Reaction de Tembryon de Poulet au bleu trypan

Reaction de Tembryon de Poulet au bleu trypan
par F. STEPHAN1 et B. SUTTER2
Laboratoire de Zoologie et d'Embryologie experimentale, Faculte des Sciences, Strasbourg
AVEC DEUX PLANCHES
EN 1941, Ancel & Lallemand signalaient que le bleu trypan etait teratogene
pour l'embryon de Poulet. Depuis lors de nombreux chercheurs ont utilise
le
meme produit avec des resultats quelque peu differents suivant les groupes de
vertebres testes: Oiseaux, Mammiferes et Batraciens.
Ancel & Lallemand avaient dispose
le colorant sur le blastoderme de 48
heures d'incubation. Us obtinrent au bout de 24 heures des hemorragies siegeant
de preference dans la region posterieure de Faxe embryonnaire. Diverses autres
substances leur donnerent
des resultats similaires, notamment le sulfate de
strychnine choisi par Stoll (1941) pour etudier la genese et la structure de ces
hematomes. Ancel (1950) rend ces lesions primaires responsables des anomalies,
jugees secondaires, qui se manifestent
a leur niveau chez des embryons plus
ages: coelosomie pour les hemorragies de la paroi latero-ventrale, reductions
variables de l'extremite caudale (anourie, brachyourie) ou des membres poste-
rieurs. II n'exclut pas cependant la possibilite d'un mecanisme direct dans la
production des monstruosites plus tardives, car certains anoures provenant des
memes series experimentales n'avaient pas
ete porteurs d'hemorragies. Des
anomalies diverses telles que coelosomie, microphthalmie, anophthalmie,
deficiences du bee ou des membres posterieurs, et surtout anourie, se presentent
chez les embryons traites
a 24 et 48 heures par Beaudoin & Wilson (1958).
Enfin tout recemment, Mulherkar (1960) decrit chez des embryons de 2 jours
environ, traites
a des stades allant de la ligne primitive a la plaque medullaire,
des irregularites somitiques et des soufflettes au niveau desquelles le mesoderme
axial est reduit, la chorde notamment.
Les anomalies induites par le bleu trypan chez les embryons de Mammiferes
(il
y a une floraison de travaux concernant les Rongeurs) sont pour une part
celles precedemment trouvees chez l'embryon de Poulet age, mais
il en est aussi
d'autres qui touchent le coeur et les gros vaisseaux, ainsi que le systeme nerveux
central, le cerveau en particulier qui est souvent hypertrophie (hydrocephalie,
exencephalie, etc.).
Les embryons de Batraciens (Waddington & Perry, 1956) peuvent presenter
1
Author's address: Institut de Zoologie, 12, rue de l'Universite", Strasbourg, France.
2
Author's address: Institut de Physiologie, 2, rue Boussingault, Strasbourg, France.
[J. Embryol. exp. Morph. Vol. 9, Part 3, pp. 410-421, September 1961]

REACTION DES EMBRYONS AU BLEU TRYPAN 411
des blocages de la gastrulation a des degres divers, des exogastrulations plus ou
moins completes, des degenerescences tissulaires (sauf pour Pendoderme) et
des oedemes, des inhibitions du bourgeon caudal, des reductions et suppressions
de la chorde au profit des somites et, chose qui contraste avec les observations
faites chez les Mammiferes, de la microcephalie. Celle-ci est attribute a un
blocage tardif de la gastrulation.
Ainsi done, en l'absence de donnees plus completes concernant l'embryon de
Poulet, ce dernier semblait se comporter d'une maniere speciale sur deux points.
Ici pas de malformation caracterisee du systeme nerveux, pas d'anomalie
cardio-vasculaire. Ceci nous avait incites a entreprendre de nouvelles recherches
dont les premiers resultats seront rapportes dans la presente note. Outre les
faits deja signales par Ancel & Lallemand, nous avons releve des dispositions
vasculaires anormales, des strophosomies et, comme Mulherkar, des irregula-
rites dans la segmentation.
METHODES
Toutes les experiences ont ete faites sur des embryons de race Leghorn blanche,
a diverses periodes de l'annee 1959 et au debut de 1960. Les oeufs furent incubes
a la temperature de 37,5° C. Us furent ouverts suivant la technique
d'fit. Wolff.
La fenetre pratiquee dans la coquille etait refermee par un bout de ruban
adhesif. L'evolution des embryons etait suivie de jour en jour.
Le bleu trypan, qui provient des Etablissements Hollborn u. Sohne de Leipzig,
fut dissous au
1/1000 dans l'eau distillee ou le liquide physiologique de Tyrode.
L'eau distillee servit au debut de ces recherches, le liquide physiologique eut la
preference par la suite, car il permet une meilleure survie des embryons. La dose
administree variait entre 0,01 a 0,05 mg. de colorant (pour 0.01 a 0,05 cm3 de
solution). Les embryons devant servir de controles recevaient en meme quantite
de l'eau distillee ou du liquide physiologique suivant le cas. D'autres etaient
simplement ouverts et refermes.
Dans les premieres experiences, le colorant etait ou depose sur l'embryon ou
injecte dans le vitellus, auquel cas il remonte en quelques secondes et s'accumule
sous le blastoderme. Dans une deuxieme serie, il fut introduit directement dans
la cavite sous-germinale. Par cette methode on peut, en operant avec douceur,
localiser grossierement le produit sous une region donnee de rembryon, sous
sa moitie posterieure par exemple. Enfin, dans une
36me serie d'essais, le colorant
impregnait un petit bloc de gelose place sur l'embryon en un point bien localise.
La dose etait dans ce cas souvent moindre que celle indiquee precedemment.
Deux cent quarante-huit embryons ont ete traites au second jour de l'incubation
suivant l'une ou l'autre de ces modalites; 49 autres ont recu, entre 48 et 72
heures d'incubation, un cube de gelose-bleu trypan sur la region branchiale. Les
embryons ont ete fixes au formol picroacetique et dessines a la chambre claire.
Ceux destines a l'etude histologique ont ete coupes a
5 /x et colores a l'hematoxy-
line-eosine.

412
F. STEPHAN ET B. SUTTER—REACTION DES
RESULTATS
Les malformations apparues a la suite du traitement au bleu trypan sont les
unes precoces—il
s'agit d'cedemes et d'irregularites somitiques—les autres
tardives: reduction de l'extremite caudale et des membres posterieurs, flexions
anormales de la colonne vertebrate troncale et coelosomie, anomalies vasculaires.
Elles seront decrites dans cet ordre. Des anomalies du bee, des mierophthalmies
ont ete notees sporadiquement; elles ne seront pas considerees.
(Edemes
Les oedemes ont ete signales deja par Ancel & Lallemand, sur des embryons
de 3 jours traites la veille, et par Mulherkar sur des embryons bien plus jeunes
traites au stade plaque neurale, voire plus tot. Nos interventions ont ete faites
au 2tmt jour, alors que les embryons avaient forme 4-20 somites, par l'une ou
l'autre des methodes indiquees, sans qu'il y ait pour cela des differences essen-
tielles dans les resultats.
s.r.
1 m/mB
FIG. 1. CEdemes axiaux. ao., aortedorsale; b.c, bourgeon caudal;
ce., oedeme; p.s., plaque somitique; s.r., sinus rhomboidal; t.n.,
tube neural.
A ce stade, les embryons sont fragiles, la seule ouverture des ceufs est une
cause de mortalite. La plupart succombent dans les 24 heures qui suivent le
traitement; parmi eux beaucoup sont porteurs d'une vesicule en arriere de la
region segmentee. Tel embryon (fig.
1A) qui a recu une goutte de bleu trypan dans
l'eau distillee (0,05 cm3 environ) au stade de 5 paires de somites, est mort au
bout de quelques heures apres avoir forme 3 autres paires de somites — et une
vesicule. Tel autre qui a recu la meme dose dans la cavite sous-germinale a
11 somites, vivait encore 24 heures apres. II avait alors 26 paires de somites et
a leur suite la vesicule, hemorragique cette fois, les aortes posterieures s'etant
rompues. Un autre enfin a recu un cube de gelose colore sur sa region posterieure.
Apres quelques heures celle-ci etait gonflee par
1'oedeme entre le 27
6me
et dernier

EMBRYONS AU BLEU TRYPAN 413
somite et le tissu dense du bourgeon caudal; les plaques somitiques etaient
rejetees contre les parois laterales
et les aortes apparaissaient par transparence
plus pres de l'axe embryonnaire (fig.
1B). Ajoutons que des oedemes beaucoup
moins prononces siegent parfois dans la paroi lateio-ventrale (cf. Ancel, 1950).
L'examen histologique montre que
la poche se developpe entre ectoderme et
entoderme distendus (Planche 1). La region des derniers somites est parfois
legerement touchee,
les somites y apparaissent creux. Dans la poche, le tissu
nerveux garde
sa forme, s'aplatissant seulement vers son extremite en une
lame pleine. La chorde s'interrompt plus tot que le tube nerveux dont elle est
legerement ecartee. Les plaques somitiques s'amenuisent vers l'arriere et
s'ecartent l'une de l'autre. Aux endroits ou la chorde fait defaut on ne trouve
plus que des lames mesodermiques delimitant l'oedeme axial d'avec
le coelome.
La limite posterieure
de la poche est imposee par le tissu dense du bourgeon
caudal. Chez les embryons
qui n'ont pas encore developpe ce bourgeon, elle
peut deborder sur
le territoire extra-embryonnaire.
Les oedemes, hemorragiques ou non, apparaissent dans toutes les series ayant
recu du bleu trypan et seulement dans celles-la (tableau 1). Sur les 248 embryons
traites au second jour, 83, soit 33 pour cent, sont porteurs d'oedemes. On releve
23, soit 9 pour cent, d'oedemes simples et 60, soit 24 pour cent, d'oedemes
hemorragiques.
La frequence de la malformation est plus elevee lorsque le
colorant est administre dans l'eau distillee (54 pour cent) que lorsqu'il Test en
liquide physiologique (29 et 21 pour cent), tandis que le nombre d'embryons
morts precocement sans lesion apparente est
le meme a peu pres dans l'un et
l'autre cas.
Dans
les experiences d'Ancel & Lallemand, faites sur des embryons de 48
heures pourvus d'une circulation active, la premiere manifestation du colorant
etait une hemorragie partant des aortes posterieures
et se developpant en une
vesicule
du type decrit ici. A ces auteurs l'hemorragie apparaissait comme
primaire. Les resultats
de Mulherkar (1960) et les notres indiquent qu'a des
stades plus jeunes il se constitue un cedeme, qui peut se remplir de sang ulte-
rieurement. L'hemorragie
est certainement secondaire dans ce cas; peut-etre
l'est-elle aussi
a 3 jours, mais alors elle apparait pratiquement avec l'oedeme et,
plus spectaculaire que lui, elle le masque.
Lesions des somites
Les irregularites somitiques
ont ete observees bien moins souvent que les
oedemes; nous n'en avons trouve que 18 cas nets pour les 248 embryons traites.
Us se rencontrent parmi les embryons ayant
de 15 a 26 somites au moment de
l'intervention.
Alors que les somites normaux se presentent en vue dorsale sous l'aspect de
briques empilees et qu'ils se moulent sur leurs voisins et sur le systeme nerveux,
les somites leses n'ont plus
en general de tels rapports et toujours leurs angles
sont arrondis. Tantot
ces somites sont raccourcis, comme tasses (fig. 2D) et

TABLEAU
1
Resultats comparatifs de la production
d'oedemes
par le bleu trypan {BT) administre en eau distillee (BT/E.
dist.),
en liquide de Tyrode (BTj Tyrode) ou en un bloc de gelose dans le liquide physiologique {BTjgel. Tyr.)
Methode
Morts dans
les 24
heures:
Avec cedeme
Sans cedeme
TOTAL
Vivants
24
heures apres traite-
ment:
Avec cedeme
Sans cedeme
TOTAL
NOMBRE TOTAL D'EMBRYONS
E.
dist.
Nombre
d'embryons
0
4
4
0
22
22
0/
/o
0
15
15
0
85
85
26
Tyrode
Nombre
d'embryons
0
1
1
0
19
19
0/
/o
0
5
5
0
95
95
20
B.T.
E.
dist.
Nombre
d'embryons
35
18
53
3
. 14
17
0/
/o
50 26 76
4
20
24
70
B.T.
Tyrode
Nombre
d'embryons
23 21
44
5
47
52
0/
/o
24 22
46
5
49
54
96
B.T.
gel.
Tyr.
Nombre
d'embryons
17
18
35
0
47
47
21 22
43
0
57
57
82
Total
B.T.
Nombre
d'embryons
75 57
132
8
108
116
0/
/o
30
23
53
3
44
47
248
on
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