Bases cellulaires et moléculaires de physiologie et technique d
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Bases cellulaires et moléculaires de physiologie et technique d’investigations Module 2: Système cardiovasculaire Hypertension artérielle: rein et balance sodique Bernard Rossier Département de Pharmacologie et de Toxicologie de l’UNIL Mardi 11 mai 2004 Hypertension artérielle: rein et balance sodique 1. Le sodium et le contrôle de l’osmolalité du liquide extracellulaire 2. Variations de l’apport de sel dans la nourriture et ses conséquences sur la pression artérielle: concept de sensibilité vs resistance au sel 3. Hypertension artérielle sensible au sel: role du rein et physiologie de la cellule cible à l’aldostérone 4. Deux exemples de techniques d’investigation expérimentale pour l’identification des gènes de susceptibilté dans la cellule cible et leur étude fonctionnelle 310 mOsm/l: le sodium est le cation principal qui détermine l’osmolarité du liquide extracellulaire et le potassium celle du liquide intracellulaire Na 140 mEq/l Na 10 mEq/l K 4 mEq/l K 150 mEq/l Liquide Extracellulaire 11.5l(16.5%) Os, conjonctif, transcellulaire 7l (10.5%) Liquide Intracellulaire 23 l (33% poids corporel) La concentration de Na (140mEq/l)) dans le liquide extracellulaire varie peu (+/- 2%) malgré de grande variation (60 x) dans la quantité de NaCl dans la nourriture de 0.5 à 30 g NaCl par jour La balance sodique est indispensable pour maintenir l’osmolalité et le volume du liquide extracellulaire en particulier le volume du plasma sanguin (4.5 l) qui est un des élément-clé du contrôle de la pression sanguine Hypervolémie----pression artérielle s’élève Hypovolémie----pression artérielle s’abaisse Hypertension artérielle: rein et balance sodique 1. Le sodium et le contrôle de l’osmolalité du liquide extracellulaire 2. Variations de l’apport de sel dans la nourriture et ses conséquences sur la pression artérielle: concept de sensibilité vs resistance au sel 3. Hypertension artérielle sensible au sel: role du rein et physiologie de la cellule cible à l’aldostérone 4. Deux exemples de techniques d’investigation expérimentale pour l’identification des gènes de susceptibilté dans la cellule cible et leur étude fonctionnelle Pression artérielle sanguine • Très variable – – – – – Age Sexe Moment de la journée Activité Ethnicité Pression artérielle sanguine • Pression « normale » 120 mmHg /80 mm Hg Systolique/diastolique • OMS Hypertension si: systolique > 140 ou diastolique> 90 Plusieurs mesures sur 24h (Remmler) Au lever,assis, le matin avant toute activité Prévalence de l ’hypertension artérielle en fonction de l ’age, du sexe et de l ’ethnicité Dans la population la variation de la pression artérielle se distribue selon une courbe de Gauss avec une tres large déviation standard Hypertension (1): une maladie silencieuse mais à risques • Très fréquente • Risque d ’infarctus, d ’attaque cérébrale (hémorrhagie), d ’insuffisance cardiaque et rénale • Coûts élevés Hypertension (2) : une maladie multifactorielle • Facteurs génétiques • Facteurs non génétiques – – – – – Excès de poids Manque d ’ exercice physique Médicament Fumée Sel Na resistant Na sensitive La sensibilité au sel augmente la probabilité de faire une hypertension Relation entre consommation de sel et hypertension artérielle L ’étude américaine DASH démontre qu ’une réduction en dessous de ce qui est actuellement recommandé (6g/j) est favorable pour diminuer la pression artérielle DASH Study « As compared with the control diet with a high sodium level, the DASH diet with a low sodium level led to a mean systolic blood pressure that was 7.1 mm Hg lower in participants without hypertension, and 11.5 mm Hg lower in participants with hypertension. Conclusions: The reduction of sodium intake to levels below the current recommendation of 100 mmol per day and the DASH diet both lower blood pressure substantially, with greater effects in combination than singly » Sacks et al (NEJM, 344, p3-10, 2001) Effets de la réduction de la consommation de sel sur la pression artérielle dans un large échantillon (>500) de la population humaine 9g/j 6g/j 3g/j Pression systolique Pression diastolique Réponse individuelle à la consommation de sel chez le volontaire jeune et en bonne santé Change in mean arterial pressure (%) Blood pressure was measured after a 7-day period of 0.25 g/d Na+ and then successive 3-day periods of 7, 14 or 18, and 28 or 34 g/d. Luft et al., Circulation., 60, 697 (1979) +30 +25 30% des normotendus et 50% des hypertendus sont sensibles au sel. +20 +1 5 +1 0 +5 0 -5 0.25 7 14 28 Daily sodium intake (g) Gènes de susceptibilité ou de sensibilité au sel Si l ’on augmente leur consommation de sel... Denton et al. Nature Medicine 1, 1009 (1995) A colony of 26 chimpanzees was divided in two groups that matched for sex and age. After one year of baseline observation, salt was added in increasing amounts to the diet of the experimental group (from 0.1 g/day to 15 g/day) during 20 months. Augmention significative (+15mmHg) chez 60% des animaux Reversible Reversible Resistance et sensibilité au sel: facteurs génétiques Hypertension artérielle: rein et balance sodique 1. Le sodium et le contrôle de l’osmolalité du liquide extracellulaire 2. Variations de l’apport de sel dans la nourriture et ses conséquences sur la pression artérielle: concept de sensibilité vs resistance au sel 3. Hypertension artérielle sensible au sel: role du rein et physiologie de la cellule cible à l’aldostérone 4. Deux exemples de techniques d’investigation expérimentale pour l’identification des gènes de susceptibilté dans la cellule cible et leur étude fonctionnelle Métabolisme du NaCl: absorption intestinale et excrétion rénale Le Chemin du Sel à travers le Corps Humain Rein Sel Absorption intestinale suit les apports: peu ou pas de contrôle Excrétion rénale: contrôlée = facteur limitant Urine γ Sel α β Canal ENaC Homéostasie du mileu extracellulaire: c ’est le rein qui joue le role-clé Sensibilité au sel: concept des gènes de susceptibilité Le rein est l’organe qui assure la balance sodique et potassique Le rein exprime des genes de sensibilité ou de resistance au sel: transporteurs de sodium et régulaeur de ces transporteurs Des mutations dans ces gènes augmentent ou diminuent leur fonction Sensibilité au sel: concept des gène de susceptibilité •Des mutations très peu fréquentes dans la population (<<1%) sont responsables des maladies monogéniques. •Des mutations plus fréquentes dans la population (>1%)(SNPs) seraient responsables du phénotype de sensibilité au sel dans l’hypertension essentielle ( maladies polygéniques) Le rein filtre 180 litres de fluide par jour…. C’est le rein qui contrôle et ajuste le sel et l’eau qui doivent etre éliminés en fonction de ce qui est Principal ingéré Cell Intercalated Cell Nous urinons 1,5 L/jour (0.5 --- 20 L) Transport transépithélial du sodium et du potassium dans la cellule principale du tube cortical collecteur (CCD) Role d’ENaC dans la physiopathologie de l’hypertension sensible au sel Liddle’s syndrome Early onset of severe hypertension Hypokalaemia Metabolic alkalosis Negligible aldosterone secretion Low plasma renin activity Autosomal dominant inheritance Pseudohypoaldosteronism type 1 (PHA-1) Salt wasting, dehydration, hypotension Hyperkalaemia Metabolic acidosis Increased plasma aldosterone level High plasma renine activity Autosomal dominant or recessive inheritance ENaC regulation by Nedd4-2 α β α α γ β PY PY Interaction C 2 WW 1 WW3 Nedd4-2 ubiquitination PY C 2 WW 4 γ PY PY PY WW 2 α WW 1 WW 2 WW3 WW 4 HEC T HECT Internalization and/or degradation (proteasome/lyzosome) Hypertension artérielle: rein et balance sodique 1. Le sodium et le contrôle de l’osmolalité du liquide extracellulaire 2. Variations de l’apport de sel dans la nourriture et ses conséquences sur la pression artérielle: concept de sensibilité vs resistance au sel 3. Hypertension artérielle sensible au sel: role du rein et physiologie de la cellule cible à l’aldostérone 4. Deux exemples de techniques d’investigation expérimentale pour l’identification des gènes de susceptibilté dans la cellule cible et leur étude fonctionnelle Technique 1:clonage moléculaire d’un gène par expression fonctionnelle d’ENaC et de CAP dans l’ovocyte de Xenopus Ne pas confondre Clonage d’un gène Clonage d’une cellule Clonage d’un organisme Technique 1:clonage moléculaire d’un gène par expression fonctionnelle d’ENaC et de CAP dans l’ovocyte de Xenopus cDNA = copie d’un RNA (en général codant pour une protéine fonctionnelle) en DNA grace à une transcriptase inverse d’origine virale (« reverse transcriptase ») Libraire de cDNA: l’ensemble des copies des messagers transcrits dans une cellule donnée 105-106 mRNAs/cellule 103-104 mRNAs différent/cellule (1 copie à 1000 copies du même messager/cellule Technique 1:clonage moléculaire d’un gène par expression fonctionnelle d’ENaC et de CAP dans l’ovocyte de Xenopus Librairie cDNA et clonage : plusieurs techniques • purification du mRNA (historique---globine!) • expression dans un système cellulaire (levure) et détection de la proteine par un anticorps spécifique • expression in silico par une approche génomique--Expressed sequence tag (EST)--- connaissance a priori de la protéine à cloner. EST ne couvrent que rarement l’ensemble des transcrits d’une cellule (mRNA rares (< 5 copies /cellule) Technique 1:clonage moléculaire d’un gène par expression fonctionnelle d’ENaC et de CAP dans l’ovocyte de Xenopus • Expression fonctionnelle (physiologique) dans un système cellulaire (ex ovocyte)---- pas de connaissance a priori de la proteine à cloner. Peut permettre de cloner des cDNA faiblement représentés dans la cellules (canaux ionique, enzyme) Technique 1:clonage moléculaire d’un gène par expression fonctionnelle d’ENaC et de CAP dans l’ovocyte de Xenopus • Clonage d’ENaC par expression fonctionnelle (physiologique) dans un système cellulaire (ex ovocyte) 1. Tissu le plus riche en molécules actives ------- colon de rat sous régime pauvre en sel Technique 1:clonage moléculaire d’un gène par expression fonctionnelle d’ENaC et de CAP dans l’ovocyte de Xenopus • Clonage d’ENaC par expression fonctionnelle (physiologique) dans un système cellulaire (ex ovocyte) 2. Essai physiologique simple: mesure électrique du courant sodium induit par l’expression du canal a sodium (voltage clamp) Technique 1:clonage moléculaire d’un gène par expression fonctionnelle d’ENaC et de CAP dans l’ovocyte de Xenopus • Clonage d’ENaC par expression fonctionnelle (physiologique) dans un système cellulaire (ex ovocyte) 3. Fractionner le RNA pour isoler la fraction la plus active dans l’essai physiologiques et faire une librairie cDNA de cette fraction. La librairie est ensuite insérée dans un vecteur (pSPORT) qui peut être amplifiée dans la levure et le mRNA extrait pout test dans l’ovocyte Technique 1:clonage moléculaire d’un gène par expression fonctionnelle d’ENaC et de CAP dans l’ovocyte de Xenopus • Clonage d’ENaC par expression fonctionnelle (physiologique) dans un système cellulaire (ex ovocyte) 4. Fractionner la librairie en pools (par ex 10 pools contenant chacun 5000 clones indépendants) et refaire l’essai fonctionnel dans l’ovocyte jusqu’à l’isolement d’un clone unique qui sera alors séquencé pour identification de la protéine Mesure du transport de sodium dans l ’ovocyte de Xenopus Macroscopic sodium channel current of ENaC in X.laevis oocytes injected with α,β and γ cRNAs (Nature,1994) ENaC:propriétés biochimiques • protéine: (α,β,γ) trois sous unités homologue 30% homologie •Superfamille de gènes: ENaC/degenerin •Topologie membranaire: deux domaines TM • stoechiométrie: heterotetramère (αβαγ) ENaC: structure hétérotétramérique α γ α β α β γ out α in side view top view Clonage par complémentation fonctionnelle pour l’identification de régulateur d’ENaC Technique 2: Transcriptome de la cellule rénale et sa régulation par l’aldostérone par la technique de SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) Identification du transriptome dans la cellule rénale apical basolateral MR par MR cloning complé mentation compléMR GR fonctionnelle CAP1 GR GR MR ENaC 11β 11β HSD2 GR Aldosterone Cortisol K+ Sgk1 mRNA AIP Na+ ARP 2K+ K+ ENaC Sgk1 Nedd 4 3Na+ α β SAGE Na,K-ATPase SAGE génère deux types de données SAGE Transcriptome Genes exprimés différentiellement SAGE: background 105-106 mRNAs/cellule Genome mammifère ~ 40’000 genes DNA mRNA Longueur moyenne d’ transcrit - 1,5 Kb Principe du SAGE : - un tag de10 bp peut distinguer plus de106 mRNAs 410 = 1’048’576 Lignée cellulaire mpkCCD -un modele cellulaire pour le mécanisme d’action de l’aldosterone mpkCCD - a clone of principal cells of the cortical collecting duct derived from a transgenic mouse (SV40 large T antigen under the control of the SV40 enhancer/L-type pyruvate kinase promoter). A.Vandewalle and coll. (1999) JASN v.10 (5) SAGE: principes Controle AAAA AAAA AAA A AAAA AAAA AAAA AAAA AAAA mRNA extraction Aldo AAAA AAAA AAAA AAAA AAAA AAAA AAAA AAAA Generation des tag SAGE (10-bp) Concatemèrisation des tags Sequençage et comparaison de l’abondance des tags SAGE: résumé des données de séquençage different tags Library Control Aldosterone 4 h Vasopressin 4 h Total tags Different tags 16’000 14’000 12’000 10’000 8’000 6’000 4’000 2’000 0 0 number of sequenced tags 37’937 62’218 67’968 168’123 14’610 40’000 80’000 120’000 sequenced tags GenBank identification of AITs/ARTs and VITs/VRTs Aldosterone 4 h 18 15 33 Vasopressin 4 h 7 17 37AIT/29ART -known genes 36 49VIT/11VRT -ESTs -no match Northern blot and RT-PCR analysis of a selection of AITs/ARTs Northern-blot RT-PCR GILZ 11.1 x AIT135 1.24 x α-ENaC 1.9 x ART146 0.62 x GAPDH x-fold changes at 4h co nt Al rol d Al o 3 0 do ’ A l 4h do 24 h co nt Al rol d Al o 3 0 do ’ A l 4h do 24 h γ-actin x-fold stimulation at 4h
