu’au contraire, elles induisent l’activation du système immunitaire. Cette activation se traduit par une réponse à médiation cellulaire et n’implique
probablement pas une réponse à médiation humorale.
Abstract
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an X-linked recessive neuromuscular disease. It is characterized by progressive muscle degeneration, eventually leading to loss
of ambulation and death. It is caused by a mutation in the dmd gene which encodes
for the dystrophin protein. This mutation alters the normal reading frame of the gene
causing the loss of dystrophin expression, essential for the protection of muscles from
degeneration, following an effort. However, the majority of DMD patients and mdx mice
(animal model of DMD) have rare revertant muscle fibers that express dystrophin. This
expression is due to a somatic mutation, which restores of the normal reading frame of
the gene and leads to the synthesis of a recombinant dystrophin. It was suggested that
the dystrophine expressed by the revertant fibers could induce immunological tolerance, leading to the accumulation of revertant fibers. Alternatively, these rare revertant
fibers could induce an autoimmune response that limits the success of therapeutical
approaches to induce the expression of dystrophin. The aim of my study was to verify
whether the newly formed dystrophin triggers an immune response in the mdx mouse.
The Tibialis anterior (TA) muscle of mdx (dystrophic) and Rag/mdx (dystrophic,
lymphopenic) mice were first examined by immunohistochemical staining to compare
the number of revertant fibers present in immunocompetent and immunodeficient mice.
This study allowed us to evaluate the influence of the immune system on the presence
of revertant fibers. The presence of a potential cellular immune response against dystrophin was then investigated in vivo. Splenocytes from mdx and 10J mice were transferred intravenously into Rag and Rag/mdx. The muscules of these mice were examined
by immunohistochemical staining to detect the presence of immune cellular infiltration
around the revertant fibers.
Finally, to study the humoral response, I examined sera from mdx mice using immunohistochemical staining and Western blotting to check for antibodies against dystrophin.
My research showed that immunodeficient mice had a significantly higher number
v
of dystrophin-positive fibers, suggesting that the immune system is involved in the
elimination of revertant fibers in immunocompetent mdx mice. In addition, T cells
obtained from mdx mice and injected in Rag/mdx mice infiltrated muscles of Rag/mdx
mice containing revertant fibers supporting the hypothesis that mdx mice do make a
cellular immune response against the dystrophin revertant fibers. However, the mdx
mouse serum did not contain any antibodies against dystrophin. These results suggest
that revertant fibers do not induce an immune tolerance to the newly formed dystrophin,
but on the contrary, they trigger the activation of the immune system. This activation
results in a cell-mediated immunity but not a humoral immunity.
Avant-propos
Tout d’abords, je tiens à remercier mon directeur de recherche, le Dr. Jacques-P.
Tremblay, pour m’avoir accueilli dans son laboratoire. J’ai beaucoup apprécié travailler
sous sa direction, d’autant plus que ceci m’a permis d’approfondir mes connaissances
grâce à ses judicieux conseils, ses idées sans fin et son esprit ouvert à toutes les idées
et suggestions de ces étudiants. Je n’ai jamais cogné à la porte de son bureau pour
discuter de mon projet, sans avoir eu tout le temps nécessaire de sa part.
Je remercie également les membres du laboratoire pour leur aide et leurs réponses
à mes innombrables questions, surtout Joël pour toute sa patience et ses conseils. Un
merci spécial à Amina qui m’a aidé dans certaines manipes et qui est devenue une très
bonne amie.
Du fond du coeur, je remercie ma famille au Liban : mon père pour avoir toujours cru
en moi, ma mère pour m’avoir soutenue et encouragée pendant toutes les circonstances
et mes deux sœurs pour m’avoir remonté le moral durant les nombreuses journées
nostalgiques. Je suis là grâce à vous. Je vous aime !
Finalement, un gros MERCI à mon amoureux Walid pour son support en tout temps,
son énorme patience et sa compréhension quand ça n’allait pas très bien et que j’étais
insupportable et pour son amour. Je t’aime.
vii
Je dédie ce mémoire à mes parents,
mes soeurs et à mon mari.
Table des matières
Résumé
ii
Abstract
iv
Table des matières
ix
Table des figures
xi
1
.
.
.
.
1
1
1
1
3
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
4
4
6
7
8
9
10
11
11
12
12
12
13
13
3 Le système immunitaire
3.1 Introduction à l’immunobiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Lignée lymphocytaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1 Lymphocytes T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
24
24
25
2
Le tissu musculaire
1.1 Généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2 Le muscle squelettique : sa structure et son fonctionnement
1.2.1 Anatomie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3 Régénération du tissu musculaire . . . . . . . . . . . . . . .
La
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
dystrophie musculaire de Duchenne
Historique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
La pathophysiologie de la DMD . . . . . . . . . . . .
Le gène de la dystrophine . . . . . . . . . . . . . . .
La dystrophine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Les mutations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Complexe glycoprotéique associé à la dystrophine . .
Les modèles animaux . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.7.1 Modèle murin . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.7.2 Le chien GRMD, modèle canin de la DMD . .
2.7.3 Modèle primate . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.8 Traitements de la DMD . . . . . . . . . . . . . . . .
2.8.1 Thérapies pharmacologiques (par médication)
2.8.2 Thérapies en développement . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
ix
3.3
3.4
3.5
3.6
3.2.2 Lymphocytes B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cellules présentatrices d’antigènes (CPA) . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.1 CPA « professionnelles » . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.2 CPA « non professionnelles » . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) . . . . . . . . . . . . .
Immunobiologie du muscle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Le muscle exprime d’autres molécules participant à la réaction immunitaire
4 Fibres révertantes et système immunitaire
4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2 Mécanismes impliqués dans la restauration de l’expression de la
trophine dans les fibres révertantes . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3 La tolérance immunologique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.1 Tolérance centrale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.2 La tolérance périphérique . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . .
dys. . .
. . .
. . .
. . .
29
32
33
33
34
36
39
41
41
42
45
45
45
5 Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
5.1 Problématique, hypothèses et objectifs . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.1 Problématique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.2 Hypothèse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.3 Objectifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Matériel et méthodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.1 Comparaison du nombre des fibres dystrophine-positives entre
des souris dystrophiques immunocompétentes et immunodéficientes
5.2.2 Vérification de la présence d’une réponse immune cellulaire in vivo
5.2.3 Vérification de la présence d’une réponse immune à médiation
humorale contre la dystrophine . . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
48
48
48
49
49
Résultats
5.3 Comparaison du nombre des fibres dystrophine-positives entre des souris
dystrophiques immunocompétentes et immunodéficientes . . . . . . . .
5.4 Vérification de la présence d’une réponse immune cellulaire in vivo . . .
5.5 Vérification de la présence d’une réponse immune à médiation humorale
contre la dystrophine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
57
6 Discussion et conclusions
6.1 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2 Conclusions et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
68
68
71
Bibliographie
73
49
51
53
57
58
63
Table des figures
1.1
1.2
Anatomie du muscle squelettique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Processus de réparation du muscle squelettique . . . . . . . . . . . . .
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
Premières observations de la DMD . . . . . . . . . . . . .
Représentation moléculaire de la dystrophine . . . . . . . .
Le complexe de la dystrophine . . . . . . . . . . . . . . . .
Transplantation de myoblastes . . . . . . . . . . . . . . . .
Facteurs limitant la greffe de myoblastes . . . . . . . . . .
Principaux AONs utilisés dans le cadre de la DMD . . . .
Saut d’exon médié par des oligonucléotides antisens dans la
3.1
Récepteur d’une cellule lymphocytaire de type T et ses sous unités membranaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Développement et maturation des lymphocytes T au niveau thymique .
Proportion des lymphocytes T survivant une sélection thymique selon
leur affinité TCR-CMH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Schéma d’une immunoglobuline. C : parties constantes, V : parties variables
Maturation des lymphocytes B. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Les complexes majeurs d’histocompatibilité chez la souris et chez l’humain.
La structure des CMH de classe I et de classe II. . . . . . . . . . . . .
Immunobiologie du muscle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
DMD
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Le nombre de fibres révertantes est plus élevé dans les T.A. des souris
immunodéficientes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Contrôle négatif. Absence d’infiltration de lymphocytes T CD4+ dans les
souris Rag/mdx naïves, n’ayant reçu aucun transfert. . . . . . . . . . .
Contrôle négatif. Absence d’infiltration de lymphocytes T CD4+ dans les
souris Rag/mdx 14 jours après le transfert de splénocytes de 10J. . . .
Absence de CD4+ dans les muscles de souris Rag/mdx au jour 7 suite au
transfert de splénocytes provenant de souris mdx. . . . . . . . . . . . .
Présence de lymphocytes T CD4+ autour des fibres révertantes dans les
muscles de souris Rag/mdx 14 jours après le transfert de splénocytes de
souris mdx. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
3
7
9
10
14
17
22
23
26
27
29
30
32
35
36
37
58
59
60
60
61
xi
Absence de lymphocytes T CD4+ dans le muscle de souris Rag au J14
suite au transfert adoptif de splénocytes des souris mdx. . . . . . . . . .
5.7 Infiltration de lymphocytes T CD8+ dans le muscle de souris Rag/mdx
suite au transfert de splénocytes provenant de souris mdx. . . . . . . .
5.8 Absence d’anticorps anti-dystrophine dans le sérum de souris mdx. . . .
5.9 Absence de la présence d’anticorps dirigés contre la dystrophine dans les
sérums de souris mdx. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.10 Contrôle positif de la transfection. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.11 Western-Blot des différents extraits protéiques. . . . . . . . . . . . . . .
5.12 Contrôle positif de nucléofection. Myoblastes nucléofectés avec un plasmide codant la protéine fluorescente verte (GFP). . . . . . . . . . . . .
5.6
62
62
64
64
65
66
67
Chapitre 1
Le tissu musculaire
1.1
Généralités
Le tissu musculaire représente environ 40 à 50% de la masse corporelle. Son bon fonctionnement assure le mouvement, le maintien de la posture ainsi que la thermogenèse.
Trois différents types de muscule composent l’organisme : le muscle lisse, cardiaque et
squelettique. La dystrophie musculaire de Duchenne touche les trois types de muscles,
mais c’est le muscle squelettique qui est le plus touché, alors que les muscles lisses
et cardiaque sont affectés moins rapidement. Ces derniers se contractent de façon involontaire, au contraire du muscle squelettique qui est le seul type musculaire pouvant
répondre à notre volonté. Il est également le plus abondant de l’organisme. La section
suivante décrira plus explicitement sa structure et ses fonctions.
1.2
1.2.1
Le muscle squelettique : sa structure et son
fonctionnement
Anatomie
La fibre musculaire est l’unité de base du muscle squelettique. Chaque fibre a une
forme cylindrique avec un diamètre de 10 à 100 microns et une longueur pouvant atteindre 30 cm. Elle contient noyaux, mitochondries, réticulum endoplasmique et myofibrilles (Tortora et Grabowski, 1994). Ces longues et fines fibres multinucléées sont
Chapitre 1. Le tissu musculaire
2
parallèles les unes aux autres et chaque fibre est enveloppée et séparée des autres par une
mince couche de tissu conjonctif, l’endomysium. Une autre couche de tissu conjonctif,
le périmysium, enveloppe jusqu’à 150 fibres pour former un faisceau. Un fascia de tissu
conjonctif fibreux, l’épimysium, enveloppe l’ensemble du muscle. Cette gaine protectrice
se referme aux extrémités et s’unit aux autres enveloppes du tissu intramusculaire pour
former le tissu conjonctif dense et fort des tendons qui réunissent chaque extrémité du
muscle à la surface externe des os, le périoste. Le sarcolemme situé sous l’endomysium
entoure chaque fibre musculaire et délimite le contenu cellulaire de la fibre.
Une fibre musculaire est formée par la fusion de plusieurs cellules dont le cytoplasme
a fusionné pour former un syncytium ; les nombreux noyaux de ces cellules sont situés à
la périphérie du cytoplasme (sarcoplasme), juste sous la membrane cellulaire (Tortora
et Grabowski, 1994), voir figure 1.1.
FIGURE 1.1 – Anatomie du muscle squelettique. Le muscle squelettique, attaché
à l’os par un tendon, est ceint par deux membranes : plus à l’extérieur, on retrouve
le fascia profond et plus en profondeur l’épimysium. Le muscle squelettique est formé
de plusieurs faisceaux de fibres. Ces faisceaux sont entourés d’une membrane appelée
périmysium et sont irrigués dans la matrice extracellulaire par des artères et des veines.
Les fibres musculaires à l’intérieur des faisceaux sont entourées d’un tissu conjonctif appelé endomysium. À l’intérieur de chaque fibre musculaire, on retrouve des myofibrilles.
Des cellules mononuclées situées près des fibres musculaires, appelées cellules satellites,
demeurent disponibles pour la régénération musculaire. (The McGraw-Hill Companies,
1999).
Chapitre 1. Le tissu musculaire
1.3
3
Régénération du tissu musculaire
Les efforts physiques relativement intenses constituent des traumatismes aux muscles et provoquent des bris musculaires nécessitant une réparation rapide. Ce mécanisme
de réparation se divise en deux phases : la phase dégénérative et la phase régénérative.
La première étape survient après le bris musculaire. Les fibres endommagées nécrosent
et provoquent une réaction inflammatoire au site endommagé. Les neutrophiles s’infiltrent d’abord et les macrophages phagocytent les débris causés par la nécrose des fibres.
Par la suite, la régénération de ces bris a lieu et elle est prise en charge par des cellules
précurseurs de muscles appelées cellules satellites. Lors du développement, les cellules
satellites se divisent et fusionnent pour former le tissu musculaire (Moss et Leblond,
1971; Schultz, 1996). Plus tard dans le développement, ces cellules auront plutôt un état
quiescent et seront activées par les dommages musculaires. Les cellules satellites sont
situées entre la lame basale et la membrane cytoplasmiques des fibres (Mauro, 1961) et
peuvent être identifiées par des marqueurs comme Pax7, Pax3, m-cadhérine, myocyte
nucleor factor, CD34 et Myf5. Ces cellules reçoivent des signaux suite aux bris musculaires. Elles vont alors proliférer et migrer jusqu’aux fibres musculaires endommagées
afin de fusionner avec elles et réparer le dommage (Charge et Rudnicki, 2004). Figure
1.2
FIGURE 1.2 – Processus de réparation du muscle squelettique. (A) : Le
phénomène de réparation du muscle squelettique est caractérisé par une phase dégénérative suivie d’une phase régénérative. (B) : Une blessure au niveau du Tibialis anterieur causée par l’injection de cardiotoxine résulte en une nécrose des myofibrilles
ainsi qu’en une activation d’une réaction inflammatoire destructrice du muscle. (C) :
afin de régénérer les myofibrilles, les cellules satellites s’activent et fusionnent avec les
fibres nécrotiques pour les réparer. Charge et Rudnicki (2004).
Chapitre 2
La dystrophie musculaire de
Duchenne
2.1
Historique
La dystrophie musculaire de Duchenne « DMD » a sans doute affecté des humains
depuis les premiers temps. Les anciens Egyptiens ont illustré sur les murs de tombes des
anormalités physiques qu’on reconnait aujourd’hui telles que la poliomyélite paralytique
et le nanisme congénital. En fait, sur le mur d’une tombe à Beni Hasan (illustrée dans des
manuscrits au Ashmolean Museum, Oxford), datant de l’Empire du Milieu (2800−2500
BC), des scientifiques ont remarqué une illustration d’un garçon atteint de ce qui peut
possiblement être une dystrophie musculaire. Il avait perdu l’arc normal de ses pieds, ses
mollets paraissaient élargis et il pouvait avoir un certain degré de (pseudo) hypertrophie
de certains muscles de membres supérieurs.
Cette illustration était interprétée de différents points de vue, par différents scientifiques qui l’attribuaient à différentes anormalités. Cependant, Duchenne, à qui la
DMD doit son nom, en visitant le National Hospital for Nervous Diseases à Londres, où
une reproduction de la peinture était montrée, a commenté que le garçon illustré par
l’artiste a pu souffrir d’une dystrophie musculaire pseudo-hypertrophique.
Cependant, la première description clinique de la dystrophie pourrait être attribuée
à Sir Charles Bell qui, dans sa publication The nervous system of the human body
(1830), décrivit un homme de 18 ans avec une faiblesse musculaire qui « le rendait
incapable de se lever, il enroule et secoue son corps pour se jeter debout de son siège »
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
5
(Bell, 1830).
En 1836, deux chercheurs italiens, (Conte et Gioja, 1836), ont écrit un article portant
sur deux frères présentant une faiblesse progressive des jambes ainsi que des signes
d’hypertrophie musculaire (Conte et Gioja, 1836). Dans cette étude, les auteurs citent
les travaux d’un médecin italien, Giovanni Semmola, qui aurait décrit brièvement ces
mêmes frères en 1829 et qui serait donc le premier à avoir présenté officiellement des
travaux scientifiques sur cette pathologie. Malheureusement, cette citation est la seule
trace à ce jour de cet article qui demeure autrement introuvable (Tyler, 2003). S’il
existait, ce rapport devancerait d’un an celui de Bell (1830).
Cependant, selon le professeur Alan Emery, les études de Semmola, de Bell ou de
Conte ne sont pas assez exhaustives pour que leurs auteurs soient considérés comme père
de la DMD. La première vraie étude a été publiée par le médecin anglais Edward Meryon
(1807-1880). Il décrivit la maladie chez quatre frères de la même famille (Engel et C.,
1994). Ses descriptions furent aussi claires et précises que celles qui suivirent. En 1851, à
une réunion du Royal Medical and Chirurgical Society à Londres, il a présenté une étude
portant sur neuf garçons de trois familles avec la maladie (Meryon, 1851). Les résultats
ont été publiés l’année suivante (Meryon, 1852), dans lesquels il a souligné trois points
importants. D’abord, la maladie affectait les mâles et était familiale. Deuxièmement, il a
examiné attentivement la moelle épinière après le décès d’un garçon atteint de DMD et
il conclut que tous les aspects nerveux étaient normaux incluant les voies nerveuses et les
cellules ganglionnaires. Troisièmement, son étude microcopique du muscule le conduit
à conclure : les fibres striées primitives et élémentaires se sont avérées complètement
détruites, le tissu musculaire était diffusé et dans de nombreux endroits converti en
globules huileuses et en matière granulaire, le sarcolemme ou la tunique de la fibre
élémentaire était cassée (fracturée) et détruite. Meryon attribua la cause de la maladie
à une carence en éléments nutritionnels. Une année plus tard, William John Little (18101894) publia son livre (Little, 1853) avec une description de la maladie pareille à celle
de Meryon. En 1861, Duchenne (1861) (Duchenne de Boulogne, 1806-1875) attribua la
cause de la maladie à un désordre cérébral et la nomma « paraplégie hypertrophique de
l’enfance »Ėt ce n’est qu’en 1868 qu’il découvrit que ce trouble était relié aux muscles
(Duchenne, 1868). Ensuite il a décrit la fibrose et l’adipose caractérisant la DMD et il
a commencé à chercher des thérapies telles les massages, l’hydrothérapie ainsi que la
stimulation électrique. Ses études cliniques étaient beaucoup plus poussées au niveau
étiologique que celles des autres, c’est pour cela qu’il fut nommé père de la DMD.
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
2.2
6
La pathophysiologie de la DMD
La dystrophie musculaire de Duchenne affecte 1/3500 garçons nés. La cause de cette
maladie est une mutation au niveau du locus p21 du chromosome X, codant pour une
protéine : la dystrophine (Eric et al., 1987). L’absence de la dystrophine causée par
cette mutation détermine le caractère pathologique de cette maladie. En fait, la dystrophine assure la liaison entre la matrice extracellulaire et le cytosquelette d’actine des
fibres muculaires. En son absence, cette liaison n’existe plus fragilisant ainsi le muscle
(Blau et al., 1983; Engel et Franzini, 2004). En général, c’est une femme porteuse qui
transmet son chromosome X portant la mutation à son fils, mais dans le tiers des cas,
c’est une nouvelle mutation qui est en cause dans la maladie (Emery, 1970; Gardner,
1980). Sur le plan clinique, les premiers signes apparaissent dans la petite enfance (dès
2-3 ans), avec une démarche dandinante sur la pointe des pieds, une difficulté à monter
les escaliers, des mollets hypertrophiés, un léger retard de croissance ainsi qu’un taux
élevé de PCK (Phosphocreatine kinase) sérique (Emery et Muntoni, 2003). Vers l’âge
de cinq ans, l’enfant éprouvera des difficultés motrices et utilisera ses bras pour pouvoir
se lever. Cette manœuvre, nommée manœuvre de Gowers, a été décrite en 1886 par
William Richard Gowers qui l’attribua à une faiblesse des extenseurs de la hanche et
des genoux causant de la difficulté pour se lever, figure 2.1. La dégénérescence musculaire progresse et affecte plus les muscles proximaux que distaux ainsi que la partie
inférieure plutôt que supérieure (Allsop et Ziter, 1981; Cohen et al, 1982). L’enfant est
confiné à une chaise roulante vers l’âge de 10 ans, où seulement 14% sont capables de
monter les escaliers avec une légère difficulté (Brooke et Griggs, 1981). Durant cette
période, l’enfant perd ses facultés ambulatoires autonomes. Après cette perte, la majorité (75−90%) des patients développent une scoliose tel que démontré dans les dessins
originaux de Duchenne (Kinali et al, 2009). Suite à la fibrose ainsi qu’à l’adipose, une
pseudo-hypertrophie de certains muscles est observée. Ensuite la dégénérescence musculaire progresse pour atteindre le diaphragme ainsi que les muscles intercostaux (muscles
respiratoires) vers l’âge de vingt ans, menant le patient à l’utilisation d’appareils de
ventilation. Les muscles cardiaques sont aussi atteints et le patient meurt d’une insuffisance cardiaque ou respiratoire (dans une plus grande proportion) dans la vingtaine
(Mukoyama et al, 1987).
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
7
FIGURE 2.1 – Premières observations de la DMD. (A) Photographie du premier
patient observé par Duchenne. Il a une hypertrophie des muscles inférieurs ainsi qu’une
lordose assez prononcée de la colonne vertébrale. (B) Représentation de la manoeuvre
de Gowers. (C) Dessin de deux frères atteints de DMD examinés par Gowers. Les
caractéristiques de la maladie sont évidentes à 7 ans (patient de droite) alors que peu
de signes cliniques se manifestent à 4 ans (patient de gauche). La mère de ces enfants
avait un frère atteint. Tirée de Tyler (2003).
2.3
Le gène de la dystrophine
Le gène causant la dystrophie musculaire de Duchenne a été caractérisé en 1986
(Monaco et Neve, 1986) et son produit, la dystrophine, a été caractérisée en 1987 par
le groupe de Kunkel (Eric et al., 1987). Le gène est localisé au niveau du locus Xp21
du chromosome X, ce qui fait que la DMD est une maladie héréditaire liée au sexe
et qu’elle touche surtout les garçons. Ce gène est le plus grand gène connu avec 2.4
mégabases d’ADN, constituant ainsi 1% du chromosome X. 79 exons constituent la
partie codante du gène (environ 14 kilobases), ils sont séparés par des introns pouvant
atteindre 200 kilobases (Koenig et Hoffman, 1987). Uniquement 0.6% du gène code
pour l’ARN messager. Plusieurs épissages alternatifs peuvent se produire au niveau de
l’ARN pré-messager et on compte actuellement au moins sept promoteurs spécifiques à
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
8
certains tissus (Bies et al, 1992; Feener et al., 1989). Ainsi on retrouve de la dystrophine
au niveau du cortex cérébral (Barnea et al, 1990; Nudel, 1989), dans les cellules de
Purkinje (Gorecki, 1992), dans les cellules gliales (Bar et al, 1990; Lederfein et al, 1992),
dans les cellules de Schwann (Byers et al., 1993) et plusieurs autres organes (Ahn et
Kunkel, 1993; Muntoni et al., 2003).
2.4
La dystrophine
Avec un poids moléculaire de 427 kDa et un total de 3 685 acides aminés, la dystrophine est la deuxième plus grosse protéine humaine après la titine (Davison et Critchley, 1988). En se basant sur sa séquence d’acides aminés, elle partage certains aspects
structuraux avec la spectrine et l’α-actinine (Hammonds, 1987; Davison et Critchley,
1988) En se basant sur ces homologies structurales, elle est divisée en quatre domaines
(Koenig et al., 1988).
Le domaine N-terminal est composé des premiers 240 acides aminés, il contient des
séquences homologues au domaine de liaison l’α-actinine, il se lie à l’actine (Hammonds,
1987; Levine et Moir, 1990; Hemmings et Kuhlman, 1992; Way et Pope, 1992).
Ensuite, suit un long domaine répétitif spectrin-like, de 2 400 acides aminés (entre
les acides aminés 338 et 3 055). Sa séquence prédit une forme allongée et consiste en
25 (Cross et Stewart, 1990) ou 26 (Koenig et al., 1988) séquences répétées en forme de
triple hélices ressemblant à la spectrine.
Le troisième domaine comprend 280 acides aminés contenant 15 cystéines et une série
de 142 acides aminés ayant une homologie de 24% avec l’extrémité carboxy-terminale
de l’α-actinine (Koenig et al., 1988).
Et finalement un domaine C-terminal qui est formé d’au moins 420 acides aminés. La
section riche en cystéines (troisième domaine) et l’extrémité proximale sont essentielles
pour la liaison de la dystrophine à son complexe associé (Bies et Caskey, 1992; Suzuki
et Yoshida, 1992; Ervasti et Campbell, 1993; Matsumura et Tome, 1993; Jung et Yang,
1995). Ce domaine possède aussi une homologie significative à l’utrophine, une protéine
encodée sur le chromosome 6 et qui est de la même famille que la dystrophine (Love et
Hill, 1989; Love et Byth, 1993). Figure 2.2
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
9
FIGURE 2.2 – Représentation moléculaire de la dystrophine. La dystrophine
se divise en quatre sous-domaines et mesure jusqu’à 170 nm. Cette protéine est très
conservée entre les différentes espèces, mais le nombre de spectrines peut quant à lui
varier.
2.5
Les mutations
Les types de mutations qui surviennent à l’intérieur du gène de la dystrophine
sont nombreux : soit des réarrangements de larges sections d’ADN (délétions ou duplications), soit des mutations impliquant un nombre faible de nucléotides (mutations
ponctuelles ou microdélétions). Les réarrangements importants sont retrouvés dans environ 60 à 65% des cas de DMD (Koenig et Hoffman, 1987; Baumbach et Chamberlain,
1989; Battaloglu et Telatar, 1992; Covone et Caroli, 1992; Niemann-Seyde et Slomski,
1992; Simard et Gingras, 1992; Specht et Beggs, 1992; Bushby et Gardner-Medwin,
1993). Les duplications partielles surviennent dans 6% des mutations en Amérique du
Nord (Hu et Ray, 1990), mais ce chiffre passe à 14% des cas au Japon (Hiraishi et Kato,
1992). Certaines régions du gène sont plus sensibles aux mutations et sont situées là où
les introns sont particulièrement longs (entre les premiers 20 exons du gène), à l’intérieur
du plus large intron et entre les exons 44 et 45 (Koenig et Hoffman, 1987; Den Dunnen
et Grootscholten, 1989; Koenig et Beggs, 1989). Ces réarrangements importants sont
généralement de longueurs inégales. Dans le cas des petites mutations, elles apparaissent dans 30% des cas de DMD (Bulman et Gangopadhyay, 1991; Kilimann et Pizzuti,
1992; Roberts et Bobrow, 1992; Bushby et Gardner-Medwin, 1993) dont trois types ont
été identifiés jusqu’à présent : des mutations ponctuelles, une délétion d’un nucléotide
(Prior et Papp, 1993) et une délétion de 32 paires de bases (Matsuo et Masumura, 1991).
La plupart de ces mutations provoquent un changement du cadre de lecture produisant
une protéine non-fonctionnelle.
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
2.6
10
Complexe glycoprotéique associé à la dystrophine
Le complexe associé à la dystrophine (CAD) compte 18 protéines : la laminine-α2
(mérosine), les dystroglycans (α, β), les sarcoglycans (α, β, δ, , γ), la sarcospan, la
dystrobrevine, les syntrophines (α1 , β1 et β2 ), la « nitric oxyde synthase » (NOs), la
MAST205 (« microtubule associated serine/theronime kinase 205 Kd » ), la syncoiline,
la calvéoline−3 et la Grb2. Ces protéines forment un complexe qui, en s’associant avec
la dystrophine, lient les filaments d’actine avec la matrice extracellulaire, en traversant
le sarcolemme (Ehmsen et Poon, 2002). Ce lien permet de stabiliser la membrane de
la fibre, figure 2.3. Dans le cas de la DMD, les protéines du CAD ne se localisent pas
au sarcolemme, dû à l’absence de dystrophine (Ervasti et Ohlendieck, 1990; Ohlendieck
et Matsumura, 1993). Cette observation se produit aussi chez les souris mdx le modèle
animal de souris de DMD (Ervasti et Ohlendieck, 1990; Ohlendieck et Campbell, 1991).
Ce qui fait que la fibre musculaire se brise facilement lors de contractions musculaires.
De plus, des modifications dans les gènes de certaines protéines du CAD se traduisent
en myopathie.
FIGURE 2.3 – Le complexe de la dystrophine. La dystrophine est une très grande
protéine qui permet de faire le lien entre le cytosquelette d’actine et la matrice extracellulaire via la liaison de plusieurs complexes protéiques. Une mutation dans cette
protéine est responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne ou de Becker. Image
adaptée de Bonnemann et al. (1996).
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
2.7
11
Les modèles animaux
Une variété de modèles animaux a été utilisée pour étudier les mécanismes de nécrose
des fibres musculaires ainsi que la faisabilité des différents traitements dans le cadre
d’essais thérapeutiques (Partridge, 1991).
2.7.1
Modèle murin
La souris mdx est le modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne. Elle
possède une mutation à la position 3 185 de l’exon 23, ce qui convertit le codon glutamine
CAA en un codon stop TAA (Sicinski et al., 1989). Cette mutation s’est produite chez la
souche de souris congénitale C57BL/10ScSn. Le produit du gène muté de la dystrophine
est tronqué et ne possède pas la capacité fonctionnelle de s’attacher au sarcolemme. De
plus, comme chez les patients DMD, il en résulte une absence marquée du complexe
glycoprotéique associé à la dystrophine (Ohlendieck et Campbell, 1991). Cependant, les
souris mdx, comparées aux humains, ne présentent que peu de phénotypes associés à la
maladie et elles ont la capacité de se reproduire. On observe peu de fibres musculaires en
nécrose et elles sont continuellement remplacées par des fibres régénératrices au lieu du
tissu conjonctif. Toutes les fibres musculaires des souris mdx ont leurs noyaux localisés
au centre de la fibre, même lorsque celles-ci ont atteint leur maturité. Les fibres de type
II sont préférentiellement remplacées par des fibres de type I, comme chez les patients
DMD (Jackson et Jones, 1984; Wong et Cheung, 1979).
L’utilisation de la souris mdx est néanmoins limitée d’un côté par la taille réduite
des muscles greffés et d’un autre côté par les différences pathologiques qui subsistent
entre le modèle murin et humain de la DMD. Contrairement aux muscles de patients
DMD, les souris mdx ne montrent pas de dégénérescence musculaire progressive et le
tissu musculaire n’est pas remplacé par la fibrose ou du gras à l’exception du Soleus
chez la souris âgée (Lefaucheur et Pastoret, 1995; Pastoret et Sebille, 1995). Une phase
aiguë de dégénérescence et régénérescence se produit néanmoins chez ces souris entre
l’âge de 3 et 4 semaines (Grounds et McGeachie, 1992).
Un autre modèle murin utilisé pour la recherche de traitement pour la DMD est
la souris Rag/mdx résultant du croisement de la souris mdx avec une souris « Severe
Combined ImmunoDeficiency » (SCID), une souris immunodéficiente. Ce modèle sert
surtout à évaluer les traitements cellulaires ou géniques sans devoir affronter le problème
du rejet immunitaire et donc sans l’obligation d’utiliser des immunosuppresseurs.
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
2.7.2
12
Le chien GRMD, modèle canin de la DMD
Les différences existantes entre les caractéristiques de la pathologie chez l’humain
et celles observées chez les souris ne permettent pas de créer de bases solides pour la
poursuite des travaux vers des essais cliniques. Des modèles plus fidèles doivent donc
être utilisés. Jusqu’à présent, le chien est le meilleur modèle disponible. L’absence de la
dystrophine chez les chiens cause une myopathie et cardiomyopathie similaires aux patients DMD (Valentine et al., 1992). Le Golden retriever dont le gène de la dystrophine
est muté (GRMD) est le modèle canin le plus utilisé. Cette mutation consiste en un
remplacement d’une base A par G à l’intérieur d’un site d’épissage consensus situé à
l’extrémité 3 de l’intron 6, ce qui produit une protéine manquant les exons 6 à 8. Au
niveau phénotypique, le chien GRMD possède une masse corporelle raide comparable
à celle des patients DMD avec une démarche chambranlante, une difficulté à se nourrir (Howell et Fletcher, 1997). Au niveau histologique, le chien présente une atrophie
musculaire causée par le remplacement des fibres nécrosées par du tissus fibreux. Mais
malgré leur grande ressemblance aux patients DMD, ces chiens ne sont pas des animaux
de laboratoires idéaux à cause des coûts élevés de leur maintien.
2.7.3
Modèle primate
Le primate représente un excellent modèle quant à la taille de ses muscles ainsi que
la similitude de son système immunitaire avec celui de l’humain. Malheureusement, il
n’existe aucun primate portant une mutation sur le gène de la dystrophine. Dans notre
laboratoire, ce modèle est utilisé dans le but d’améliorer la transplantation de cellules
myogéniques.
2.8
Traitements de la DMD
À ce jour, il n’existe malheureusement pas de thérapies efficaces pour la dystrophie
musculaire de Duchenne. Les traitements présentement offerts servent à améliorer la
qualité de vie des patients et à retarder l’apparition des premiers symptômes de la
DMD. Des exercices et des étirements pratiqués dès le plus jeune âge permettent de
repousser l’apparition de lordose (Eagle, 2002).
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
2.8.1
13
Thérapies pharmacologiques (par médication)
Divers produits pharmacologiques sont utilisés pour diminuer l’inflammation qui apparait suite aux nombreux bris musculaires engendrés par la fragilité musculaire. L’administration de corticostéroïdes, tels la prednisone, ou l’un de ses dérivés, le déflazacort,
a montré une amélioration phénotypique des patients (Bonifati et al, 2000). Une étude
a même démontré que le déflazacort augmentait la prolifération cellulaire et la fusion de
myoblastes de souris mdx (Anderson et al., 1996), une caractéristique intéressante dans
l’optique de diminuer la dégénérescence musculaire. Malheureusement, des chirurgies
sont également nécessaires afin de prolonger la durée de vie des patients. Pour contrer
la compression du diaphragme produite par le développement de lordose, des tiges de
métal sont installées dans le dos afin de redresser la posture. Cette intervention permet
d’améliorer la capacité respiratoire de la personne.
2.8.2
Thérapies en développement
Thérapie cellulaire
1] Transplantation de myoblastes normaux
La thérapie cellulaire par transplantation de myoblastes consiste à injecter des myoblastes normaux dans les muscles de patients DMD. Elle est basée sur la capacité de
ces cellules à fusionner avec les fibres musculaires de l’hôte, transférant ainsi leur noyau
contenant le gène normal de la dystrophine. La dystrophine et ses protéines associées
sont alors exprimées au sarcolemme dans ces fibres (Karpati et Pouliot, 1989), figure
2.4. Le groupe de Partridge fut le premier à démontrer qu’à la suite d’une transplantation de myoblastes sains chez la souris mdx, les fibres hybrides nouvellement formées
exprimaient la dystrophine (Partridge et al, 1989). Suite à ces résultats, plusieurs essais
cliniques ont été effectués chez l’humain (Huard, 1992; Gussoni et al., 1992; Karpati et
al, 1993; Tremblay et al, 1993). Les résultats n’étaient pas aussi prometteurs que chez la
souris puisque seulement 10% des fibres des muscles greffés exprimaient la dystrophine.
Ce résultat décevant est attribuable à trois facteurs limitant de la thérapie cellulaire :
la faible migration des cellules injectées suite à l’injection, la mort cellulaire précoce des
myoblastes injectés et le rejet immunitaire des myoblastes exprimant la dystrophine en
absence d’immunosuppression. Figure 2.5.
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
14
FIGURE 2.4 – Transplantation de myoblastes. (1) D’abord, on pratique une biopsie sur un tissu musculaire d’un donneur sain. (2) Représentation d’une fibre musculaire
formée de plusieurs myotubes. (3) Autour de ces myotubes, se trouvent les cellules satellites qui sont des cellules mononucléés et qui participent à la régénération musculaire.
Ces cellules provenant de la biopsie sont mises en culture in vitro pour les faire proliférer
(4) et par la suite sont greffées chez un patient dystrophique (5). La coupe histologique
en (6) représente un marquage à la β-Galactosidase sur un muscle de singe greffé avec
des cellules exprimant LacZ. Image adaptée de Tremblay et Skuk (2001).
a] Faible migration des myoblastes greffés
L’un des problèmes limitant le succès de la greffe de myoblastes est la faible migration des cellules injectées à partir de leur site d’injection (Mendell et Kissel, 1995; Skuk
et Tremblay, 2000). Chez la souris, les myoblastes migrent entre 2, 6 − 9, 5 × 105 µm2
d’un site d’injection 4 jours suivant l’injection (Ito et Hallauer, 1998). Ce problème est
contourné en effectuant des trajectoires d’injection à tous les millimètres, permettant
ainsi une bonne distribution des cellules à travers le muscle (Skuk et Goulet, 2006,
2000, 2002; Skuk et Roy, 2004). En effet, l’injection de myoblastes en suivant des trajectoires séparées par 1 millimètre a permis d’obtenir un succès de greffe de myoblastes
de 60% chez le singe (Skuk et Goulet, 2002). La migration limitée des myoblastes peut
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
15
être due à leur incapacité à franchir la matrice extracellulaire présente entre les fibres
musculaires. En effet, la motilité des myoblastes est très affectée par la nature et la composition de la matrice extracellulaire (Yao et Ziober, 1996). Il existe différents agents
capables de modifier la matrice extracellulaire parmi lesquels on connait les métalloprotéinases capables de digérer la matrice extracellulaire. Ainsi, certaines études ont
montré que le prétraitement des myoblastes par un inducteur de métalloprotéinases
avant leur transplantation, améliore leur dispersion à travers le muscle par un facteur
de trois suite à leur injection (Ito et Hallauer, 1998). D’autre part, il a été démontré
que la co-injection de facteurs de croissance tels que l’IGF-1 (Insulin-like growth factor
1) et le MGF (Mechano-Growth Factor), permettait d’augmenter la capacité migratoire des myoblastes in vivo (Lafreniere et Mills, 2004) du fait qu’ils sont capables de
réguler positivement le système protéolytique (Allen et Teitelbaum, 2003). L’utilisation
d’autres facteurs motogéniques comme l’IL-4 représente aussi un bon moyen pour stimuler la migration intramusculaire des myoblastes injectés à partir du site d’injection
(Lafreniere et Mills, 2006). Figure 2.5.
b] La mort précoce des myoblastes greffés
Des résultats obtenus par plusieurs équipes ont montré que la majeure partie des
myoblastes greffés, de 70% à 95%, meurent durant les 3 à 4 jours suivant la greffe (Huard
et Acsadi, 1994; Fan et Maley, 1996; Guerette et Skuk, 1997; Merly et Huard, 1998;
Beauchamp et Morgan, 1999). De nombreuses études tentent d’identifier les différents
facteurs responsables de cette mort précoce des myoblastes in vivo. À ce sujet, il a été
démontré que la réponse inflammatoire médiée par les neutrophiles est responsable de la
mort des myoblastes (Guerette et Skuk, 1997). Cette mort peut aussi être causée par les
leucocytes infiltrant le muscle (Guerette et Asselin, 1997). Cependant, l’administration
d’agents anti-inflammatoires n’ont pas permis la réduction de la mort des myoblastes,
alors que la modification génétiques des myoblastes pour qu’ils expriment la protéine
anti-inflammatoire « Transforming Growth Factor-β1 » (TGF-β1 ) a permis de réduire
la mort des myoblastes de 20% (Merly et al., 1998). De plus, l’administration d’un anticorps contre un récepteur lymphocytaire, le “lymphocyte function-associated antigen
1” (LFA-1) a montré une diminution de la mortalité des cellules greffées (Guerette et
al, 1997). Le prétraitement et la coinjection de tubulysine, un facteur antiapoptotique,
ainsi que l’induction d’un choc thermique aux cellules avant la greffe améliorèrent la
survie des cellules (El Fahime et al, 2003; Bouchentouf et al., 2004). Figure 2.5.
c] La réponse immune de l’hôte
Le rejet de la greffe par le système immunitaire constitue un obstacle majeur face à
la transplantation de myoblastes. Suite à une transplantation sans immunosuppression
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
16
chez des patients DMD et des souris mdx, on a noté la présence d’anticorps dirigés
contre la dystrophine (Huard, 1992; Roy et al., 1993). Des lymphocytes infiltrants ont
été aussi observés chez le singe une semaine après la greffe (Skuk et al, 1999, 2002).
Les lymphocytes entraînent la lyse des fibres qui dérivent du donneur mais endommagent aussi le muscle en relâchant certaines cytokines (Wernig et Irintchev, 1995). Une
immunosuppression adéquate est donc essentielle. Figure 2.5.
Le rejet immunitaire des myoblastes transplantés est empêché soit par l’utilisation
d’immunosuppresseurs, soit par l’induction d’une tolérance immunologique. Dans le
cadre des immunosuppresseurs, les meilleurs résultats étaient obtenus avec le Tacrolimus
ou le FK506 (Lochmuller et al., 1996; Skuk et Goulet, 2000) que ce soit chez la souris
(Kinoshita et Vilquin, 1994) ou chez le singe (Kinoshita et al., 1996). Cependant, il
a été rapporté qu’un traitement prolongé avec des immunosuppresseurs entraîne une
neurotoxicité et une néphrotoxicité (McDiarmid et al., 1995). En plus, l’immunosuppression n’est pas spécifique et affecte le système immunitaire en entier, ce qui augmente le risque de maladies infectieuses et de cancer. Pour remédier à ces problèmes,
des protocoles d’induction de tolérance immunitaire, un état d’insensibilité du système
immunitaire vis-à-vis des cellules greffées, sont en cours de développement. Il existe
deux types de tolérance immunitaire : la tolérance périphérique et la tolérance centrale.
La tolérance périphérique consiste à moduler des cellules présentes dans les organes
lymphoïdes secondaires. Cependant, ce type de tolérance n’est pas permanent. Alors
que la tolérance centrale consiste à moduler les cellules au niveau du thymus, lieu de
l’éducation lymphocytaire, donc elle est permanente. Il existe de nombreux protocoles
chez la souris qui permettent d’obtenir une tolérance centrale basée sur le développement d’un chimérisme hématopoïétique. Le chimérisme hématopoïétique est un état
dans lequel des cellules souches hématopoïétiques provenant de la moelle osseuse de
deux animaux génétiquement différents coexistent. Le développement de chimérisme
nécessite une myéloablation (destruction partielle ou complète des cellules de la moelle
osseuse du receveur) avant la greffe pour permettre le repeuplement de la moelle par
les cellules du donneur. Des essais de transplantation de moelle osseuse chez la souris
ont réussi à développer un chimérisme chez la receveuse suite à une transplantation de
moelle osseuse du donneur. Ce chimérisme a permis la tolérance vis-à-vis la transplantation d’organes provenant de ce même donneur (Pelot et al, 1999; Sharabi et Sachs,
1989; Tomita et al, 1989). D’autres approches non-myéloablatives, moins toxiques, sont
en développement pour induire un chimérisme hématopoïétique chez l’humain.
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
17
FIGURE 2.5 – Facteurs limitant la greffe de myoblastes. (1) Représentation
d’une greffe de cellules myogéniques exprimant le gène LacZ. On distingue très bien
les différentes trajectoires d’injection et on remarque que les cellules migrent très peu
en dehors de ces trajectoires. (2) Marquage à l’alizarin rouge qui marque le calcium
intracellulaire démontrant la mortalité des cellules suite à une greffe (2a). Des cellules
inflammatoires, comme les neutrophiles, pourraient être responsables en partie de cette
mort accrue (2b). Une petite partie des cellules greffées prolifèrent et contribuent à la
réparation des fibres musculaires (2c). (3) Un marquage à l’hématoxyline (mauve) et
l’éosine (rose) montre l’infiltration par les lymphocytes du receveur d’un muscle de singe
greffé. Le singe n’avait reçu qu’une faible dose d’immunosuppresseur. Image adaptée de
Tremblay et Skuk (2001).
2] Thérapies par l’utilisation de cellules souches
L’utilisation de cellules de la moelle osseuse pour former du tissu musculaire a
récemment soulevé un grand intérêt. Des résultats obtenus par l’équipe de Gussoni
(Gussoni et Soneoka, 1999) ont montré la capacité des cellules souches provenant de
la moelle osseuse de migrer de la circulation sanguine vers les sites de régénération du
muscle pour former des fibres dystrophine positives. De plus, l’injection de cellules de la
moelle osseuse directement dans le muscle a permis la production de fibres musculaires,
à un taux plus faible cependant, que l’injection de cellules d’origine musculaire (Ferrari
et al., 1998).
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
18
En effet, suite à la transplantation de cellules de moelle osseuse chez un enfant
immuno-déficient, il a été rapporté que des noyaux du donneur se sont retrouvés dans
les fibres du patient (Gussoni et al., 2002). Cette même étude a permis de mettre en évidence la capacité de ces cellules à restaurer la dystrophine chez les enfants transplantés
mais avec un taux très faible (0.5 − 0.9%). Cependant, le faible taux de migration des
cellules de la moelle osseuse aux muscles ne permet pas d’envisager cette application
comme traitement des dystrophies musculaires.
Thérapie génique
La thérapie génique consiste à restaurer l’expression normale d’un gène d’intérêt à
l’intérieur d’une cellule. Dans le cas de la dystrophie musculaire de Duchenne, le gène
d’intérêt est le gène de la dystrophine et le but thérapeutique est de faire exprimer
cette protéine à l’intérieur des fibres musculaires. Pour ce faire, il existe différentes
approches permettant d’agir sur différents niveaux. D’une part, il est envisageable d’introduire le gène fonctionnel. Différentes approches existent pour l’introduction du gène :
les approches virales et les approches non-virales. D’autre part, il est maintenant possible de modifier l’ARN messager à partir du transcrit primaire. En effet, l’utilisation
d’aminoglycosides permet à la machinerie traductionnelle de passer outre un codon stop
prématuré causant ainsi la production d’une dystrophine fonctionnelle.
1] Introduction du gène de la dystrophine
Plusieurs vecteurs permettent d’introduire le gène normal de la dystrophine et ils
sont classés dans deux catégories : vecteurs viraux et vecteurs non-viraux.
a] Approches non virales
Les approches non-virales consistent à véhiculer un gène en utilisant un ADN nu sous
forme de plasmide. L’injection de plasmides contenant le gène de la dystrophine dans le
muscle de la souris dystrophique a permis d’observer seulement 1% de fibres exprimant
la dystrophine (Acsadi et al., 1991). Les résultats d’un essai clinique de phase I dans 9
patients atteints de DMD ou de la dystrophie musculaire de Becker (BMD) ont cependant montré des succès limités (Romero et Braun, 2004). En effet, seulement 6% des
fibres des patients exprimaient la dystrophine après deux injections de 600µg de plasmide. Suite à ces résultats décevants, on tente d’améliorer l’efficacité de la transfection
des plasmides par l’application d’un courant électrique au niveau du muscle (Aihara et
Miyazaki, 1998; athiesen, 1999). Le transfert de plasmide contenant un gène rapporteur
par électroporation à l’intérieur des muscles de souris mdx a entraîné l’expression de la
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
19
dystrophine dans 40% des fibres musculaires sur une durée de 10 semaines en présence
d’immunosuppresseurs (Vilquin et Kennel, 2001). Cependant, cette méthode reste très
invasive. Une approche alternative plus efficace pour l’introduction d’un gène consiste
à utiliser des vecteurs viraux.
b] Approches virales
Plusieurs types de vecteurs viraux ont été utilisés. Les adénovirus furent les premiers vecteurs viraux utilisés chez la souris mdx afin d’insérer une version tronquée de
la dystrophine (Amalfitano et Parks, 2002). L’immunogénicité des adénovirus, l’absence
d’intégration dans le génome des transgènes qu’ils contiennent et la grosseur limitée du
transgène limitent cependant leur utilisation. Les adénovirus « helper-dependent » et
les virus associés à l’adénovirus (AAV) ont permis de réduire en partie ces problèmes.
Les AAV, en particulier, provoquent une réponse inflammatoire et immunologique
plus faible que l’adénovirus, mais possède une capacité d’encapsidation plus petite.
Ils représentent pour le moment des vecteurs de choix (Wang et al, 2007; Goyenvalle et
al, 2004).
En effet, ils sont capables de transduire le tissu musculaire et d’entraîner une expression soutenue du transgène avec une réaction immunologique réduite, du moins chez la
souris (Xiao et Li, 1996). De plus, certains sérotypes ont un tropisme plus élevé pour
le tissu musculaire (AAV-6) (Ghosh et al., 2006).
Ainsi, dans le cadre de la dystrophie musculaire, l’injection intramusculaire de virus
de type AAV codant pour la mini-dystrophine (Wang et Li, 2000; Watchko et al.,
2002) ou la micro-dystrophine (Fabb et Wells, 2002) chez la souris mdx a entrainé une
amélioration de la pathologie.
2] Ignorer le codon stop (le « read through » du codon stop)
Environ 13% des cas de DMD sont causés par une mutation non sens qui résultent
en un codon stop prématuré (Welch et al., 2008). Il existe plusieurs molécules comme la
gentamicine et le PTC124 qui permettent d’incorporer un acide aminé (aa) au niveau
du codon stop, ce qui permet au ribosome d’ignorer le codon stop et donc de produire
une dystrophine complète.
a] La gentamicine
La gentamicine est un antibiotique de la famille des aminoglycosides. Cet antibiotique interfère avec la machinerie traductionnelle de la cellule à la rencontre d’un codon
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
20
stop (Singh et al., 1979; Palmer et al., 1979; oshizawa et al., 1998). Le rôle de la gentamicine est d’introduire un acide aminé au niveau du codon stop ce qui permet à la
machinerie traductionnelle de continuer la traduction de l’ARNm (Kaufman, 1999; Aurino et Nigro, 2006). Une approche thérapeutique utilisant la gentamicine fut testée chez
la souris mdx, le résultat montrait une augmentation jusqu’à 20% de fibres dystrophines
positives (Barton et al, 1999). Suite à ces résultats, deux études cliniques furent menés
sur des patients DMD et BMD mais les résultats furent mitigés (Wagner et al, 2001;
Politano et al, 2003). Étant données la variabilité de son efficacité et de sa toxicité,
la gentamicine pourrait être remplacée par une nouvelle molécule plus prometteuse, le
PTC124.
b] Le PTC124
Le PTC124 est une molécule récente permettant le ‘read through’ du codon stop et
ayant le même principe d’action que la gentamicine (genetic disorders). Elle possède
une efficacité comparable à celle de la gentamicine, soit 20 à 25% d’augmentation de
fibres dystrophine-positives chez les mdx traitées (Welch et al, 2007). Des essais cliniques
de phase II furent commencés sur des patients DMD et BMD avec le PTC124, mais en
date du 3 mars 2010, les 3 essais en cours furent interrompus et seul l’un d’entre eux
pourrait hypothétiquement reprendre (clinicaltrials).
3] Modification de l’ARN messager
Le but de cette approche potentielle est de réparer l’ADN des patients DMD sans
remplacer la dystrophine d’une manière exogène (Mann et al., 2001). En effet, la DMD
est due à une mutation, dans la plupart des cas une délétion, qui change le cadre de
lecture du gène (Koenig et Beggs, 1989), induisant ainsi un codant stop prématuré
aboutissant à la formation d’une dystrophine non-fonctionnelle. En fait, dans la dystrophie musculaire de Becker, une forme moins sévère de dystrophie, les délétions dans le
gène dmd n’entraînent pas un décalage dans le cadre de lecture et induisent la formation d’une dystrophine tronquée mais fonctionnelle. De ce fait, on a pensé que le fait de
contrôler l’épissage du gène de la dystrophine, en retirant de l’ARN messager les exons
avant ou après la mutation, une forme courte de la dystrophine pourrait être exprimée,
ce qui permettrait de convertir le phénotype DMD en phénotype moins sévère BMD.
Dans le but de contrôler l’épissage du gène et de corriger la mutation, on a recourt à
des oligoribonucléotides antisens (AON). Il s’agit d’un ARN simple brin court constitué
de 20 à 30 nucléotides dont la séquence est complémentaire à celle de l’exon à retirer pour
rétablir le cadre de lecture normal. Il existe présentement deux types d’AON utilisés,
les 2’O-methyl-phosphorothioates et les morpholinos (Gebski et al, 2003; Heemskerk
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
21
et al, 2009), figure 2.6. Ces modifications sur les oligonucléotides leur permettent de
ne pas être dégradés aussi rapidement que le serait l’ARN ou l’ADN. En effet, l’AON
se lie à la séquence cible et empêche sa traduction, l’exon est donc sauté et le cadre
de lecture normal est rétabli. Cette technique a permis de rétablir la production d’une
forme tronquée, mais fonctionnelle de dystrophine chez des souris (Mann et Honeyman,
2002; Lu et Mann, 2003) et dans des cellules de patients humains (Aartsma-Rus et
Janson, 2003; Aartsma-Rus et Kaman, 2004), figure 2.7.
Une étude menée chez la souris mdx montre qu’une simple injection intramusculaire
d’ONAs a permis la restauration de l’expression de la dystrophine tronquée dans 23%
des fibres. L’injection systémique est aussi possible et permet de restaurer la dystrophine
dans les muscles difficiles d’accès comme le diaphragme (Lu et Mann, 2003). Une autre
étude menée chez la souris mdx montre que deux semaines après l’injection intraveineuse
d’ONAs morpholino, l’expression de la dystrophine a été détectée dans tous les muscles
squelettiques, incluant le diaphragme, les muscles intercostaux et abdominaux (Alter
et al., 2006). Une troisième étude, aussi chez la souris mdx, montre que des injections
intraveineuses hebdomadaires sur une durée de 7 semaines résultent en la restauration
de la dystrophine tronquée dans 70% des fibres (Fletcher et al., 2007).
Au vue de ces résultats, un essai clinique fut réalisé sur 7 patients dystrophiques
dans le but d’épisser l’exon 51 afin de rétablir le cadre de lecture de leur dystrophine.
Le morpholino fut injecté de façon intramusculaire et des biopsies furent effectuées 3
à 4 semaines après le traitement. Le muscle injecté avec la forte dose d’AO montrait
une augmentation de l’expression de dystrophine au niveau de la trajectoire d’injection
d’environ 60% et plus loin dans le muscle d’environ 20% ; aucun signe de toxicité ne fut
décelé.
Cependant, cette approche est limitée par la stabilité des AONs. En effet, avec
une demi-vie variant entre deux et quatre mois, il a été démontré que les effets des
AONs diminuent rapidement (Lu et Mann, 2003). Il est donc indispensable d’effectuer
fréquemment des injections d’AON (Lu et Mann, 2003; Rando, 2007). La seule façon
de remédier à ce problème serait d’utiliser un vecteur viral pour maintenir l’expression
des AONs (Denti et al., 2006; Goyenvalle et al, 2004; De-Angelis et al., 2002).
De plus, cette therapie est limitée par la variabilité des mutations possibles. Il faut
donc construire autant d’AONs qu’il y a de mutations, ce qui fait que cette thérapie
est inapplicable en abscence de diagnostique moléculaire précis et systématique pour
chaque patient afin de synthétiser des AONs spécifiques pour la mutation en question.
De point de vue immunitaire, le saut d’exon pose un dilemme. En fait, le saut
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
22
d’exon mime un phénomène tout à fait naturel chez les patients DMD qui induit la
production de fibres musculaires dystrophine-positives appelées « fibres révértantes » .
Ces rares fibres résultent d’un phénomène d’épissage alternatif spontané au niveau de
l’ARNm qui corrige la mutation d’origine et restaure le cadre de lecture normal ce qui
permet à la machinerie traductionnelle de continuer la traduction produisant ainsi une
dystrophine tronquée mais fonctionnelle (Laws et al., 2008). De ce fait, il est possible
que l’expression de la dystrophine suite à une thérapie génique puisse déclencher une
réaction immunitaire destructive contre le « néoantigène » (Wells et al., 2002).
FIGURE 2.6 – Les principaux AONs utilisés dans le cadre de la DMD. À
gauche est représenté un schéma du 2’-O-méthyl-phosphorothioate et à droite, celui du
morpholino. R et R’ représentent la continuation de la chaine oligomérique de l’AON
en 5’ et en 3’ respectivement. Modifiée de Corey et Abrams (2001).
Chapitre 2. La dystrophie musculaire de Duchenne
23
FIGURE 2.7 – Saut d’exon médié par des oligonucléotides antisens dans la
DMD. (A) La dystrophine pleine longueur possède un domaine N-terminal liant à l’actine, un domaine central et un domaine liant le β-dystroglycan. (B) Dans le cas de la
DMD, le cadre de lecture du gène est interrompu (dans cet exemple causé par une délétion des exons 48 − 50), résultant en un codon stop prémature et donc une dystrophine
tronquée non-fonctionnelle. (C) Des oligonucléotides antisens (AONs) peuvent être employés pour restaurer le cadre de lecture normal. Des AONs spécifiques s’hybrident à
l’exon 51 et cachent cet exon de la machinerie d’epissage ce qui restaure le cadre de
lecture normal du gène. Une dystrophine tronquée à l’intérieur mais possèdant les domaines N-terminal et C-terminal, est alors formée. C’est une dystrophine partiellement
fonctionnelle. Aartsma-Rus et GERT (2007).
Chapitre 3
Le système immunitaire
3.1
Introduction à l’immunobiologie
Le système immunitaire a pour fonction de protéger l’organisme contre les éléments
étrangers et de maintenir la cohérence des cellules et des tissus qui le constituent et
d’assurer son intégrité. Ce système est capable de discriminer entre ce qui lui appartient
(le soi) et ce qui ne lui appartient pas (le non soi). Pour accomplir ce rôle, le système
immunitaire produit des facteurs moléculaires et cellulaires qui éliminent les substances
étrangères, les agents infectieux et les constituants altérés de l’organisme.
On distingue trois types cellulaires majeurs impliqués de manière active dans le système immunitaire : les lymphocytes T (LT), les lymphocytes B (LB) et les phagocytes.
Ces cellules originent de la moelle osseuse pour ensuite maturer et migrer dans différents
tissus lymphoïdes.
Les lymphocytes sont impliqués dans les mécanismes de défense spécifiques alors
que les phagocytes se partagent les défenses innées en même temps qu’elles participent
à l’induction et la régulation de la réponse immunitaire spécifique.
3.2
Lignée lymphocytaire
Les lymphocytes jouent un rôle prédominant dans la défense immune spécifique. Ils
se différencient à partir des cellules souches hématopoïétiques par un stade intermédiaire
Chapitre 3. Le système immunitaire
25
de cellules souches lymphoïdes.
3.2.1
Lymphocytes T
Les lymphocytes « T » doivent leur nom au thymus, l’organe dans lequel leur maturation s’effectue. Le recepteur des cellules T ou TCR (T cell receptor) est un recepteur
membranaire reconnaissant des peptides antigéniques présentés par la niche peptidique
de CHM (de classeI et II). Chaque LT possède un TCR unique spécifique d’un peptide
antigénique présenté par le CMH. Les TCR sont des hétérodimères composés de deux
chaînes polypeptidiques α et β ou γ et δ, ces chaînes appartiennent à la super famille
des immunoglobulines et sont liées de manière covalente par des ponts disulfures (Abbas
et al., 1991), figure 3.1. Environ 90% des LTs circulants portent des TCRs de type αβ
les autres portant des TCRs de type γδ. Le site de liaison à l’Ag au sein des TCRs est
formé de 3 régions hypervariables et se situent vers l’extrémité N-terminale. L’extrême
diversité des parties variables est générée par un réarrangement génique complexe, produisant ainsi de grandes possibilités d’affinité à différents peptides. Un seul type de
TCR est exprimé sur un lymphocyte.
Les TCRs s’associent au complexe moléculaire CD3 sur la membrane des LTs. C’est
le complexe CD3 qui est responsable de la traduction du signal provoqué par l’interaction des TCRs avec l’Ag. Les chaînes du CD3 sont responsables de la signalisation
moléculaire du TCR, menant à l’activation du lymphocyte. Chacune des chaînes du
CD3 possède des sites de phosphorylation de tyrosines au niveau intracellulaire (ITAM,
immunoreceptor tyrosine-based activation motif). Ces ITAM servent de substrat pour
des kinases de la famille Src (Lck et Fyn). Il se déclenche alors une cascade complexe
d’activation de différentes enzymes.
L’affinité de la liaison du TCR avec le CMH est insuffisante pour générer une activation du lymphocyte T. Les molécules CD4 et CD8 sur les lymphocytes viennent
stabiliser et renforcer la liaison TCR-CMH. Ces molécules interagissent respectivement
avec le CMH de classe II ou de Classe I et participent à la transduction du signal
activateur via le CD3.
Chapitre 3. Le système immunitaire
26
FIGURE 3.1 – Récepteur d’une cellule lymphocytaire de type T et ses sous unités
membranaires.
Maturation des lymphocytes T
Les lymphocytes T quittent la moelle osseuse pour migrer vers le thymus afin de
maturer. Ces cellules s’appellent prothymocytes ou thymocytes corticaux. À ce stade,
les prothymocytes n’expriment pas de molécules de surface telle que CD4 ou CD8, ils
vont passer une première phase de maturation en lignée lymphocytaire. Ils vont interagir
avec un réseau de cellules épithéliales dans le cortex thymique, ce qui leur permettra
d’acquérir certaines molécules de surface spécifiques aux lymphocytes T. Après ce stade,
les cellules sont appelées thymocytes « doubles négatifs » puisqu’elles n’expriment pas
encore le complexe CD3/TCR et le co-récepteur CD4 ou CD8. Ensuite, les thymocytes
« doubles négatifs » se sub-divisent selon leur expression des molécules CD25 (récepteur
de l’IL−2), CD44 (molécule d’adhésion) et c-kit (récepteur du « stem cell factor » ).
Lorsque les thymocytes expriment CD44 et CD25, les gènes codant pour la chaîne β
du TCR se réarrangent pour être exprimée. Les cellules qui échouent ce réarrangement
meurent, alors que les cellules qui réussissent et produisent une chaîne β fonctionnelle,
survivent et perdent l’expression de CD25. La chaîne β s’assemble avec une chaîne α
substitut pour former le pré-récepteur T (pré-TCR), accompagné du CD3. L’assemblage
CD3/pré-TCR engendre une prolifération et l’expression des molécules CD4 et CD8,
ce sont les thymocytes « doubles positifs »L̇orsque la prolifération s’arrête, les gènes
codant pour la chaîne α se réarrangent et cette chaine α est exprimée à la surface
avec la chaîne β, formant ainsi un TCR fonctionnel. Par la suite, ces cellules « doubles
positives » font l’objet de sélections positive et négative pour finalement former des
thymocytes matures simple positif CD4+ /CD8− ou CD8+ /CD4− , figure 3.2.
Chapitre 3. Le système immunitaire
27
FIGURE 3.2 – Développement et maturation des lymphocytes T au niveau thymique
(Goldsby et al., 2000).
1] La sélection positive
La sélection positive est une étape de maturation durant laquelle les lymphocytes
T sont exposés aux molécules de CMH de classe I et II présentées par les cellules épithéliales du cortex thymique. Cette sélection est nécessaire pour induire une réponse
immunitaire restreinte aux molécules du CMH. Suite à cette exposition, seuls les lymphocytes interagissant avec le CMH de classe I et le CMH de classe II vont recevoir un
« signal de survie »L̇es thymocytes qui ne se lient pas aux CMH mourront par apoptose
dans les jours suivant. Leurs débris seront alors phagocytés par les macrophages du
thymus.
L’avenir des thymocytes est également déterminé par l’étape de sélection positive
qui permet de différentier les lymphocytes en CD4+ ou CD8+ . Les thymocytes doublespositifs (CD4+ /CD8+ ) interagissant avec un CMH de classe II deviendront des lymphocytes T CD4+ , alors que ceux interagissant avec un CMH de classe I vont maturer
Chapitre 3. Le système immunitaire
28
pour devenir des lymphocytes T CD8+ . La plupart des lymphocytes (> 95%) ne survivront pas à ce processus de sélection positive. Les thymocytes sélectionnés positivement passent ensuite à la médulla, où ils subiront la sélection négative. Figure 3.3
2] La sélection négative
Dans la zone médullaire, les thymocytes sont à nouveau exposés à des molécules de
CMH complexées avec des peptides du soi. Ces complexes CMH-peptide sont présentés
par des cellules présentatrices d’antigène (CPA) comme les macrophages et les cellules
dendritiques. Les affinités entre les TCR et les CMH peuvent varier de faible à forte. La
sélection négative permet la discrimination entre les différentes affinités. Elle élimine
ainsi les thymocytes qui réagissent fortement aux interactions entre leur TCR et un
CMH présentant un peptide du soi. Cette sélection est importante pour développer
une tolérance au soi. Les LTs interagissant faiblement avec le complexe CMH-peptide
sont aussi éliminés. La grande majorité des thymocytes meurent durant ce processus.
Seuls les LTs ayant une affinité intermédiaire avec le complexe CMH-peptide du soi
survivent. Les mécanismes précis de la sélection négative ne sont pas encore connus,
mais les cellules meurent par apoptose.
Une fois ces deux sélections terminées, les lymphocytes T sont de petite taille et en
état de repos. Ils se retrouveront dans le système immun périphérique et migreront dans
les organes lymphoïdes secondaires où ils pourront effectuer leur tâche de reconnaissance
des antigènes étrangers. Figure 3.3.
Chapitre 3. Le système immunitaire
29
FIGURE 3.3 – Proportion des lymphocytes T survivant une sélection thymique selon
leur affinité TCR-CMH.
3.2.2
Lymphocytes B
Les lymphocytes B jouent un rôle majeur dans la réponse immunitaire humorale. Ils
produisent des anticorps spécifiques aux antigènes et jouent le rôle de CPA pour activer
une réponse immune contre des protéines solubles.
Le récepteur des lymphocytes B (BCR)
Le récepteur des lymphocytes B est composé d’une immunoglobuline (Ig) transmembranaire et de deux hétérodimères liés par des ponts disulfures appelés Ig−α /Ig −β.
Les chaînes Ig−α et Ig−β possèdent une longue queue cytoplasmique qui leur permet
d’interagir avec des molécules de signalisation intracellulaire.
Les immunoglobulines (Ig) Les immunoglobulines, appelées aussi anticorps, sont
les principaux acteurs de la réaction humorale. Ces molécules sont produites par les LBs.
Les immunoglobulines sont constituées de quatre chaînes peptidiques : deux chaînes
légères identiques de 25 kDa et deux chaînes lourdes identiques de 50 kDa et plus.
Chapitre 3. Le système immunitaire
30
Chaque chaîne légère est liée à une chaîne lourde par des ponts disulfures. Enfin les deux
chaînes lourdes sont également reliées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne
contient des régions constantes et des régions variables. Les régions variables sont constituées d’environ 110 acides aminés et sont différentes pour chaque LB. Généralement,
un LB ne produit qu’un seul type d’Ig spécifique. À l’intérieur des régions variables se
retrouvent les régions hypervariables. Il existe trois de ces régions par chaîne lourde et
légère et elles constituent de 15 − 20% du domaine variable. Les régions hypervariables
sont les portions des Igs qui lient les Ags, figure 3.4.
FIGURE 3.4 – Schéma d’une immunoglobuline. C : parties constantes, V : parties
variables (Goldsby et al., 2000).
Maturation des Lymphocytes B
Cette étape a lieu dans la moelle osseuse. Durant cette étape, une cellule souche
lymphoïde se transforme en cellule B mature exprimant IgM et IgD membranaires
(Révillard, 2001). D’abord, ces cellules souches se différencient en cellules progénitrices
de la lignée des lymphocytes B, appelées pro-B. Ces cellules expriment le CD45R, une
tyrosine phosphatase (appelée également B220 chez la souris). Afin de passer du stade
pro-B au stade pré-B, ces cellules necessitent une interaction avec les cellules stromales.
Les cellules stromales de la moelle osseuse jouent deux rôles importants : interaction
directe avec les Pro et Pré-B et sécrétion de cytokines, comme l’IL−7, nécessaires au
processus de développement. Les intéractions membranaires des cellules pro-B avec les
cellules stromales impliquent des molécules d’adhésion telles que le VLA−4 (Very Late
Antigen-4) et VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1) (présentes respectivement
sur les cellules B et les cellules stromales). Suite à ces contacts cellulaires, les cellules
Chapitre 3. Le système immunitaire
31
pro-B expriment alors un récepteur appelé c-kit. Le ligand de ce récepteur est le SCF
(stem cell factor). C-kit est une tyrosine kinase et son activation déclenche la prolifération et la différenciation des cellules pro-B en pré-B. Pour achever leur maturation,
les lymphocytes B doivent exprimer le récepteur à l’IL−7. La sécrétion d’IL−7 par les
cellules stromales est indispensable à la maturation des cellules pré-B. Le récepteur à
l’IL−2 (CD25) est alors exprimé ainsi que le récepteur des lymphocytes Pré-B résultant d’un réarrangement génique codant pour la chaîne lourde des immunoglobulines.
Ensuite, un réarrangement génique des chaînes légères des immunoglobulines conduit à
l’expression d’une IgM complète à la surface de la cellule qui devient alors un lymphocyte B immature. Ce lymphocyte B immature subira une sélection négative par l’Ag.
Si un lymphocyte B immature ne réagit contre aucun antigène du soi, la cellule est
sauvée et elle poursuivra sa différenciation. Par contre, si les LBs immatures reçoivent
un signal par leur BCR dû à une interaction avec un Ag du soi, alors quatre possibilités peuvent survenir : la mort par apoptose, la production d’un nouveau récepteur
réarrangé, l’induction d’un état de non-réponse permanente aux antigènes (anergie) et
l’ignorance, figure 3.5.
La cellule B immature subira une délétion clonale par apoptose en réagissant aux
antigènes du soi par plusieurs récepteurs simultanément. Néanmoins, la cellule B immature peut encore réarranger sa chaîne légère et exprimer un nouveau récepteur à sa
surface, qui pourrait être non réactif au soi, on parle alors de « receptor editing » . Si
la cellule B immature reçoit un faible signal par son récepteur, causé par une réactivité
de faible valence (cas des antigènes solubles), elle devient alors inactive et ce de façon
permanente (anergie). Ces cellules migrent aux organes lymphoïdes secondaires, mais
mourront relativement tôt, dû à leur incapacité de s’activer, même en présence d’aide
par les cellules CD4+ . Finalement, les LBs immatures possédant une faible affinité
aux antigènes du soi resteront en état d’ignorance face à leur antigène (ignorance).
Néanmoins, ces cellules ignorantes pourraient être impliquées dans le développement
de maladies auto-immunes s’activant contre un antigène du soi lors de circonstances
particulières, figure 3.5.
Chapitre 3. Le système immunitaire
32
FIGURE 3.5 – Maturation des lymphocytes B. Lors de la première stimulation
antigénique, les LBs vont se transformer en plasmocytes sécrétant essentiellement des
immunoglobulines de types M. Lors de la deuxième stimulation antigénique, les LBs mémoires se transforment en plasmocytes sécrétant essentiellement des immunoglobulines
de type G, A ou E selon la nature de la stimulation (Révillard, 2001).
3.3
Cellules présentatrices d’antigènes (CPA)
Il existe deux catégories de cellules présentatrices d’antigènes : les CPA « professionnelles » et les CPA « non-professionnelles » .
Chapitre 3. Le système immunitaire
3.3.1
33
CPA « professionnelles »
Les CPA « professionnelles » possèdent trois caractéristiques qui les définient. Elles
présentent l’antigène exogène aux cellules T CD4 via les molécules du CMH de classe
II ainsi que l’antigène endogène aux cellules T CD8 via les molécules du CMH de classe
I et elles expriment des molécules de co-stimulation, qui permettront véritablement à
la réponse T de s’amplifier.
Les principales CPA permettant l’induction d’une réponse des LTs à un Ag exogène
sont les cellules dendritiques du tissu conjonctif de différents organes (coeur, foie, rein,
muscle . . . ), les dendrocytes I et II du derme et les cellules de Langerhans de l’épiderme. Ces cellules sont d’origine hématopoïétique (CD45+ ). Ces cellules présentent
constitutivement le CMH de classe I et de classe II à leur surface lorsqu’elles sont dans
leurs tissus respectifs. Puis, lors d’une stimulation par l’Ag ou par différents types de
cytokines, les CPA perdent leur morphologie dendritique et deviennent arrondies. Elles
migrent alors vers le ganglion lymphatique régional où elles vont présenter pendant
plusieurs jours les mêmes peptides d’origine exogène à un grand nombre de LTs passant
au contact de leurs prolongements dendritiques. C’est cette interaction des CPA avec
les LTs qui permet l’induction d’une réponse immunitaire T spécifique.
Il existe un autre type de CPA qui sont les cellules dendritiques folliculaires. Cependant, ces cellules ne sont pas d’origine hématopoïétique (CD45− ). Elles fixent l’Ag sur
leurs récepteurs membranaires et l’exposent de façon prolongée aux LBs dans les centres
germinatifs ganglionnaires. Cette présentation antigénique est nécessaire à la maturation des LBs qui, selon le type de signal reçu, vont se différencier soit en lymphocytes
B mémoire soit en plasmocytes qui vont secréter des anticorps circulants.
3.3.2
CPA « non professionnelles »
Les lymphocytes B peuvent dans certains cas participer à la présentation antigénique
aux LT CD4+ pour le développement d’une réponse Ac dépendant des LTs. En effet, les
LBs reconnaissent l’Ag par leurs Igs membranaires et peuvent l’internaliser. Le peptide
antigénique est alors dégradé et présenté par le CMH de classe II des LBs.
La présentation de l’Ag aux LT CD4+ peut être également assurée par des cellules
endothéliales et épithéliales exprimant des molécules de classe II du CMH après stimulation par l’IFNγ ou des mastocytes. Les LTs CD8+ , quant à eux, interagissent avec
toutes les cellules exprimant des molécules de classe I du CMH. Cette interaction induit
Chapitre 3. Le système immunitaire
34
une lyse de la CPA par cytotoxicité et/ou la synthèse de différentes cytokines (IFNγ,
TNFα).
De plus, les monocytes/macrophages peuvent par leur capacité phagocytique absorber des bactéries, parasites, levures et débris cellulaires. Puis, les peptides antigéniques
résultants de la destruction des absorbas exogènes peuvent être présentés par le CMH
de classe II aux LT CD4+ et induire une réponse T spécifique.
3.4
Le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH)
Les gènes du complexe majeur d’histocompatibilité codent pour des molécules qui
s’expriment à la surface des cellules. Ces molécules appartiennent chez l’humain au système HLA (« Human Leukocyte Antigen fg ). Ce dernier est impliqué fortement dans le
rejet des greffes inter-individus non identiques génétiquement (allogéniques). Les gènes
HLA se retrouvent sur le chromosome 6, tandis que chez la souris, les gènes codant pour
les CMH sont appelés H−2 et se retrouvent sur le chromosome 17 (Benjamini et al.,
1996). Le CMH a une organisation relativement conservée au sein des espèces animales.
Il s’agit d’un système multigénique, multiallélique, d’expression codominante. On distingue trois classes de gènes qui s’assemblent pour former des molécules différentes :
CMH de classe I, II et III. Parmis les locus du CMH de classe I, on retrouve les HLAA, B et C chez l’humain et H-2K, D et L chez la souris. Les locis du CMH de classe II
regroupent les gènes HLA-DP, DQ, DR pour l’humain et I-A, I-E chez la souris. Les
gènes des CMHs de classe III codent entre autre pour des facteurs impliqués dans le
système du complément, figure 3.6.
Les molécules des CMH de classe I sont des glycoprotéines hétérodimériques transmembranaires composées d’une chaîne α de 44 kDa et d’une chaîne légère appelée
β2 -microglobuline (β2 M, non codée par le locus CMH) de 12 kDa. La partie extracellulaire de la chaîne α est divisée en trois domaines globulaires : α1 , α2 et α3 . Les domaines
α1 et α2 servent à la liaison d’un antigène et sont des régions variables, tandis que le
domaine α3 est essentiellement conservé. La variabilité des domaines α1 et α2 permet
la liaison d’un grand nombre de peptides aux molécules de CMH, figure 3.7.
Chapitre 3. Le système immunitaire
35
FIGURE 3.6 – Les complexes majeurs d’histocompatibilité chez la souris et chez l’humain (Benjamini et al., 1996).
Les CMH de classe I sont exprimés sur toutes les cellules somatiques et leur reconnaissance est restreinte aux lymphocytes CD8+ . Les peptides, présentés par les CMHs
de classe I, sont endogènes. C’est à dire qu’ils sont généralement synthétisés à l’intérieur
de la cellule à l’instar des antigènes viraux. Ces antigènes sont découpés en peptides
par le protéasome dans le cytosol. La longueur des peptides capables de se lier à la
niche peptidique du CMH de classe I varie de 10 à 20 acides aminés. Le polymorphisme
de la niche peptidique des différents allèles génère une variation chimique permettant
ainsi différentes affinités à différents peptides. D’autres résidus polymorphiques de la
molécule de classe I forment des contacts avec les TCRs. Ainsi, les TCRs interagissent spécifiquement avec les CMHs et le peptide qu’ils présentent. Les CMH de classe
II sont composés de deux chaînes polypeptidiques non-covalentes (α et β). Ces deux
chaînes sont codées aux locus des CMH de classe II. Comme les molécules de classe I,
Chapitre 3. Le système immunitaire
36
les CMH de classe II possèdent un polymorphisme élevé et chaque allèle est exprimé en
co-dominance. Cette expression co-dominante permet l’association des chaînes α et β
des deux allèles, générant ainsi plusieurs molécules différentes pouvant être exprimées à
la surface d’une même cellule. La distribution des molécules de classe II est plus limitée
que celle de classe I. Les molécules de classe II s’expriment de manière constitutive
et seulement sur les cellules comme les LBs, les cellules dendritiques et les cellules de
l’épithélium thymique. L’ensemble de ces cellules appartenant à la famille des CPAs.
Plusieurs autres types cellulaires, dont les macrophages et les myoblastes, expriment le
CMH de classe II sous induction par des facteurs comme l’interféron-γ. Les molécules
de classe II se retrouvent également sur les LTs humains activés, mais sont absents
chez la souris. La liaison d’un CMH de classe II est restreinte à un TCR exprimé sur
les lymphocytes T CD4+ . La fonction phagocytaire des CPAs, exprimant les CMHs de
classe II, permet la présentation de peptides exogènes par ces molécules. Les particules
phagocytées par les CPAs se retrouvent dans les endosomes pour être clivées par des
protéases. Les endosomes fusionnent avec les vésicules de l’appareil de Golgi contenant
les CMHs de classe II (Abbas et al., 1991). Les CMHs de classe II se retrouvent ensuite
à la surface des CPAs pour permettre une présentation d’Ags aux lymphocytes T.
FIGURE 3.7 – La structure des CMH de classe I et de classe II (Benjamini et al.,
1996).
3.5
Immunobiologie du muscle
Dans le contexte de ce mémoire, il est intéressant d’établir un lien entre le tissu musculaire et les différents constituants du système immunitaire. En effet, le muscle peut,
dans certaines circonstances, être le terrain de réactions immunitaires. Cet état survient
dans le cas de maladies autoimmunes, d’infections, de dommages musculaires et lors
de l’application de traitements tels que les thérapies cellulaire ou génique (Dalakas et
Chapitre 3. Le système immunitaire
37
Hohlfeld, 2003; Prud’homme et al., 2001; Vincent, 2002). En plus de la participation
classique des cellules du système immunitaire dans ces réactions, le muscle devient luimême acteur de ces réponses immunitaires intramusculaires (Hohlfeld et Engel, 1994).
Ce rôle actif du muscle repose principalement sur le fait que la cellule musculaire possède
la capacité fonctionnelle d’agir, sous certaines conditions, en tant que cellule présentatrice d’antigènes (CPA) non professionnelle exprimant des molécules du CMH et de
costimulation (Nagaraju, 2001).
De plus, la capacité des myoblastes à sécréter des cytokines, des chémokines ainsi
qu’à exprimer des molécules d’adhésion cellulaires vient renforcer le degré de participation du tissu musculaire dans la réaction immunitaire impliquée dans la phase de
l’inflammation (Figarella-Branger et al., 2003; Nagaraju, 2001) (figure 3.8).
FIGURE 3.8 – Immunobiologie du muscle. Ce schéma représente toutes les
molécules exprimées ou sécrétées par un myoblaste de façon constitutive ou induite
(Wiendl et al., 2005).
Aucune expression de molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH)
n’est détectée par marquage immunohistologique dans le tissu musculaire en conditions
physiologiques (Karpati et al., 1988; Emslie-Smith et al., 1989). Il a cependant été montré que la cellule musculaire in vitro et in vivo en contexte inflammatoire exprime les
molécules du CMH de classe I et II. Les myoblastes humains expriment constitutive-
Chapitre 3. Le système immunitaire
38
ment le CMHI (HLA-A,-B,-C) (Goebels et al., 1992; Hardiman et al., 1993; Hohlfeld
et Engel, 1990; Mantegazza et al., 1991; Michaelis et al., 1993; Nagaraju et al., 1998;
Roy et al., 1991; Wiendl et al, 2000). Le niveau d’expression de ces molécules est augmenté en présence de cytokines proinflammatoires (IFNγ, TNFα, IL1−α ; 1 − β) et de
chémokines (MIP−1α). Quant à l’IFN−α, il induit l’expression du CMHII au niveau
des myotubes et des myoblastes (Goebels et al., 1992; Mantegazza et al., 1991; Michaelis
et al., 1993). In vivo, l’expression du CMH de classe I et de classe II est augmentée
en condition pathologique et plus particulièrement dans les myopathies inflammatoires
telle que la polymyosite (PM), ou encore dans la dystrophie musculaire de Duchenne
(Chen, 2004; Karpati et al., 1988; Emslie-Smith et al., 1989).
La cellule musculaire est capable d’exprimer les protéines de l’immunoprotéasome
nécessaires à la présentation de peptide antigène intracytoplasmique par le CMH de
classe I (Ferrer et al, 2004). Les cellules musculaires saines peuvent également être
reconnues par les lymphocytes T cytotoxiques (LTC) via le CMH de classe I (Hohlfeld
et Engel, 1991). La présentation des antigènes endogènes aux LTC peut donc avoir
lieu à la surface de la fibre musculaire et après activation, ces LTC peuvent provoquer
la nécrose de la fibre musculaire en relarguant des granzymes lytiques. De la même
manière, après un stimulus inflammatoire in vitro (IFN−γ) (Michaelis et al., 1993;
Goebels et al., 1992; Mantegazza et al., 1991) ou chez un patient atteint de myopathie
inflammatoire, on détecte l’expression de molécules du CMH de classe II (Inukai et
al, 2000; Kumamoto et al, 1997; Gallardo et al., 2001). De plus, il a été montré que
les cellules musculaires humaines sont équipées de toutes les molécules nécessaires à la
présentation d’antigènes sur le CMH de classe II (Inukai et al, 2000; Gallardo et al.,
2001; Wiendl et al, 2003a). Les cellules musculaires en condition inflammatoire peuvent
donc présenter des antigènes extracellulaires ou intravésiculaires (viraux, bactériens,
auto-antigènes et allo-antigènes musculaires) aux lymphocytes T CD4 via le CMH de
classe II.
Enfin, il est possible d’induire l’expression d’une molécule « non classique » du CMH
de classe I : HLA-G (Wiendl et al, 2000). Le rôle immunobiologique de ce CMH n’est
pas encore clairement connu, mais il est incontestablement impliqué dans le non-rejet
du foetus par la mère (Carosella et al., 2001; Diehl et al., 1996). Les cytokines proinflammatoires induisent l’expression de HLA-G ce qui inhibe fortement les lymphocytes
T et protège donc le muscle des dégâts induits par ces cellules.
Chapitre 3. Le système immunitaire
3.6
39
Le muscle exprime d’autres molécules participant à la réaction immunitaire
Nous avons vu que les myoblastes semblaient s’approprier un rôle de CPAs. Cependant pour être réellement efficaces, d’autres molécules doivent venir compléter leur
profil de CPAs comme les molécules de costimulation, par exemple. Les myoblastes n’expriment pas en culture les molécules de costimulation classique que sont le B7 − 1
(CD80) et le B7 − 2 (CD86) (Behrens et al., 1998; Bernasconi et al., 1998). L’IFNγ
et le TNFα ne modifient pas ce profil de non-expression. Cependant, les myoblastes
peuvent exprimer d’autres molécules de costimulation. ICOS-L « Inducible Costimulator Ligand » appartient à la famille B7. L’expression physiologique d’ICOS-L est faible
voire néant dans le muscle, mais forte en présence de TNFα, comme c’est le cas dans les
myopathies inflammatoires (Schmidt et al., 2004; Wiendl et al., 2003b). Le récepteur de
cette molécule se trouve sur les LTs activés. L’intéraction d’ICOS-L avec son récepteur
favorise la costimulation des LTs CD4 et CD8 (Greenwald et al., 2005; Wiendl et al.,
2003b). Un second membre de la famille des molécules B7, le B7-H1 est retrouvé sur les
myoblastes stimulés par l’IFNγ. À l’opposé d’ICOS-L, B7-H1 inhibe l’activation des LTs
CD4 et CD8 et réduit leur production de cytokines (Chen, 2004; Wiendl et al., 2003a).
Le CD40, autre molécule de costimulation participant à la régulation de l’activation des
LTs, est exprimé par les myoblastes humains. Son niveau d’expression dépend des concentrations d’IFNγ et de TNFα auxquels les myoblastes sont exposés (Behrens et al.,
1998; Sugiura et al., 2000).
Chez la souris, il a été observé que les fibres musculaires synthétisaient des chemokines
lors d’injection d’oligonucléotides contenant des motifs CpG non-méthylés. Ces chemokines
attirent les cellules impliquées dans la phase de l’inflammation en sécrétant entre autre
de l’IFNγ (Stan et al., 2001). Cette cytokine pousse alors les myotubes à exprimer le
CMHII et d’autres molécules impliquées dans la présentation de l’Ag. Ces résultats
sont particulièrement problématiques si nous considérons les thérapies impliquant l’injection d’ADN nu (cf chapitre des thérapies géniques). Les « toll-like receptor » (TLR)
contribuent, via leur capacité à capter des pathogènes ou des signaux endogènes du
danger, à établir un lien entre la réponse immunitaire innée et adaptative. in vitro,
les myoblastes expriment constitutivement le TLR de type 3 (Schreiner et al., 2006).
La fixation d’ADN double brin ou d’ARN double brin au TLR des myoblastes active
la cascade dépendante du NF-κB et augmente la sécrétion de nombreuses cytokines
(Schreiner et al., 2006).
Nous avons donc vu que l’inflammation joue un rôle central dans la réponse immune musculaire. Elle favorise le recrutement des CPA professionnelles qui autrement
Chapitre 3. Le système immunitaire
40
sont peu nombreuses dans le muscle et elle stimule l’expression des molécules du CMH
ainsi que des molécules co-stimulatrices des lymphocytes T à la surface des myoblastes.
Ainsi le myoblaste peut se comporter comme une CPA non professionnelle dans des
réactions immunes CMH I ou CMH II dépendantes (Goebels et al., 1992; Wiendl et
al, 2003c,b) et peut donc former in vitro une synapse immunologique avec des cellules T. L’efficacité stimulatrice de cette synapse immunologique peut être discutée,
en effet expérimentalement les CPA non professionnelles dépourvues de molécules de
co-stimulation appropriées induisent le plus souvent une tolérance (Warrens et al, 1994).
Cependant le muscle semble présenter un micro-environnement approprié où la
présentation d’antigènes et co-stimulation n’ont pas besoin d’être effectuées par les
mêmes cellules (transco-stimulation). Et même si la fibre musculaire mature exprime
moins abondamment les molécules exprimées par le myoblaste, il semblerait qu’elle
puisse participer aux réactions immunes.
Chapitre 4
Fibres révertantes et système
immunitaire
4.1
Introduction
Comme il a été mentionné dans le chapitre 2, une mutation au niveau du gène dmd
provoque, dans le cas de la DMD, l’apparition d’un codon stop prématuré empêchant la
production de la dystrophine. Mais plusieurs groupes ont rapporté la présence de fibres
dystrophine-positives chez des patients DMD (Shimizu et al., 1988; Nicholson et al.,
1989; Burrow et al., 1991; Klein et al., 1992; Nicholson et al., 1992).
Ces fibres surviennent chez plus de 50% des patients et ont été détectées au niveau
du muscle squelettique (Hoffman et al., 1990). Ce phénomène n’est pas exclusif aux
humains, il a été observé également chez la souris mdx et le chien cxmd (Sicinski et al.,
1989; Valentine et al., 1992).
La dystrophine révertante présente une localisation membranaire, comme la dystrophine normale, ce qui suggère qu’elle pourrait être fonctionnelle.
Les fibres révertantes (FR) sont détectées dans les muscles de souris mdx de tout
âge et augmentent en nombre, en taille et en longueur avec l’âge (Lu et al., 2000).
Il a été démontré que l’expansion de ces fibres dépend fortement et directement
de l’intensité des cycles de dégénération/régénération du muscle (Hoffman et al., 1990;
Yokota et al., 2006).
Chapitre 4. Fibres révertantes et système immunitaire
42
Des analyses plus détaillées ont révélé la structure des fibres révertantes présentes
chez les souris mdx. Des tests d’immunofluorescence en utilisant des anticorps spécifiques
aux régions N-terminal et C-terminal de la dystrophine montrent que ces domaines sont
exprimés dans les fibres révertantes (Thanh et al., 1995). De plus, il a été démontré que
le niveau des protéines associées à la dystrophine, telles que la β-dystroglycane, l’α et
la β-sarcoglycane et l’α-syntrophine, était rétabli et était comparable à celui des souris
C57 normales (Lu et al., 2000).
Toutefois, des anticorps spécifiques à des portions de la dystrophine codées par des
exons à proximité de la mutation mdx (mutation non-sens au niveau de l’exon 23) ne
détectent pas les fibres révertantes. Ces études suggèrent que les fibres révertantes expriment des dystrophines produites à partir de transcrits ayant subi un épissage alternatif
et manquants l’exon muté ainsi qu’un nombre variable d’exons adjacents (Lu et al.,
2000). Des formes épissées alternativement d’ARNm de dystrophine sont détectables
par RT-PCR dans le muscle dystrophique et dans le muscle normal, indiquant que le
phénomène d’épissage peut se produire quel que soit le phénotype du muscle (Lu et al.,
2000; Sherratt et al., 1993)
4.2
Mécanismes impliqués dans la restauration de
l’expression de la dystrophine dans les fibres
révertantes
Depuis leur découverte chez les patients DMD et les souris mdx, la nature des fibres
révertantes présentes dans des muscles dystrophiques a été un grand mystère. L’élucidation des mécanismes responsables de la production de la dystrophine révertante était
limitée par la faible abondance des fibres révertantes, la nature multinucléique de la
fibre musculaire ainsi que par la taille du gène de la dystrophine (Burrow et al., 1991;
Klein et al., 1992; Fanin et al., 1995).
Le saut d’exon, associé à des mutations non-sens, a été rapporté dans des gènes
comme le gène du facteur V III dans le cas de l’hémophilie A (Naylor et al., 1993),
les gènes de l’anémie de Fanconi groupe C (Gibson et al., 1993), le gène de la fibrilline
(FBN1) dans le syndrome de Marfan et le gène de l’ornithine d-aminotransférase (OAT)
dans l’atrophie gyrée (Dietz et al., 1998), le gène de la transacylase (E2) du complexe de
la chaine ramifiée a-keto déshydrogénase acide humaine dans la leucinose (Fisher et al.,
1993) et plus récemment dans le gène de la 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase (Pie
et al., 1997). Dans le gène de la dystrophine, le saut d’exon autour des mutations
Chapitre 4. Fibres révertantes et système immunitaire
43
ponctuelles a été également rapporté et il en résulte des transcrits “in-frame” et des
dystrophines raccourcies. Ces transcrits étaient étudiés chez les patients BMD (Shiga
et al., 1997; Melis et al., 1998)
En 1997, une équipe a identifié plusieurs transcrits de dystrophine, résultant d’un
épissage alternatif permettant de sauter 5 à 11 exons, incluant l’exon muté 23, dans le
muscle de souris mdx (Wilton et al., 1997). Cependant, il est difficile de déterminer si ces
transcrits d’ARNm détectés par transcription inverse (RT)-PCR, du tissu musculaire
entier, sont pertinents avec la production de dystrophine dans les fibres révertantes.
En absence de résultats les reliant directement aux fibres révertantes, ces transcrits
pourraient tout simplement être le résultat d’évènements d’épissages aléatoires de faible
niveau. Pour répondre à ces questions, la même équipe, le groupe de Partridge, a tenté
d’examiner la dystrophine dans les FRs de la souris mdx aux niveaux de la protéine,
l’ARN et l’ADN. Pour ce faire, ils ont examiné, par immunohistochimie, des coupes
de muscles sériées en utilisant une palette d’anticorps monoclonaux et polyclonaux
reconnaissant des exons spécifiques. Ceci permettait une analyse de la composition en
exons de la dystrophine révertante au sein des FRs individuelles (Lu et al., 2000).
Ils ont trouvé que la réversion de l’expression de dystrophine dans les muscles de
souris mdx utilisait des mécanismes impliquant le saut d’exon massif. Le nombre d’exons
manquants variait de quelques uns jusqu’à 30 dans différents regroupements de FRs.
Le gène de la dystrophine semble être sujet aux délétions qui comptent pour 80%
dans le cas de BMD et 64% dans le cas de DMD. Des délétions impliquant autant
que 30 exons, bien que rares, ont été rapportées (Chelly et al., 1990; Love et al., 1991;
Winnard et al., 1993). Il est donc clair qu’une mutation par délétion doit être considérée
comme cause potentielle de l’expression de dystrophine dans les FRs (Hoffman et al.,
1990; Fanin et al., 1995; Winnard et al., 1993; Thanh et al., 1995). Cependant, cette
hypothèse a été rejetée suite à une étude au niveau génomique. Cette étude a montré que
les exons codant les épitopes manquant dans la dystrophine révertante étaient détectés
au niveau génomique. Ceci exclu la possibilité qu’un mécanisme de délétion génomique
soit responsable de la production de FRs et implique un phénomène de saut d’exon
basé sur l’épissage alternatif de l’ARNm qui manque les exons en question (Lu et al.,
2000).
L’expression spontanée de la dystrophine chez les patients DMD et la souris mdx
est due alors à un phénomène de saut d’exon ou « exon skipping »Ċe phénomène a
lieu au cours de la formation de l’ARNm de la dystrophine. Il donne naissance à une
dystrophine tronquée mais fonctionnelle, manquant l’exon de la mutation ainsi que
d’autres exons adjacents qui varient d’un individu à l’autre (Lu et al., 2000).
Chapitre 4. Fibres révertantes et système immunitaire
44
Ce phénomène naturel représente un modèle pour l’étude de réversion fonctionnelle
de mutations non-sens dans le cadre de thérapie génique de la DMD.
Le profil immunitaire des FRs est encore mal connu. Plusieurs hypothèses existent
concernant l’immunogénicité de la dystrophine néoformée. Cependant, aucune étude
n’a été réalisée pour prouver ces hypothèses.
Une première hypothèse suggère que la dystrophine néoformée passe inaperçue par
le système immunitaire et donc induit une tolérance immunologique envers les FRs.
En fait, le nombre des fibres dystrophine-positives qui semble augmenter avec l’âge
pourrait appuyer cette hypothèse (Dominic et al., 2002). Si c’est le cas, une dystrophine
résultant d’une thérapie génique, comme le saut d’exon, ne serait pas considérée comme
un antigène et donc ne serait pas rejetée par le système immunitaire. Certaines études
ont montré que l’introduction du gène de la dystrophine, via un plasmide chez la souris
mdx, induisait une augmentation de l’expression de la dystrophine sans déclencher une
réponse immune (Ferrer et al., 2000; Bittner, 1994; Vilquin, 1995).
Cette tolérance pourrait être expliquée par le fait que différents isoformes de dystrophine sont exprimés dans différents tissus comme le cerveau, la rétine, les reins. . . suite
à l’activation de différents promoteurs (Nudel, 1989; Gorecki, 1992; Bakker et Van Ommen, 1998). Une autre explication est la présence des fibres révertantes qui pourrait être
responsable de l’induction d’une tolérance spécifique envers la dystrophine néoformée
et donc la dystrophine thérapeutique (Dominic et al., 2002). Cependant, les essais cliniques de transfert de myoblastes normaux chez des patients DMD n’étaient pas réussis,
bien que des fibres dystrophine-positives étaient exprimées de façon transitoire dans le
muscle injecté (Ferrer et al., 2000). Cette expression transitoire de dystrophine était
probablement due à un rejet immunitaire, ce qui est appuyé par la détection, dans
le sérum de certains patients, d’anticorps contre la dystrophine suite au transfert des
myoblastes (Tremblay et al, 1993).
D’autre part, une étude récente effectuée sur des patients DMD a montré la présence
d’une réponse cellulaire envers des épitopes de la dystrophine avant le traitement par
transfert de gène (Jerry et al., 2010). En effet, chez ces patients, des fibres révertantes
étaient détectées dans des muscles non-traités. Les lymphocytes T spécifiques pour
la dystrophine étaient surement activés par la dystrophine révertante. Comme tous
les lymphocytes T mémoires, ils participent à l’accélération du déclenchement d’une
réponse immune envers la mini-dystrophine thérapeutique.
Chapitre 4. Fibres révertantes et système immunitaire
4.3
45
La tolérance immunologique
La tolérance immunologique se définit comme étant la capacité du corps à accepter
un ou des antigènes étrangers de manière spécifique tout en restant fonctionnel à 100%.
Elle peut être « naturelle » (tolérance du soi), dans laquelle le système immunitaire n’attaque pas les antigènes du soi, ou une « tolérance induite » dans laquelle une tolérance
envers des antigènes exogènes pourrait être créée en manipulant le système immunitaire.
La tolérance survient en trois formes : centrale, périphérique ou acquise.
4.3.1
Tolérance centrale
La tolérance centrale survient au cours du développement lymphocytaire au niveau
du thymus et de la moelle osseuse. Les lymphocytes T et B reconnaissant des antigènes
du soi sont éliminés, prévenant ainsi l’autoimmunité. Ce processus est le plus actif au
stade fœtal, mais continue tout au long de la vie au fur et à mesure que des nouveaux
lymphocytes sont produits. Les processus de sélections positive et négative, responsables
du développement de la tolérance centrale, sont décrits dans le chapitre 3.
4.3.2
La tolérance périphérique
La tolérance périphérique est maintenue par des mécanismes qui agissent sur les lymphocytes matures qui ont quitté les organes générateurs et qui rencontrent les antigènes
du "soi" dans les tissus périphériques. Ces mécanismes sont très importants parce qu’il
est illusoire de penser que tous les antigènes du soi sont présentés au niveau thymique.
En effet, il arrive à l’occasion que certains lymphocytes T échappent à la sélection
thymique négative. Ainsi, sans ces mécanismes de tolérance périphérique, la prévalence
des maladies auto-immunes serait largement décuplée au sein de la population. Les mécanismes de tolérance périphérique ont été divisés en quatre groups (Lebranchu, 2004).
L’ignorance
Le principe de base de l’ignorance repose au niveau de la séquestration des cellules du système immunitaire, c’est-à-dire que les allo-antigènes ne viennent jamais en
contact avec les cellules lymphocytaires. C’est principalement lors des greffes qui ne
Chapitre 4. Fibres révertantes et système immunitaire
46
sont pas vascularisées, comme une greffe de cornée, que ce mécanisme de tolérance périphérique survient (Starzl et Zinkernagel, 2001). De plus, certaines régions sont dites
immunoprotégées à cause de l’incapacité des cellules du système immunitaire à accéder
à ces dernières comme, par exemple, les îlots de Langerhans (Duvivier-Kali, 2001).
L’anergie
L’anergie, également appelée la paralysie lymphocytaire, est une incapacité fonctionnelle des lymphocytes T naïfs activés par un antigène à proliférer (Schwartz, 1996).
Pour qu’un lymphocyte T prolifère, deux signaux sont nécessaires : celui produit par
son TCR suite à la rencontre avec l’antigène, ainsi que celui produit via la costimulation. Il a déjà été démontré que le blocage des interactions CD80−CD86/CD28 (Lin,
1993; Yamada, 1996) induisait une tolérance par anergie. Même si de manière générale
le phénomène d’anergie survient lors de l’absence d’un des signaux de costimulation,
certaines études ont démontré qu’une liaison de faible affinité avec le TCR pouvait
également engendrer l’anergie (Sloan-Lancaster et al., 1996).
La délétion clonale par apoptose
La délétion clonale par apoptose est un mécanisme naturel qui survient vers la fin
d’une réaction immunitaire. Le principal but de cette délétion est d’éliminer le surplus de
lymphocytes T activés une fois la menace neutralisée. Cette délétion clonale peut se faire
de manière passive via une privation ou un épuisement des facteurs de croissance tels
l’IL−2, l’IL−4, l’IL−9, l’IL−15, l’IL−21. En effet, ces interleukines sont responsables
de l’activation de divers facteurs anti-apoptotiques tels le Bcl-2 et le Bcl-xl (Petschner,
1998). En l’absence de ces derniers, l’apoptose est déclenchée via une signalisation
intracellulaire. La délétion clonale par apoptose est également provoquée de manière
active via la fixation de l’IL−2 à son récepteur, ce qui déclenche le phénomène de
mort induite par l’activation cellulaire (AICD, activation-induced cell death) (Lechler
et al., 2003). En effet, 1’IL−2 engendre l’expression de CD178 (FasL) au niveau de la
membrane cellulaire des lymphocytes qui, en se liant à CD95 (Fas), présent également
sur la membrane, active la voie des caspases menant à l’apoptose (Li et al, 2000).
Chapitre 4. Fibres révertantes et système immunitaire
47
La suppression par régulation negative
Le concept de régulation négative effectuée par une sous population lymphocytaire a
été abordé sérieusement pour la première fois dans les années 1970. Ces cellules étaient
alors appelées lymphocytes T suppresseurs (Gershon et Kondo, 1970). Ces lymphocytes
supresseurs sont aujourd’hui appelés lymphocytes régulateurs ou Treg. Ce sont des
lymphocytes CD4+ CD25+ qui ont pour rôle de réguler négativement l’activation du
système immunitaire, prévenant ainsi le développement de pathologies de réactivité au
soi comme les maladies auto-immunes.
Chapitre 5
Etude du profil immunogénique de
la dystrophine révertante
5.1
5.1.1
Problématique, hypothèses et objectifs
Problématique
Jusqu’à aujourd’hui, aucune étude sur l’immunogénicité des fibres révertantes présentes
dans les souris mdx n’a été conclusive. En fait, plusieurs hypothèses contradictoires ont
été proposées à ce sujet.
5.1.2
Hypothèse
Notre hypothèse est que les fibres révertantes sont probablement immunogènes et
ne demeurent pas inaperçues par le système immunitaire.
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
5.1.3
49
Objectifs
Objectif général
L’objectif général de notre étude est de vérifier si les fibres révertantes sont éliminées
suite à une activation du système immunitaire déclenchée par la dystrophine néoformée.
Objectifs spécifiques
Notre premier objectif est de comparer le nombre de fibres révertantes présentes
dans les muscles de souris dystrophiques immunocompétentes avec celui des souris dystrophiques immunodéficientes.
Notre deuxième objectif est d’identifier quel type d’immunité, cellulaire ou humorale,
est responsable de ce rejet.
5.2
5.2.1
Matériel et méthodes
Comparaison du nombre des fibres dystrophine-positives
entre des souris dystrophiques immunocompétentes et
immunodéficientes
Modèles murins utilisés
La souris mdx (immunocompétente) et la souris Rag/mdx (immunodéficientes) ont
été utilisées dans cette première expérience. Les souris mdx et les souris Rag ont à
l’origine été achetées chez Jackson Laboratory (Bar HArbor, ME, USA). Les colonies
ont été ensuite maintenues et reproduites à l’animalerie du CHUL. Les souris rag/mdx
ont été obtenues par croisement dans notre animalerie. Toutes les expériences ont été
menées en accordance avec le Comité de protection des animaux du Centre hospitalier
universitaire de Québec (CPA-CHUQ).
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
50
Prélèvement des muscles
Des souris mdx et Rag/mdx, de même âge (5-6 mois), ont été sacrifiées et les muscles
Tibialis antérieurs T.A. ont été prélevés et placés dans une solution de sucrose à 30%
pendant deux heures pour déshydrater le muscle avant l’étape de congélation. Pour
les congeler, les muscles ont été placés dans du Cryomatrix et plongés dans de l’azote
liquide. Ils ont été par la suite conservés à −80 ◦ C.
Les muscles ont été coupés à l’aide d’un cryostat, en sections de 11 µm.
Détection de dystrophine par immunohistochimie
Afin de bloquer les sites de fixaton non spécifiques, les lames ont été d’abords incubées dans une solution de blocage, PBS 10% FBS, pendant une heure. Ensuite, un
anticorps polyclonal de lapin contre la région C-terminale de la dystrophine (dilution
1 :3000 dans du PBS 10% FBS, anticorps polyclonal produit dans notre laboratoire)
a été appliqué sur les coupes pendant une heure. Après trois lavages au PBS, de cinq
minutes chacun, les coupes ont été incubées avec l’anticorps secondaire anti-lapin couplé
au fluorochrome Alexa 488 (greeen) ou Alexa 546 (red) (dilution 1 :300 dans du PBS
1% FBS, Molecular Probes, Eugene, OR). Après une incubation d’une heure, les lames
ont été lavées trois fois dans du PBS et montées dans du PBS-Glycérol (1 :1).
Les fibres dystrophine-positives ont été comptées en utilisant un microscope à fluorescence.
Analyse statistique
Les valeurs significatives ont été calculées en utilisant une analyse de variance
(ANOVA) avec le programme R Project for Statistical Computing. Un P < 0.05 était
considéré comme significatif.
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
5.2.2
51
Vérification de la présence d’une réponse immune cellulaire in vivo
En plus des souris mdx et Rag/mdx utilisées dans la première expérience, des souris
saines du même background génétique C57Bl/10J (10J) et des souris Rag immunodéficientes non dystrophiques ont aussi été utilisées. Pour vérifier la présence d’une réponse
cellulaire, des splénocytes provenant de souris mdx ou 10J ont été transférés chez des
Rag et Rag/mdx.
Extraction de splénocytes
Tout d’abord, les souris ont été sacrifiées selon les protocoles standards de l’animalerie et leurs rates ont été récoltées de manière stérile. Par la suite, les rates ont été
placées dans 3 mL de tampon isotonique de type HBSS (Hank’s balanced salt solution)
avant d’être broyées à l’aide d’un pilon et d’un mortier afin d’obtenir une suspension
tissulaire. Cette suspension a ensuite été épurée à l’aide d’un filtre à pores de 50 microns et les cellules ont été concentrées par 10 minutes de centrifugation à une vitesse
de rotation fournissant une force équivalente à 300G. À cette étape, un culot de cellules
détachées de leur matrice et exempt de tissus conjonctif a été obtenu.
Déplétion des Treg
Dans une première expérience, les lymphocytes régulateurs CD25+ ont été éliminés.
La déplétion de ces Treg a été effectuée en utilisant une colonne de séparation cellulaire
MACS (Miltenyi Biotec). D’abords, le mélange cellulaire a été incubé avec un anticorps
anti-CD25 couplé à PE (Phycoerythrin) (BioLegend, San Diego, CA), pendant 15 minutes, à 4 ◦ C. Une fois l’incubation terminée, les cellules ont été lavées 2 fois pour être
ensuite incubées avec les micro-billes anti-PE (Anti-PE Microbeads, Miltenyi Biotec)
pendant 15 minutes à 4 ◦ C. Ces micro-billes se sont liées aux cellules reconnues par
l’anti-CD25. Après lavages, les cellules ont été resuspendues dans une solution tampon
pour enfin être passées dans la colonne de séparation. Les cellules CD25+ sont retenues
par l’aimant de la colonne et le reste des cellules a été récupéré. Elles ont été injectées
dans les souris immunodéficientes.
Approximativement 20 × 106 splénocytes ont été transférés dans les souris Rag et
Rag/mdx par injection intra-veineuse. Les souris recevant des splénocytes provenant
de 10J ont été considérées comme contrôle négatif. Les souris ont été classées en trois
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
52
groupes : un premier groupe a été sacrifié 7 jours après le transfert, un deuxième au jour
14 et un dernier groupe au jour 21. Comme contrôle additionnel, des Rag et Rag/mdx
non injectés ont été utilisées.
Prélèvement des muscles
Les souris ont été sacrifiées selon les protocoles standards de l’animalerie et leurs
T.A. ont été prélevés et congelés comme décrit précédemment. Ils ont été ensuite coupés
en sections de 11 µm.
Détection de l’infiltration de LT CD4+ autour des fibres révertantes par
immunohistochimie
Deux lames sériées de chaque série de lames ont été utilisées pour effectuer les deux
immunohistochimies séparément. En fait, un double marquage contre la dystrophine et
le CD4 sur une même lame n’a pas été réussi.
Immunohistochimie
Pour le marquage de la dystrophine, le même protocole a été utilisé que celui décrit
dans la section 5.2.1.
Pour détecter les lymphocytes T CD4+ , les lames ont d’abords été incubées avec
une solution de blocage, soit une solution saline contenant un tampon phosphate (PBS)
contenant 10% de sérum fœtal de veau (FBS) pendant 1 h. Ensuite, un anticorps monoclonal anti-CD4 (GK1.5) a été appliqué sur les coupes pendant une heure. Pour
détecter les lymphocytes T CD8+ , les lames ont d’abords été incubées avec une solution
de blocage, PBS 10% FBS, pendant une heure. Ensuite, un anticorps monoclonal antiCD8 (Y+5162) a été appliqué sur les coupes pendant une heure. Par la suite pour les
CD4 et les CD8, trois lavages au PBS, de cinq minutes chacun ont été faits et un anti-rat
IgG couplé au fluorochrome Alexa 488 (green) (dilution 1 :300 dans du PBS 10% FBS,
Invitrogen, Burlington, Ontario, Canada) a été appliqué. Après une incubation d’une
heure, les lames ont été lavées trois fois dans du PBS et montées dans du PBS-Glycérol
(1 :1).
Les lames sériées ont été observées en microscopie à fluorescence.
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
5.2.3
53
Vérification de la présence d’une réponse immune à médiation humorale contre la dystrophine
Dans ces expériences, seulement des souris mdx et 10J ont été utilisées.
Pour vérifier la présence d’une réponse humorale chez les souris mdx, leur sérum a
été prélevé pour être utilisé comme anticorps primaire en immunohistochimie sur des
coupes de muscles provenant des mêmes souris, ainsi que sur des muscles de souris 10J.
Prélèvement du sérum
Les souris mdx et 10J ont été anesthésiées et le sang périphérique total a été récupéré
par ponction cardiaque, une méthode permettant la récupération d’un volume maximal
de sang. En utilisant une seringue de 1 mL et une aiguille de 25G, insérée dans le coeur
de la souris, entre 0.7 et 1 mL de sang a été récupéré. Le sang récupéré a été transféré
dans des eppendorfs ne contenant pas d’anticoagulants. Les eppendorfs ont été laissés
à 37 ◦ C pendant une heure pour que le sang coagule et forme un culot. Ensuite, les
eppendorfs ont été centrifugés à 4 000 rpm pendant 15 min et le sérum, séparé du
culot, a été pipeté et transféré dans des tubes à congélation. Les échantillons de sérum
ont été conservés à −80 ◦ C.
Les T.A. de souris ont été prélevés, congelés et sectionnés comme décrit précédemment.
Analyse par Immunohistochimie
Afin de vérifier si le sérum de souris mdx contenait des anticorps contre la dystrophine présente dans les fibres révertantes, une immunohistochimie a été réalisée et
le sérum a été appliqué sur des coupes de muscles provenant des souris mdx ainsi que
sur des coupes de muscles de souris 10J. Les lames ont d’abords été incubées dans une
solution de blocage, PBS 10% FBS, pendant une heure. Ensuite, 200 µL de sérum (aucune dilution) a été appliqué sur les coupes pendant une heure. Comme contrôle positif,
un anticorps polyclonal de lapin anti-dystrophin (dilution 1 :3000 dans du PBS 10%
FBS, anticorps polyclonal produit dans notre laboratoire) a été appliqué sur des lames
sériées. Après trois lavages au PBS, de cinq minutes chacun, l’anticorps secondaire couplé au fluorochrome a été ajouté. Sur les lames à tester, les coupes ont été incubées avec
un anti-souris IgG couplé au fluorochrome Alexa 546 (rouge) (dilution 1 :300 dans du
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
54
PBS 10% FBS, Molecular Probes, Eugene, OR) et les lames contrôles ont été incubées
avec un anti-lapin Alexa 546 (rouge) (dilution 1 :300 dans du PBS 1% FBS, Molecular
Probes, Eugene, OR). Après une incubation d’une heure, les lames ont été lavées trois
fois dans du PBS et montées dans du PBS-Glycérol (1 :1).
Les lames sériées sont observées en microscopie à fluorescence.
Analyse par immunobuvardage (Western blot)
L’analyse par immunobuvardage est effectuée à partir des protéines extraites des
cellules 293T transfectées avec un plasmide codant pour la dystrophine ou avec un
plasmide codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) comme contrôle négatif.
Premièrement, les cellules ont été récupérées dans du tampon de lyse (20 mM Tris
pH7.5, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1% SDS) et les protéines ont été précipitées avec un
protocole utilisant du méthanol/chloroforme. Les protéines ont été resuspendues dans
des conditions réductrices, bouillies pendant cinq minutes et quantifiées par essais colorimétriques à l’acide bicinchoninique (BCA) (Thermo Scientific). Ensuite, 20 µg de
protéines de chaque échantillon ont été déposés sur un gel de polyacrylamide, composé
d’un gel séparateur de 7% et d’un gel d’empilement de 4%. Le gel est soumis à 110 volts
pendant 4 heures de façon à séparer les protéines selon leur poids moléculaire (migration
prolongée à cause du haut poids moléculaire de la dystrophine). Les protéines ont été
par la suite transférées sur une membrane de polyvinylidène difluoride (PVDF ; Amersham Biosciences,UK) durant toute la nuit à 20 milliampères (mA) à 4 ◦ C. Les sites non
spécifiques ont ensuite été bloqués pendant une heure avec une solution de tampon phosphate (PBS) contenant 0.05% de Tween20 (Laboratoire Mat, Beauport, Québec, CA)
et 5% de lait en poudre écrémé. Ensuite, la membrane a été incubée toute la nuit à 4 ◦ C
avec les sérums de souris mdx et le sérum d’une souris 10J comme contrôle, dans une
solution de PBS-Tween 0.05% contenant 5% de lait en poudre écrémé. Comme contrôle
positif, une autre membrane avec les mêmes protéines a été incubée avec un anticorps
monoclonal de souris contre la dystrophine, le NCL-Dys2 (dilution 1 :50, Novocastra,
Leica Microsystems, Concord, ON). Pour le contrôle négatif, le NCL-Dys2 a été incubé
avec des protéines de cellules 293T transfectées avec le plasmide codant pour la protéine
fluorescente verte (GFP). Les membranes ont été lavées trois fois pendant 10 minutes
avec du PBS-Tween 0.05%. Le Tween est un détergent permettant d’enlever les anticorps fixés moins solidement suite à une liaison non-spécifique. L’anticorps secondaire
est une immunoglobuline, spécifique pour la partie constante de l’immunoglobuline de
l’espèce de l’anticorps primaire (anti-mouse IgG pour les deux membranes), couplé à
la peroxydase de raifort, il est dilué 1 :1000 dans du PBS/Tween 0.05% contenant 5%
de lait en poudre. Les membranes ont été incubées avec l’anticorps secondaire pendant
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
55
une heure. Une autre série de lavages a été nécessaire avant de faire tremper pendant
deux minutes les membranes dans une solution pour induire la chemiluminescence (GE
Healthcare, Buckinghamshire, UK). Le résultat a été visualisé en exposant la membrane
à un film Amersham HyperfilmT M ECL (GE Healthcare).
Transfection de cellules 293T (lipofectamine)
Des cellules 293T ont été cultivées dans Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)
(Gibco, Burlington, ON), supplémenté avec 10% de sérum fœtal de veau (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA), à 37 ◦ C, 5% CO2. Ces cellules ont été gardées en culture jusqu’à
environ 90% de confluence (2-3 jours) pour ensuite être transfectées. Ces cellules ont été
transférées dans des plaques de 6 puits, à une densité de 8 × 105 cellules/500 µL dans du
DMEM. 4 µg du plasmide codant la dystrophine pleine longueur (plasmide pTG15130
PlasmidFactory (Bielefeld, Germany)) et 4 µg du plasmide codant la protéine fluorescente GFP (pLeGFP) ont été dilués chacun dans 250 µL du milieu Opti-MEM (Invitrogen). Ensuite, 10 µL de l’agent de transfection Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ont été
dilués dans 250 µL d’Opti-MEM et incubés pendant 5 minutes. Une fois l’incubation
terminée, l’ADN dilué et la lipofectamine diluée ont été combinés et incubés pendant 20
minutes à température de la pièce. Le mélange ADN-Lipofectamine a alors été ajouté à
chaque puits. Les plaques ont alors été gardées à 37 ◦ C pendant 48 à 72 h. L’expression
de la GFP a été vérifiée par microscopie à fluorescence. Les protéines ont été extraites,
dosées et analysées par Western-Blot afin de vérifier l’expression de la dystrophine.
Ce western a été réalisé en utilisant l’anti-dystrophine NCL-Dys2 (Novocastra, Leica
Microsystems).
Nucléofection des myoblastes
Les myoblastes utilisés provenaient de cultures primaires. Ils ont été décongelés et
mis en culture jusqu’à 80% de confluence. Pour la nucléofection, 9 µg du plasmide
codant la dystrophine pleine longueur (plasmide pTG15130 PlasmidFactory (Bielefeld,
Germany)) et 2 µg du plasmide codant la protéine fluorescente verte (GFP) (pmaxGFP
Vector) ont été transférés dans les cuvettes de nucléofection. Les myoblastes ont été
trypsinisés pour être détachés des puits, lavés dans du HBSS « Hank’s Balanced Salt
Solution » (GIBCO) et resuspendus dans la solution de nucléofection (Nucleofector
Solution, Amaxa Basic Nucleofector Kit, Lonza, Germany). Ils ont ensuite été transférés
dans la cuvette de nucléofection. La cuvette a été placée dans le Nucleofector (Lonza,
Germany) et le programme P − 022 a été utilisé permettant le passage d’un courant
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
56
électrique pour introduire le plasmide à l’intérieur des cellules.
Les myoblastes nucléofectés ont alors été transférés dans une plaque de 6 puits, dans
du DMEM et incubés à 37 ◦ C pendant 48 h.
Culture primaire
Les souriceaux ont été sacrifiés par décapitation à l’âge de deux ou trois jours. Les
quatre pattes ont été récupérées et disséquées sous microscope afin d’isoler les muscles.
Ces derniers sont émincés et digérés dans une solution de HBSS « Hank’s Balanced Salt
Solution » (GIBCO) contenant 2 µg/µl de collagénase type IV (GIBCO) et 2.5 µg/µl de
dispase Il (Sigma). La digestion enzymatique a été faite sous agitation à 37 ◦ C pendant
une heure. L’ajout de DMEM-HG complet a été ajouté pour inactiver la digestion.
Des centrifugations ont permis l’isolation des cellules qui ont ensuite été lavées avec du
HBSS et mises en culture dans du milieu DMEM-HG. Après 48 heures, les cellules ont
été décollées à l’aide de la trypsine et congelées dans du DMEM-HG contenant 50% de
FBS et 10% de diméthyl sulfoxide (DMSO, Sigma) pour une utilisation ultérieure. Lors
de l’utilisation de ces cellules, une immunocytochimie a été effectuée afin de vérifier le
pourcentage de cellules exprimant la desmine, un marqueur des myoblastes.
Extraction de protéines à partir de muscles de souris 10J
Des souris 10J ont été sacrifiées et les muscles ont été prélevés comme décrit
précédemment. Ils ont ensuite été broyés, dans du HBSS, à l’aide d’un broyeur de tissus.
Pour briser les membranes cellulaires, l’homogénat de muscles a été sonifié. Ensuite, les
protéines ont été extraites et analysées par western blot pour vérifier la présence de la
dystrophine.
Les protéines provenant des cellules 293T transfectées, des myoblastes nucléofectés
et des muscles de souris 10J ont été analysées par Western Blot afin de détecter la
dystrophine en utilisant un anticorps contre la dystrophine le NCL-Dys2 (dilution 1 :50,
Novocastra, Leica Microsystems, Concord, ON). Les protéines contenant la dystrophine
ont ensuite été utilisées pour analyser les sérums des souris par Western Blot.
Résultats
5.3
Comparaison du nombre des fibres dystrophinepositives entre des souris dystrophiques immunocompétentes et immunodéficientes
Des muscles T.A. de souris mdx et Rag/mdx ont été prélevés et marqués en immunohistochimie avec un anticorps marquant la dystrophine afin de comparer le nombre de
fibres révertantes entre les souris immunocompétentes et immunodéficientes. En comparant le nombre de fibres révertantes entre les souris mdx et les souris Rag/mdx, j’ai
constaté que les souris mdx immunocompétentes possédaient un nombre significativement moins élevé de fibres révertantes que les souris Rag/mdx (Figure 5.1). Les souris
mdx avaient surtout des fibres révertantes individuelles, éparpillées à travers le muscle,
alors que les souris Rag/mdx avaient des groupements plus larges de fibres révertantes.
Ce résultat suggère que les fibres révertantes sont probablement éliminées par le système
immunitaire chez les souris immunocompétentes.
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
58
FIGURE 5.1 – Le nombre de fibres révertantes est plus élevé dans les T.A.
des souris immunodéficientes. Ce graphe montre la moyenne des fibres révertantes
présentes dans les T.A. de souris immunocompétentes mdx et de souris immunodéficientes Rag/mdx.
5.4
Vérification de la présence d’une réponse immune cellulaire in vivo
Pour vérifier la présence d’une réponse cellulaire, des splénocytes provenant de souris
mdx ou 10J étaient transférés chez des Rag et Rag/mdx. Le but de cette expérience
était de vérifier si ces cellules reconnaîtraient les fibres révertantes présentes dans les
muscles des Rag/mdx et les fibres musculaires normales, exprimant la dystrophine, chez
les souris Rag.
Dans les muscles de souris contrôle négatif (souris Rag/mdx naïves et souris Rag
ou Rag/mdx ayant reçu des splénocytes de 10J ), aucun marquage de cellules CD4+
n’a été détecté (Figure 5.2, 5.3). Aucune infiltration par des CD4+ n’a aussi été observée dans les muscles de souris Rag et Rag/mdx sacrifiées au J7 (Figure 5.4) et J21
suite au transfert adoptif de splénocytes de souris mdx. Cependant après ce type de
transfert chez les souris Rag/mdx, une infiltration de LTs CD4+ a été observée chez
les souris sacrifiées au jour 14 (Figure 5.5). En plus, seuls les muscles contenant des
fibres révertantes montraient une infiltration par les CD4+ , alors que cette infiltration
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
59
était absente dans les muscles ne contenant pas de fibres révertantes. Ceci nous mène
à croire que ces lymphocytes T CD4+ étaient dirigés contre les fibres révertantes et
plus précisément, contre la dystrophine néoformée présente dans ces fibres dystrophinepositives. Cependant, ces lymphocytes T CD4+ n’étaient pas toujours localisés autour
des groupements des fibres révertantes. Dans plusieurs coupes de muscles, j’ai détecté
une infiltration de CD4+ sans pouvoir détecter de fibres révertantes dans la même région, alors que dans certaines autres, cette infiltration était localisée au même endroit
que les fibres dystrophine-positives. A ma grande surprise, je n’ai pas observé chez les
souris Rag (Figure 5.6) (exprimant la dystrophine dans toutes leurs fibres musculaires)
une infiltration cellulaire similaire à celle observée chez les Rag/mdx (Figure 5.5) alors
qu’on s’attendait à une infiltration plus importante à cause de l’abondance des fibres
exprimant la dystrophine. La présence de lymphocytes T CD8+ (Figure 5.7) dans les
souris Rag/mdx était associée à la présence de lymphocytes T CD4+ .
L’expérience précédente avait été faite chez des souris où j’avais déplété les Treg.
Cette expérience a été répétée deux fois, mais sans déplétion de Treg afin de vérifier si
ces derniers jouaient un rôle dans la régulation de la réponse immune envers les fibres
révertantes. Les mêmes résultats ont été obtenus dans les deux expériences, montrant
ainsi que les Treg ne sont pas impliqués dans la régulation de la réaction immune envers
la dystrophine.
FIGURE 5.2 – Contrôle négatif. Absence d’infiltration de lymphocytes T
CD4+ dans les souris Rag/mdx naïves, n’ayant reçu aucun transfert. Des
souris Rag/mdx non-injectées ont été sacrifiées et ont servi de contrôle négatif. Les
lymphocytes T CD4+ sont marqués avec un anticorps couplé au fluorochrome Alexa488 émettant dans le vert.
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
60
FIGURE 5.3 – Contrôle négatif. Absence d’infiltration de lymphocytes T
CD4+ dans les souris Rag/mdx 14 jours après le transfert de splénocytes
de 10J. 20 × 106 splénocytes de souris 10J ont été transférés par injection intraveineuse dans des Rag/mdx. Ces dernières ont été sacrifiées 14 jours après le transfert.
Les lymphocytes T CD4+ sont marqués avec un anticorps couplé au fluorochrome Alexa488 émettant dans le vert.
FIGURE 5.4 – Absence de CD4+ dans les muscles de souris Rag/mdx au jour 7
suite au transfert de splénocytes provenant de souris mdx. 20 × 106 splénocytes
de souris mdx ont été transférés par injection intra-veineuse dans des Rag/mdx. Ces
dernières ont été sacrifiées 7 jours après le transfert.(A) La dystrophine est détectée
avec un marquage utilisant un anticorps couplé au fluorochrome Alexa-488 émettant
dans le vert. (B) Les lymphocytes T CD4+ sont marqués avec un anticorps couplé au
fluorochrome Alexa-546 émettant dans le rouge .
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
61
FIGURE 5.5 – Présence de lymphocytes T CD4+ autour des fibres révertantes
dans les muscles de souris Rag/mdx 14 jours après le transfert de splénocytes
de souris mdx. 20×106 splénocytes de souris mdx ont été transférés par injection intraveineuse dans des Rag/mdx. Ces dernières ont été sacrifiées 14 jours après le transfert.
(A) La dystrophine est détectée avec un marquage utilisant un anticorps couplé au
fluorochrome Alexa-546 émettant dans le rouge. (B) Les lymphocytes T CD4+ sont
marqués avec un anticorps couplé au fluorochrome Alexa-488 émettant dans le vert.
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
62
FIGURE 5.6 – Absence de lymphocytes T CD4+ dans le muscle de souris
Rag au J14 suite au transfert adoptif de splénocytes des souris mdx. Des
souris Rag ont reçu un transfert de 20 × 106 splénocytes provenant de souris mdx
et ont été sacrifiées après 14 jours. (A) La dystrophine est détectée avec un marquage
utilisant un anticorps couplé au fluorochrome Alexa-546 émettant dans le rouge. (B) Les
lymphocytes T CD4+ sont marqués avec un anticorps couplé au fluorochrome Alexa-488
émettant dans le vert.
FIGURE 5.7 – Infiltration de lymphocytes T CD8+ dans le muscle de souris
Rag/mdx suite au transfert de splénocytes provenant de souris mdx. 20 ×
106 splénocytes de souris mdx ont été transférés par injection intra-veineuse dans des
Rag/mdx qui ont été sacrifiées 14 jours après le transfert. Les lymphocytes T CD8+
sont marqués avec un anticorps couplé au fluorochrome Alexa-488 émettant dans le
vert.
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
5.5
63
Vérification de la présence d’une réponse immune à médiation humorale contre la dystrophine
Pour vérifier la présence d’une réponse humorale chez les souris mdx, leur sérum a
été prélevé pour être utilisé comme anticorps primaire en immunohistochimie sur des
coupes de muscles provenant des mêmes souris, ainsi que sur des muscles de souris 10J.
Le marquage par immunohistochimie, utilisant les sérums de mdx comme anticorps
primaire, n’a détecté aucune fibre révertante (Figure 5.8-B). Alors qu’en utilisant l’anticorps anti-dystrophine, la dystrophine présente dans les fibres revertantes a été détectée
(Figure 5.8-A). Cela suggère que le sérum de mdx ne contient pas d’anticorps contre la
dystrophine présente dans les fibres révertantes. Cependant, ce résultat est peu fiable,
parce que l’immunohistochimie est une méthode de détection qui nécessite un taux relativement élevé d’anticorps et les anticorps contre la dystrophine s’ils sont présents dans
le sérum des souris mdx, aurait probablement une concentration faible. Pour cette raison, j’ai aussi fait des Western-Blots, une méthode plus sensible pour détecter de faibles
concentrations d’anticorps. J’ai obtenu le même résultat négatif qu’avec l’immunohistochimie. En effet, le sérum de souris mdx n’a pas détecté la bande de dystrophine
(Figure 5.9). Les deux techniques indiquent donc que les souris mdx n’ont pas ou très
peu d’anticorps contre la dystrophine. Ces résultats suggèrent que la réponse immune
envers les fibres révertantes n’implique pas une immunité à médiation humorale, mais
seulement une immunité à médiation cellulaire.
Afin de réaliser ce Western-Blot, il fallait avoir de la dystrophine. Plusieurs moyens
de l’obtenir dont la transfection des cellules 293T avec le plasmide codant pour la
dystrophine, la nucléofection de myoblastes et l’homogénisation de muscles de 10J ont
été essayés. Ensuite, les protéines ont été extraites de ces cellules. Ces protéines ont été
analysées par Western-Blot afin de déterminer lesquelles contenaient la dystrophine.
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
64
Immunohistochimie sur des coupes de muscles de souris mdx avec le sérum
de souris comme anticorps primaire
FIGURE 5.8 – Absence d’anticorps anti-dystrophine dans le sérum de souris
mdx. Un marquage immunohistochimique avec un anti-dystrophine (contrôle positif)
(A) ou avec le sérum de sourismdx (B) est effectué sur une coupe de muscle demdx.
L’anticorps secondaire est couplé à un fluorochrome émettant dans le rouge.
Western-Blot utilisant des sérums de souris mdx afin d’y détecter la présence
d’anti-dystrophine
FIGURE 5.9 – Absence de la présence d’anticorps dirigés contre la dystrophine dans les sérums de souris mdx. Les sérums de souris mdx ou 10J ont
été utilisés en Western Blot comme anticorps primaires sur des extraits protéiques de
cellules 293T transfectées avec le gène de la dystrophine. Un anticorps anti-dystrophine
Dys2 a servi comme contrôle positif. Des cellules 293T transfectées avec un plasmide
codant pour la GFP ont été utilisées comme contrôle négatif.
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
65
Transfection avec la lipofectamine de cellules 293T avec un plasmide codant
pour la GFP ou pour la dystrophine
La transfection de cellules 293T avec un plasmide codant pour la GFP comme
contrôle positif montre la réussite de la transfection avec un pourcentage de 90 à 95% de
cellules exprimant la GFP (Figure 5.10). Afin de vérifier si la dystrophine est exprimée,
un Western Blot a été réalisé. Une bande de dystrophine a été détectée dans l’extrait
de protéines provenant des cellules 293T transfectées avec la dystrophine (Figure 5.11).
En se basant sur ce résultat positif, des protéines extraites de cellules 293T transfectées
avec la dystrophine ont été utilisées pour effectuer le Western-Blot avec les sérums de
souris mdx.
FIGURE 5.10 – Contrôle positif de la transfection : Des cellules 293T ont
été transfectées, en utilisant la lipofectamine, avec un plasmide codant la
protéine fluorescente verte (GFP). Une observation sous lampe ultraviolet montre
que plus de 90% des cellules expriment la protéine fluorescente verte.
Western-Blot des différents extraits protéiques
Afin de réaliser ce Western-Blot, il fallait avoir de la dystrophine. Plusieurs moyens
de l’obtenir dont la transfection des cellules 293T avec le plasmide codant pour la
dystrophine, la nucléofection de myoblastes et l’homogénisation de muscles de 10J ont
été essayés. Ensuite, les protéines ont été extraites de ces cellules. Ces protéines ont été
analysées par Western-Blot afin de déterminer lesquelles contenaient la dystrophine.
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
66
FIGURE 5.11 – Western-Blot des différents extraits protéiques. Les extraits
protéiques provenant des 293T transfectées avec le gène de la dystrophine ou de la
GFP (2,6), des myoblastes nucléofectés (3) et de l’homogénat de muscles de 10J (4,5)
ont été testés par western blot avec un anti-dystrophine.
Nucléofection des myoblastes avec un plasmide codant pour la GFP ou pour
la dystrophine
Suite à la nucléofection avec un plasmide codant la GFP comme contrôle positif,
seulement 25 − 30% des myoblastes nucléofectés exprimaient la GFP (Figure 5.12).
Ce pourcentage est relativement faible étant donné que l’efficacité de transfection du
plasmide codant la GFP est beaucoup plus élevée. Le plasmide codant la dystrophine
pleine longueur a une taille plus grande que le plasmide codant pour la GFP, il est donc
plus difficile de le transfecter. Pour cette raison et en se basant sur le pourcentage des
myoblastes exprimant la GFP, le taux des myoblastes exprimant la dystrophine serait
beaucoup plus faible et ne dépasserait pas 5% étant donné que la dystrophine possède
un poids moléculaire beaucoup plus élevé et est donc plus difficile à nucléofecter.
Chapitre 5. Etude du profil immunogénique de la dystrophine révertante
67
FIGURE 5.12 – Contrôle positif de nucléofection. Myoblastes nucléofectés
avec un plasmide codant la protéine fluorescente verte (GFP). Des myoblastes
ont été nucléofectés avec un plasmide codant la GFP comme contrôle positif. (A) Myoblastes observés sous la lampe UV. (B) Photo des myoblastes en contraste de phase
montrant le total des myoblastes.
Chapitre 6
Discussion et conclusions
6.1
Discussion
La restauration de la dystrophine par thérapie génique est un traitement possible de
la dystrophie musculaire de Duchenne. Cependant, il existe une claire évidence qu’une
néo-expression de la dystrophine pourrait agir comme antigène capable de stimuler une
réponse immune cytotoxique, ce qui représente un problème important face à toute
forme de thérapie visant à restaurer l’expression de la dystrophine chez les patients
DMD. En fait, la présence de lymphocytes T activés contre des épitopes de la dystrophine, avant traitement, chez certains patients DMD, vient appuyer cette hypothèse
(Mendell et al., 2010). Ces LTs étaient sûrement activés par les fibres révertantes qui
étaient présentes dans les muscles de ces patients. Par contre, des lymphocytes T activés
non pas été décelés chez tous les patients. En effet, l’activation des LTs peut dépendre
du moment durant le développement où s’est produit une mutation somatique menant
à un épissage modifié du mRNA de la dystrophine générant les fibres révertantes (Klein
et al., 1992). La présence ou non d’une réponse immue contre la dystrophine présente
dans les fibres révertantes peut donc dépendre du moment de cette mutation en fonction de la maturation du système immunitaire menant soit à l’induction d’une réponse
immune ou à une tolérance immunologique.
Une variation dans l’activation ou dans l’intensité de la réponse immune cellulaire
contre la dystrophine pourrait être influencée par l’immunogénétique (HLA de classe I
ou II) ou par la sévérité de l’inflammation musculaire chez les différents patients DMD
(Mendell et al., 2010). En effet, les fibres musculaires normales, dans des conditions
physiologiques, n’expriment pas de molécules de complexe majeur d’histocompatibilité
(CMH) (Karpati et al., 1988; Emslie-Smith et al., 1989). Par contre, dans un con-
Chapitre 6. Discussion et conclusions
69
texte inflammatoire, causé par certaines pathologies, dont la dystrophie musculaire de
Duchenne, ces fibres expriment le CMH de classe I et classe II (Chen, 2004; Karpati
et al., 1988; Emslie-Smith et al., 1989). De plus, il a été montré que les cellules musculaires humaines sont équipées de toutes les molécules nécessaires à la présentation
d’antigènes sur le CMH de classe II (Inukai et al, 2000; Gallardo et al., 2001; Wiendl
et al., 2003a). Les cellules musculaires en condition inflammatoire peuvent donc présenter des antigènes extracellulaires ou intravésiculaires (viraux, bactériens, auto-antigènes
et allo-antigènes musculaires) aux lymphocytes T CD4 via le CMH de classe II. Ce qui
peut expliquer la reconnaissance immunitaire par les CD4+ des fibres révertantes au
niveau des muscles de souris Rag/mdx, après le transfert de splénocytes de souris mdx.
En revanche, chez les souris Rag, nous nous attendions à voir un degré d’infiltration de
lymphocytes plus élevé que chez les souris Rag/mdx, étant donné que l’expression de
la dystrophine est présente dans toutes les fibres musculaires. Ceci n’était pas le cas.
Cette observation peut être expliquée par le fait que le tissu musculaire de souris Rag
est normal, non dystrophique, donc n’exprime pas des molécules de CMH. En plus, la
dystrophine est exprimée de façon naturelle chez les Rag non dystrophiques et n’est
pas considérée comme antigène, donc il est impossible aux lymphocytes T de la reconnaître, ce qui explique parfaitement notre résultat et nous mène plus à croire que
la réponse observée chez les Rag/mdx est dirigée contre la dystrophine révertante. Le
fait que la présence de CD4+ n’était pas toujours localisée autour des groupements de
fibres révertantes nous semblait initialement surprenant. Notre interprétation est que
les fibres dystrophine-positives étaient probablement détruites avant que les souris ne
soient sacrifiées. Bien que dans certains cas, les lymphocytes et les fibres révertantes
étaient co-localisés probablement parce l’infiltration de cette région du muscle par les
lymphocytes était récente.
La réduction du nombre des fibres dystrophine-positives chez la souris mdx immunocompétente par rapport à la Rag/mdx immunodéficientes suggère que ces fibres
révertantes induisent une réponse auto-immune plutôt qu’une tolérance.
Par contre, l’absence de marquage, par immunohistochimie, de la dystrophine par
le sérum de souris mdx suggère l’absence d’une immunité à médiation humorale. Mais
ce résultat n’était pas suffisant pour confirmer l’absence d’anticorps anti-dystrophine.
En fait, le titre de ces anticorps pourrait être bas de sorte qu’ils ne sont pas détectables
par immunohistochimie. Alors, pour avoir des résultats plus fiables, on a procédé par
Western Blot. L’analyse par Western Blot n’a pas non plus permis de détecter des
anticorps contre la dystrophine confirmant les résultats de l’immunohistochimie.
Deux études ont précédemment été réalisées pour examiner les réponses immunes
spécifiques contre la dystrophine (Ferrer et al., 2000; Braun et al, 2000). Ces études ont
Chapitre 6. Discussion et conclusions
70
utilisé un ADN plasmidique pour le transfert du gène de la dystrophine, elles ont donc
évité les complications attachées à la co-administration d’autres protéines potentiellement étrangères, comme dans le cas de transferts viral ou cellulaire. Les deux études
ont montré la présence d’une réponse immune humorale et cellulaire suite au transfert
de plasmides codant la dystrophine humaine chez la souris mdx. Ces études ont évalué
la production d’anticorps anti-dystrophine par Western Blots et ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay). Ces études ont également montré la présence d’une infiltration
par les cellules CD8+ associée à une perte de fibres dystrophine-positives dans le muscle injecté. Ces deux ensembles de données complémentaires démontrent que malgré
la similitude de 90% d’acides aminés entre les dystrophines humaine et murine, il y a
suffisamment de différences au niveau des épitopes pour déclencher une réponse immunitaire. D’autre part, une étude similaire, utilisant un plasmide codant pour la dystrophine
murine transféré dans des souris mdx, n’a pas montré la présence d’une réponse immune
destructive envers la dystrophine murine exprimée (Ferrer et al., 2000). Les auteurs ont
spéculé que le manque de réponse immune contre la dystrophine murine pourrait être
dû à l’expression continue d’autres isoformes de la dystrophine entre autres dans le
cerveau (Nudel, 1989; Gorecki, 1992; Bakker et Van Ommen, 1998).
Une autre explication proposée à la tolérance immune apparente envers les fibres
révertantes et envers l’expression de la dystrophine murine pleine longueur, après le
transfert, pourrait être que la charge d’antigène est en dessous du seuil nécessaire pour
déclencher une réponse immune. Cette faible charge pourrait être causée par le faible
pourcentage de fibres révertantes et par la faible efficacité du transfert plasmidique cités
dans les études mentionnées précédemment.
Dans d’autres études, le risque d’immunité à médiation cellulaire peut avoir été
minimisé par le nombre limité de différences entre le gène du soi défectif et le transgène
thérapeutique, soit à cause du fait que le phénotype de la maladie est causé par un plus
petit nombre de mutations faux-sens (missense mutations) ou du fait que les patients
de l’étude, suite à une sélection, n’avaient pas de larges délétions changeant le cadre de
lecture. Cependant, une nombre substantiel de patients DMD ont de larges délétions
génomiques (Roberts et al., 1994), conduisant à la perte d’un nombre considérable
d’épitopes potentiellement immunogènes. Ces patients pourraient ne pas être tolérants
au transfert de la dystrophine. Ainsi, il serait important dans le futur de déterminer le
génotype précis ainsi que le phénotype des patients DMD participant à des essais de
thérapie génique.
Puisque la dystrophine est une protéine du cytosquelette, donc non accessible aux
anticorps, la réponse à médiation humorale en elle-même ne suscite pas une inquiétude
comparée à la réponse immune cytotoxique menée par les lymphocytes T CD8+ . Cepen-
Chapitre 6. Discussion et conclusions
71
dant, la présence d’anticorps spécifiques contre la dystrophine (Huard, 1992; Tremblay
et al, 1993; Karpati et al, 1993) suite à une greffe de myoblastes normaux montre que
cette protéine est décelée par le système immunitaire comme un antigène étranger et
peut potentiellement déclencher des réponses immunes cytotoxiques. Cependant, dans
une autre étude où une présence de lymphocytes T spécifiques contre la dystrophine
avait été détectée avant traitement, des anticorps spécifiques contre la dystrophine n’ont
pas été détectés dans les sérums des patients (Mendell et al., 2010).
En résumé, les études sur les réponses immunes envers la dystrophine ont rapporté des résultats contradictoires. Mais aucune de ces études précédentes n’a investigué
dans la réponse immune envers la dystrophine révertante sans transfert de dystrophine
thérapeutique. Les résultats obtenus dans mes travaux sont préliminaires et des vérifications plus approfondies sont nécessaires.
6.2
Conclusions et perspectives
En conclusion, mes travaux ont montré que la dystrophine présente dans les fibres
révertantes induit probablement une activation du système immunitaire, conduisant à
l’élimination de ces fibres dystrophine-positives. Cette réponse immune observée était
à médiation cellulaire et non à médiation humorale étant donné que le sérum des souris
mdx ne contenait pas d’anticorps anti-dystrophine.
Évidemment, ces présents travaux ne sont pas à 100% complétés et plusieurs expériences restent à être effectuées. Dans le but de faciliter ces expériences, il serait mieux
d’utiliser la dystrophine recombinante à l’état pur ou des pools de peptides synthétisés
afin de vérifier la spécificité de la réponse immune. En plus, des tests plus sensibles devront être effectués comme par exemple l’ELISPOT (Enzyme-Linked Immunosorbent
Spot), une méthode efficace pour détecter les lymphocytes T activés suite à leur stimulation par la dystrophine. Une autre méthode qui devrait être employée est la CFC
(Cytokine Flow Cytometry) qui permet de détecter les cytokines secrétées par les lymphocytes activés. Ces méthodes seraient très intéressantes pour mieux comprendre les
mécanismes de la réaction immune contre la dystrophine ainsi que pour identifier les
différentes cytokines secrétées par les lymphocytes suite à leur activation.
Il serait aussi très important d’étudier l’implication d’autres types cellulaires dans
la réponse immune envers la dystrophine, comme par exemple les cellules NK, les Tregs,
etc.
Chapitre 6. Discussion et conclusions
72
Le saut d’exon et la suppression des codons stop sont considérés comme des traitements potentiels pour induire l’expression de la dystrophine chez les patients DMD.
Ces stratégies peuvent aussi stimuler ou restimuler une réponse immune contre la dystrophine. L’infiltration des muscles contenant des fibres révertantes par des lymphocytes T suggère que le suivi des réponses immunitaires cellulaires devrait être une
priorité pour tout traitement expérimental visant à ré-exprimer la dystrophine chez
les patients DMD. Une immunosuppression ou une thérapie d’induction de tolérance
spécifique envers la dystrophine seront nécessaires pour maintenir l’expression de la
dystrophine à long terme. Une meilleure compréhension des mécanismes de rejet de la
dystrophine révertante aiderait à mieux développer des stratégies de tolérance. Dans ce
but, il serait très intéressant de déterminer les épitopes immunogènes de la dystrophine
afin de développer un protocole d’induction de tolérance spécifique à ces épitopes. Une
fois une telle tolérance établie, la restauration de la dystrophine par thérapie génique
serait très prometteuse.
Bibliographie
Aartsma-Rus, A. et GERT, B. V. (2007). Antisense-mediated exon skipping : A
versatile tool with therapeutic and research applications. RNA, 13:1609–1624.
Aartsma-Rus, A. et Janson, A. A. (2003). Therapeutic antisense-induced exon skipping in cultured muscle cells frora six différent dmd patients. Hum Mol Genet, 12:907–
14.
Aartsma-Rus, A. et Kaman, W. E. (2004). Comparative analysis of antisense oligonucleotide analogs for targeted dmd exon 46 skipping in muscle cells. Gene Ther,
11:1391–8.
Abbas, A. K., Lichtman, A. H. et al (1991). Cellular and molecular immunology,
pages 109–138. Philadelphia, Saunders.
Acsadi, G., Dickson, G., Love, D., Jani, A., Walsh, F. S., Gurusinghe, A.,
Wolff, J. A. et Davies, K. E. (1991). Human dystrophin expression in mdx mice
after intramuscular injection of dna constructs. 352:12.
Ahn, A. H. et Kunkel, L. M. (1993). The structural and functional diversity of
dystrophin. Nat Genet, 3:283–91.
Aihara, H. et Miyazaki, J. (1998). Gene transfer into muscle by electroporation in
vivo. Nat Biotechnol, 16:867–70.
Allen, D. L. et Teitelbaum, D. H. (2003). Growth factor stimulation of matrix
metalloproteinase expression and myoblast migration and invasion in vitro. Am J
Physiol Cell Physiol, 284:c809–15.
Allsop, K. G. et Ziter, F. A. (1981). Loss of strength and functional decline in
duchenne’s dystrophy. Arch Neurol, 38:406–11.
Alter, J., Lou, F., Rabinowitz, A., Yin, H., Rosenfeld, J., Wilton, S. D., Partridge, T. A. et Lu, Q. L. (2006). Systemic delivery of morpholino oligonucleotide
restores dystrophin expression bodywide and improves dystrophic pathology. Nat
Med, 12:175–7.
BIBLIOGRAPHIE
74
Amalfitano, A. et Parks, R. J. (2002). Separating fact from fiction : assessing the
potential of modified adenovirus vectors for use in human gene therapy. Curr Gene
Ther, 2:111–33.
Anderson, J., McIntosh, L. M. et Poettcker, R. (1996). Deflazacort but not
prednisone improves both muscle repair and fiber growth in diaphragm and limb
muscle in vivo in the mdx dystrophic mouse. Muscle Nerve, 19:1576–1585.
athiesen, I. (1999). Electropermeabilization of skeletal muscle enhances gene transfer
in vivo. Gene Ther, 6:508–14.
Aurino, S. et Nigro, V. (2006). Readthrough strategies for stop codons in duchenne
muscular dystrophy. Acta Myol, 25:5–12.
Bakker, E. et Van Ommen, G. J. B. (1998). Duchenne and becker musculardystrophy
(dmd and bmd). in : Emery aeh (ed). neuromuscular disorders : Clinical and molecular
genetics. John Wiley and Sons : Chichester, pages 59–85.
Bar, S. et al (1990). A novel product of the duchenne muscular dystrophy gene
which greatly differs from the known isoforms in its structure and tissue distribution.
BioehemJ, 272:557–60.
Barnea, E. et al (1990). Specificily of expression of the muscle and brain dystrophin
gene promoters in muscle and brain cells. Neuron, 5:881–8.
Barton, E. R. et al (1999). Aminoglycoside antibiotics restore dystrophin function
to skeletal muscles of mdx mice. J Clin Invest, 104:375–81.
Battaloglu, E. et Telatar, M. (1992). Dna analysis in turkish duchenne/becker
muscular dystrophy families. Hum Genet, 89:635–639.
Baumbach, L. L. et Chamberlain, J. S. (1989). Molecular and clinical correlations of
deletions leading to duchenne and becker muscular dystrophies. Neurology, 39:465–
474.
Beauchamp, J. R. et Morgan, J. E. (1999). Dynamics of myoblast transplantation
reveal a discrète minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic
source. J Cell Biol, 144:1113–22.
Behrens, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T., Goebels, N., Wekerle, H.
et Hohlfeld, R. (1998). Human muscle cells express a functional costimulatory
molecule distinct from b7.1 (cd80) and b7.2 (cd86) in vitro and in inflammatory
lesions. J Immunol, 161:5943–51.
Bell, S. C. (1830). On the nervous system. p.clxii, second édition.
BIBLIOGRAPHIE
75
Benjamini, E., Sunshine, G. H. et al (1996). Immunology : a short course, pages
113–128. New York, Wiley-Liss.
Bernasconi, P., Confalonieri, P., Andreetta, F., Baggi, F., Cornelio, F. et
Mantegazza, R. (1998). The expression of co-stimulatory and accessory molecules
on cultured human muscle cells is not dependent on stimulus by pro-inflammatory cytokines : relevance for the pathogenesis of inflammatory myopathy. J Neuroimmunol,
85:52–8.
Bies, R. D. et al (1992). Human and murine dystrophin mRNA transcripts are differentially expressed during skeletal muscle, heart, and brain development. Nucleic
Acids Res, 20:1725–31.
Bies, R. D. et Caskey, C. T. (1992). An intact cysteine-rich domain is required for
dystrophin function. J Clin Invest, 90:666–672.
Bittner, R. E. e. a. (1994). Coisogenic all-plus-one immunization : a model for identifying missing proteins in null-mutant conditions. antibodies to dystrophin in mdx
mouse after transplantation of muscle from normal coisogenic donor. Neuropediatrics,
25:176–182.
Blau, H. M., Webster, C. et Pavlath, G. K. (1983). Defective myoblasts identified
in duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A, 80:4856–60.
Bonifati, M. D. et al (2000). A multicenter, double-blind, randomized trial of deflazacort versus prednisone in duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve, 23:1344–1347.
Bonnemann, C. G., McNally, N. M. et Kunkel, L. M. (1996). Beyond dystrophin :
current progress in the muscular dystrophies. Curr Opin Pediatr, 8:569–82.
Bouchentouf, M., Benabdallah, B. F. et Tremblay, J. P. (2004). Myoblast survival enhancement and transplantation success improvement by heat-shock treatment
in mdx mice. Transplantation, 77:1349–1356.
Braun, S. et al (2000). Immune rejection of human dystrophin following intramuscular
injections of naked dna in mdx mice. Gene Ther, 7:1447–1457.
Brooke, M. H. et Griggs, R. C. (1981). The natural history of duchenne muscular
dystrophy : a caveat for therapeutic trials. Trans Am Neurol Assoc, 106:195–9.
Bulman, D. E. et Gangopadhyay, S. B. (1991). Point mutation in the human dystrophin gene : identification through western blot analysis. Genomics, 10:457–460.
Burrow, K., Coovert, D. D., Klein, C. J., Bulman, D. E., Kissel, J. T., Rammohan, K. W. et Burghes, A. H. M. (1991). Dystrophin expression and somatic reversion in prednisone-treated and untreated duchenne dystrophy. Neurology, 41:662–666.
BIBLIOGRAPHIE
76
Bushby, K. M. et Gardner-Medwin, D. (1993). The clinical, genetic and dystrophin
characteristics of becker muscular dystrophy. ii. correlation of phenotype with genetic
and protein abnormalities. Pediatr Neurol, 240:105–112.
Byers, T. J., Lidov, H. G. et Kunkel, L. M. (1993). An alternative dystrophin
transcript specific to peripheral nerves. Nat Genet, 4:77–81.
Carosella, E. D., Moreau, P., Aractingi, S. et Rouas-Freiss, N. (2001). Hla-g :
a shield against inflammatory aggression. Trends Immunol, 22:553–5.
Charge, S. et Rudnicki, M. (2004). Cellular and molecular régulation of muscle
régénération. Physiol Rev, 84:209–238.
Chelly, J., Gilgenkrantz, H., Lambert, M., Hamard, G., Chafey, P., Recan,
D., Katz, P., Chapelle, A., Koenig, M. et Ginjaar, I. B. (1990). Effect of
dystrophin gene deletions on mrna levels and processing in duchenne and becker
muscular dystrophies. Cell, 63:1239–1248.
Chen, L. (2004). Co-inhibitory molecules of the b7-cd28 family in the control of t-cell
immunity. Nat Rev Immunol, 4:336–47.
Cohen, L. et al (1982). A statistical analysis of the loss of muscle strength in duchenne’s muscular dystrophy. Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 37:123–38.
Conte, G. et Gioja, L. (1836). Scrofola del sistema muscolare. Annali Clinici dell’Ospedale degli Incurabili di Napoli. 2:66–79.
Corey, D. R. et Abrams, J. M. (2001). Morpholino antisense oligonucleotides : tools
for investigating vertebrate development. Genome Biol, 2:1015.
Covone, A. E. et Caroli, F. (1992). Screening duchenne and becker muscular dystrophy patients for deletions in 30 exons of the dystrophin gene by three-multiplex
pcr. Hum Genet, 51:675–677.
Cross, R. A. et Stewart, M. (1990). Structural predictions for the central domain
of dystrophin. FEBS Lett, 262:87–92.
Dalakas, M. C. et Hohlfeld, R. (2003). Polymyositis and dermatomyositis. Lancet,
362:971–82.
Davison, M. D. et Critchley, D. R. (1988). alpha-actinins and the dmd protein
contain spectrin-like repeats. Cell, 52:159–160.
De-Angelis, F. G., Sthandier, O., Berarducci, B., Toso, S., Galluzzi, G.,
Ricci, E., Cossu, G. et Bozzoni, I. (2002). Chimeric snrna molecules carrying
BIBLIOGRAPHIE
77
antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin premrna induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in delta 48-50
dmd cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 9:9456–61.
Den Dunnen, J. T. et Grootscholten, P. M. (1989). opography of the duchenne
muscular dystrophy (dmd) gene : Fige and cdna analysis of 194 cases reveals 115
deletions and 13 duplications. Am J Hum Genet, 45:835–847.
Denti, M. A., Rosa, A. et al (2006). Body-wide gene therapy of duchenne muscular
dystrophy in the mdx mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A, 103:3758–63.
Diehl, M., Munz, C., Keilholz, W., Stevanovic, S. et Holmes, N. (1996). Nonclassical hla-g molecules are classical peptide presenters. Curr Biol, 6:305–14.
Dietz, H. C., Valle, D., Francomano, C. A., Kendzior, R. J., Pyeritz, R. E.
et Cutting, G. R. (1998). The skipping of constitutive exons in vivo induced by
nonsense mutations. Science, 259:680–683.
Dominic, J. W., Aurora, F. et Kim, E. W. (2002). Immunological hurdles in the
path to gene therapy for duchenne muscular dystrophy. ISSN, pages 1462–3994.
Duchenne, G. B. A. (1861). De l’électrisation localisée et de son application à la
pathologie et à la thérapeutique, pages 837–870. Paris, Chez J.-B. Ballière.
Duchenne, G. B. A. (1868). De la paralysie musculaire pseudo-hypertrophique ou
paralysie myo-sclérosique. Paris, Chez J.-B. Ballière.
Duvivier-Kali, V. e. a. (2001). Complete protection of islets against allorejection and
autoimmunity by a simple barium-alginate membrane. Diabetes, 50(8):1698–1705.
Eagle, M. (2002). Report on the muscular dystrophy campaign workshop : exercise
in neuromuscular diseases newcastle. Neuromuscul Disord, 12:975–983.
Ehmsen, J. et Poon, E. (2002). The dystrophin-associated protein complex. J Cell
Sci, 115:2801–2803.
El Fahime, E. et al (2003). Tubulyzine, a novel tri-substituted triazine, prevents the
early cell death of transplanted myogenic cells and improves transplantation success.
Biochem Cell Biol, 81:81–90.
Emery, A. E. (1970). Duchenne muscular dystrophy. genetic aspects, carrier detection
and antenatal diagnosis. J Med Genet, 7:334–7.
Emery, A. E. H. et Muntoni, F. (2003). Duchenne muscular dystrophy, pages 26–41.
Oxford : Oxford University Press, third édition.
BIBLIOGRAPHIE
78
Emslie-Smith, A. M., Arahata, K. et Engel, A. G. (1989). Major histocompatibility
complex class i antigen expression, immunolocalization of interferon subtypes, and t
cellmediated cytotoxicity in myopathies. Hum Pathol, 20:224–31.
Engel, A. et C., F. A. (1994). Myology : Basic and Clinical.
Engel, A. et Franzini, A. C. (2004). Myology : Basic and Clinical, pages 961–1000.
New York : McGraw-Hill, Medical Pub, third édition.
Eric, P. H., Robert, H. B. et Louis, M. K. (1987). Dystrophin : The protein product
of the duchenne muscular dystrophy locus. 51:919–928.
Ervasti, J. M. et Campbell, K. P. (1993). A role for the dystrophin-glycoprotein
complex as a transmembrane linker between laminin and actin. J Cell Biol, 122:809–
823.
Ervasti, J. M. et Ohlendieck, K. (1990). Deficiency of a glycoprotein component of
the dystrophin complex in dystrophic muscle. Nature, 345:315–319.
Fabb, S. A. et Wells, D. J. (2002). Adeno-associated virus vector gene transfer and sarcolemmal expression of a 144 kda micro-dystrophin effectively restores
the dystrophin-associated protein complex and inhibits myofibre degeneration in
nude/mdx mice. Hum Mol Genet, 11:733–41.
Fan, Y. et Maley, M. (1996). Rapid death of injected myoblasts in myoblast transfer
therapy. Muscle Nerve, 19:853–60.
Fanin, M., Dnieli, G. A., Cadaldini, M., Miorin, M., Vitiello, L. et Angelini,
C. (1995). Dystrophin-positive fibers in duchenne dystrophy : origin and correlation
to clinical course. Muscle Nerve, 18:1115–1120.
Feener, C. A., Koenig, M. et M., K. L. (1989). Alternative splicing of human dystrophin mrna generates isoforms at the carboxy terminus. Nature, 338:509–11.
Ferrari, G., Cusella-De Angelis, G. et al (1998). Muscle regeneration by bone
marrow-derived myogenic progenitors. Science, 279:1528–30.
Ferrer, A., Wells, K. E. et Wells, D. J. (2000). Immune responses to dystropin :
implications for gene therapy of duchenne muscular dystrophy. Gene Ther, 7:1439–
1446.
Ferrer, I. et al (2004). Proteasomal expression, induction of immunoproteasome
subunits, and local mhc class i presentation in myofibrillar myopathy and inclusion
body myositis. J Neuropathol Exp Neurol, 63:484–98.
BIBLIOGRAPHIE
79
Figarella-Branger, D., Civatte, M., Bartoli, C. et Pellissier, J. F. (2003).
Cytokines, chemokines, and cell adhesion molecules in inflammatory myopathies.
Muscle Nerve, 28:659–82.
Fisher, C. W., Fisher, C. R., Chuang, J. L., Lau, K. S., Chuang, D. T. et Cox,
R. P. (1993). Occurrence of a 2-bp (at) deletion allele and a nonsense (g-to-t) mutant
allele at the e2 (dbt) locus of six patients with maple syrup urine disease : multipleexon skipping as a secondary effect of the mutations. Am. J. Hum. Genet, 52:414–424.
Fletcher, S., Honeyman, K., Fall, A. M., Harding, P. L., Johnsen, R. D., Steinhaus, J. P., Moulton, H. M., Iversen, P. L. et Wilton, S. D. (2007). Morpholino
oligomer-mediated exon skipping averts the onset of dystrophic pathology in the mdx
mouse. Mol Ther, 15:1587–92.
Gallardo, E., de Andres, I. et Illa, I. (2001). Cathepsins are upregulated by
ifngamma/stat1 in human muscle culture : a possible active factor in dermatomyositis.
J Neuropathol Exp Neurol, 60:847–55.
Gardner, M. D. (1980). Mutation rate in duchenne type of muscular dystrophy. Br
Med Bull, 36:117–22.
Gebski, B. et al (2003). Morpholino antisense oligonucleotide induced dystrophin
exon 23 skipping in mdx mouse muscle. Hum Mol Genet, 12:1801–11.
Gershon, R. K. et Kondo, K. (1970). Cell interactions in the induction of tolerance :
the roie of thymic lymphocytes. Immunology, 18(5):723–737.
Ghosh, A., Yue, Y. et al (2006). Viral serotype and the transgene séquence influence
overlapping adeno-associated viral (aav) vector-mediated gene transfer in skeletal
muscle. J Gene Med, 8:298–305.
Gibson, R. A., Hajiampour, A., Murer-Orlando, M., Buchwald, M. et
Mathew, C. G. (1993). A nonsense mutation and exon skipping in the fanconianaemia group c gene. Hum. Mol. Genet, 2:797–799.
Goebels, N., Michaelis, D., Wekerle, H. et Hohlfeld, R. (1992). Human myoblasts as antigen-presenting cells. J Immunol, 149:661–7.
Goldsby, R. A., Kindt, T. J. et al (2000). Kuby immunology.
Gorecki, D. e. a. (1992). Expression of four alternative dystrophin transcripts in brain
regions regulated by different promoters. Hum Mol Genet, 1:505–510.
Goyenvalle, A. et al (2004). Rescue of dystrophic muscle through u7 snrna-mediated
exon skipping. Science, 306:1796–9.
BIBLIOGRAPHIE
80
Greenwald, R., Freeman, G. et Sharpe, A. (2005). The b7 family revisited. Annu
Rev Immunol, 23:515–48.
Grounds, M. D. et McGeachie, J. K. (1992). Skeletal muscle regeneration after
crush injury in dystrophic mdx mice : an autoradiographic study. Muscle Nerve,
15:580–586.
Guerette, B. et al (1997). Prevention by anti-lfa-1 of acute myoblast death following
transplantation. J Immunol, 159:2522–31.
Guerette, B. et Asselin, I. (1997). Control of inflammatory damage by anti-lfa-1 :
increase success of myoblast transplantation. Cell Transplant, 6:101–107.
Guerette, B. et Skuk, D. (1997). Prévention by anti-lfa-1 of acute myoblast death
following transplantation. J Immunol, 159:2522–31.
Gussoni, E., Bennett, R. R. et al (2002). Long-term persistence of donor nuclei in a
duchenne muscular dystrophy patient receiving bone marrow transplantation. J Clin
Invest, 110:807–14.
Gussoni, E., Pavlath, G. K., Lanctot, A. M., Sharma, K. R., Miller, R. G.,
Steinman, L. et Blau, H. M. (1992). Normal dystrophin transcripts detected in
duchenne muscular dystrophy patients after myoblast transplantation. Nature, 356:
435–438.
Gussoni, E. et Soneoka, Y. (1999). Dystrophin expression in the mdx mouse restored
by stem cell transplantation. Nature, 401:390–4.
Hammonds, R. G. (1987). Protein sequence of dmd gene is related to actin-binding
domain of alpha-actinin. Cell, 51.
Hardiman, O., Faustman, D., Li, X., Sklar, R. M. et Brown, J. r. (1993). Expression of major histocompatibility complex antigens in cultures of clonally derived
human myoblasts. Neurology, 43:604–8.
Heemskerk, H. et al (2009). In vivo comparison of 2’-o-methylphosphorothioate
and morpholino antisense oligonucleotides for duchenne muscular dystrophy exon
skipping. J Gene Med, 11:257–66.
Hemmings, L. et Kuhlman, P. A. (1992). Analysis of the actin-binding domain of
alpha-actinin by mutagenesis and demonstration that dystrophin contains a functionally homologous domain. J Cell Biol, 6:1369–1380.
Hiraishi, Y. et Kato, S. (1992). Quantitative southern blot analysis in the dystrophin
gene of japanese patients with duchenne or becker muscular dystrophy : a high frequency of duplications. Am J Hum Genet, 29:897–901.
BIBLIOGRAPHIE
81
Hoffman, E. P., Morgan, J. E., Watkins, S. C. et Partidge, T. A. (1990). Somatic
reversion/suppression of the mouse mdx phenotype in vivo. J Neurol Sci, 99:9–25.
Hohlfeld, R. et Engel, A. G. (1990). Lysis of myotubes by alloreactive cytotoxic
t cells and natural killer cells. relevance to myoblast transplantation. J Clin Invest,
86b:370–4.
Hohlfeld, R. et Engel, A. G. (1991). Coculture with autologous myotubes of cytotoxic t cells isolated from muscle in inflammatory myopathies. Ann Neurol, 29:498–
507.
Hohlfeld, R. et Engel, A. G. (1994). The immunobiology of muscle. Immunol
Today, 15:269–74.
Howell, J. M. et Fletcher, S. (1997). Use of the dog model for duchenne muscular
dystrophy in gene therapy trials. Neuromuscul Disord, 7:325–328.
Hu, X. Y. et Ray, P. N. (1990). Duplicational mutation at the duchenne muscular dystrophy locus : its frequency, distribution, origin, and phenotypegenotype correlation.
Am J Hum Genet, 46:682–695.
Huard, J. et Acsadi, G. (1994). Gene transfer into skeletal muscles by isogenic
myoblasts. Hum Gene Ther, 8:949–58.
Huard, J. e. a. (1992). Human myoblast transplantation between immunohistocompatible donors and recipients produces immune reactions. Transplant Proc, 24:3049–
3051.
Inukai, A. et al (2000). Expression of hla-dr and its enhancing molecules in muscle
fibers in polymyositis. Muscle Nerve, 23:385–92.
Ito, H. et Hallauer, P. L. (1998). Prior culture with concanavalin a increases intramuscular migration of transplanted myoblast. Muscle Nerve, 21:291–297.
Jackson, M. J. et Jones, D. A. (1984). Experimental skeletal muscle damage : the
nature of the calcium- activated degenerative processes. Eur J Clin Invest, 14:369–
374.
Jerry, R. M., Katherine, C., R.K., L., Zarife, S.and Chris Shilling, M., Sarah,
L., Dawn, B., Steven, G., Chengwen, L., G., G., M., V., C., B., Reed Clark,
K., L., J., Xiao Xiao, M., Jade, S., M.P.M., Scott, W. M., Jude, S. et W.,
C. M. (2010). Dystrophin immunity in duchenne’s muscular dystrophy. N Engl J
Med, 363.
Jung, D. et Yang, B. (1995). Identification and characterization of the dystrophin
anchoring site on beta-dystroglycan. J Biol Chem, 270:27305–27310.
BIBLIOGRAPHIE
82
Karpati, G. et al (1993). Myoblast transfer in duchenne muscular dystrophy. Ann
Neurol, 34:8–17.
Karpati, G. et Pouliot, Y. (1989). Dystrophin is expressed in mdx skeletal muscle
fibers after normal myoblast implantation. Am J Pathol, 135:27–32.
Karpati, G., Pouliot, Y. et Carpenter, S. (1988). Expression of immunoreactive
major histocompatibility complex products in human skeletal muscles. Ann Neurol,
23:64–72.
Kaufman, R. J. (1999). Correction of genetic disease by making sense from nonsense.
J Clin Invest, 104:367–8.
Kilimann, M. W. et Pizzuti, A. (1992). Point mutations and polymorphisms in the
human dystrophin gene identified in genomic dna sequences amplified by multiplex
pcr. Hum Genet, 89:253–258.
Kinali, M. et al (2009). Local restoration of dystrophin expression with the morpholino oligomer avi-4658 in duchenne muscular dystrophy : a single-blind, placebocontrolled, dose-escalation, proof-of-concept study. Lancet Neurol, 8:918–928.
Kinoshita, L., Roy, R. et al (1996). Myoblast transplantation in monkeys : control
of immune response by fk506. J Neuropathol Exp Neurol, 55:687–97.
Kinoshita, L. et Vilquin, J. T. (1994). Immunosuppression with fk 506 insures good
success of myoblast transplantation in mdx mice. Transplant Proc, 26:3518.
Klein, C. J., Coovert, D. D., Bulman, D. E., Ray, P. N., Mendell, J. R. et
Burghes, A. M. (1992). Somatic reversion/suppression in duchenne muscular dystrophy (dmd) : evidence supporting a frame-restoring mechanism in rare dystrophinpositive fibers. Am J Hum Genet, 50:950–959.
Koenig, M. et Beggs, A. H. (1989). The molecular basis for duchenne versus becker
muscular dystrophy : correlation of severity with type of deletion. Am J Hum Genet,
45:498–506.
Koenig, M. et Hoffman, E. P. (1987). Complete cloning of the duchenne muscular
dystrophy (dmd) cdna and preliminary genomic organization of the dmd gene in
normal and affected individuals. Cell, 50:509–517.
Koenig, M., Monaco, A. P. et Kunkel, L. M. (1988). The complete sequence of
dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein. Cell, 53:219–228.
Kumamoto, T. et al (1997). Calpain and cathepsins in the skeletal muscle of inflammatory myopathies. Eur Neurol, 37:176–81.
BIBLIOGRAPHIE
83
Lafreniere, J. F. et Mills, P. (2004). Growth factors improve the in vivo migration
of human skeletal myoblasts by modulating their endogenous proteolytic activity.
Transplantation, 77:1741–1747.
Lafreniere, J. F. et Mills, P. (2006). Interleukin-4 improves the migration of human
myogenic precursor cells in vitro and in vivo. Exp Cell Res, 312:1127–1141.
Laws, N. and, C.-N. R. A., Irwin, N., Johnsen, R., Fletcher, S., Wilton, S. D.
et Hoey, A. J. (2008). Long-term administration of antisense oligonucleotides into
the paraspinal muscles of mdx mice reduces kyphosis. J Appl Physiol, 105:662–8.
Lebranchu, Y. (2004). Tolérance, aspects théoriques et cliniques : implications pour
la transplantation. Actualités néphrologiques, pages 283–299.
Lechler, R., Garden, O. et Turka, L. (2003). The complementary roles of de le
lion and regulation in transplantation tolerance. Nat Rev Immunol, 3(2):147–158.
Lederfein, D. et al (1992). A 71-kilodalton protein is a major product of the duchenne
muscular dystrophy gene in brain and other nonmuscle tissues. Proc Natl Acad Sci
USA, 89:5346–50.
Lefaucheur, J. P. et Pastoret, C. (1995). Phenotype of dystrophinopathy in old
mdx mice. Anat Rec, 242:70–76.
Levine, B. A. et Moir, A. J. (1990). The interaction of actin with dystrophin. FEBS
Lett, 263:159–162.
Li, X. C. et al (2000). The role of t cell apoptosis in transplantation tolerance. Curr
Opin Immunol, 12(5):522–527.
Lin, H. e. a. (1993). Long-term acceptance of major histocompatibility complex mismatched cardiac allografts induced by ctla41g plus donor-specific transfusion. J Exp
Med, 178(5):1801–1806.
Little, W. J. (1853). On the nature and treatment of the deformities of the human
frame. London.
Lochmuller, H., Petrof, B. J. et al (1996). Transient immunosuppression by
fk506 permits a sustained high-level dystrophin expression after adenovirus-mediated
dystrophin minigene transfer to skeletal muscles of adult dystrophic (mdx) mice.
GeneTher, 3:706–16.
Love, D. R. et Byth, B. C. (1993). Dystrophin and dystrophin-related proteins : a
review of protein and rna studies. Neuromuscul Disord, 3:5–21.
BIBLIOGRAPHIE
84
Love, D. R., Flint, T. J., Genet, S. A., Middleton-Price, H. R. et Davies,
K. E. (1991). Becker muscular dystrophy patient with a large intragenic dystrophin
deletion : implications for functional minigenes and gene therapy. J. Med. Genet,
28:860–864.
Love, D. R. et Hill, D. F. (1989). An autosomal transcript in skeletal muscle with
homology to dystrophin. Nature, 339:55–58.
Lu, Q. L. et Mann, C. J. (2003). Functional amounts of dystrophin produced by
skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nat Med, 9:1009–14.
Lu, Q. L., Morris, G. E., Wilton, S. D., Ly, T., Artem’yeva, O. V., Strong, P. et
Partridge, T. A. (2000). Massive idiosyncratic exon skipping corrects the nonsense
mutation in dystrophic mouse muscle and produces functional revertant fibers by
clonal expansion. The Journal of Cell Biology, 148:985–995.
Mann, C. J. et Honeyman, K. (2002). Improved antisense oligonucleotide induced
exon skipping in the mdx mouse model of muscular dystrophy. J Gene Med, 4:644–54.
Mann, C. J., Honeyman, K. et al (2001). Antisense-induced exon skipping and
synthesis of dystrophin in the mdx mouse. Proc Natl Acad Sci U S A, 98:42–47.
Mantegazza, R., Hughes, S. M., Mitchell, D., Travis, M., Blau, H. M. et Steinman, L. (1991). Modulation of mhc class ii antigen expression in human myoblasts
after treatment with ifn-gamma. Neurology, 41:1128–32.
Matsumura, K. et Tome, F. M. (1993). Deficiency of dystrophin-associated proteins in duchenne muscular dystrophy patients lacking cooh-terminal domains of
dystrophin. J Clin Invest, 92:866–871.
Matsuo, M. et Masumura, T. (1991). Exon skipping during splicing of dystrophin
mrna precursor due to an intraexon deletion in the dystrophin gene of duchenne
muscular dystrophy kobe. J Clin Invest, 87:2127–2131.
Mauro, A. (1961). Satellite cell of skeletal muscle fiber. J Biophys Biochem Cytol,
9:493–5.
McDiarmid, S. V., Busuttil, R. W. et al (1995). Fk506 (tacrolimus) compared with
cyclosporine for primary immunosuppression after pédiatrie liver transplantation.
results from the u.s. multicenter trial. Transplantation, 59:530–6.
Melis, M. A., Montoni, F., Cau, M., Loi, D., Puddu, A., Boccone, L., Mateddu,
A., Cianchetti, C. et Cao, A. (1998). Novel nonsense mutation in exon 72 of the
dystrophin gene leading to exon skipping in a patient with mild dystrophinopathy.
Hum. Mutat., Suppl.1:S137–S138.
BIBLIOGRAPHIE
85
Mendell, J. R., Campbell, K., Rodino-Klapac, L., Sahenk, Z., Shilling, C.,
Lewis, S., Bowles, D., Gray, S., Li, C., Galloway, G., Malik, V., Coley, B.,
Clark, K. R., Li, J., Xiao, X., Samulski, J., McPhee, S. W., Samulski, R. J.
et Walker, C. M. (2010). Dystrophin immunity in duchenne’s muscular dystrophy.
N Engl J Med, 363:1429–1437.
Mendell, J. R. et Kissel, J. T. (1995). Myoblast transfer in the treatment of duchenne’s muscular dystrophy. N Engl J Med, 333:832–838.
Merly, F. et Huard, C. (1998). Anti-inflammatory effect of transforming growth
factor-betal in myoblast transplantation. Transplantation, 65:793–9.
Merly, F., Huard, C., Asselin, I., Robbins, P. et Tremblay, J. (1998). Antiinflammatory effect of transforming growth factor-betal in myoblast transplantation.
Transplantation, 65:793–799.
Meryon, E. (1851). On fatty degeneration of the voluntary muscles (report of the
Royal Medical and chirurgical society). Lancet, 2:588–589.
Meryon, E. (1852). On granular and fatty degeneration of the voluntary muscles. Med
Chirurg Trans, 35:73–84.
Michaelis, D., Goebels, N. et Hohlfeld, R. (1993). Constitutive and cytokineinduced expression of human leukocyte antigens and cell adhesion molecules by human myotubes. Am J Pathol, 143:1142–9.
Monaco, A. P. et Neve, R. L. (1986). Isolation of candidate cdnas for portions of the
duchenne muscular dystrophy gene. Nature, 323:646–50.
Moss, F. et Leblond, C. (1971). Satellite cells as the source of nuclei in muscles of
growing rats. Anat Rec, 170:421–35.
Mukoyama, M. et al (1987). Life spans of duchenne muscular dystrophy patients in
the hospital care program in japan. J Neurol Sci, 81:155–8.
Muntoni, F., Torelli, S. et Ferlini, A. (2003). Dystrophin and mutations : one
gene, several proteins, multiple phenotypes. Lancet Neurol, 2:731–40.
Nagaraju, K. (2001). Immunological capabilities of skeletal muscle cells. Acta Physiol
Scand, 171:215–23.
Nagaraju, K., Raben, N., Merritt, G., Loeffler, L., Kirk, K. et Plotz, P.
(1998). A variety of cytokines and immunologically relevant surface molecules are
expressed by normal human skeletal muscle cells under proinflammatory stimuli. Clin
Exp Immunol, 113:407–14.
BIBLIOGRAPHIE
86
Naylor, J. A., Green, P. M., Rizza, C. et Giannelli, F. (1993). Analysis of factor
viii mrna defects in everyone of 28 haemophilia a patients. Hum. Mol. Genet, 2:11–17.
Nicholson, L., Davidson, K., Johnson, M. A., Slater, M., Young, C., Battacharya, S. et Gardner-Medwin, D. (1989). Immunoreactivity in patients with
xp2l muscular dystrophy. J Neurol Sci, 94:137–146.
Nicholson, L. V. B., Bushby, K. M. D., Johnson, M. A., denDunnen, T., Ginjaar, I. B. et Ommen, V. G. (1992). Predicted and observed sizes of dystrophin in
some patients that disrupt the open reading frame. J Med Genet, 29:892–896.
Niemann-Seyde, S. et Slomski, R. (1992). Molecular genetic analysis of 67 patients
with duchenne/becker muscular dystrophy. Hum Genet, 90:65–70.
Nudel, U. e. a. (1989). Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in
muscle and brain. Nature, 337:76–78.
Ohlendieck, K. et Campbell, K. P. (1991). Dystrophin-associated proteins are
greatly reduced in skeletal muscle from mdx mice. J Cell Biol, 115:1685–1694.
Ohlendieck, K. et Matsumura, K. (1993). Duchenne muscular dystrophy : deficiency of dystrophin-associated proteins in the sarcolemma. Neurology, 43:795–800.
oshizawa, S., Fourmy, D. et Puglis, J. D. (1998). Structural origins of gentamicin
antibiotic action. EMBO J, 17:6437–48.
Palmer, E., Wilhelm, J. M. et Sherman, F. (1979). Phenotypic suppression of
nonsense mutants in yeast by aminoglycoside antibiotics. Nature, 277:140–50.
Partridge, T. (1991). Animal models of muscular dystrophy–what can they teach
us ? Neuropathol Appl Neurobiol, 17:353–363.
Partridge, T. A. et al (1989). Dconversion of mdx myofibres from dystrophinnegative to -positive by injection of normal myoblasts. Nature, 337:176–179.
Pastoret, C. et Sebille, A. (1995). mdx mice show progressive weakness and muscle
détérioration with âge. J Neurol Sci, 129:97–105.
Pelot, M. R. et al (1999). Lymphohematopoietic graft-vs.-host reactions can be
induced without graft-vs.-host disease in murine mixed chimeras established with a
cyclophosphamide-based nonmyeloablative conditioning regimen. Biol Blood Marrow
Transplant, 5:133–43.
Petschner, F. e. a. (1998). Constitutive expression of bcl-xl or bcl-2 prevents peptide
antigen-induced t cell deletion but does not influence t cell homeostasis after a viral
infection. Eur J Immunol, 28(2):560–569.
BIBLIOGRAPHIE
87
Pie, J., Casals, N., Casale, C., Buesa, C., Mascaro, C., Barcelo, A., Rolland,
M. O., Zabot, T., Haro, D. et Eyskens, F. (1997). A nonsense mutation in the
3-hydroxy-3-methylglutaryl-coa lyase gene produces exon skipping in two patients
of different origin with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coa lyase dificiency. Biochem,
323:329–335.
Politano, L. et al (2003). Gentamicin administration in duchenne patients with
premature stop codon. preliminary results. Acta Myol, 22:15–21.
Prior, T. W. et Papp, A. C. (1993). Identification of two point mutations and a one
base deletion in exon 19 of the dystrophin gene by heteroduplex formation. Hum Mol
Genet, 2:311–313.
Prud’homme, G. J., Lawson, B. R., Chang, Y. et Theofilopoulos, A. N. (2001).
Immunotherapeutic gene transfer into muscle. Trends Immunol, 22:149–55.
Rando, T. A. (2007). Non-viral gene therapy for duchenne muscular dystrophy :
progress and challenges. Biochim Biophvs Acta, 1772:263–71.
Roberts, R. G. et Bobrow, M. (1992). Point mutations in the dystrophin gene. Proc
Natl Acad Sci U S A, 89:2331–2335.
Roberts, R. G., Gardner, R. J. et Bobrow, M. (1994). Searching for the 1 in
2,400,000 : a review of dystrophin gene point mutations. Hum Mutat, 4:1–11.
Romero, N. B. et Braun, S. (2004). Phase i study of dystrophin plasmid-based gene
therapy in duchenne/becker muscular dystrophy. Hum Gene Ther, 15:1065–76.
Roy, R., Dansereau, G., Tremblay, J. P., Belles-Isles, M. et Huard, J. (1991).
Expression of major histocompatibility complex antigens on human myoblasts. Transplant Proc, 23:799–801.
Roy, R., Tremblay, J. P. et al. (1993). Antibody formation after myoblast transplantation in duchenne-dystrophic patients, donor hla compatible. Transplant Proc,
25:955–7.
Révillard, J. P. (2001). Immunologie, pages 147–152. DB Université. Paris, Bruxelles.
Schmidt, J., Rakocevic, G., Raju, R. et Dalakas, M. (2004). Upregulated inducible co-stimulator (icos) and icos-ligand in inclusion body myositis muscle : significance for cd8+ t cell cytotoxicity. Brain, 127:1182–90.
Schreiner, B., Voss, J., Wischhusen, J., Dombrowski, Y. et Steinle, A. (2006).
Expression of toll-like receptors by human muscle cells in vitro and in vivo : Tlr3
is highly expressed in inflammatory and hiv myopathies, mediates il-8 release and
up-regulation of nkg2d-ligands. Faseb, 20:118–20.
BIBLIOGRAPHIE
88
Schultz, E. (1996). Satellite cell proliferative compartments in growing skeletal muscles. Dev Biol, 175:84–94.
Schwartz, R. (1996). Models oft cell anergy : is there a common molecular mechanism ? J Exp Med, 184(1):1–8.
Sharabi, Y. et Sachs, D. H. (1989). Engraftment of allogeneic bone marrow following administration of anti-t cell monoclonal antibodies and low-dose irradiation.
Transplant Proc,, 21:233–5.
Sherratt, T. G., Vulliamy, T., Dubowitz, V., Sewry, C. A. et Strong, P. N.
(1993). Exon skipping and translation in patients with frameshift deletions in the
dystrophin gene. Am. J. Hum. Genet., 53:1007–1015.
Shiga, N., Takeshima, Y., Sakamoto, H., Inoue, K., Yokata, Y., Yokoyama, M.
et Masafumi, M. (1997). Disruption of the splicing enhancer sequence within exon
27 of the dystrophin gene by a nonsense mutation induces partial skipping of the exon
and is responsible for becker muscular dystrophy. J. Clin. Invest, 100:2204–2210.
Shimizu, T. K., Matsumura, K., Hashimoto, K., Mannen, T., Ishigure, T.,
Eguchi, C. et Nonaka, I. (1988). A monoclonal antibody against a synthetic
polypeptide fragment of dystrophin. Proc Jpn Acad, 64:205–208.
Sicinski, P., Geng, Y., Ryder-Cook, A. S., Barnard, E. A., Darlison, M. G.
et Barnard, P. J. (1989). The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx
mouse : a point mutation. Science, 244:1578–1580.
Simard, L. R. et Gingras, F. (1992). Deletions in the dystrophin gene : analysis of
duchenne and becker muscular dystrophy patients in quebec. Hum Genet, 89:419–
424.
Singh, A., Ursic, D. et Davies, J. (1979). Phenotypic suppression and misreading
saccharomyces cerevisiae. Nature, 277:146–8.
Skuk, D. et al (1999). Successful myoblast transplantation in primates depends on
appropriate cell delivery and induction of regeneration in the host muscle. Exp Neurol,
155:22–30.
Skuk, D. et al (2002). Efficacy of myoblast transplantation in nonhuman primates
following simple intramuscular cell injections : toward defining strategies applicable
to humans. Exp Neurol, 175:112–26.
Skuk, D. et Goulet, M. (2000). Myoblast transplantation in whole muscle of nonhuman primates. J Neuropathol Exp Neurol, 59:197–206.
BIBLIOGRAPHIE
89
Skuk, D. et Goulet, M. (2002). Effïcacy of myoblast transplantation in nonhuman
primates following simple intramuscular cell injections : toward defining stratégies
applicable to humans. Exp Neurol, 175:112–126.
Skuk, D. et Goulet, M. (2006). Use of repeating dispensers to increase the efficiency
of the intramuscular myogenic cell injection procédure. Cell Transplant, 15:659–663.
Skuk, D. et Roy, B. (2004). Dystrophin expression in myofibers of duchenne muscular
dystrophy patients following intramuscular injections of normal myogenic cells. Mol
Ther, 9:475–482.
Skuk, D. et Tremblay, J. P. (2000). Progress in myoblast transplantation : a potential
treatment of dystrophies. Microsc Res Tech, 48:213–222.
Sloan-Lancaster, J., Steinberg, T. et Allen, P. (1996). Selective activation of the
calcium signaling pathway by altered peptide ligands. J Exp Med, 184(4):1525–1530.
Specht, L. A. et Beggs, A. H. (1992). Prediction of dystrophin phenotype by dna
analysis in duchenne/becker muscular dystrophy. Pediatr Neurol, 8:432–436.
Stan, A. C., Casares, S., Brumeanu, T. D., Klinman, D. M. et Bona, C. A.
(2001). Cpg motifs of dna vaccines induce the expression of chemokines and mhc
class ii molecules on myocytes. Eur J Immunol, 31:301–10.
Starzl, T. et Zinkernagel, R. (2001). Transplantation tolerance from a historical
perspective. Nat Rev Immuno1, 1(3):233–239.
Sugiura, T., Kawaguchi, Y., Harigai, M., Takagi, K. et Ohta, S. (2000). Increased cd40 expression on muscle cells of polymyositis and dermatomyositis : role
of cd40-cd40 ligand interaction in il-6, il-8, il-15, and monocyte chemoattractant
protein-1 production. J Immunol, 164:6593–600.
Suzuki, A. et Yoshida, M. (1992). Glycoprotein-binding site of dystrophin is confined
to the cysteine- rich domain and the first half of the carboxy-terminal domain. FEBS
Lett, 308:154–160.
Thanh, L. T., Man, N. T., Helliwell, T. R. et Morris, G. E. (1995). Characterization of revertant muscle fibers in duchenne muscular dystrophy, using exon-specific
monoclonal antibodies against dystrophin. Am. J. Hum. Genet., 56:725–731.
The McGraw-Hill Companies, I. (1999). http://academic.kellogg.cc.mi.us/
herbrandsonc/bio201_McKinley/muscular.htm. [Online].
Tomita, Y. et al (1989). Establishment of a novel method to induce tolerance in adult
mice across fully allogeneic (entire h-2 plus multiminor histocompatibility) antigen
BIBLIOGRAPHIE
90
barriers, using supralethal irradiation followed by injection of syngeneic bone marrow
cells plus (donor x recipient) f1 spleen cell. Immunobiology, 197:214–29.
Tortora, G. J. et Grabowski, S. R. (1994).
d’Anatomie et de Physiologie.
Le Tissu Musculaire. Principe
Tremblay, J. P. et al (1993). Results of a triple blind clinical study of myoblast
transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with duchenne
muscular dystrophy. Cell Transplant, 2:99–112.
Tremblay, J. P. et Skuk, D. (2001). Engineering myoblast transplantation. Graft,
4:558–70.
Tyler, K. L. (2003). Origins and early descriptions of duchenne muscular dystrophy.
Muscle Nerve, 28:402–22.
Valentine, B. A., Winand, N. J., Pradhan, D., Moise, N. S., de Lahunta, A.,
Kornegay, J. N. et Cooper, B. J. (1992). Canine x-linked muscular dystrophy as
an animal model of duchenne muscular dystrophy : a review. Am. J. Med. Genet.,
42:352–356.
Vilquin, J. T. et Kennel, P. F. (2001). Electrotransfer of naked dna in the skeletal
muscles of animal models of muscular dystrophies. Gene Ther, 8:1097–107.
Vilquin, J. T. e. a. (1995). Successful histocompatible myoblast transplantation in
dustrophin-deficient mdx mouse despite the production of antibodies against dystrophin. J Cell Biol, 131:975–988.
Vincent, A. (2002). Unravelling the pathogenesis of myasthenia gravis. Nat Rev
Immunol, 2:797–804.
Wagner, K. R. et al (2001). Gentamicin treatment of duchenne and becker muscular
dystrophy due to nonsense mutations. Ann Neurol, 49:706–11.
Wang, B. et Li, J. (2000). Adeno-associated virus vector carrying human minidystrophin genes effectively améliorâtes muscular dystrophy in mdx mouse model. Proc
Natl Acad Sci U S A, 97:13714–9.
Wang, Z. et al (2007). Sustained aav-mediated dystrophin expression in a canine
model of duchenne muscular dystrophy with a brief course of immunosuppression.
Mol Ther, 15:1160–6.
Warrens, A. N. et al (1994). Myoblasts fail to stimulate t cells but induce tolerance.
Int Immunol, 6:847–53.
BIBLIOGRAPHIE
91
Watchko, J., O’Day, T. et al (2002). Adeno-associated virus vector-mediated
minidystrophin gene therapy improves dystrophic muscle contractile fonction in mdx
mice. Hum Gene Ther, 13:1451–60.
Way, M. et Pope, B. (1992). Expression of the n-terminal domain of dystrophin in e.
coli and demonstration of binding to f-actin. FEBS Lett, 301:243–245.
Welch, E., Goetz, D. et Almstead, N. (2008). Reading through premature stop
codons with ptc1 24. project catalyst to find more duchenne drugs. interview by
guenter scheuerbrandt. Acta Myol, 27:63–8.
Welch, E. M. et al (2007). Ptc124 targets genetic disorders caused by nonsense
mutations. Nature, 447:87–91.
Wells, D. J., Ferrer, A. et Wells, K. E. (2002). Immunological hurdles in the path
to gene therapy for duchenne muscular dystrophy. Expert Rev Mol Med, 4:1–23.
Wernig, A. et Irintchev, A. (1995). Bystander damage of host muscle caused by
implantation of mhc-compatible myogenic cells. TJ Neurol Sci, 130:190–6.
Wiendl, H. et al (2000). Muscle fibers in inflammatory myopathies and cultured myoblasts express the nonclassical major histocompatibility antigen hla-g. Ann Neurol,
48:679–84.
Wiendl, H. et al (2003a). Antigen processing and presentation in human muscle :
cathepsin sis critical for mhc class ii expression and upregulated in inflammatory
myopathies. J Neuroimmunol, 138:132–43.
Wiendl, H. et al (2003b). Human muscle cells express a b7-related molecule, b7h1, with strong negative immune regulatory potential : a novel mechanism of counterbalancing the immune attack in idiopathic inflammatory myopathies. Faseb J,
17:1892–4.
Wiendl, H. et al (2003c). Muscle fibres and cultured muscle cells express the b7.1/2related inducible co-stimulatory molecule, icosl : implications for the pathogenesis of
inflammatory myopathies. Brain, 126:1026–35.
Wiendl, H., Hohlfeld, R. et Kieseier, B. C. (2005). Immunobiology of muscle :
advances in understanding an immunological microenvironment. Trends Immunol,
26:373–80.
Wiendl, H., Mitsdoerffer, M., Schneider, D., Chen, L. et Lochmuller, H.
(2003a). Human muscle cells express a b7-related molecule, b7-h1, with strong negative immune regulatory potential : a novel mechanism of counterbalancing the immune attack in idiopathic inflammatory myopathies. Faseb, 17a:1892–4.
BIBLIOGRAPHIE
92
Wiendl, H., Mitsdoerffer, M., Schneider, D., Melms, A. et Lochmuller, H.
(2003b). Muscle fibres and cultured muscle cells express the b7.1/2-related inducible
co-stimulatory molecule, icosl : implications for the pathogenesis of inflammatory
myopathies. Brain, 126b:1026–35.
Wilton, S. D., Dye, D. E. et Lainy, N. G. (1997). Dystrophin gene transcripts
skipping the mdx mutation. Muscle Nerve, 20a:728–734.
Winnard, A. V., Klein, C. J., Coovert, D. D., Prior, T., Papp, A., Snyder, P.,
Bulman, D. E., Ray, P. N., McAndrew, P. et King, W. (1993). Characterization
of translational frame exception patients in duchenne/becker muscular dystrophy.
Hum. Mol. Genet, 2:737–744.
Wong, P. Y. et Cheung, W. Y. (1979). Calmodulin stimulates human platelet phospholipase a2. Biochem Biophys Res Commun, 90:473–480.
Xiao, X. et Li, J. (1996). Efficient long-term gene transfer into muscle tissue of immunocompetent mice by adeno-associated virus vector. J Virol, 70:8098–108.
Yamada, A. e. a. (1996). Long-term acceptance of major histocompatibility complexmismatched cardiac allograft induced a low dose of ctla41gm plus fk506. Microbiol Immunol, 40(7):513–518.
Yao, C. C. et Ziober, B. L. (1996). Laminins promote the locomotion of skeletal
myoblasts via the alpha 7 integrin receptor. J Cell Sci, 109:3139–3150.
Yokota, T., Lu, Q. et Morgan, J. E. (2006). Expansion of revertant fibers in dystrophic mdx muscles reflects activity of muscle precursor cells and serves as an index
of muscle regeneration. J Cell Sci, 119:2679–2687.