Rôle de la chimiokine MEC/CCL28 dans la domiciliation des

INRA Tours-Nouzilly, 22 Avril 2010
Rôle de la chimiokine MEC/CCL28 dans la
domiciliation des plasmocytes à IgA dans la glande
mammaire
Berri Mustapha
Unité de Recherches IASP
Équipe LIM, INRA Centre
Tours-Nouzilly
Immunité lactogène
Immunité des muqueuses passive et humorale
transmise par le lait maternel
• La protection des muqueuses est assurée par le lait maternel grâce à
sa richesse en IgA
• Les IgA sont secrétés par des plasmocytes dites à IgA ou IgA-ASCs
Souris
IgA
20 Truie
12
Truie
16
8
12
T
8
IgM 4
IgG
4
0
80 100F
F1 5
2
Ig cell number/0.26mm
2
T cell number/0.26mm
• Recrutement dans la mamelle au cours de la lactation
15 19 25
DAY (gestation or Lactation)
Tanneau et al. J. Histo. Chem. 1999
Chabaudie et al. Res. Vet. Sci. 1993
Recrutement des lymphocytes T-CD3/β7 et IgA/β7
dans la glande mammaire de souris en relation avec
l’expression de MAdCAM-1
mating
70000
parturition
pregnancy
lactation
60000
80
50000
70
*
*
40000*
50
*
30000
60
*
*
*
*
40
30
20000
20
*
10000
*
0
Virgin
*
10
*
*
4 7
12
19
4
12
18
4
Stage of development of mammary gland (day)
MECA 32
MECA 367
CD3+/β7+
IgA+/β7+
Tanneau et al. J. Histo. Chem. 1999
cell number / mm²
stained area (µm2) / mm²
*
weaning
involution
90
Contribution d’un autre facteur chemo-attractant pour
le recrutement des IgA-ASCs dans la glande
mammaire au cours de la lactation ?
|
Quels sont les facteurs possibles?
z
Découverte d’un facteur chemoattractant dans le
colostrum de souris vis à vis des IgA-ASCs
purifiées à partir du MLN
z
Mise en évidence dans le lait de truie d’un peptide
chémoattractant pour les lymphocytes B
z
Mise en évidence de cytokines de faible poids
moléculaire ayant une activité chemoattactante
Les chemokines
z
Classification Chemokines/Récepteurs
Migration et Domiciliation des Lymphocytes
Modèle à plusieurs étapes d’adhésion et de passage au
niveau de l’endothélium
MAdCAM-1/α4β7
VCAM-1/α4β1
Plasmocytes à IgA
CCL25/CCR9
CCL28/CCR10
Une cascade d’étapes d’adhésion et d’activation faisant intervenir l’interaction entre les adressines
vasculaires, les chemokines et leurs récepteurs respectifs pour assurer le trafic des cellules de
l’immunité (Butcher and Picker, 1996; Kunkel and Butcher, 2003)
Chambre de Boyden et test de migration
Migration et domiciliation des lymphocytes
Migration et domiciliation
des lymphocytes
2
M
0.95 kb
AR
1
Nm
co
lo
n
Clonage de l’ADNc de la « Mucosae-Associated
Epithelial Chemokine » (MEC/CCL28) d’ARN de glande
salivaire (1) et de colon (2) de porc
CCL28 présente une homologie de séquence
avec les chimiokines CCL28 identifiées dans
différentes espèces
Sus scrofa
Homo sapiens
Macaca mulatta
Mus musculus
Rattus norvegicus
Sus scrofa
Homo sapiens
Macaca mulatta
Mus musculus
Rattus norvegicus
1
ILPIASSCCT
ILPIASSCCT
ILPIASSCCT
ILPMASSCCT
ILPIASSCCT
Sus scrofa
Homo sapiens
Macaca mulatta
Mus musculus
Rattus norvegicus
58
LIKQWMKEQA
TVKQWMKVQA
TVKQWMKVQA
TLKQWMRASE
TLKRWMSASE
EVSHHISRRL
EVSHHISRRL
EVSHHISRRL
EVSHHVSGRL
EVSHHIPRRL
AKKDAKGNIC
AKKNGKGNVC
AKKNGKGNAC
VKKNGRENVC
MK-NGKENLC
LERVNTCRLQ
LERVNMCRIQ
LERVNTCHIQ
LERVSSCSIQ
LERVNSCSIQ
HKKKHHSKRN
HRKKHHGKRN
HRKKHHSKRN
SGKKQPSRKD
PRKKQDSGKD
S1
MQHTGLALVA
MQQRGLAIVA
MQQTGLAIMA
MQQAGLTLMA
MQQAGLTLVA
RADGDCDLAA
RADGDCDLAA
RADGDCDLAA
RADGDCDLAA
RADGDCDLAA
SKGAHQEKHSNRAHQGKHSNRAHQGKHRKGHTTRKHRKGHTPRKHG
S22
LAACVALHHS EA
LAVCAALHAS EA
LAICAALHAS EA
VAVCVAFQTS EA
VAVCVAFRTS EA
VILHVKRRRI
VILHVKRRRI
VILHVKRRRI
VILHVKRRRI
VILHVKRRRI
57
CVSPHNH
CVSPHNH
CVSPHNH
CISPHNR
CVSPHNP
--------ET
--------ET
--------ET
-----RTRGT
KHGTRRIHGT
105
HGHKTPY
YGHKTPY
YDHKTPY
HRHEASR
HDHEAPR
Préparation et purification de CCL28 recombinante
Migrating cells number (±SEM)/
4 microscopic fields
Chemoattraction sur la lignée L14
DNAK
fMLP
MEC
15
**
*
10
*
**
5
0
RPMI
10-6
10-7
pCCL28 (M)
Production d’un anticorps anti-CCL28 par
immunisation génique
10-8
Distribution différentielle des ARNm de CCL28 et de CCL25 par
RT-PCR dans différents tissus muqueux (Berri et al. Mol. Immunol.
1
CCL28/MEC
0.5
0
1 2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14
1.5
1
CCL25/TECK
0.5
Salivary
glands
Small intestine
Large
intestine
Nasal
mucosa
Skin
Thymus
MLN
9 10 11 12 13 14
Rectum
8
Caecum
7
Colon
6
Peyer’s patch
5
Ileum
4
Jejunum
3
Duodenum
2
Sublingual gland
1
Submandibular gland
0
Parotid gland
Ratio of CCL25/cyclophilin mRNA Ratio of CCL28/cyclophilin mRNA
2008)
Expression de CCL28 dans la glande mammaire en
lactation et dans le lait de la truie
Sow Mammary gland
1.00
Meurens et al. Vet. Immunol.
Immunopathol. 2006; Berri et al.
Mol. Immunol. 2008
TECK/CCL25
0.75
Chemokine (Log ratio to cyclophilin)
MEC/CCL28
0.50
0.25
0.00
-0.25
-0.50
-0.75
-1.00
-1.25
-40
-30
-20
-10
F
10
20
30
40
Berri et al. Mol. Immunol. 2008
A
Analyse de CCL28 en Western Blot dans du
lait de truie (L20) et celui de la femme (L30)
B
X400
Sow milk
Analyse en Immunohistochimie de
CCL28 dans la glande mammaire
Human milk
-50
Stage of development of mammary gland (day before or after farrowing)
Sow milk
-60
Human milk
-1.50
-125
3
4
X400
A: La protéine CCL28 est détectée au niveau des
cellules épithéliales et dans le lumen où le lait est
excrété. B: Aucune réaction n’est observée avec le
contrôle isotypique.
1
2
Les échantillons de lait ont été analysés en SDSPAGE et révélés avec l’Ac anti-CCL28 (1 et 2) ou
avec le contrôle isotypique (3 et 4).
Expression de CCR10
différents tissus muqueux
et
CCL28
dans
(bp)
500
400
300
CCL28 (384-bp)
500
400
200
CCR10 (280-bp)
6
7
Small intestine
8
9 10
Large
intestine
11
12
13
14
Skin
Nasal
mucosa
5
Thymus
4
MLN
1 2
3
Salivary
glands
1 : parotide, 2 : glande submandibulaire, 3 : glande sublinguale, 4 : duodénum, 5 :
jéjunum, 6 : iléum, 7 : Plaques de Peyer, 8 : colon, 9 : caecum, 10 : rectum, 11 : MLN,
12 : thymus, 13 : peau, 14 : muqueuse nasale
Expression de CCR9 et CCL25 dans différents
tissus muqueux
500
400
300
CCR9 (446-bp)
1
2
Salivary
glands
3
*
4
5
6
7
Small intestine
8
9
*
10 11 12 13 14
Large
intestine
Skin
Nasal
mucosa
* *
Thymus
*
MLN
500
400
300
CCL25 (453-bp)
1 : parotide, 2 : glande submandibulaire, 3 : glande sublinguale, 4 : duodénum, 5 :
jéjunum, 6 : iléum, 7 : Plaques de Peyer, 8 : colon, 9 : caecum, 10 : rectum, 11 : MLN,
12 : thymus, 13 : peau, 14 : muqueuse nasale
Expression de CCR10 en comparaison avec
CCR9 au cours du développement de la glande
mammaire de truie
Cyclo (369-bp)
CCR10 (280-bp)
CCR9 (446-bp)
2
3
Gestation
4
5
6
7
Lactation
8
9
Weaning
1
1 : 50 jours G; 2 : 83 jours G; 3 : 105 jours G; 4 : 113 jours G; 5 : 3 jours L; 6 : 9 jours L;
7 : 16 jours L, 8 : 20 jours L, 9 : 3 jours après le sevrage.
La chimiokine CCL28 est impliquée dans le
transfert des IgA maternelles au nouveau-né
Wilson E. , Butcher E., J. Exp. Med. 2004
CCR10 est indispensable pour l’accumulation
des IgA-ASC dans la glande mammaire en
lactation
Cas des souris CCR10/KO
Morteau et al., J. Immunol. 2008
Conclusions
|
Caractérisation
des
différents
compartiments
systémiques et muqueux du système immunitaire du
porc
z
Un compartiment aérien supérieur VCAM-1/ α4β1
et CCL28/CCR10
z
Un compartiment muqueux intestinal MAdCAM-1/
α4β7, CCL25/CCR9 et CCL28/CCR10
|
Un lien immun entéro-mammaire MAdCAM-1/α4β7 et
CCL28 /CCR10
|
Un lien immun entre le tractus aérien supérieur et
la mamelle VCAM1/α4β1 et CCL28 / CCR10
Modèle de migration des plasmocytes à IgA entre les
différents compartiments muqueux
Vitamine A
Acide rétinoic
(Mora et al. 2006, Science
Agace 2006, Nat. Rev.)
Vitamine D
1,25(OH)2D3
(Sigmundsdotti et al. 2007
Nat. Immunol.)
Conclusions et Perspectives
Pour une meilleure protection du nouveau-né
|
Amélioration de l’immunité lactogène
z
Induction des plasmocytes à IgA dans les sites inducteurs
Stimulation du recrutement local au niveau de la glande
mammaire
z
|
Amélioration de la production des IgA par l’intestin du nouveau-né
Prébiotiques amplifiant la réponse immunitaire intestinale et
favorisant la flore intestinale
z
z
Probiotiques recombinants délivrant des chemokines
z
Stimulation de l’expression des récepteurs de domiciliation
UN GRAND MERCI
Équipe LIM
Claire CHEVALEYRE
Sandrine MELO
Françoise MANGIN
François MEURENS
Henri SALMON
Doctorants
Benoît LEVAST
Galliano ZANELLO
Stagiaires
INRA de Jouy-en-Josas
François LEFEVRE,
VIDO, Saskatoon Canada
Gerdts VOLKER
Institut Pasteur de Lille
Catherine DANIEL, Bruno POT