Peptides d`élastine et régulation de la réponse immune
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UNIVERSITE DE REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE U.F.R. DE PHARMACIE ANNEE 2011 THESE Présentée le 13 décembre 2011 en vue de l’obtention du DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE REIMS CHAMPAGNE ARDENNE Discipline : Immunologie Par Aurélie DUPONT Née le 21 Février 1984 à Charleville-Mézières (08) Peptides d'élastine et régulation de la réponse immune : rôle sur les fonctions biologiques des polynucléaires neutrophiles au cours de la BPCO et sur les fonctions effectrices des cellules dendritiques. JURY Rapporteurs Dr. Marc DIEDERICH (Luxembourg) Pr. Jacques AUBRY (Nantes) Examinateurs Dr. Christophe CARNOY (Lille) Pr. François LEBARGY (Reims) Directeur de thèse Co-Directeur de thèse Dr. Richard LE NAOUR (Reims) Dr. Frank ANTONICELLI (Reims) REMERCIEMENTS Je tiens tout d‟abord à remercier le Pr. J.Aubry et le Dr. M.Diederich d‟avoir accepté d‟être les rapporteurs de ce travail de thèse. Je remercie également le Dr. C.Carnoy d‟avoir accepté de juger ce travail. Je remercie le Pr M.Guenounou de m‟avoir accueillie au sein de son laboratoire Immunité et inflammation de l‟épithélium respiratoire EA4303 et de m‟avoir fourni les moyens de mener cette recherche à bien. Je remercie les Dr R.Le Naour et F.Antonicelli de m‟avoir proposé ce sujet de recherche et de m‟avoir fait confiance pour le mener à son terme. Je remercie Valérie Gafa pour ses conseils scientifiques aussi nombreux que précieux, pour son sourire, sa bonne humeur, son humour mais aussi ses coups de gueule toujours bien placés. Merci de m‟avoir soutenue, voire supportée tout au long de ces années y compris dans les moments plus difficiles. Je remercie Stéphanie Héry-Huynh pour son sourire et sa gentillesse. Je remercie le Pr François Lebargy pour m‟avoir permis de recruter les patients dans son service mais aussi pour avoir accepté de juger ce travail. Et je remercie aussi le docteur Sandra Dury pour son aide précieuse dans le recrutement des patients mais aussi pour sa gentillesse. Merci également à l‟ensemble des patients et sujets recrutés lors de cette étude qui m‟ont permis de réaliser ce travail. Je remercie aussi l‟ensemble des infirmières du service hospitalier de pneumologie pour le temps qu‟elles m‟ont accordé et toujours avec le sourire. Je remercie le Professeur E.Toulmonde pour avoir mis à ma disposition les ressources du service de cytaphérèse de l‟Etablissement Français du Sang Nord de France de Reims, pour l‟approvisionnement en matériel biologique nécessaire à la réalisation de ce travail. Merci également à l‟ensemble du personnel de l‟EFS pour sa gentillesse et sa disponibilité. Merci enfin aux donneurs anonymes qui ont permis la réalisation de mes recherches. Je remercie le Pr. P.N’Guyen d‟avoir mis à notre disposition le matériel d‟élutriation qui nous a permis d‟obtenir le matériel biologique nécessaire à cette étude. Et je remercie surtout Catherine Mace pour m‟avoir fourni les monocytes d‟élutriation, ainsi que pour sa disponibilité et son sourire. Je tiens aussi à remercier Thomas Baranek pour sa gentillesse et sa patience a toute épreuve, Fred Velard, pour son humour et sa présence en cas de besoin qui m‟ont été très utiles. Tous deux m‟ont permis de démarrer ce travail. Je remercie Chantal Grimplet, qui est toujours là pour nous aider, toujours patiente et d‟une gentillesse incomparable, sans elle ce labo ne fonctionnerait pas aussi bien. Je remercie Karine Sénéchal, qui m‟a accompagnée durant mes études supérieures, sans qui je n‟aurais pas eu le cran d‟affronter la fin de mon DEA, elle saura de quoi je parle. C‟est probablement aussi grâce à nos pauses cafés que j‟ai fini ce travail (mais pas grâce aux « formations » auxquelles elle m‟a trainée d‟ailleurs pour cela je ne te remercie toujours que très moyennement, mais cela nous a appris que des champs de moutons existaient ;-) au moins ça fait des souvenirs). Je remercie Christelle Cassan pour les fous rires, les déménagements, les bonbons, entre autre… J‟ai tenu la 1ère année et demie grâce à toi (oui : pffff je sais) et le reste du temps, à distance tu l‟as passé à supporter mes grognements par mail et téléphone et puis tu es probablement celle qui aura lu mon manuscrit le plus souvent. Accroches toi maintenant que tu es revenue, c‟est moi qui subirai tes mails de grognements promis ! Et surtout ta spéciale dédicace (oui je le fais : et sans faute sauf si toi tu t‟es plantée) : supercalifragilistic-expialidocious. Je remercie Mehdi Sellami et Ch i e e C i Do iw , pour avoir fait vivre le 3ème étage. Et tout les étudiants présents ou passés qui ont permis de mettre un peu de vie : Denise, Hedi, Stéphane, Elodie, Sophie, Amandine, Flo, Hélène, Jérome, Lydia, Léa, ainsi que tous les membres de nos midis pizzas et pardon à ceux que j‟oublie. Je voudrais aussi remercier mes parents qui m‟ont toujours soutenue et supportée. Je vous aime. Mes grands-parents qui m‟ont élevée, c‟est grâce à eux que j‟en suis là, je vous aime de tout mon cœur. Je remercie aussi mon petit frère que j‟adore malgré ses goûts parfois étranges notamment en matière de foot, et nos prises de bec, tu me fais toujours mourir de rire, garde le sens de l‟humour surtout si tu viens en fac tu en auras besoin. Je pense aussi au reste des membres de ma famille qui m‟ont soutenue aussi : Martine (tu es devenue ma marraine sans aucune hésitation) et André. Mes cousins-cousines et leur progéniture, Kevin et Hugo, Jérémy et sa puce Eugénie, Gauthier et sa petite Colline qui grandit vite, Laetitia et sa « petite Jess ». Je veux aussi remercier mes deux meilleures amies, Juju, je te connais depuis toujours et c‟est rare de ne jamais se perdre de vue je te remercie d‟être toujours restée une amie parfaite. Mélie, on a passé notre adolescence ensemble et malgré les moments difficiles de cette période je ne garde que de très bon souvenirs je te souhaite le meilleur, si quelqu‟un le mérite c‟est bien toi ! LISTE DES ABREVIATIONS -1- LISTE DES ILLUSTRATIONS -6- Contexte scientifique et présentation du manuscrit -10- INTRODUCTION -13- I. De l’élastine aux peptides d’élastine (PE) : naissance d’une "matrikine" A. B. Synthèse de l’élastine -15- 1. Le gène de l’élastine (Schéma 1) -15- 2. La tropoélastine -16- 3. Les microfibrilles -18- 4. L’élastogenèse -19- 5. Structure de l’élastine mature -22- Peptides d’élastine : genèse et fonctionnalité -24- 1. Les peptides d’élastine -24- 2. Le récepteur canonique à l’élastine -25- a) Les sous-uni é du é ep eu à ’é b) Le voie de ign i ion dépend n e de ’EBP -30- c) Le à ’é -31- u e é ep eu ine ine II. La réponse immune innée et adaptative : les médiateurs cellulaires et solubles A. -14- -27- -33- Les polynucléaires neutrophiles (PN) -34- 1. Ontogenèse, différenciation et maturation -34- 2. Caractéristiques biologiques des PN -35- 3. Rôle des PN au cours de l’inflammation -37- 4. Les médiateurs de l’inflammation sécrétés par les PN -38- B. a) Les protéases -38- b) Les cytokines et les chimiokines -39- Les cellules dendritiques (CD) -46- 1. Ontogenèse des CD -46- a) La lignée myéloïde -47- b) La lignée lymphoïde -47- c) Les CD dérivées de monocytes -48- 2. Caractéristiques fonctionnelles des CD a) C p u e de ’An igène -48-48- b) Maturation des cellules dendritiques et apprêtement de ’ n igène -50- c) -52- Migration des CD d) P é en ion de ’ n igène ux LT : la synapse immunologique -53- e) -55- Maturation des CD et transduction du signal CD et tolérance immunologique -58- a) La tolérance centrale -58- b) La tolérance périphérique -59- c) Tolérance périphérique et CD tolérogéniques -60- III. PE et régulation de la réponse inflammatoire et immune -63- 3. A. Inflammation, élastases et PE -63- B. PE et polarisation de la réponse lymphocytaire T -63- C. PE et inhibition des effets inflammatoires induits au niveau du monocyte et des mélanocytes -64- D. PE et pathologies inflammatoires chroniques : modèle de la Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) -65- 1. Définition et prise en charge de la BPCO -65- 2. BPCO, réponse inflammatoire et exacerbation -66- 3. Génèse de la BPCO -68- 4. PE et BPCO -69- 5. PN et BPCO -69- 6. CD et BPCO -70- BUT DU TRAVAIL -71- MATERIELS ET METHODES -73- I. Isolement des PN de patients BPCO et de sujets non BPCO A. Isolement des polynucléaires totaux humains B. Analyse de la pureté et de la proportion de polynucléaires neutrophiles au sein des polynucléaires totaux -74-74-76- 1. Principe de la technique de cytométrie en flux -76- 2. Marquage des PN et analyse de la pureté -78- II. Mise au point d’un modèle de cellules dendritiques immatures obtenues à partir de monocytes d’élutriation A. Isolement de monocytes humains par la technique d’élutriation à contre-courant -80- -80- 1. La technique d’élutriation à contre-courant : le principe -80- 2. Elutriation des monocytes humains -82- B. Purification des monocytes par technique de billes magnétiques -82- C. Analyse de la pureté des monocytes CD14+ obtenus après tri magnétique -83- D. Différenciation des monocytes CD14+ en CD immatures -84- 1. -84- Préparation des cellules 2. Vérification de la différenciation des monocytes en CD immatures -84- E. Protocole de maturation des CD immatures -85- 1. -85- Préparation des cellules 2. Vérification de la différenciation des CD immatures en CD matures -86- III. Tri cellulaire de lymphocytes T CD4+ autologues pour les tests de présentation d’antigène par les CD matures -87- A. Principe du tri cellulaire par cytométrie en flux -87- 1. Préparation des cellules -88- 2. Analyse des populations cellulaires -89- 3. Tri des lymphocytes T CD3+CD4+ -90- RESULTATS -91- Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD -92- Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of human dendritic cells with tolerogenic features -123- DISCUSSION GENERALE - CONCLUSION -162- BIBLIOGRAPHIE GENERALE -167- Liste des abréviations LISTE DES ABREVIATIONS °C : Degrès Celsius AA : Acide aminé AAA : Anévrisme Aortique Abdominal Ac : Anticorps ADN : Acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire Ag : Antigène AMPc : Adénosine MonoPhosphate cyclique Akt : Protéine kinase B AP- : Activator Protein -APC : Allophycocyanine ARN : Acide Ribonucléique ARNm : Acide Ribonucléique messager Bcl-XL : B-cell lymphoma BPCO : Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive c-src : Cellular-src CBP : Creb Binding Protein CD- : Cluster of Differentiation CD : Cellule Dendritique CDi : Cellule Dendritique immature CDp : Cellule Dendritique plasmacytoïde CDt : Cellule Dendritique tolérante cm : centimètre CMH : Complexe Majeur d‟Histocompatibilité 1 Liste des abréviations CPA : Cellule présentatrice d‟antigène CRE : Cis Response Element CRP : C-Reactive Protein CTLA-4 : Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4 CXCR1 : CXC chemokine receptor type 1 CXCR2 : CXC chemokine receptor type 2 DC-SIGN : Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-integrin EBP : Elastin Binding Protein ERK 1/2 : Extracellular signal-Regulated protein Kinase 1/2 FAK : Focal Adhesion Kinase Fc : Fragment cristallisable FEV : Forced Expiratory Volume -FITC : Fluorescéine isothiocyanate FVC : Forced Vital Capacity G-CSF : Granulocyte Colony Stimulating Factor GM-CSF : Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor GMPc : Guanosine MonoPhosphate cyclique GOLD : Global initiative for chronic-Obstructive Lung Disease GRE : Glucocorticoide Response Element GRO-α : Growth Regulated Oncogen alpha h : Heure H-2M : H2-Macroglobulin HLA- : Human Leukocyte Antigen HNF-1 : Hepatocyte Nuclear Factor 1 I-κB : Inhibitor of NF-κB ICAM : Intracellular Cell Adhesion Molecule 2 Liste des abréviations IDO : Indoleamine-2,3-dioxygenase IFN- : Interféron IgM : Immunoglobuline M IGF-1 : Insulin Growth Factor 1 IKK : I-κB Kinase IL : Interleukine ILT-3 : Immunoglobulin-like Transcript 3 IP-10 : Inducible Protein 10 IRF-1 : Interferon Regulatory Factor 1 JNK : Jun N-terminal Kinase kDa : kilo Dalton km : kilomètre KO : Knock Out LB : Lymphocyte B LBA : Lavage Broncho-Alvéolaire LC : Langerhans Cell LPS : Lipopolysaccharide LT : Lymphocyte T LTc : Lymphocyte T cytotoxique LTh : Lymphocyte T helper LTreg : Lymphocyte T régulateur m : mètre M-CSF : Macrophage Colony Stimulating Factor MAGP-1 : Microfibril Associated Glycoprotein 1 MAGP-2 : Microfibril Associated Glycoprotein 2 MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase 3 Liste des abréviations MCP-1 : Monocyte Chimioattractant Protein 1 MEC : Matrice Extra-Cellulaire MEK 1/2 : MAPK/ERK Kinase 1 et 2 min : minute MIP-3α : Macrophage Inflammatory Protein 3 alpha ml : Millilitre MMP : Matrix Metalloproteinase MPO : Myéloperoxydase MT6-MMP : Membrane-Type 6 Matrix Metalloproteinase NADPH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate NE : Neutrophil Elastase Neu-1 : Neuraminidase-1 NF-κB : Nuclear Factor-κB NF-AT : Nuclear Factor of Activated T Cell NF-IL6 : Nuclear Factor for IL-6 NK : Natural Killer PAF : Platelet Activating Factor PAMPs : Pathogen-Associated Molecular Pattern PDGF : Platelet Derived Growth Factor -PE : Phycoérythrine PE : Peptide d‟Elastine PG-E2 : Prostaglandine E2 PI3K : Phosphatydil Inositol 3 Phosphate PKC : Protéine Kinase C PLC : Phospholipase-C PN : Polymorphonucléaire Neutrophile 4 Liste des abréviations PPCA : Protective Protein Cathepsin-A PRRs : Pattern Recognition Receptor RANTES : Regulated upon Activation Normal T Expressed and Secreted RER : Réticulum Endoplasmique Rugueux s : Seconde SLPI : Secretory Leucoprotease Inhibitor SP-1 : Specific Protein 1 Src : Sarcoma SRE : Serum Response Element TcR : T cell Receptor TGF-β : T n fo ming G o w h F o β TIMP- : Tissu Inhibitor of Metalloproteinases TLR : Toll Like Receptor TNF-α : Tumo Ne o i F o α TNF-RI : TNF receptor type I TNF-RII : TNF receptor type II TRAF-6 : TNF Receptor Associated Factor 6 TRIF : TIR-domain-containing adapter-Inducing interferon-β Factor VCAM : Vascular Cell Adhesion Molecule VGVAPG : Valine-Glycine-Valine-Alanine-Proline-Glycine μl : Microlitre 5 Liste des illustrations LISTE DES SCHEMAS INTRODUCTION Schéma 1 : Structure de l‟ADNc de la tropoélastine humaine. -16- Schéma 2 : Les microfibrilles structurant la fibre élastique. -19- Schéma 3 : Modèle d‟élastogenèse. -21- Schéma 4 : Modèle de formation des liaisons croisées de l‟élastine. -22- Schéma 5 : Modèles structuraux proposés pour l‟élastine. -23- Schéma 6 : Disposition des fibres d‟élastine dans l‟aorte (a) et les poumons (b). -24- Schéma 7 : Le récepteur à l‟élastine. -27- Schéma 8 : Epissage alternatif du gène de la β-Galactosidase donnant lieu au S-Gal. -27- Schéma 9 : Effets des galactosucres sur le récepteur à l‟élastine. -28- Schéma 10 : Modélisation d‟un coude β de type VIII formé par la séquence GXXP. -29- Schéma 11 : Synthèse des voies de signalisation mises en jeu par la fixation des PE au -31- complexe récepteur de l‟élastine. Schéma 12 : La granulocytopoïèse dans la moelle osseuse. -35- Schéma 13 : Les neutrophiles sur le site d‟infection. -38- Schéma 14 : Structure du gène de l‟IL-8. -40- Schéma 15 : Bilan des effets de l‟IL-8 sur les PN. -41- Schéma 16 : A : Structure du gène de l‟IL-6, B : Structure de son promoteur. -42- Schéma 17 : Structure du récepteur de l‟IL-6. -43- Schéma 18 : Structure du gène du TNF-α. -44- Schéma 19 : Structure des deux types de récepteurs du TNF-α. -45- Schéma 20 : Ontogénie des cellules dendritiques. -49- Schéma 21 : Présentation antigénique restreinte au CMH de classe II. -51- Schéma 22 : Présentation antigénique restreinte au CMH de classe I. -52- Schéma 23 : Implication de CD dans la réponse immunitaire. -55- Schéma 24 : Voies de signalisation mises en jeu lors de la maturation des CD induite -57- par les TLRs. Schéma 25 : Les CD au centre du mécanisme de tolérance. -62- Schéma 26 : Classification des différents états de la BPCO selon les critères GOLD -666 Liste des illustrations Schéma 27 : BPCO et inflammation chronique. -68- MATERIEL ET METHODES Schéma 28 : Isolement des polynucléaires par le Polymorphprep TM -75- Schéma 29 : Principe de l‟analyse cellulaire par cytométrie en flux. -77- Schéma 30 : Le système d‟élutriation. -81- Schéma 31 : Principe du tri cellulaire. -88- LISTE DES TABLEAUX INTRODUCTION Tableau 1 : Effets des PE. -26- Tableau 2 : Contenu des différents granules des PN. -36- RESULTATS Publication 1 Tableau 1 : Caractéristiques des cohortes étudiées. -103- 7 Liste des illustrations LISTE DES FIGURES MATERIEL ET METHODES Figure 1 : Pourcentage de lymphocytes, de monocytes et de PN dans la population -79- polynucléaire totale obtenue par la technique de PolymorphprepTM. Figure 2 : Pourcentage de monocytes CD14+ obtenus après tri sur colonne. -84- Figure 3 : Pourcentage de cellules exprimant les marqueurs CD1a, CD14 et CD83 -85- après différenciation des monocytes en CD immatures. Figure 4 : Pourcentage de cellules immatures et matures exprimant les marqueurs de -87- surface CD86 et CD83. Figure 5 : Représentation bi-paramétrique de la taille (FSC) en fonction de la complexité (SSC) des cellules de la fraction lymphocytaire d‟élutriation. -89- Figure 6 : Représentation bi-paramétrique de la fluorescence PE en fonction de la fluorescence APC. -89- Figure 7 : Vérification de la pureté des lymphocytes T CD3+CD4+ après tri cellulaire. -90- RESULTATS Publication 1 Figure 1 : Migration différentielle des PN des trois cohortes sous l‟effet du VGVAPG. -105- Figure 2 : Production différentielle de cytokines pro-inflammatoires par les PN des -107- trois cohortes et modulation par le VGVAPG. Figure 3 : Phagocytose et production de radicaux libres différentielles par les PN des -109- trois cohortes sous l‟effet du VGVAP. Figure 4 : Expression différentielle du S-Gal par les PN des trois cohortes et effet du -111- VGVAPG. 8 Liste des illustrations Publication 2 Figure 1 : Présence du S-Gal sur les CD et implication dans la chemoattraction de ces -138- cellules par le VGVAPG. Figure 2 : Modèle de différenciation puis de maturation de CD sous l‟effet du LPS et -142- rôle du VGVAPG. Figure 3 : Modulation de la maturation LPS induite des CD par le VGVAPG. -143- Figure 4 : Production différentielle de cytokines pro ou anti-inflammatoires par les -143- CD sous l‟effet du LPS ± VGVAPG. Figure 5: Production différentielle de cytokines anti-inflammatoires ou -145- Figure 6 : Prolifération de LT et polarisation vers un profil de LT spécifiques sous -147- tolérogéniques par les CD sous l‟effet du LPS ± VGVAPG. l‟effet du LPS ± VGVAPG. 9 Contexte scientifique et présentation du manuscrit Contexte scientifique et présentation du manuscrit L‟organisme humain est en perpétuel combat contre les microorganismes de son environnement (bactéries, virus, champignons, parasites…) et il utilise pour cela le système immunitaire. Face à une agression, il existe deux types de réponses immunitaires : la réponse innée (naturelle) et la réponse adaptative (spécifique). La réponse innée se caractérise principalement par une inflammation et des interactions entre les cellules et leur environnement. Ce processus est finement régulé par des facteurs solubles (cytokines, chimiokines…), ce qui permet d‟éliminer l‟agent pathogène sans que les tissus hôtes ne soient lésés. Au cours de la réponse innée, les cellules inflammatoires (macrophages, polynucléaires neutrophiles…) sécrètent de nombreuses protéases qui participent au remodelage tissulaire en trouvant de nombreuses cibles au sein de la Matrice Extracellulaire (MEC). La réponse adaptative se caractérise, quant à elle, par la mobilisation de populations cellulaires capables de coopérer entre elles afin de mettre en place une réponse spécifique ciblée sur la reconnaissance d‟antigènes caractéristiques de l‟agent pathogène. Elle met en jeu des cellules capables de phagocyter l‟antigène et de le présenter aux lymphocytes T et B. C‟est le cas, en particulier, des Cellules Dendritiques (CD). Les lymphocytes activés vont alors proliférer, former des clones spécifiquement dirigés contre les différents antigènes et permettre la destruction des agents pathogènes et/ou des cellules infectées exprimant ces antigènes. La MEC est un réseau tridimensionnel qui sert de support architectural et qui permet la cohésion des tissus. Elle est composée de nombreuses macromolécules telles que l‟élastine, les collagènes, les laminines, la fibronectine, ou encore les glycosaminoglycanes. La dégradation de ces macromolécules conduit à la génèse de peptides doués d‟activités biologiques, appelés "matrikines". Ces matrikines influencent le comportement des cellules présentes dans leur environnement immédiat. L‟élastine est une molécule de la MEC présente en grande quantité dans les tissus dont la composante élastique est essentielle à leurs fonctions. C‟est le cas de la peau, des artères et des poumons. Depuis plusieurs années, l'élastine est décrite comme une cible importante au cours des pathologies inflammatoires touchant les tissus riches en élastine et caractérisées par une forte synthèse de protéases élastinolytiques. La dégradation de l‟élastine génère des peptides d‟élastine solubles qui exercent leurs activités biologiques par le biais d‟un récepteur 10 Contexte scientifique et présentation du manuscrit spécifique présent à la surface de nombreuses populations cellulaires. L‟interaction des peptides d‟élastine avec leur récepteur engendre des propriétés biologiques variées et en particulier des propriétés de chimiotactisme, de régulation de la prolifération cellulaire et de contrôle du tonus vasculaire. Par ailleurs, la présence du récepteur à l‟élastine à la surface des monocytes et des Lymphocytes T (LT) confère à ces peptides des propriétés de régulation de l‟expression des cytokines et a permis de mettre en lumière le rôle important des peptides d‟élastine dans la régulation de la réponse inflammatoire et immunitaire. La Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) est une pathologie caractérisée par une inflammation chronique du parenchyme pulmonaire et par une détérioration progressive et irréversible des voies aériennes. La réponse inflammatoire y est caractérisée par une infiltration massive du tissu respiratoire par les Polynucléaires Neutrophiles (PN) et les LT et par une production importante de protéases par l‟ensemble des cellules inflammatoires. Ces protéases, qui sont directement impliquées dans les lésions tissulaires de la BPCO, participent activement à la dégradation des fibres élastiques du parenchyme pulmonaire générant ainsi des peptides d‟élastine actifs qui sont impliqués dans la progression de la maladie. Un travail antérieur, réalisé dans le laboratoire et en collaboration avec l‟Unité CNRS 6237, a permis de montrer que les peptides d‟élastine régulent le niveau d‟expression des cytokines par les monocytes et les lymphocytes T humains. Dans la continuité de ce travail, nous avons émis l‟hypothèse que les peptides d‟élastine pouvaient également réguler les propriétés biologiques d‟autres cellules cibles de l‟immunité telles que les PN et les CD. Pour l‟étude sur les PN, et afin de nous placer dans des conditions les plus proches de la réalité physio-pathologique possible, nous avons comparé les effets des peptides d‟élastine sur les fonctions de PN isolés de sujets sains avec ceux obtenus à partir de PN isolés de patients atteints de BPCO. Pour l‟étude sur les CD, les cellules cibles ont été obtenues par différenciation in vitro de monocytes isolés de donneurs sains. Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit a donc porté sur l‟étude de la régulation de l‟immunité innée et adaptative par les petides d‟élastine. La régulation de la réponse innée étant abordée au niveau du PN et dans le cadre d‟une pathologie inflammatoire chronique type, la BPCO tandis que la modulation de la réponse adaptative par les PE a été étudiée au niveau de la régulation des fonctions effectrices des CD. 11 Contexte scientifique et présentation du manuscrit Le manuscrit est organisé en quatre parties : La première partie est une introduction qui présente 1) les connaissances actuelles sur les peptides issus de la dégradation de l‟élastine, 2) les populations cellulaires et les médiateurs solubles étudiés au cours de ce travail, et 3) la mise en jeu de ces différents acteurs au cours de la BPCO et dans le contexte d‟immuno-intervention des CD. La deuxième partie présente un "matériels et méthodes" succinct qui vient en complément, quand cela nous a paru nécessaire, des parties "materials and methods" décrits dans les articles intégrés au manuscrit. La troisième partie présente, au travers d‟articles, l‟ensemble des résultats que nous avons obtenus au cours de ce travail de thèse. Une première série de résultats a permis la rédaction d‟un article intitulé "Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD" qui a été soumis pour publication dans The European Respiratory Journal (manuscript registered under number ERJ-01458-2011). Une seconde série de résultats a permis de rédiger un article intitulé "Elastin peptides influence the differentiation of human dendritic cells with tolerogenic features" que nous soumettrons pour publication dans The Journal of Immunology. Enfin, la quatrième partie regroupe une discussion/conclusion sur le rôle des peptides d‟élastine dans la régulation de l‟immunité innée et adaptative et sur la prise en compte des fonctions biologiques de ces peptides dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques dans lesquels ils peuvent être impliqués. L‟ensemble du travail présenté dans ce document a été réalisé à l‟UFR de Pharmacie de Reims au sein de l‟EA 4303 "Inflammation et immunité de l‟épithélium respiratoire" en collaboration avec l‟UMR CNRS 6237 "Matrice extracellulaire et dynamique cellulaire". Ce travail s‟intègre dans l‟axe II "inflammation, infection et réparation tissulaire" du projet stratégique de l„IFR 53. 12 Introduction INTRODUCTION 13 Elastine I. De l’élastine aux peptides d’élastine (PE) : naissance d’une "matrikine" L‟élastine est l‟une des principales protéines responsable de l‟élasticité des tissus humains. Elle est un composant essentiel de la matrice extra-cellulaire (MEC). Présente en plus ou moins grande quantité, elle représente 2 à 3 % de la masse sèche de la peau, 4% de celle des tendons, 3 à 7% de celle des poumons mais elle représente 50% de la masse sèche des ligaments et 30% de celle des grands vaisseaux sanguins (Uitto J., 1979). Qu‟elle soit ou non fortement représentée dans la MEC, sa présence reste indispensable au maintien de l‟intégrité mais aussi du bon fonctionnement des tissus dans lesquels elle est présente. Elle s‟organise en fibres élastiques qui permettent aux tissus de se déformer et de reprendre leur forme initiale sans dépenser d‟énergie (Rosenbloom J. et al, 1993). Or, les fonctions biologiques des tissus comme la peau, les poumons, le cœur parmi tant d‟autres, dépendent de cette élasticité car, dans les conditions physiologiques, elles reposent sur des cycles de contraction-extension. Les fibres élastiques sont d‟autant plus importantes pour l‟organisme que leur absence ou leur dégradation est fréquemment impliquée dans des pathologies diverses. Leur absence, qu‟elle soit due à une mutation du gène ou à une dégradation de la protéine, provoque une perte d‟élasticité. Le syndrome de Williams est un exemple de pathologie liée à la mutation du gène de l‟élastine. Les patients souffrent alors de problèmes cardiaques, artériels, mais aussi d‟un faciès déformé ainsi que de retards mentaux (Lowery MC. et al, 1995 ; Ewart A. et al, 1993). Lorsque l‟élastine est dégradée, comme cela est le cas au cours des pathologies à inflammations chroniques comme la Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) ou l‟Anévrisme Aortique Abdominal (AAA) (Schriver EE. et al, 1992 ; Wiernicki I. et al, 2008), on retrouve alors une perte d‟élasticité associée à la production de produits de dégradation de l‟élastine. Ces produits de dégradation, appelés Peptides d‟Élastines (PE), exercent des fonctions biologiques pouvant mimer ou antagoniser les effets de la protéine initiale. Ces peptides issus de la dégradation d‟une protéine de la MEC, et qui, par euxmêmes, sont capables d‟exercer des fonctions biologiques sont appelés des Matrikines (Duca L., 2004). 14 Elastine A. Synthèse de l’élastine 1. Le gène de l’élastine (Schéma 1) Le gène de l'élastine code, chez l‟Homme, pour la tropoélastine humaine. Il est présent en un exemplaire unique localisé sur la région proximale du bras long du chromosome 7, au locus 7q11.23 (Fazio MJ. et al, 1991). Le transcrit primaire fait 45 kb et contient 34 exons (Tassabehji M. et al, 1997 ; Yeh H. et al, 1989). Les exons sont petits (27 à 186 paires de bases) et se retrouvent intercalés entre de grands introns (Bashir MM. et al, 1989 ; Cicilia G. et al, 1985). L‟ADN complémentaire (ADNc), comme la protéine pour laquelle il va coder, consiste en une succession de régions hydrophobes, riche en acides aminés non polaires (principalement glycine, valine, alanine, proline qui s‟organisent souvent en petites répétitions de peptides), et de régions hydrophiles riches en lysines séparées par 2 à 3 alanines ou prolines et qui sont impliquées dans les liaisons croisées. Ces différents domaines sont codés par des exons différents et alternés (Indik Z. et al, 1987 ; Pierce RA. et al, 1990 ; Bashir MM. et al, 1989 ; Cicilia G. et al, 1985). La région 5‟ du gène contient deux séquences CAAT dans son promoteur mais pas de TATA Box. Elle contient en plus, de nombreux éléments de réponses aux facteurs de transcriptions comme SP1, AP2, ou CRE. (Bashir MM. et al, 1989 ; Fazio MJ. et al, 1990). L‟exon 36, qui code pour la partie C-terminale, est extrêmement basique ce qui permet à la tropoélastine d‟interagir avec les protéines microfibrillaires qui sont très acides. Cet exon pourrait également contenir des éléments de régulation de la transcription (Indik Z., Yoon K. et al, 1987 ; Indik Z. et al, 1989 ; Parks WC. and Deak SB., 1990). Chez les mammifères la structure du gène de l‟élastine est relativement bien conservée (>70%) et les quelques variations que l‟on peut observer se trouvent principalement dans les régions codant pour les parties hydrophobes. Les régions riches en alanines sont, quant à elles, extrêmement conservées (Boyd CC. et al, 1991). Il en est de même pour la région 5‟ du gène et pour l‟exon 36 qui code pour la partie C-Terminale de la tropoélastine (Bashir MM. et al, 1989 ; Fazio MJ. et al, 1990 ; Indik Z., Yoon K. et al, 1987 ; Indik Z. et al, 1989 ; Parks WC. and Deak SB., 1990). Il existe, cependant, une spécificité de l‟élastine humaine. En effet, le gène de l‟élastine humaine comprend un exon supplémentaire (exon 26A) qui n‟est représenté dans aucune autre espèce de mammifère. Cet exon, contrairement au reste de la protéine, est 15 Elastine hydrophile car très riche en sérines et en résidus chargés. Par ailleurs, il contient la seule histidine de la tropoélastine. Lorsque cet exon est absent, la protéine est un moins bon substrat pour la lysyl oxydase (Indik Z. et al, 1987 ; Bedell-Hogan D. et al, 1993). Le gène de la tropoélastine est soumis à un fort "épissage alternatif". Cet épissage supprime, dans la grande majorité des cas, un exon complet mais peut aussi parfois ne supprimer qu‟une partie d‟exon ce qui aboutit à la production de nombreuses isoformes de l‟élastine pour lesquelles aucune fonctionnalité spécifique n‟a été décrite à ce jour (Indik Z. et al, 1987). Dans la tropoélastine humaine, les exons les plus couramment épissés sont les exons 22, 23, 24, 26A, 32 et 33 (Boyd CC. et al, 1991 ; Indik Z. et al, 1987 ; Fazio MJ. et al, 1988 ; Fazio MJ., Olsen DR., Kuivaniemi H. et al, 1988). A ce jour, 11 isoformes de la tropoélastine présentes en fonction du stade de développement, du tissu et de l‟âge de la personne ont été identifiées (Heim RA. et al, 1991 ; Parks WC. and Deak SB., 1990 ; Starcher BC., 2000). Schéma 1 : Structure de l‟ADNc de la tropoélastine humaine (d‟après Vrhovski B. and Weiss A.S., 1998). 2. La tropoélastine L‟apparition de cette protéine dans le phylum coïncide avec la formation d‟un système vasculaire clos et correspond à une réponse adaptative aux hautes pressions et au flux sanguin pulsatile (Sage H. and Gray WR., 1977). Le gène de l‟élastine code pour une protéine secrétée de 72 kDa qui contient un peptide signal de 26 AA : la tropoélastine (Indik Z., Yoon K. et al, 1987). Cette protéine est secrétée dans la MEC en 20 min à 1 h, tardivement au stade fœtal et pendant toute la période 16 Elastine entourant la naissance (Uitto J. et al, 1991). Elle est synthétisée principalement par les cellules embryonnaires et les tissus à croissance rapide ainsi que par des cellules telles que les cellules musculaires lisses, les fibroblastes, les cellules endothéliales…. (Rosenbloom J. and Cywinski A., 1976). La synthèse protéique a lieu dans la lumière du Réticulum Endoplasmique Rugueux (RER) où la protéine est libérée grâce au clivage de son peptide signal (Saunders NA. and Grant ME., 1984). Par la suite, la tropoélastine est amenée à la membrane plasmique via des vésicules et grâce à l‟intervention de protéines chaperonnes parmi lesquelles l‟Elastine Binding Protein (EBP) qui joue également le rôle de récepteur de l‟élastine (Damiano V. et al, 1981 ; Saunders NA. and Grant ME., 1985). La tropoélastine subit très peu de modifications post-traductionnelles. En revanche, la production de la tropoélastine est finement régulée, au niveau prétranscriptionel, mais aussi aux niveaux pré et post-traductionnels (Mecham RP. et al, 1985 ; Liu J., and Davidson JM., 1989). En effet, de nombreux éléments présents dans le promoteur permettent la fixation de facteurs de transcription qui stimulent ou inhibent la transcription. Ainsi, l‟Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) augmente la transcription du gène de la tropoélastine en se fixant sur son élément de réponse situé sur le promoteur du gène (Rich CB. et al, 1992). Le TNF-α, quant à lui, inhibe la transcription du gène de la tropoélastine par le biais de la fixation du facteur de transcription Jun/Fos sur l‟élément de réponse AP1 dans le promoteur (Kahari V-M. et al, 1992). L‟élastine, elle aussi, lorsqu‟elle s‟accumule, exerce un rétrocontrôle négatif sur son propre gène (Foster JA. and Curtiss SW., 1990). Les acides aminés de la tropoélastine sont principalement des glycines, prolines, alanines et valines qui composent à eux seuls 75% de la protéine (dont 30% de glycines) (Uitto J., 1979). La tropoélastine est composée de deux régions distinctes et alternées : une région hydrophobe majoritairement composée d‟acides aminés hydrophobes : alanines, valines, glycines et prolines s‟organisant souvent en répétitions (notamment la séquence GXXPG), et une région hydrophile, composée de lysines séparées soit par des fragments polyalanines de 2 à 3 acides aminés ou par une proline associée à une alanine ou à une glycine. Ces deux types de régions s‟alternent le long de la protéine (Indik Z., Yoon K. et al, 1987 ; Indik Z. et al, 1989). Les zones hydrophiles, qui sont caractérisées par la présence de lysines, sont responsables de la formation des liaisons croisées. Afin de permettre aux liaisons croisées de 17 Elastine se faire, les lysines sont extrêmement bien ordonnées au sein de la protéine : elles sont suffisamment proches les unes des autres pour se lier par condensation spontanée tout en étant séparées les unes des autres par 2 à 3 acides aminés dans la même chaine. Cette organisation des lysines dans la protéine permet de coupler deux monomères de tropoélastine ce qui a pour effet d‟organiser le dimère en hélice-α et de rendre le polymère formé particulièrement insoluble (Foster JA. et al, 1976). Les zones hydrophobes, elles, sont plutôt libres de leurs mouvements et les répétitions peptidiques ont tendance à s‟organiser plutôt en tours ou en coudes β qui ont un rôle d‟espaceurs des hélices (Urry DW. and Long MM., 1976 ; Urry DW. et al, 1974). La tropoélastine a une durée de vie couvrant quasiment la totalité de la vie de l‟organisme, elle est donc très peu renouvelée et doit pour cela être très résistante afin d‟assurer durablement les fonctions qui lui sont spécifiques (Hall D., 1976). En cas de lésions, le gène de l‟élastine peut-être stimulé mais cela reste une manière minoritaire de néosynthétiser de l‟élastine. La plupart du temps, les nouvelles fibres élastiques produites sont plutôt formées grâce à un recyclage des peptides issus de la dégradation de l‟élastine native. Mais dans tous les cas les fibres élastiques nouvellement synthétisées sont désorganisées et pas totalement fonctionnelles (Tinker D. et al, 1990 ; Rucker RB. and Dubick MA. 1984 ; Soskel NT. and Sandberg LB., 1987 ; Belknap JK. et al, 1996). 3. Les microfibrilles Les microfibrilles sont des protéines associées à l‟élastine. Elles apparaissent antérieurement à l‟élastine au cours du développement embryonnaire. A elles seules, elles représentent 5 à 10% de la masse sèche de la fibre élastique (Ross R. and Bornstein P., 1969). Leur apparition antérieure à celle de l‟élastine laisse supposer que ces microfibrilles s‟associent entre elles afin de former une sorte d‟échafaudage dirigeant la déposition mais aussi l‟orientation et l‟assemblage de la tropoélastine et donnant leur forme définitive aux fibres élastiques matures (Mithieux SM. and Weiss AS., 2005) (Schéma 2). Les principales microfibrilles identifiées, à ce jour, sont les fibrillines 1 et 2 qui sont de larges protéines acides, riches en cystéines, étendues, flexibles et dont la structure primaire est caractérisée par la présence de répétitions de fixation au calcium (Kielty CM. et al, 2002). 18 Elastine Elles s‟associent tête-à-tête en réseaux parallèles de 6 à 8 molécules pour former la structure de la microfibrille (Gibson MA. et al, 1996). D‟autres protéines sont également associées aux microfibrilles. C‟est le cas de la vitronectine, de l‟émiline (Bressan GM. et al, 1993) ou encore des Protéines Associées Aux Microfibrilles comme la protéine MAGP-1 qui stabilise l‟agrégation des fibrillines par des ponts disulfures et offre une ancre à l‟élastine permettant ainsi la liaison élastine - fibrillines (Dahlback K. et al, 1990). Schéma 2 : Les microfibrilles structurant la fibre élastique (d‟après Rock MJ. et al, 2004). 4. L’élastogenèse Les fibres d‟élastine sont constituées à 90-95% par la tropoélastine. C‟est le composant amorphe que l‟on peut observer en microscopie électronique. Les 5 à 10% restant constituent la partie fibrillaire composée des microfibrilles et d‟autres protéines qui viennent s‟associer conjointement à la tropoélastine et aux microfibrilles (par exemples : l‟EBP, les protéoglycanes, l‟ostéopontine, la fibuline-1…). Lors de l‟élastogenèse, les microfibrilles sont synthétisées en premier puis excrétées à la membrane plasmique où elles se rassemblent en petits agrégats pour former un échafaudage (Rosenbloom J. et al, 1993). Les monomères de tropoélastine une fois synthétisés sont pris en charge par des protéines chaperonnes. La plus 19 Elastine importante semble être l‟EBP. Puis le complexe tropoélastine/EBP ainsi formé se déplace sur le cytosquelette d‟actine jusqu‟à atteindre la membrane plasmique (Damiano V. et al, 1981 ; Saunders NA. and Grant ME., 1985). Là, le complexe rencontre les microfibrilles riches en galactosucres qui vont interagir avec l‟EBP entrainant la modification de sa conformation. L‟EBP relâche alors la tropoélastine et est recyclé dans le RER. L‟accumulation de la tropoélastine au site où se trouvent les microfibrilles entraine l‟élongation des fibres élastiques le long des microfibrilles qui agissent donc comme une sorte d‟échafaudage dirigeant la construction de la fibre (Mecham RP. et al, 1989 ; Mecham RP. et al, 1991 ; Hinek A. et al, 1988) (Schéma 3). Les monomères de tropoélastine s‟accumulent donc le long des microfibrilles et subissent un processus de coacervation dont les conditions optimales (température de 37°C, pH entre 7 et 8, concentration en Chlorure de Potassium de 150 mM) permettent l‟obtention d‟un polymère insoluble (Vrhovski B. et al, 1997). Lorsque ces conditions ne sont pas respectées, et particulièrement aux basses températures, l‟eau forme une structure en forme de clathrate autour des régions hydrophobes de la protéine empêchant celle-ci de prendre sa configuration tridimensionnelle. La tropoélastine est alors soluble. En revanche, dès que la température augmente, les clathrates d‟eau sont rompus. Cela libère les régions hydrophobes et permet l‟agrégation des monomères de tropoélastine selon l‟ordre défini par les successions des domaines hydrophobes. Le polymère formé devient insoluble (Urry DW. and Long MM., 1977). 20 Elastine Schéma 3 : Modèle d‟élastogenèse (d‟après Mithieux SM. and Weiss AS., 2005). A terme, on obtient une phase viscoélastique très concentrée en tropoélastine avec des résidus de lysine se retrouvant placés les uns à côté des autres de manière à faciliter la formation des liaisons croisées. Sous l‟effet de la lysyl oxydase, les résidus de lysine subissent une désamination oxydative donnant alors des allysines. Les allysines et les lysines sont les précurseurs réactifs à l‟origine de la formation des liaisons croisées. Ces deux précurseurs interagissent entre eux et forment par simple condensation deux intermédiaires : la lysinonorleurcine et l‟allysine aldol. Ces deux intermédiaires peuvent à leur tour se condenser afin de former la desmosine. L‟allysine aldol peut également se condenser à une autre lysine pour former la merodesmosine qui, à son tour, se condense avec une allysine pour former l‟isodesmosine (Vrhovski B. and Weiss AS., 1998). Les produits finaux de ces liaisons croisées, la desmosine et l‟isodesmosine, résultent donc de la condensation de quatre lysines situées à proximité les unes des autres et permettent de relier deux fibres d‟élastine entre elles (Partridge SM. et al, 1964 ; Foster JA. et al, 1974). Les desmosines et isodesmosines, qui sont deux structures typiques de l‟élastine, sont des marqueurs de la dégradation de l‟élastine (Gottlieb DJ. et al, 1996) (Schéma 4). 21 Elastine Schéma 4 : Modèle de formation des liaisons croisées de l‟élastine (d‟après Vrhovski B. and Weiss AS., 1998). 5. Structure de l’élastine mature La structure de l‟élastine mature n‟est pas connue de manière précise. En effet, il est très difficile d‟étudier la protéine en dehors de son environnement physiologique, car elle est immédiatement dénaturée. De plus, cette protéine n‟a pas de structure stable en raison de son mouvement perpétuel (Fleming WW. et al, 1980). Cependant, différents modèles, extrapolés d‟après les propriétés physiques et cristallographiques connues de la protéine, existent (Mithieux SM. and Weiss AS., 2005). En effet, il est couramment admis que l‟élasticité dépend de l‟entropie. Lorsque la fibre est étirée, l‟entropie diminue et c‟est donc le retour spontané au maximum d‟entropie qui fournit la force nécessaire à l‟élasticité de la fibre (Mithieux SM. and Weiss AS., 2005). D‟ après ce postulat, quatre modèles ont pu être théorisés (Schéma 5). 22 Elastine Schéma 5 : Modèles structuraux proposés pour l‟élastine (d‟après Vrhovski B. and Weiss AS., 1998). a) Modèle du réseau aléatoire : La fibre d‟élastine serait constituée d‟un réseau de chaînes pontées de manière aléatoire et se déplaçant librement. Lorsque la fibre est étirée, les chaînes sont alors ordonnées ce qui limite la liberté conformationelle et diminue l‟entropie. b) Modèle de la goutte liquide : La fibre d‟élastine serait composée de l‟association de monomères globulaires liés par des liaisons croisées et dont les domaines hydrophobes sont masqués au centre du polymère. L‟étirement de la fibre diminue l‟entropie mais expose également ces domaines hydrophobes au solvant et ainsi la force hydrophobe participe également à l‟élasticité de la fibre. 23 Elastine c) Modèle "Oiled coil" : Dérivé du modèle de la goutte liquide, les monomères sont fibrillaires et s‟associent en alternant les liaisons croisées α-hélicoïdales et de larges rouleaux "oiled coil" qui sont les domaines hydrophobes de la protéine masqués au repos. L‟hydrophobie participe donc également à l‟élasticité de la fibre. d) Modèle fibrillaire : La fibre élastique serait composée de spirales β conformationellement libres et espacées par des tours β qui confèrent l‟élasticité. La disposition des fibres matures est, quant à elle, bien connue, et elle diffère en fonction des tissus, conférant à chacun des propriétés rhéologiques différentes. (PasqualiRonchetti I. and Baccarani-Contri M., 1997). Ainsi, dans les artères, les fibres élastiques sont organisées en anneaux concentriques entourant les vaisseaux (Li D. et al, 1998) alors que dans les poumons ces fibres forment une matrice sur l‟ensemble de l‟organe avec des zones de concentration au niveau des jonctions alvéolaires (Starcher BC., 2000) (Schéma 6). Schéma 6 : Disposition des fibres d‟élastine dans l‟aorte (a) et dans les poumons (b) (d‟après Mithieux SM. and Weiss AS., 2005). B. Peptides d’élastine : genèse et fonctionnalité 1. Les peptides d’élastine L‟élastine est une macromolécule très résistante et dont la durée de vie (70 ans) couvre quasiment la vie de l‟organisme dont elle est issue (Hall D., 1976). Elle est donc très peu dégradée de manière physiologique. Il existe tout de même une faible proportion de 24 Elastine dégradation durant la croissance, le remodelage tissulaire, la grossesse, la réparation des blessures mais également durant le vieillissement (Werb Z. et al, 1982). Cependant, l‟élastine peut être le siège d‟une forte dégradation lors d‟un processus pathologique touchant un tissu riche en élastine comme cela est le cas dans les pathologies pulmonaires chroniques (Taggart CC, et al, 2005). Ce sont alors les protéases produites par les cellules inflammatoires qui sont responsables de l‟élastolyse : des sérines protéases et en particulier la Neutrophile Elastase (NE), l‟élastase pancréatique et la Cathepsine G (Stone PJ. et al, 1982), mais également des métallo-protéinases matricielles (MMP) telles que les MMP-2, 7, 9 ou encore la MMP-12 également appelée l‟élastase du macrophage (Shapiro SD., 1994). La dégradation de l‟élastine par les différentes protéases aboutit à la production de peptides solubles d‟élastine (PE). Ces PE sont retrouvés in vivo dans les conditions physiologiques décrites ci-dessus et dans les conditions pathologiques, où il existe une dégradation de la matrice élastique (Frances C. and Robert L., 1984 ; Fulop T. et al, 1990 ; Hornebeck W. et al, 1984). Les PE sont présents dans les différents fluides (urine, plasma, lavage broncho-alvéolaire) de sujets sains ou de patients (Schriver EE. et al, 1992). Les PE exercent des effets biologiques par le biais d‟un récepteur spécifique exprimé à la surface de nombreux types cellulaires (Larbi A. et al, 2005 ; Robinet A. et al, 2007). Ces peptides sont appelés peut "matrikines" (Duca L., 2004). Leurs effets biologiques sont divers et variés et dépendent de la séquence du peptide mais aussi du type cellulaire sur lequel il entre en interaction avec son récepteur (Tableau 1). 2. Le récepteur canonique à l’élastine L‟existence d‟un récepteur aux PE a été suggéré, pour la première fois, par l‟équipe de RM. Senior afin d‟expliquer l‟activité chemo-attractante de la tropoélastine et de ses fragments protéolytiques sur les leucocytes et les fibroblastes (Senior RM. et al, 1980 ; Senior RM. et al, 1984). 25 Elastine Peptide/élastine derivative VGVAPG Cell-type PMNL PGVGVA, VGVGVAa Skin fibroblasts Bovine nuchal ligament fibroblasts, monocytes, neutrophils VSMC PMNL VGVPGb Biological effects Promotes increase in Ca2+, superoxyde production and elastase release Proliferation Chemotaxis références (45) (62-114) (105-107) Myofibrillogenesis see VGVAPG (64) (45) Monocytes Chemotaxis (12) VGV, PGV, PVGV, VGVA HUVEC Vasodilatation, increase (Ca2+)i (26) kappa Élastine Skin fibroblasts, astrocytoma, Monocytes, smooth muscle cells Chick VSMC Ion fluxes Neutrophils, lung carcinoma cells, fibroblasts M27 tumour cells Monocytes Monocytes Monocytes Monocytes Bovine ligamentum fibroblasts Chemotaxis Bovine aortic endothelial cells Bovine auricular chondroblasts, A2058 melanoma cells Chemotaxis Chemotaxis VPGVGc PGAIPG, VGAMPG, VGMAPG, VGSLPG, VGLSPG, AGAIPG,PGAVPG GAIPG (non-EBP) YGVG, FGVG GVAPG (non-EBP) GLVPG VGAPG AGVPGFGVG, GFGVGAGVP, GFGVG, GVGVAP GLGVGAGVP LGTIPG Proliferation Chemotaxis Chemotaxis Chemotaxis Chemotaxis Chemotaxis (32) (122) (40,41) (41) (5) (5,12) (5) (5) (77) (78) (96) a No effect on vasodilatation or (Ca2+)i (26) b Mixed effects of this peptide have been shown. Deemed inactive by Grosso and Scott (41) c Did not induce proliferation of human skin fibroblasts (114) or chemotaxis of bovine ligamentum fibroblasts (77) Tableau 1 : Effets des PE (d‟après Rodgers UR. and Weiss AS., 2005). Le récepteur à l‟élastine est composé de trois sous-unités : l‟Elastin Binding Protein (EBP), également appelée S-Gal, est une protéine de 67 kDa présente à la périphérie de la membrane plasmique ; la Protective Protein Cathepsin A (PPCA) et la Neuraminidase-1 (Neu-1) sont deux protéines transmembranaires respectivement de 55 et 61 kDa (Mecham RP. et al, 1989). Chacune de ces trois protéines assurent des fonctions propres (Schéma 7). 26 Elastine Schéma 7 : Le récepteur à l‟élastine (d‟après Vrhovski B. and Weiss AS., 1998). a) Les sous-uni é du é ep eu à ’é ine - L’Elastin binding Protein (EBP) Cette sous-unité est une forme enzymatiquement inactive de la β-Galactosidase obtenue par épissage alternatif du gène de la β-Galactosidase. Ce processus permet d‟obtenir une protéine viable mais ayant perdu son site actif (Schéma 8). Schéma 8 : Epissage alternatif du gène de la β-Galactosidase donnant lieu au S-Gal (d‟après Privitera S. et al, 1998). La sous-unité S-Gal peut lier deux autres protéines transmembranaires, la PPCA (55 kDa) et la Neu-1 (61 kDa), pour former un complexe récepteur (Mecham RP. et al, 1989). Dans ce complexe, c‟est le S-Gal qui possède le site de fixation à la tropoélastine et aux PE. Il contient également un site de fixation aux galactosucres (comme le lactose). En cas de 27 Elastine fixation d‟un galactosucre sur le S-Gal, il y a modification tridimensionnelle du complexe récepteur ce qui diminue l‟affinité pour la tropoélastine et à terme entraine la dissociation du complexe (Hinek A. et al, 1988). Cette particularité explique que le lactose soit régulièrement utilisé comme un inhibiteur des effets des PE, puisqu‟il est un antagoniste indirect des peptides pour le récepteur (Schéma 9). Schéma 9 : Effets des galactosucres sur le récepteur à l‟élastine (d‟après Vrhovski B. and Weiss AS., 1998). Le S-Gal joue également un rôle de protéine chaperonne de la tropoélastine lors de l‟élastogenèse. En effet, l‟EBP une fois synthétisée, fixe la tropoélastine dans le compartiment intracellulaire, empêchant ainsi l‟agrégation des molécules de tropoélastine, mais aussi leur dégradation par les protéases. Le complexe EBP/Tropoélastine est ensuite adressé à la membrane plasmique, puis excrété. L‟EBP fixe alors les galactosucres présents sur les microfibrilles et ainsi, libère la tropoélastine qui peut se polymériser (Hinek A. and Rabinovitch M., 1994). Le S-Gal, en plus de son rôle de récepteur, joue un rôle crucial et indispensable dans la synthèse même des fibres élastiques (Hinek A. et al, 1995). Afin de se lier efficacement au récepteur S-gal, les PE doivent contenir la séquence minimale GXXP qui doit être repliée en coude β de type VIII (Moroy G. et al, 2005) (Schéma 10). Les différentes séquences actives identifiées sont les séquences PGAIP, GVAPG, GLVPG, GGVPG et tout particulièrement la séquence VGVAPG qui est une séquence répétée six fois dans l‟exon 24 de la tropoélastine (Hinek A. et al, 1993). Cependant cet exon étant sensible à l‟épissage 28 Elastine alternatif, la séquence VGVAPG n‟est pas toujours présente dans la tropoélastine. Le S-Gal peut donc reconnaître d‟autres séquences de la tropoélastine, avec cependant une moindre affinité que pour VGVAPG, et ceci afin de conserver sa capacité à jouer son rôle de récepteur et/ou de protéine chaperonne (Grosso LE. and Scott M., 1993). X2 X3 G1 P4 Schéma 10 : Modélisation d‟un coude β de type VIII formé par la séquence GXXP (d‟après Floquet N. et al, 2004). - La Protective Protein Cathepsin A (PPCA) La PPCA est une protéine synthétisée sous la forme d‟un zymogène de 54 kDa qui, une fois dans le lysosome, est clivé en deux sous-unités de 32 et 20 kDa reliées entre-elles par des ponts disulfures inter-chaînes. Dans ce compartiment, la PPCA possède une activité de sérine protéase. Cependant, dans le complexe récepteur de l‟élastine l‟activité catalytique de la PPCA n‟est pas nécessaire. Son rôle, supposé dans ce complexe récepteur est la protection des deux autres sous-unités Neu-1 et S-Gal de la dégradation intra-lysosomale. (Callahan JW., 1999). - La Neuraminidase-1 (Neu-1) La Neu-1 est synthétisée sous la forme d‟une pré-proenzyme de 45,5 kDa, pouvant être glycosylée jusqu‟à atteindre un poids moléculaire de 48,3 à 61 kDa. Cette enzyme a pour principale activité le clivage de l‟extrémité N-Terminale des acides sialiques. Cette activité enzymatique n‟est pas nécessaire à l‟assemblage du complexe récepteur de l‟élastine. Cependant, elle est indispensable à la transmission du signal. C‟est Neu-1 qui déclenche les voies de signalisation consécutives à la fixation des PE à la sous-unité S-Gal (Duca L. et al, 29 Elastine 2007). La Neu-1, comme la PPCA, est contenue dans le compartiment lysosomal ou est présente à la membrane plasmique. La proximité de la Neu-1 et de la PPCA permet leur couplage et ces deux protéines sont régulièrement retrouvées associées l‟une à l‟autre. Ce couplage est facilité par la phosphorylation de la partie C-Terminale de la Neu-1 (qui correspond au signal d‟internalisation de la protéine). Dans le lysosome, la sous-unité S-Gal peut s‟associer au complexe formé par la Neu-1 et la PPCA afin de stabiliser l‟ensemble (Lukong KE. et al, 2001 ; Van der Horst GT. et al, 1989). b) Le voie de ign i ion dépend n e de ’EBP La fixation de la tropoélastine ou de ses produits de dégradation à la sous-unité S-Gal, entraine la mobilisation de nombreuses voies de signalisation. Les voies de signalisation mises en jeu dépendent à la fois des effets biologiques et du type cellulaire impliqué (Duca L., 2004). Par exemple, la cascade d‟activation mettant en jeu la Focal Adhesion Kinase (FAK), c-src, le Platelet Derived Growth Factor (PDGF), Raf, Ras, MEK1/2, et ERK1/2 est impliquée dans la prolifération cellulaire (Jacob MP. et al, 1987 ; Varga Z. et al, 1989 ; Faury G. et al, 1998). Dans les fibroblastes, la libération de protéases sous l‟effet des PE est la conséquence de la mise en jeu successive de la Phosphatydil Inositol Kinase 3 (PI3K) (sous-unité p110γ), de Raf-1, de MEK1/2 et d‟ERK1/2 qui active le facteur de transcription AP-1 (Duca L. et al, 2002). Dans la lignée de cellules tumorales M27, les effets chemo-attractants des PE sont la conséquence de l‟activation de la phospholipase C (PLC) et de la protéine kinase C (PKC) (Blood CH. and Zetter BR., 1989), alors que dans les monocytes, les mêmes effets sont liés à une augmentation de la Guanosine 3‟,5‟ Mono-Phosphate cyclique (GMPc) (Fulop Jr. T. et al, 1986). Dans les Polynucléaires Neutrophiles (PN), le complexe récepteur de l'élastine est couplé à une protéine G sensible à la toxine pertussique (PTX). La stimulation des PN par les PE induit la formation d'inositol 3‟, 4‟, 5‟ trisphosphate (IP 3) (Varga, 1989 et 1990) ce qui amène une augmentation significative de la concentration en calcium intracellulaire. Plus récemment, nous avons montré dans notre laboratoire que les peptides d‟élastine activent les voies de signalisation ERK1/2 et p38 MAPK et mettent en jeu les facteurs de transcription AP-1 et NF-κB dans les LT humains, les cellules de mélanome et dans les monocytes (Debret R. et al, 2005 ; Debret R. et al, 2006 ; Baranek T. et al, 2007). La complexité des voies de 30 Elastine signalisation mises en jeu lors de l‟interaction PE/récepteur à l‟élastine est résumée sur le schéma 11. Schéma 11 : Synthèse des voies de signalisation mises en jeu par la fixation des PE au complexe récepteur de l‟élastine (d‟après Debret R. et al, 2005). c) Le u e é ep eu à ’é ine Plusieurs faits expérimentaux indiquent que l‟EBP n‟est pas le seul récepteur à l‟élastine. En effet, des souris invalidées pour le gène de la β-galactosidase sont parfaitement viables et ne montrent aucune altération particulière dans la composition de leurs tissus riches en élastine (Hahn CN. et al, 1997). Plus récemment, il a même été démontré l‟existence d‟un récepteur à l‟élastine insensible au lactose ce qui, encore une fois, confirme l‟existence de récepteurs autres que l‟EBP pour expliquer les effets biologiques de l‟élastine et de ces peptides de dégradation. (Maeda I. et al, 2007). Par ailleurs, les données de la littérature montrent que les galectines, et en particulier la Galectine-3, partagent de nombreuses caractéristiques physico-chimiques avec l‟EBP et la fixation de l‟élastine sur la Galectine-3 est effective et est aussi inhibée par le lactose. L‟interaction Elastine-Galectine-3 ne semble 31 Elastine donc pas être à l‟origine des effets présentés ci-dessus mais semble principalement intervenir pour faciliter l‟adhérence des cellules aux tissus riches en fibres élastiques (Ochieng J. et al, 1999). L‟intégrine αvβ3 peut également servir de récepteur pour l‟élastine. Et si, à ce jour, aucun effet biologique consécutif à l‟interaction de l‟élastine avec l‟intégrine α vβ3 n‟a été décrit, il apparaît cependant que cette interaction est essentielle au cours des processus d‟élastogenèse (Rodgers UR. and Weiss AS., 2004). 32 Médiateurs de la réponse immunitaire II. La réponse immune innée et adaptative : les médiateurs cellulaires et solubles Le processus inflammatoire se déclenche dès les premiers contacts avec un antigène reconnu comme potentiellement pathogène. Ce processus qui participe au développement de la réponse dite "innée", est la conséquence d‟interactions multiples entre les cellules inflammatoires et leur environnement. Les macrophages et les polynucléaires neutrophiles sont les principales cellules inflammatoires mises en jeu au cours de la réponse innée. Arrivés au site infectieux, ils sécrètent de nombreuses protéases (MMP, sérine protéases, élastase…), et de nombreux médiateurs de l‟inflammation (cytokines, chimiokines, radicaux libres oxygénés…) qui assurent la destruction de l‟agent pathogène. Le processus inflammatoire fait alors l‟objet d‟un contrôle fin et complexe qui permet le retour à un état d‟immunosurveillance basal. En cas de diminution de ces mécanismes de contrôle et donc de persistance de l‟agent pathogène, une réponse dite "adaptative" se déclenche. Cette réponse va mobiliser différentes populations cellulaires capables de coopérer entre elles afin de mettre en place une réponse spécifique ciblée sur la reconnaissance d‟antigènes caractéristiques de l‟agent pathogène. Les premières cellules mises en jeu au cours de la réponse adaptative sont les cellules dendritiques qui sont des cellules phagocytaires présentant de façon spécifique les antigènes aux lymphocytes T et B. Après activation, les lymphocytes prolifèrent pour former des clones spécifiquement dirigés contre les différents antigènes et permettant la destruction des agents pathogènes et/ou des cellules infectées exprimant ces antigènes. Dans ce travail de thèse, nous nous sommes focalisés sur l‟étude de deux populations cellulaires jouant, pour chacune d‟entre elles, un rôle clé dans l‟immunité innée ou acquise, les polynucléaires neutrophiles et les cellules dendritiques. Outre l‟intérêt de ces deux populations comme cellules cibles pour l‟étude du rôle des peptides d‟élastine dans la régulation de la réponse immunitaire, nous avons été confortés dans ce choix par le fait que ces deux types cellulaires sont capables de coopérer et de faire le lien entre l‟immunité innée et adaptative. Ainsi, les polynucléaires neutrophiles peuvent attirer les cellules dendritiques sur le lieu d‟infection et, par une interaction physique, activer leur maturation et leur différenciation (Bennouna S. et al, 2003 ; Megiovanni AM. et al, 2006). De plus, les polynucléaires neutrophiles après avoir phagocyté l‟agent pathogène entrent en apoptose. Les cellules dendritiques peuvent alors ingérer les corps apoptotiques dérivés des polynucléaires 33 Polynucléaires neutrophiles neutrophiles et présenter les antigènes présents dans ces corps apoptotiques. Ceci confère aux polynucléaires neutrophiles des fonctions de présentation d‟antigènes vis-à-vis des cellules dendritiques (Ludwig IS. et al, 2006). A l‟opposé, les cellules dendritiques augmentent la durée de vie des polynucléaires neutrophiles, prolongeant et amplifiant ainsi leurs fonctions effectrices (Ludwig IS. et al, 2006). A. Les polynucléaires neutrophiles (PN) 1. Ontogenèse, différenciation et maturation Les polynucléaires neutrophiles (PN) sont des cellules de l‟immunité innée appartenant au groupe de cellules couramment appelés leucocytes. Ils dérivent des cellules de la moelle osseuse, et plus particulièrement de la lignée cellulaire myéloblastique (Borregaard N., 2010). La différenciation de cette lignée est finement contrôlée, notamment par le G-CSF, et se fait en plusieurs étapes. Le progéniteur initial est le myéloblaste qui va ensuite se différentier en promyélocyte, la cellule poursuit sa différenciation en entrant dans le stade myélocyte puis survient le stade métamyélocyte et enfin, le dernier stade transitoire de la différenciation est le stade de cellule à bandes, qui sous l‟effet du G-CSF se différencie enfin en polynucléaire. Ce processus est appelé la granulocytopoïèse et donne lieu à trois types de polynucléaires : les polynucléaires neutrophiles, les polynucléaires éosinophiles et les polynucléaires basophiles qui forment la famille des granulocytes. Les polynucléaires éosinophiles, et basophiles sont principalement mis en jeu lors des allergies ou des infections parasitaires ; les polynucléaires neutrophiles sont, quant à eux, le plus souvent recrutés pour lutter contre les infections courantes, bactériennes ou virales, dans le cadre de la défense immunitaire innée (Hirai K. et al, 1997 ; Macedo RC. et al, 2010) (Schéma 12). 34 Polynucléaires neutrophiles Schéma 12 : La granulocytopoïèse dans la moelle osseuse (d‟après Borregaard N., 2010). 2. Caractéristiques biologiques des PN Les PN sont la première ligne de défense contre les micro-organismes ayant réussi à pénétrer les barrières physiologiques. Ils sont sécrétés en grand nombre (1 à 2.10 11 cellules par jour chez un adulte) et circulent dans le sang pendant quelques heures en tant que cellules dormantes capables d‟être mobilisées à tout instant. Ce groupe de cellules a été nommé granulocyte car toutes les cellules en faisant partie sont caractérisées par la présence de granules dans leur cytoplasme. Les granules des PN sont classés en trois groupes : les granules primaires, aussi appelés azurophiles et qui contiennent la myéloperoxidase, les granules secondaires, aussi appelés spécifiques et qui contiennent en particulier la lactoferrine, et enfin, les granules tertiaires renfermant de la gélatinase (Borregaard N. et al, 1995 ; Borregaard N. and Cowland JB., 1997). Ces trois types de granules sont formés de manière séquentielle respectivement durant les stades promyélocyte, myélocyte-métamyélocyte, et le stade de cellule à bandes. Chacun de ces granules étant formé à un temps précis de la différenciation cellulaire, il ne renferme que des protéines produites durant la période de différenciation où ils ont été synthétisés. Ceci constitue un "ciblage dépendant du stade de biosynthèse" et non un "ciblage par adressage" plus classique (Le Cabec V. et al, 1996). En plus de leurs granules, les PN contiennent des vésicules de sécrétion. Celles-ci sont des organelles de stockage, formées par endocytose au cours de la maturation. Elles contiennent notamment des récepteurs de surface nécessaires à la migration des PN au travers de l‟endothélium (N. Borregaard, et al, 1992) (Tableau 2). 35 Azurophil granules Specific granules Gelatinase granules Secretory vesicles Membrane CD63 CD11c/CD18 CD11c/CD18 Alkalyne phosphatase CD68 Presenilin 1 Stomatin CD15 CD66 CD67 Cytochrome b558 Diacylglycerol deacetylating enzyme fMLP-R CD10 CD11c/CD18 CD13 V-type H+-ATPase Cytochrome b558 fMLP-R Leukolysin NRAMP-1 CD14 CD16 Fibronectin-R SCAMP CD45 G-proteinα-subunit Laminin-R SNAP-23, -25 uPA-R CR1 C1q-R Leukolysin VAMP-2 Cytochrome b558 NB1 antigen 19kDa protein 155-kDa protein Rap-1, Rap-2 + V-type H -ATPase Decay-accelerating factor (DAF) fMLP-R Leukolysin VAMP-2 V-type H+-ATPase SCAMP SNAP-23, -25 Stomatin Thrompospondin-R TNF-R uPA-R VAMP-2 Vitronectin-R Matrix Acid ß-glycerophosphatase ß2-Microglobulin Acetyltransferase Acid mucopolysaccharide α1-Antitrypsin α-Mannosidase Azurocidin Collagenase CRISP-3 (SGP-28) Gelatinase hCAP-18 ß2-Microglobulin CRISP-3 Gelatinase Lysozyme BPI ß-Glycerophosphatase ß-Glucuronidase Cathepsins Defensins Elastase Lysozyme MPO Histaminase Heparanase Lactoferrin Lysozyme NGAL uPA Sialidase Transcobalamin-I Plasma protein N-acetyl-ß-glucosaminidase Proteinase-3 Sialidase Ubiquitin-protein R, receptor; CRISP, cystein-rich secretory protein; SGP-28, specific granule protein of 28 kDa; uPA, urokinase-type plasminogen activator. Other abbreviations as explained in text. Tableau 2 : Contenu des différents granules des PN (d‟après Faurschou M. and Borregaard N., 2003). 36 Polynucléaires neutrophiles 3. Rôle des PN au cours de l’inflammation La mobilisation des PN à la suite d‟une infection est un processus complexe appelé diapédèse. Sur le site d‟une infection, les PN sont capables de fixer des molécules (PSélectine, E-Sélectine, ICAM…) exprimées par les cellules endothéliales activées. Les vésicules de sécrétion sont alors mobilisées très rapidement, ce qui permet la libération de nouveaux récepteurs de surface nécessaires à la migration des PN au travers de l‟endothélium. Cette étape a lieu le plus souvent dans les veinules post-capillaires où l‟endothélium est fin, et où le diamètre du vaisseau est suffisamment petit pour permettre le ralentissement des PN. En interagissant avec les molécules exprimées à la surface des cellules endothéliales, les PN ralentissent (étape de rolling), puis adhèrent fermement à l‟endothélium. Ceci s‟accompagne d‟une polarisation des cellules concentrant les récepteurs de chimiokines et de phagocytose au niveau des lamellipodes. Une fois ces différentes étapes achevées, les PN traversent l‟endothélium en utilisant deux voies non mutuellement exclusives. Les PN peuvent traverser l‟endothélium en passant entre les cellules endothéliales, c‟est la voie para-cellulaire, ou ils peuvent passer au travers de la cellule endothéliale, c‟est la voie trans-cellulaire. Cette dernière voie n‟est utilisée que dans 20% des cas de diapédèse (Woodfin A. et al, 2010). A ce stade, les granules et leurs contenus sont peu mobilisés. Ce sont majoritairement les vésicules de sécrétion, qui ont un seuil de mobilisation faible, qui sont mises en jeu au cours de la diapédèse. Par la suite, les granules contenant les gélatinases, puis les granules spécifiques, et enfin les granules azurophiles seront mobilisés pour lutter contre les agents pathogènes (Borregaard N., 2010). Cette gradation dans la mobilisation des différents granules permet de cibler les agents pathogènes, tout en limitant la propagation des lésions infligées aux tissus hôtes. Ainsi, les granules contenant les gélatinases sont mis en jeu lors de la diapédèse, tandis que les granules spécifiques et azurophiles sont principalement impliqués dans la destruction des bactéries (Schéma 13). Une fois passée la barrière endothéliale, les PN doivent traverser la membrane basale. Pour cela, ils utilisent les protéases libérées par l‟exocytose des vésicules de sécrétion et les gélatinases libérées par les granules dédiés (Kang T. et al, 2001). Au cours de leur migration dans les tissus, les PN sont fortement activés ce qui leur permet de phagocyter les microorganismes étrangers et de libérer le contenu des granules spécifiques et azurophiles : radicaux libres, protéases, et autres substances bactéricides (défensines, lactoferrine, lysozyme…) (Sørensen OE. et al, 2001). Les PN sont également capables de recruter d‟autres 37 Polynucléaires neutrophiles cellules immunitaires en produisant des chemokines comme l‟IL-8 et GRO-α ce qui amplifie la réponse inflammatoire (Scapini P., et al. 2005). Afin d‟éviter des dommages tissulaires collatéraux importants, les PN doivent cependant être rapidement neutralisés, ce qui explique leur durée de vie courte qui représente un excellent système d‟autorégulation. Les PN entrent donc rapidement en apoptose après leur intervention, et les débris cellulaires sont phagocytés par les macrophages arrivés plus tardivement sur le site inflammatoire (Burg ND. and Pillinger MH., 2001). Schéma 13 : Les neutrophiles sur le site d‟infection (d‟après Borregaard N., 2010). 4. Les médiateurs de l’inflammation sécrétés par les PN a) Les protéases Les PN sécrètent de nombreuses protéases telles que la MMP-2, la MMP-8 et la MMP-9 toutes trois capables de dégrader les collagènes des membranes basales. Ces trois MMP sont impliquées dans la pénétration des PN dans les tissus après la diapédèse (Kang T. et al, 2001). Les PN sécrètent également la MMP-25 (également appelée MT6-MMP), protéase transmembranaire qui semble avoir pour rôle de faciliter la migration transendothéliale des PN (Faurschou M. and Borregaard N., 2003). Les PN sont aussi capables de sécréter des sérines protéases telles que la protéinase-3 et la cathepsine G. Ces sérines 38 Polynucléaires neutrophiles protéases dégradent des composants de la matrice extracellulaire, notamment l‟élastine mais également la fibronectine, la laminine, la vitronectine ou encore le collagène de type IV ce qui a pour effet de faciliter le déplacement des PN. Ces protéases sont aussi fortement impliquées dans l‟activité bactéricide des neutrophiles, dans l‟activation des cellules endothéliales, des cellules épithéliales, des macrophages et des lymphocytes et donc participent à l‟amplification de la réponse inflammatoire. Enfin, les PN sécrètent la neutrophile élastase (NE) qui aide au déplacement des cellules au sein de la MEC mais aussi à la destruction efficace des agents pathogènes (Owen CA. and Campbell EJ., 1999). La libération de ces différentes protéases par les PN peut entrainer de graves dommages au niveau des tissus hôtes environnants si elle n‟est pas précisément contrôlée. La libération des protéases est donc contrebalancée par la synthèse, par les PN, d‟inhibiteurs spécifiques de ces protéases. Les Tissue Inhibitor of Metalloproteinases (TIMPs), dont on connaît quatre représentants : les TIMPs 1 à 4, qui sont de puissants inhibiteurs des MMPs. L‟α1-antitrypsine, l‟α1-antichymotrypsine, l‟α2-macroglobuline et l‟inhibiteur de leucoprotéinases sécrétées (SLPI) sont, quant à eux, de puissants inhibiteurs des sérines protéases. L‟α1-antitrypsine est le principal inhibiteur de la NE et une déficience de synthèse de cet inhibiteur est souvent impliquée dans le développement de pathologies touchant les tissus riches en élastine et caractérisées par une inflammation chronique. Ce mécanisme participe notamment au développement de la BPCO (Witko-Sarsat V. et al, 2000). b) Les cytokines et les chimiokines Les PN ont une capacité de sécrétion de cytokines pro-inflammatoires importante ce qui leur permet d‟une part d‟amplifier la réponse inflammatoire et d‟autre part d‟assurer le trait d‟union entre la réponse immunitaire innée et la réponse immunitaire adaptative (Cassatella MA., 1995). Durant ce travail de thèse nous nous sommes principalement focalisés sur trois cytokines pro-inflammatoires dont la production par les PN est avérée et qui peuvent également être modulées par les PE dans d‟autres types cellulaires (Baranek T. et al, 2007). 39 Polynucléaires neutrophiles - L’IL-8 Structure du gène L‟IL-8 humaine est codée par un gène de 5191 paires de bases contenant 4 exons. Il est localisé sur le chromosome 4 au locus 4q12-q21 (Zhang W. and Chen H., 2002). Ce gène possède dans son promoteur les éléments de réponse aux facteurs de transcription AP-1, AP-2, IRF-1, HNF-1, NF-IL-6 et NF-κB (Schéma 14). L‟importance relative de chacun de ces facteurs dépend du type cellulaire produisant la cytokine (Okamoto S. et al, 1992). Le nombre important de facteurs de transcription impliqués dans la régulation de la synthèse de l‟IL-8 suggère un contrôle majoritairement transcriptionel. Le gène de l‟IL-8 code pour une préprotéine de 99 AA, qui, après clivage du peptide signal de 20 AA, donne une protéine mature de 8 kDa. Cette protéine est basique et contient 4 cystéines formant 2 ponts disulfures (Mukaida N. et al, 1994). Schéma 14 : Structure du gène de l‟IL-8 (d‟après Mukaida N. et al, 1994). Source et inducteurs L‟IL-8 est produite par de nombreux types cellulaires tels que les monocytes, les lymphocytes T, les PN, les fibroblastes, les cellules endothéliales et épithéliales (Zhang W., et al, 2002). Dans tous ces types cellulaires, différentes molécules comme les lectines, les facteurs mitogènes et des cytokines pro-inflammatoires comme l‟IL-1, ou le TNF sont impliquées dans la régulation de la synthèse de l‟IL-8 (Okamoto S. et al, 1992). Activités biologiques et récepteurs L‟IL-8 est un puissant chimio-attractant et un puissant activateur des PN. L‟IL-8, produite précocément au cours de l‟inflammation, attire les PN au site inflammatoire tout en modifiant leur morphologie afin de faciliter leur migration trans-endothéliale. Au site inflammatoire, l‟IL-8 active les PN qui libèrent les protéines contenues dans les vésicules de sécrétion et dans les granules spécifiques. En fonction de l‟intensité de l‟activation, l‟IL-8 40 Polynucléaires neutrophiles peut induire la libération des protéines contenues dans les granules azurophiles et la gélatinase contenue dans les granules tertiaires. L‟IL-8 active également la NADPH Oxydase des PN ce qui conduit à la production d‟ions superoxydes et de radicaux libres oxygénés qui une fois libérés participent au burst oxydatif (Baggiolini M. and Clark-Lcwisb I., 1992). L‟IL-8 exerce également un effet chimio-attractant vis-à-vis des lymphocytes T (Okamoto S. et al, 1992) (Schéma 15). Le récepteur de l‟IL-8 appartient à la famille des récepteurs couplés aux protéines G. Deux types de récepteurs ont été identifiés à ce jour : le CXCR1 et le CXCR2 (Zhang W. et al, 2002). Schéma 15 : Bilan des effets de l‟IL-8 sur les PN (d‟après Barnes PJ., 2001). - L’IL-6 Structure du gène Le gène de l‟IL-6 humaine est localisé sur le chromosome 7 au locus 7p21. Il comporte 5000 paires de bases et est composé de 5 exons. Il code pour une pré-protéine de 212 AA, de laquelle le peptide signal peut-être clivé pour donner une protéine mature de 184 AA dont le poids moléculaire peut aller de 25 à 30 kDa. L‟hétérogénéité dans la masse moléculaire de la protéine mature s‟explique par le fait que la protéine peut-être O- ou NGlycosylée et ceci sans que ses fonctions en soient altérées (Gaillard O., 2002). Dans la protéine mature, il existe 4 cystéines dont 2 sont indispensables à l‟activité biologique. Ces 41 Polynucléaires neutrophiles cystéines sont impliquées dans la formation de ponts disulfures. De nombreux éléments de réponse aux facteurs de transcription SRE, CRE ou AP-1 sont présents dans le promoteur du gène de l‟IL-6 ce qui participe d‟une régulation fine de la synthèse de la protéine (Kishimoto T., 1989) (Schéma 16). Schéma 16 : A : Structure du gène de l‟IL-6 ; B : Structure du promoteur de l‟IL-6 (d‟après Kishimoto T., 1989). Source et inducteurs L‟IL-6 humaine est produite par de nombreux types cellulaires : des cellules de la réponse immune comme les monocytes ou les macrophages, les lymphocytes ou les PN mais également des cellules non immunes comme les fibroblastes, les cellules épithéliales ou les cellules endothéliales (Kishimoto T., 1989). La modulation de l‟IL-6 varie en fonction du type cellulaire. Dans les monocytes et les macrophages, le lipopolysaccharide (LPS) de la paroi des bactéries à Gram négatif entraine une stimulation de la production d‟IL-6 alors que l‟IL-4 a un rôle inhibiteur de la production de l‟IL-6 (Helfgott DC. et al, 1987). Dans les PN, la production de l‟IL-6 est stimulée par le G-CSF (Ericson SG. et al, 1998). Activités biologiques et récepteur L‟IL-6 est une cytokine douée de nombreuses fonctions biologiques qui varient en fonction du type cellulaire. Ainsi, elle active la synthèse d‟anticorps par les lymphocytes B, ou participe à l‟hématopoïèse en synergie avec l‟IL-3 (Kishimoto T., 1989). Elle joue un rôle déterminant dans le contrôle de la phase aigüe de l‟inflammation : c‟est une cytokine proinflammatoire pyrogène qui induit la production de la plupart des protéines de l‟inflammation aiguë (Gauldie J. et al, 1987). Elle dirige la transition de la phase aiguë de l‟inflammation vers 42 Polynucléaires neutrophiles la phase chronique en modifiant la nature de l‟infiltrat cellulaire : elle est impliquée dans le remplacement progressif des PN par les monocytes (Kaplanski G. et al, 2003). Les effets biologiques de l‟IL-6 sont la conséquence de l‟interaction de la cytokine avec un récepteur spécifique. Ce récepteur est une protéine de 468 AA ne possédant qu‟un seul domaine transmembranaire associé à un domaine intra-cytoplasmique de 82 AA et ne possédant pas d‟activité de Tyrosine kinase (Schéma 17). Schéma 17 : Structure du récepteur de l‟IL-6 (d‟après Kishimoto T., 1989). - TNF-α Structure du gène Le gène du TNF-α humain est localisé sur le chromosome 6 au locus 6p21.3. Il est composé de 3600 paires de bases réparties en trois introns et quatre exons (Nedwin GE. et al, 1985). Le promoteur du TNF-α possède des sites de fixation pour différents facteurs de transcription, principalement NF-κB et AP-1, mais aussi AP-2, NF-AT, CRE (Kuprash DV. et al, 1999 ; Yao J. et al, 1997). Ces différents facteurs de transcription interagissent différemment selon le type cellulaire et la nature du stimulus activateur. Le gène du TNF-α est un gène de la réponse immune immédiate ; 15 à 30 minutes suffisent pour augmenter le 43 Polynucléaires neutrophiles niveau d'ARNm codant pour le TNF-α après stimulation (Schéma 18). Le gène du TNF-α code pour une pré-protéine transmembranaire de 157 AA ayant un poids moléculaire de 26 kDa. Le peptide signal du TNF-α néo-synthétisé est particulièrement grand (76 AA) et peut être clivé par une métalloprotéase membranaire : la TNF-α convertase enzyme (TACE) (Gearing AJ. et al, 1994). Le TNF-α mature ainsi libéré a un poids moléculaire de 17 kDa et peut s'assembler en trimère (Aggarwal BB. et al, 1985). Le TNF-α peut exercer ses fonctions biologiques sous différentes formes : sous une forme soluble après clivage du peptide signal ou sous une forme membranaire en l‟absence de clivage (Kriegler M. et al, 1988). Schéma 18 : Structure du gène du TNF-α (d‟après Bashir MM. et al, 2009). Source et inducteurs De nombreuses cellules produisent du TNF-α. Les monocytes et les macrophages en sont les principales sources, mais les cellules dendritiques, les lymphocytes T et B, les cellules Natural Killer (NK), les PN, les mastocytes et les fibroblastes en synthétisent également (Bazzoni F. and Beutler B., 1996). L'expression du gène du TNF-α est régulée par de nombreux stimuli. Les facteurs bactériens sont de puissants inducteurs du TNF-α. Le LPS est le plus puissant stimulus de la biosynthèse du TNF-α par les monocytes et les cellules dendritiques via une interaction avec le complexe récepteur CD14/TLR4 présent à la surface de ces cellules (Gangloff S. et al, 2005). Le LPS est également capable d‟induire une augmentation de la production de TNF-α dans les PN (Sohn EJ. et al, 2007). Activités biologiques et récepteur Le TNF-α exerce des activités biologiques variées sur de nombreux types cellulaires. Cependant, son rôle principal apparaît au cours de l'inflammation. Il favorise le chimiotactisme des monocytes et des PN en induisant la production de chimiokines (MCP-1, IL-8…) (Hachicha M. et al, 1993 ; Rathanaswami P. et al, 1993) et l‟expression de molécules 44 Polynucléaires neutrophiles d‟adhérence (ICAM-1, VCAM-1, sélectines) à la surface de ces cellules (Iademarco MF. et al, 1995 ; Weller A. et al, 1992). Au niveau du site inflammatoire, le TNF-α induit l‟exocytose des granules de sécrétion des PN et donc la libération de radicaux libres et de protéases (Gamble JR. et al, 1985 ; Klebanoff SJ. et al, 1986). Le TNF-α active également la transcription de différentes cytokines pro-inflammatoires (IL-1, IL-6,…) et de facteurs de croissance (GM-CSF) ce qui permet d‟amplifier la réponse inflammatoire. Le TNF-α intervient aussi dans la genèse de la réponse immunitaire spécifique en favorisant, en synergie avec le GM-CSF, la maturation des cellules dendritiques (Caux C. et al, 1992). Le TNF-α contrôle, directement ou indirectement, la prolifération et la différenciation des lymphocytes T et des lymphocytes B (Grech AP. et al, 2000 ; Zuniga-Pflucker JC. et al, 1995). L‟ensemble de ces activités passent par l‟interaction du TNF-α avec son récepteur spécifique. Il existe deux types de récepteur que l‟on peut différencier par leur poids moléculaire : le TNF-RI et le TNF-RII respectivement de poids moléculaire 55 et 75 kDa. Ces deux récepteurs ont une représentation ubiquitaire mais le TNF-RII semble majoritairement représenté à la surface des cellules dérivant de la lignée hématopoïétique (Fiers W., 1991) (Schéma 19). Schéma 19 : Structure des récepteurs du TNF-α (d‟après Camussi G. et al, 1991). 45 Cellules dendritiques B. Les cellules dendritiques (CD) Les cellules dendritiques (CD) sont les cellules clés de la réponse immunitaire adaptative puisque cette réponse est médiée par les lymphocytes T et B sous le contrôle des CD. En effet, les CD sont les principales cellules présentatrices d‟antigènes de l‟organisme ainsi que les principales cellules activatrices des lymphocytes par le biais des molécules de co-stimulation qu‟elles expriment à leur surface. De plus, elles sont aussi capables de sécréter des cytokines initiatrices de la réponse immunitaire ou encore d‟induire la tolérance immunitaire vis-à-vis des molécules du "soi" (Banchereau J. and Steinman RM., 1998 ; Burnet FM., 1976). Les CD ont été découvertes en 1973 (Steinman RM. and Cohn ZA., 1973) et présentent une grande hétérogénéité dans leur phénotype et dans leurs fonctions qui varient en fonction du tissu dont elles sont originaires. Ainsi, les CD de l‟épiderme, appelées cellules de Langerhans, ont une morphologie typique de CD avec la présence de dendrites et possèdent des granules particuliers, les granules de Birbeck. Elles expriment les marqueurs de surface HLA-DR, HLA-DQ et CD1a, mais pas ou très peu de molécules de co-stimulation. A l‟opposé, dans le derme, les CD ne possèdent pas de granules de Birbeck et expriment très peu le marqueur CD1a. En revanche, elles expriment fortement le marqueur CD32 impliqué dans la capture de l‟antigène. Cette hétérogénéité rend difficile la définition d‟un profil type de marqueurs membranaires spécifiques à l‟ensemble des cellules dendritiques (Reid CD., 1998). Les CD ne sont que faiblement représentées dans les tissus. Elles y sont sous une forme immature avec des capacités de phagocytose importantes mais peu aptes à présenter des antigènes. Cependant, en présence de signaux inflammatoires, elles phagocytent rapidement les antigènes puis subissent une maturation rapide qui les transforme en cellules présentatrices d‟antigènes qui migrent vers les ganglions lymphoïdes où elles initient la réponse immunitaire. Leur rôle dans les tissus est donc un rôle de sentinelle (Reid CD., 1998). 1. Ontogenèse des CD Il existe deux types de CD : les cellules dérivant de la lignée myéloïde, qui regroupent les cellules de Langerhans et les CD interstitielles, et les CD dérivant de la lignée lymphoïde 46 Cellules dendritiques et qui constituent les CD plasmacytoïdes (CDp) (Reid CD., 1998). L‟ensemble de ces cellules découle d‟un même progéniteur hématopoïétique possédant le marqueur de surface CD34 (Schéma 20). a) La lignée myéloïde Il existe deux précurseurs possibles des CD dans la lignée myéloïde. Ces deux précurseurs, que l‟on peut retrouver dans le sang circulant, ont en commun le marqueur de surface CD11c mais se distinguent par la présence ou l‟absence du marqueur CD14 (Spits H. et al, 2000). Les progéniteurs CD14- sont à l‟origine des CD immatures CD14-CD1a+ qui à terme donneront les CD typiques de l‟épiderme, les cellules de Langerhans. Les progéniteurs CD14+ donnent, eux, les CD typiques du derme, les CD interstitielles. Dans les deux cas, la présence de GM-CSF est indispensable à la différenciation en CD. En l‟absence de GM-CSF, les progéniteurs CD14+ qui sont capables de sécréter du M-CSF se différencient en macrophages (Caux C. et al, 1996). Les deux types de CD d‟origine myéloïde sont capables de stimuler les lymphocytes et d‟orienter la réponse induite vers la production d‟un profil de cytokines de type 1 (IFN- et TNF-α), mais seules les CD dérivées des progéniteurs CD14+ sont capables de stimuler les LB afin d‟induire la production d‟IgM (Caux C. et al, 1996). b) La lignée lymphoïde Les progéniteurs lymphoïdes sont à l‟origine de nombreux types cellulaires différents comme les lymphocytes T et B et les cellules NK. Mais ces progéniteurs peuvent aussi se différencier en précurseurs de cellules dendritiques plasmacytoïdes (CDp) caractérisés, entre autre, par l‟expression des marqueurs de surface lymphoïdes CD8α, CD4, CD45RA et CD123 (récepteur de l‟IL-3) (Spits H. et al, 2000). Contrairement aux CD myéloïdes, la différenciation des précurseurs en CDp ne fait pas intervenir le GM-CSF mais l‟IL-3 (McKenna K. et al, 2005). Les CDp sont spécialisées dans la production d‟IFN-α et β et orientent la réponse des LT vers un profil de production de cytokines de type 2 (IL-4 et IL-5). Elles sont également impliquées dans l‟induction de la tolérance vis-à-vis des antigènes "du soi" en déclenchant une anergie des LT ou un mécanisme apoptotique des clones de cellules T dirigés contre ces antigènes (Spits H. et al, 2000 ; Ardavin C., 1997). Elles s‟accumulent 47 Cellules dendritiques principalement dans les tissus lymphoïdes : ganglions lymphatiques, moelle osseuse et thymus mais on peut également les retrouver sur les sites inflammatoires et dans le sang (McKenna K. et al, 2005). c) Les CD dérivées de monocytes Dans l‟organisme, les CD et les monocytes sont deux types cellulaires distincts mais qui dérivent d‟un progéniteur commun : la cellule progénitrice myéloïde. Les monocytes sont des cellules myéloïdes de grandes tailles et rondes, circulant de façon transitoire dans le sang, et capables de se différencier en macrophages dans les tissus (Naito M. et al., 1997). Les CD sont des cellules en fin de différenciation présentant de nombreuses expansions cytoplasmiques (Banchereau J. et al, 2000). Les monocytes (CD14+CD11c+CD1a-) conservent la capacité à se différencier in vitro en CD en présence de GM-SCF et d‟IL-4 (Santin AD. et al, 1999). Les CD ainsi obtenus ont un phénotype immature : elles expriment faiblement les molécules de co-stimulation CD80 et CD86, les molécules du CMH de classe II et de nombreux récepteurs aux chimiokines associées à l‟inflammation (CCR1, CCR2 et CCR5). Ces cellules ont une grande capacité de capture de l‟Ag associée à une faible capacité de présentation des peptides antigéniques aux lymphocytes T. In vivo, la différenciation des monocytes en CD peut se produire lors d‟interactions avec des cellules de structure, telles que les cellules endothéliales (Randolph GJ. et al, 1998 ; Randolph GJ. et al, 1999). La maturation en CD CD14- CD83+ CD86+ HLA-DRhi CCR7+ peut, quant à elle, être obtenue avec des Ag bactériens (ex : le LPS) ou des cytokines comme le TNF-α ou l‟IL-1β. L‟interaction avec des lymphocytes auxiliaires CD4+ entraîne la maturation et l‟activation de ces CD, via le CD154 (Albert ML. et al, 2001). 2. Caractéristiques fonctionnelles des CD a) C p u e de ’An igène Les CD immatures qui jouent un rôle de sentinelle dans les tissus de l‟organisme expriment peu de molécules de co-stimulation et sont donc de mauvais activateurs des LT. En revanche, ces CD ont une grande capacité de captation de l‟antigène. Elles ont plusieurs 48 Cellules dendritiques moyens à leur disposition pour capturer l‟antigène. Elles peuvent intercepter par phagocytose des agents pathogènes comme les bactéries et les virus mais également des particules et des corps apoptotiques (Svensson M. et al, 1997). Elles peuvent également utiliser i) la macropinocytose qui consiste à former puis à englober de larges vésicules de pinocytose contenant le fluide extracellulaire et les solutés qui y sont présents (Sallusto F. and Lanzavecchia A., 1995), ou ii) l‟endocytose qui met en jeu des récepteurs de types Lectines, ou des récepteurs pour le fragment Fc des immunoglobulines (RFc ou RFcε) (Sallusto F. and Lanzavecchia A., 1994). Ces différents processus permettent aux CD de capter des antigènes présents à de faibles concentrations (de l‟ordre de la picomole) dans l‟environnement alors que les autres cellules présentatrices d‟antigène de l‟organisme ne captent que les antigènes présents à des concentrations 106 fois plus élevées (Banchereau J. and Steinman RM., 1998). Schéma 20 : Ontogénie des cellules dendritiques (d‟après Banchereau J. et al, 2000). 49 Cellules dendritiques b) Maturation des cellules dendritiques et apprêtement de ’ n igène Une fois l‟antigène capté, les CD sont le siège d‟une maturation d‟abord partielle puis définitive. La CD devient alors réfractaire à toute nouvelle stimulation antigénique. La maturation définitive nécessite la mise en jeu de signaux qui peuvent être d‟origine microbienne, ou liés à des cytokines (comme le TNF-α ou l‟IL-6) ou à des interactions cellulaires. Tout au long du processus de maturation, la CD subit un ensemble de mécanismes, dit d‟apprêtement, qui lui permet d‟être dans les conditions idéales de présentation aux lymphocytes T. Deux mécanismes d‟apprêtement peuvent coexister : des mécanismes d‟apprêtement endogènes et exogènes. Les CD sont capables de produire de nombreuses molécules du CMH de classe II comme les HLA-DM ou l‟H-2M qui vont se retrouver dans des compartiments endosomaux spécifiques. Ces molécules du CMH sont associées à une chaîne invariante glycosylée nommée Ii qui intervient dans l‟assemblage et la stabilisation du complexe. La chaîne Ii présente une composante nommée CLIP (Class II associated Ii Peptide) qui se place dans la zone où se logent les peptides antigéniques, permettant d‟éviter toutes associations entre la molécule du CMH de classe II et un peptide inapproprié. Au cours du mécanisme d‟apprêtement exogène, c‟est avec ces compartiments endosomaux que les vésicules d‟endocytose contenant l‟antigène vont fusionner. Au cours des fusions, l‟Ag va être protéolysé en peptides antigéniques et c‟est la fusion de ces derniers avec les molécules de classe II qui permet le clivage de la chaîne Ii libérant ainsi la place occupée par la protéine CLIP au profit des peptides antigéniques. Le complexe Ag/CMH II est alors dirigé à la surface de la CD afin d‟être présenté aux lymphocytes (Nijman HW. et al, 1995 ; Pierre P. et al, 1997) (schéma 21). 50 Cellules dendritiques Schéma 21 : Présentation antigénique restreinte au CMH de classe II (d‟après Mayer G., 2006). Les CD expriment également à leur surface des molécules de classe I du CMH. Des Ag d‟origine virale, mais aussi certains Ag particulaires et des complexes immuns phagocytés, peuvent être présents dans le cytosol au moment où la CD déclenche ses mécanismes d‟apprêtement (schéma 22). Ces Ag sont alors dégradés dans le protéasome en peptides antigéniques et transportés dans le réticulum endoplasmique, grâce à des protéines de transport ATP-dépendant (TAP1 et TAP2), où elles sont associées avec des molécules de classe I du CMH avant d‟être transportés à la surface cellulaire (Banchereau J. and Steinman RM., 1998). 51 Cellules dendritiques Schéma 22 : Présentation antigénique restreinte au CMH de classe I (d‟après Mayer G., 2006). Le remaniement de l‟antigène s‟accompagne de changements phénotypiques des CD. On observe ainsi une augmentation de l‟expression des molécules de co-stimulation, CD40, CD80 et CD86 nécessaires à l‟activation des lymphocytes T (Santin AD. et al, 1999). On peut voir également l‟acquisition du marqueur de surface CD83 qui signe la maturation définitive des CD (Zhou LJ. and Tedder TF., 1996). Enfin, on note l‟apparition du récepteur de chimiokines CCR-7 qui permet aux CD de quitter l‟interface épithéliale pour gagner les organes lymphoïdes secondaires via les vaisseaux lymphatiques (Sozzani S. et al, 1998). c) Migration des CD Les CD possèdent de fortes capacités migratoires qui varient en fonction de leur stade de maturation. La migration de la moelle osseuse vers les tissus périphériques puis vers les organes lymphoïdes secondaires est finement régulée et dépend à la fois, de l‟expression de molécules d‟adhérence comme les sélectines et les intégrines mais aussi de l‟expression 52 Cellules dendritiques différentielle de récepteurs de chimiokines (Caux C. et al, 2002). Le recrutement des précurseurs des CD vers les sites inflammatoires est contrôlé par l‟action de différentes chimiokines. Les CD migrent vers le site inflammatoire en réponse à la production, par les cellules épithéliales, de chimiokines inflammatoires telles que MIP-3α, RANTES ou encore SDF-1 (Caux C. et al, 2000). Au fur et à mesure de leur déplacement orienté, les CD augmentent le niveau d‟expression des récepteurs aux chimiokines à leur surface ce qui amplifie la migration. Une fois sur site, les CD peuvent capturer un antigène ce qui conduit à la maturation des cellules et à un changement de leur profil migratoire. Au cours de ce changement, les CD diminuent leur niveau d‟expression de certains récepteurs aux chimiokines et acquièrent de nouveaux récepteurs tel que le récepteur de surface CCR-7 (Sozzani S. et al, 1998). Ce changement de profil migratoire permet aux CD de quitter les tissus et de gagner les organes lymphoïdes secondaires. En effet, parallèlement à l‟acquisition par les CD du récepteur CCR-7, la chimiokine CCL21 (ligand du CCR-7) est produite par les cellules endothéliales des vaisseaux lymphatiques. Ceci favorise la migration des CD à travers les vaisseaux et la colonisation des ganglions de drainage de la zone enflammée. La localisation finale des CD dans les zones T paracorticales met en jeu la chimiokine CCL19, produite localement, et également le ligand du CCR-7 (Cyster JG., 1999). d) P é en ion de ’ n igène ux LT : la synapse immunologique Une fois arrivées dans les organes lymphoïdes secondaires, les CD matures interagissent avec le récepteur des cellules T (TcR) via le complexe CMH/antigène à la surface de la cellule en constituant la synapse immunologique. La synapse immunologique est un phénomène dynamique complexe, non entièrement élucidé (Dustin ML. et al, 2010 ; Varma R. et al, 2006) et qui met en jeu des mouvements ioniques, des modifications du cytosquelette, des interactions physiques directes et l‟intervention de cytokines et de chimiokines (Dustin ML., 2006). La synapse se forme dans la zone de contact entre les membranes plasmiques des deux cellules (CD et lymphocyte), zone où se concentrent les molécules d‟adhérence, les molécules du CMH et les molécules de co-stimulation. En l‟absence d‟antigène, le contact n‟est que transitoire. En présence d‟antigène, deux types de contact peuvent s‟instaurer. Des contacts cellulaires longs et intermittents mais suffisamment forts pour déclencher la prolifération des LT CD8 + ou pour stimuler la production de 53 Cellules dendritiques cytokines (Scholer A. et al, 2008). Il peut également s‟agir de contacts longs qui vont déclencher la reconnaissance par les LT naïfs de plusieurs complexes CMH/antigène sur la cellule dendritique. La synapse immunologique alors obtenue (durée de 6h à 18h) permet la différenciation en LT effecteur (Iezzi G. et al, 1998 ; Irvine DJ. et al, 2002 ; Mempel TR. et al, 2004). Cette interaction forte est indispensable à l‟initiation d‟une réponse mémoire (Scholer A. et al, 2008). La formation de la synapse est initiée par l‟interaction forte entre les molécules LFA-1 et ICAM 2/3 exprimées à la surface du LT et par les molécules ICAM-1 (CD54) et DC-SIGN (CD209) exprimées sur la CD mature. Cette interaction arrête la migration des LT. Plus le nombre d‟antigène est important et plus cette fixation initiale est rapide et stable (Henrickson SE. et al, 2008). Par la suite, les molécules CD4 ou CD8 et les molécules de co-stimulation, présentes à la surface des LT, sont recrutées au niveau de la synapse immunologique pour renforcer le dialogue entre la CD et le LT (Krummel MF. et al, 2000). L‟engagement de quelques TcR initie un premier signal conduisant à des modifications du cytosquelette, à la redistribution des autres TcR et des molécules CD28 et CTLA-4 qui vont pouvoir se lier aux molécules de co-stimulation exprimées à la surface des CD. L‟engagement de la molécule CD28 augmente l‟expression du gène de l‟IL-2 (Fraser JD. et al, 1991) et du gène antiapoptotique Bcl-XL ce qui protège les cellules T du signal apoptotique conféré par l‟engagement du TcR (Boise LH. et al, 1995). D‟autres molécules de co-stimulation participent au dialogue CD/LT. Par exemple les interactions CD40/CD40 ligand sont aussi impliquées dans la genèse de signaux co-activateurs (Ludewig B. et al, 1995). Une fois activés, les LT effecteurs migrent vers le site inflammatoire où ils déclenchent soit une réponse immune à médiation humorale par le biais de la production d‟immunoglobulines soit une réponse immune à médiation cellulaire par la genèse de LT cytotoxiques. (Banchereau J. and Steinman RM., 1998) (Schéma 23). 54 Cellules dendritiques Schéma 23 : Implication des CD dans la réponse immunitaire (d‟après Banchereau J. and Steinman RM., 1998). e) Maturation des CD et transduction du signal La maturation des CD se fait suite à la fixation d‟un antigène étranger. Le plus répandu est le lipopolysaccharide (LPS) présent à la surface des bactéries à Gram négatif. C‟est à ce jour, le mode d‟activation des CD le plus étudié et le mieux connu. Le LPS fait parti des molécules que l‟on appelle les Pathogen Associated Molecular Pattern (PAMPs), produits des membranes bactériennes présentant des spécificités antigéniques et capables d‟être présentés par les cellules présentatrices d‟antigène. Les PAMPs sont reconnus par des récepteurs présents à la surface des cellules immunitaires, les Pattern Recognition Receptor (PRRs) dont les plus connus sont les Toll-Like receptor (TLR) (Mogensen TH., 2009). Les CD présentent un profil de PRR particulier qui est modulé en fonction du stade d‟activation des cellules. L‟expression de la plupart des TLR est diminuée au cours de la différenciation 55 Cellules dendritiques des CD ; seul le TLR-3 voit son expression augmenter (Visintin A. et al, 2001). En présence du LPS on observe une augmentation transitoire de l‟expression des TLR-2 et TLR-4 (récepteurs spécifiques du LPS) qui est rapidement suivie par une diminution de l‟expression de ces molécules. Cette observation concorde avec la capacité des CD, une fois qu‟elles ont été activées, d‟entrer dans un état de non stimulation antigénique. La mise en jeu des TLR va mobiliser principalement les voies de signalisation NF-κB et p38MAPK, toutes deux indispensables à la maturation des CD, mais également les voies de signalisation MEK1/2, ERK1/2 et JNK à un moindre niveau. Différentes voies de signalisation sont donc impliquées dans la maturation et l‟activation des CD par le LPS (Yanagawa Y. and Onoé K., 2007 ; Rescigno M. et al, 1998) (Schéma 24). 56 Cellules dendritiques Schéma 24 : Voies de signalisation mises en jeu lors de la maturation des CD induite par les TLRs (d‟après Gauzzi MC. et al, 2010). 3. CD et tolérance immunologique Le système immunitaire possède deux fonctions principales qui peuvent sembler diamétralement opposées. Il doit, en effet, déclencher très rapidement une forte réponse 57 Cellules dendritiques immunologique en cas d‟agression par un agent pathogène. Il doit également mettre en place un état de tolérance vis-à-vis des antigènes "du soi" et des antigènes étrangers non dangereux auquel l‟organisme est quotidiennement confronté comme par exemple les antigènes contenus dans les aliments ou dans l‟air respiré. Le système immunitaire est virtuellement capable de produire des clones d‟anticorps spécifiques dirigés contre tous les antigènes présents dans l‟environnement (Manicassamy S. and Pulendran B., 2011). Cependant, pour les antigènes appartenant au "soi" (auto-antigènes) le système immunitaire a mis en place des mécanismes lui permettant d‟éliminer les clones "autoréactifs" dirigés contre ces auto-antigènes (Burnet FM., 1976 ; Nossal GJ., 1994). De même, pour les antigènes inoffensifs pour l‟organisme et constamment présents dans l‟environnement, le système immunitaire a mis en place des systèmes de régulations permettant une réponse à minima. Il existe donc un équilibre complexe mis en place par le système immunitaire pour permettre de défendre l‟organisme contre les agents pathogènes tout en restant tolérant vis-à-vis des auto-antigènes ou des antigènes inoffensifs. La moindre défaillance de cet équilibre subtil peut conduire au développement d‟une réponse immunitaire inadaptée allant d‟une réponse incontrôlée au développement d‟un mécanisme auto-immun. A l‟opposé, une tolérance trop importante peutêtre à l‟origine d‟infections chroniques, d‟un échappement des agents pathogènes à la surveillance immune, ou de l‟expansion de cellules tumorales. C‟est pourquoi la mise en place de la tolérance se doit d‟être finement régulée. Il existe deux types majeurs de tolérance, la tolérance centrale et la tolérance périphérique (Nossal GJ., 1994). a) La tolérance centrale La tolérance centrale est mise en place dans le thymus et la moelle épinière, lieu de synthèse respective des clones de cellules T et de cellules B. Elle consiste en l‟élimination de 90 à 99% des clones autoréactifs de cellules T et B par une sélection négative qui entraine l‟apoptose de ces cellules (Manicassamy S. and Pulendran B., 2011). Les clones autoréactifs possédant un TcR ayant une forte affinité pour les auto-antigènes présentés par les molécules du CMH des cellules dendritiques thymiques sont éliminés. Le phénomène de tolérance centrale réside donc principalement dans la mise en jeu de mécanismes de délétion des lymphocytes néoformés auto-réactifs, mais il implique également la formation de lymphocytes T régulateurs (LTreg) (Durkin HG. and Waksman BH., 2001). Cependant, 58 Cellules dendritiques malgré l‟efficacité du mécanisme de tolérance centrale, certains antigènes parviennent à y échapper soit car les TcR qui leurs sont spécifiques ont une trop faible affinité pour eux (Bouneaud C. et al, 2000) soit parce qu‟ils sont dans des zones sanctuaires de l‟organisme (le cerveau, la chambre antérieure de l‟œil…). Ainsi, la tolérance centrale ne permet pas d‟éliminer l‟ensemble des clones autoréactifs. Afin de palier à ce défaut, une tolérance périphérique a été développée par l‟organisme et sert de mécanisme de sauvegarde (Rocha B. and von Boehmer H., 1991 ; Jones LA. et al, 1991 ; Manicassamy S. and Pulendran B., 2011). b) La tolérance périphérique Les mécanismes de la tolérance périphérique permettent d'éliminer hors du thymus les éventuels clones auto-réactifs ayant échappé à la délétion intra-thymique ou les clones dirigés contre des auto-antigènes absents dans le thymus. La tolérance périphérique est notamment très importante sur les sites infectieux où les CD présentent aux LT un ensemble de protéines comprenant des Ag étrangers mais aussi des Ag "du soi" provenant des dégradations (destructions tissulaires, apoptose) engendrées par l‟inflammation. Les cellules dendritiques sont capables d‟induire une tolérance périphérique par différents moyens. Tout d‟abord de manière passive. En effet les CD peuvent induire la délétion des clones auto-réactifs en activant leur programme apoptotique après activation lymphocytaire et mise en jeu de la voie Fas-FasL (Suda T. et al, 1993). Ce mécanisme est très efficace puisqu‟il élimine définitivement les cellules réactives. Les CD peuvent également induire l‟anergie de ces clones en générant une stimulation antigénique incomplète. Cela conduit à une paralysie fonctionnelle des cellules qui se traduit par une absence de synthèse de cytokines et l‟incapacité à répondre à une nouvelle stimulation (Steinman RM. et al, 2003). Cet état est cependant un état réversible et ce mécanisme constitue donc un mécanisme de tolérance temporaire. Les CD peuvent également induire une tolérance périphérique de manière active en générant des LTreg (Maldonado RA. and Von Andrian UH.). Le concept de LTreg est apparu dans les années 1970 et a été envisagé comme un contingent de lymphocytes T responsables du contrôle et de l‟achèvement de la réponse immune. Différents modèles expérimentaux ont montré le rôle des LTreg dans l‟induction de la tolérance aux antigènes du "soi" et aussi dans l'induction de la tolérance aux allo-antigènes en transplantation (Mason D. and Powrie F., 1998 ; Sakaguchi S., 2000 ; Shevach EM., 2000). Deux populations de LTreg 59 Cellules dendritiques sont impliquées dans ces mécanismes. D‟une part, les LTreg CD4+ CD25+ qui sont produits dans le thymus et qui exercent leur activité suppressive par l‟intermédiaire de molécules exprimées à leur surface lors d‟un contact cellulaire avec les lymphocytes T effecteurs (Chen W. et al, 2003). D‟autre part, les LTreg issus de LT CD4 + conventionnels qui se sont différenciés sous l‟action d‟un stimulus particulier constituant un stade alternatif de différenciation plutôt qu‟une lignée cellulaire à part entière. Leur mécanisme d‟action fait intervenir des cytokines immunomodulatrices comme l‟IL-10 et le TGF-β (Jonuleit H. et al, 2003). c) Tolérance périphérique et CD tolérogéniques Les caractéristiques (phénotypiques, fonctionnelles, de maturation…) des CD constituent les éléments clés de leur rôle dans la tolérance immunologique. Ainsi, les CD immatures sont capables d‟induire un état de tolérance qui génère des clones LTreg du fait d‟une expression insuffisante de molécules du CMH et de molécules de co-stimulation et/ou de la mise en jeu d‟un réseau cytokinique inadapté dans le microenvironnement cellulaire (Manicassamy S. and Pulendran B., 2011). Dans ce cas, la tolérance semble être liée au déclenchement d‟un programme par défaut qui perdure tant que l‟ensemble des stimuli nécessaires à le contrôler ne sont pas réunis. Cependant, les CD ayant un état de maturation intermédiaire entre état mature et immature et qualifiée de CD "semi-matures" semblent le mieux refléter le rôle des CD dans les phénomènes de tolérance. Ces cellules, qui ont la capacité de présenter des Ag aux lymphocytes, ne possèdent pas l‟ensemble du répertoire immunologique nécessaire à l‟induction d‟une réponse immune spécifique. Ces CD "semimatures" ont été dénommées CD tolérogéniques (Reis e Sousa C., 2006 ; Wakkach A. et al, 2003). L‟absence d‟expression de molécules de co-stimulation, notamment CD80 et CD86, est l‟une des caractéristiques principales des CD tolérogéniques (Janeway CA. Jr. and Medzhitov R., 2002). En effet, lorsqu‟un LT naïf reconnaît un antigène en l‟absence de signaux de co-stimulation, il s‟inactive et entre en état d‟anergie ce qui participe au mécanisme de tolérance. Si l‟absence de certains signaux de co-stimulation est primordiale dans l'induction de la tolérance par les CD, d‟autres caractéristiques de ces cellules doivent être prises en compte lors de l‟interaction avec les lymphocytes. Ainsi, un autre élément clé dans l‟induction de l‟état d‟anergie des lymphocytes T au contact des CD, est la diminution 60 Cellules dendritiques du niveau d‟expression du CD40L à la surface du lymphocyte T activé. Un signal inhibiteur délivré par la CD lors du contact cellulaire est à l‟origine de cette diminution d‟expression du CD40L. Les molécules ILT-3 et ILT-4, exprimées à la surface des CD "semi-matures", sont impliquées dans cette diminution (Kuwana M., 2002). Ces molécules de la famille des récepteurs inhibiteurs Ig-like interfèrent avec la signalisation induite par l‟interaction CD40/CD40L. La production d‟Indoleamine 2, 3-dioxygenase (IDO) est également un autre mécanisme impliqué dans l‟action des CD tolérogéniques. La production d‟IDO est augmentée lors de l‟inflammation (Munn DH. et al, 2002) et elle peut être induite via les récepteurs de l‟IFN- ce qui provoque l‟apoptose des lymphocytes T. L‟IDO est une enzyme qui catalyse la première étape du métabolisme du tryptophane. Des études récentes suggèrent que les LTreg peuvent agir directement sur les CD afin d‟entraîner une production autocrine de l‟IDO. Ainsi, l‟engagement du récepteur CTLA-4 sur la molécule B7 aboutit à la production d‟IFN- par les CD tolérogéniques. L‟IL-10 et le PGE2, deux molécules associées aux réponses inflammatoires chroniques, augmentent la production d‟IDO par les CD (Munn DH. et al, 2002 ; Curti A. et al, 2009). Par ailleurs, l‟IL-10 est une cytokine immunosuppressive qui inhibe les gènes de maturation et les gènes des molécules de costimulation et qui peut activer la stimulation des CD et conduire à un état d‟anergie de LT CD4+ et CD8+ alloréactifs (Munn DH. et al, 2002 ; Steinbrink K. et al, 1997). L‟IL-10 est également synthétisée par les CD tolérogéniques afin de stimuler la différenciation des LT en LTreg. Ainsi, des CD prélevées sur des mélanomes invasifs et produisant des quantités importantes d‟IL-10 induisent l‟anergie des LT CD8+ spécifiques de la tumeur (Munn DH. et al, 2002 ; Steinbrink K. et al, 1999 ; Akbari O. et al, 2001 ; Belkaid Y. and Oldenhove G., 2008). 61 Cellules dendritiques Schéma 25 : Les CD au centre du mécanisme de tolérance (d‟après Manicassamy S. and Pulendran B., 2011). Le contrôle de la tolérance est donc un mécanisme complexe, pas encore totalement élucidé qui nécessite la prise en compte d‟un grand nombre de facteurs. En effet, les différents facteurs tolérogènes cités précédemment peuvent provenir de nombreuses cellules comme les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, ou même d‟autres cellules immunitaires comme les cellules NK ou les macrophages qui interagissent avec les cellules dendritiques pour les rendre tolérantes mais peuvent aussi agir sur les LT et favoriser la différenciation de LTreg. De plus les CD rendues tolérantes vont alors produire leurs propres facteurs de tolérance, de même les LTreg peuvent aussi produire des cytokines ce qui aboutit à la création d‟un réseau complexe capable de propager la tolérance (Manicassamy S. and Pulendran B., 2011). 62 Peptides d‟élastine et inflammation III. PE et régulation de la réponse inflammatoire et immune A. Inflammation, élastases et PE L‟inflammation est caractérisée par l‟infiltration de nombreuses cellules inflammatoires parmi lesquelles les PN et les macrophages qui sécrètent de nombreuses protéases. Ces protéases qui sont générées afin de détruire les agents pathogènes vont également exercer leurs activités protéolytiques sur les composants de la MEC environnante. L‟élastine est l‟un des principaux composants de la MEC. Par ailleurs, les PN sécrètent de nombreuses protéases à activité élastinolytique : la Neutrophile Elastase (NE), l‟élastase pancréatique et la Cathepsine G (Stone PJ. et al, 1982), des métallo-protéinases matricielles (MMP) telles que les MMP-2, 7, 9 ou encore la MMP-12 (Shapiro SD., 1994). La dégradation de l‟élastine par ces différentes protéases aboutit à la production de PE retrouvés en grandes quantités in vivo au cours des processus inflammatoires touchant des tissus riches en élastine (Frances C. and Robert L., 1984 ; Fulop T. et al, 1990 ; Hornebeck W. et al, 1984). Les PE exercent des effets biologiques divers et variés dé pendant à la fois de la séquence du peptide généré, mais aussi du type cellulaire sur lequel il se f ixe à son récepteur (Rodgers UR. and Weiss AS., 2005). B. PE et polarisation de la réponse lymphocytaire T Les cytokines produites par les lymphocytes T jouent un rôle central dans l‟inflammation et dans la réponse immune. Ainsi, la balance Th1/Th2, qui régule l‟équilibre des cytokines pro- et anti-inflammatoires, est importante dans la protection de l‟hôte contre les infections. Au cours de l‟athérosclérose, la réponse immunitaire est caractérisée par un profil cytokinique de type Th1 avec production d‟IL-2, d‟IFN-γ, d‟IL-12, d‟IL-15 et d‟IL-18 (Frostegard, 1999) alors que dans l‟anévrisme aortique abdominal (AAA) la balance semble pencher vers un profil cytokinique de type Th2 avec une production d‟IL-4, d‟IL-5 et d‟IL10. Par ailleurs, le récepteur à l‟élastine à été mis en évidence à la surface des lymphocytes T isolés de plaques d‟athérome (Peterszegi, 1996) et les PE sont fortement présents dans le sérum de patients atteints d‟athérosclérose. Nous avons montré dans notre laboratoire, en 63 Peptides d‟élastine et inflammation collaboration avec l‟unité CNRS du Pr FX Maquart, que le récepteur S-Gal est présent à la surface des lymphocytes T humains circulants et que l‟interaction des peptides d‟élastine avec ce récepteur oriente les lymphocytes T naïfs vers un phénotype Th1 et inverse la polarisation de lymphocytes pré-orientés Th2 également vers un profil Th1 (Debret R. et al, 2005). Rapportés aux pathologies artérielles, nos travaux montrent que les effets polarisateurs des PE vis-à-vis des lymphocytes T pourraient amplifier la réponse Th1 initiée lors de lésions athérosclérotiques et donc aggraver la pathologie artérielle, ou, au contraire, pourraient réguler la réponse Th-2 initiée lors du développement de l‟AAA et donc exercer un effet bénéfique sur la pathologie. La dualité des effets des PE au cours des pathologies artérielles est encore incomprise à ce jour. C. PE et inhibition des effets inflammatoires induits au niveau du monocyte et des mélanocytes Au cours des pathologies inflammatoires, les cellules inflammatoires se retrouvent dans un milieu complexe constitué de nombreux facteurs solubles pouvant provenir à la fois d‟un environnement exogène (agents microbiens) et d‟un environnement endogène (peptide issus de la dégradation de la MEC). Dans un tel contexte, nous avons montré que les PE exercent des activités inhibitrices sur les effets induits par le LPS au niveau des monocytes humains. Ainsi, les PE diminuent le niveau de production des cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-1β et IL-6) induit par une activation des monocytes humains par le LPS. Cet effet est la conséquence de l‟interaction des PE avec le récepteur S-gal exprimé à la surface des monocytes. Cet effet inhibiteur n‟est pas limité à une activation par le LPS puisque que nous avons retrouvé cet effet dans un modèle de mélanome où un état d‟inflammation est associé à un processus tumoral. Dans ce modèle, nous avons mis en évidence le potentiel inhibiteur des PE sur la synthèse de deux cytokines pro-inflammatoires, l‟IL-8 et GRO-α, induite par l‟IL-1β dans les mélanocytes (Baranek T et al, 2007). 64 Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive D. PE et pathologies inflammatoires chroniques : modèle de la Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) 1. Définition et prise en charge de la BPCO La Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) est une pathologie complexe caractérisée par une détérioration progressive et irréversible des voies aériennes (Croxton TL. et al, 2003). Dans les pays industrialisés cette pathologie est la 4ème cause de mortalité ce qui constitue un véritable problème de santé publique (Smida V., 2011). On estime que 80 à 90% des BPCO sont causées par le tabac, les 10 à 20 % restant sont liés à différents polluants (Sethi JM. and Rochester CL. 2000). Le terme de BCPO est général et recouvre différentes atteintes. Une classification, reposant sur la sévérité de la maladie, permet de classer les patients BPCO en quatre catégories nommées GOLD (Global initiative for Chronic-Obstructive Lung Disease) 1 à GOLD 4. Ces catégories corrèlent à la sévérité de la pathologie et vont de GOLD 1 pour une pathologie modérée à GOLD 4 pour une pathologie sévère (Hogg JC. et al, 2004 ; Curtis JL. et al, 2007). Les sujets n‟ayant aucun problème pulmonaire peuvent être classés dans une catégorie à part et nommée GOLD 0. Plusieurs critères sont retenus afin de définir la sévérité de la pathologie : i) le volume d‟expiration forcé (FEV) que peut produire le patient et son rapport sur la capacité vitale forcée (FVC) aussi appelé indice de Tiffeneau, ii) la résistance pulmonaire qui évalue les facteurs mécaniques limitant l‟accès de l‟air inspiré aux alvéoles pulmonaires, et iii) la compliance pulmonaire qui représente la capacité des poumons à modifier leur volume pour répondre à une pression qui leur est appliquée. L‟indice de Tiffeneau et la FEV sont obtenus par des tests spirométriques et restent les critères les plus couramment utilisés en diagnostic de routine pour évaluer l‟occurrence d‟une BPCO ou une potentielle aggravation de la pathologie (Curtis JL. et al, 2007) (schéma 26). Les patients BPCO en difficulté respiratoire reçoivent un traitement à base de bronchodilatateurs d‟action rapide. Dans le cas d‟une BPCO modérée, le patient est traité pendant la crise respiratoire par des bronchodilatateurs à action lente. Dans le cas d‟une BPCO sévère, les glucocorticoïdes ou une antibiothérapie sont préconisés pour limiter la survenue ou l‟expansion d‟exacerbations fréquentes (Leung DYM. and Bloom JW., 2003). Les traitements de la BPCO sont des traitements contraignants et lourds pouvant nécessiter de fréquentes hospitalisations. La prise en charge de la BPCO est donc un enjeu majeur compte 65 Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive tenu de l‟accroissement constant du nombre de personnes développant cette pathologie (Sethi JM. and Rochester CL., 2000). Une meilleure connaissance des mécanismes initiant cette pathologie devrait permettre une prise en charge plus efficace de la maladie. I : Très modérée II : Modérée III : Sévère IV : Très sévère • FEV 1 /FVC ˂ 0,70 • FEV1 /FVC ˂ 0,70 • FEV1 /FVC ˂ 0,70 • FEV1 ≥ 50% préd. • 50% ≤ FEV1 ˂ 80% préd. • FEV 1 /FVC ˂ 0,70 • 30% ≤ FEV 1 ˂ 50% préd. • FEV 1 ˂ 30% du prédit ou FEV 1 ˂ 50% préd. en cas de défaillances respiratoires chroniques Permet la réduction des facteurs de risques : Vaccination contre la grippe Prescrire en sus des broncho-dilatateur à action courte (en cas de besoin) Prescription régulière de traitement avec un ou plusieurs bronchodilatateur à action longue (si nécessaire) ; Prescription de rééducation. Ajout de glucocorticoïdes inhalés en cas d‟exacerbation répétées. Mise sous oxygène en cas de défaillance respiratoire chronique. Penser à une prise en charge chirurgicale. Schéma 26 : Classification des différents états de la BPCO selon les critères GOLD (d‟après http://www.goldcopd.org/). 2. BPCO, réponse inflammatoire et exacerbation Sous le vocable BPCO coexistent différentes aspects de la maladie comme par exemple l‟emphysème qui est la composante la plus répandue de la BPCO. Il est donc, a priori, difficile d‟appréhender dans sa totalité la BCPO. Cependant, il existe des caractéristiques communes aux différentes formes de la BPCO. Ainsi, la pathologie est toujours caractérisée par une succession de phases dites stables et de phase d‟exacerbation généralement induites par une infection bactérienne ou virale. Ces phases d‟exacerbation sont des épisodes d‟aggravation de la symptomatologie associée à une forte détresse respiratoire (Seemungal T. et al, 2001). Il se développe, au cours de la BPCO, un état inflammatoire chronique qui atteint les différentes parties du poumon ainsi que le système vasculaire qui y est associé (O'Byrne PM. 66 Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive and Postma DS., 1999). Dans les voies aériennes centrales et le parenchyme pulmonaire un important infiltrat macrophagique est observé au cours des phases stables. Cet infiltrat, qui est corrélé avec le dégré d‟obstruction bronchique est associé à un afflux de LT CD8 +, de PN activés et de CD (Chung KF. and Adcock IM., 2008). Dans les petites bronches et les bronchioles, une augmentation du nombre de macrophages, de LT CD8 + et de CD est également observée. Enfin, dans les artères pulmonaires l‟infiltrat est majoritairement constitué de PN et de LT CD8+ (MacNee W., 2005 ; Lusuardi M. et al, 1994 ; Banerjee D. et al, 2004). Durant les phases d‟exacerbation, les infiltrats cellulaires varient peu sur le plan qualitatif et quantitatif par rapport à l‟état stable. Cependant, les expectorations de mucus sont beaucoup plus importantes et l‟on y retrouve des taux de médiateurs de l‟inflammation augmentés (IL-8, Leukotriène B4, myéloperoxydase, NE, TNF-α, α1-antitrypsine…) ce qui suggère une amplification du processus inflammatoire préexistant à l‟état stable (Gompertz S. et al, 2001 ; Crooks SW. et al, 2000 ; Barnes PJ. et al, 2003 ; Aaron SD. et al, 2001). Une composante systémique est également présente à l‟état stable de la pathologie avec des niveaux élevés de médiateurs inflammatoires comme l‟IL-6, le TNF-α, ou encore la C-Reactive Protein (CRP) dont le taux corrèle avec la sévérité de la pathologie (Chung KF., 2001 ; De Torres J. et al, 2008). En cas d‟exacerbation, l‟inflammation systémique s‟aggrave avec une élévation des taux d‟IL-6, d‟IP-10 et de TNF-α au niveau circulant (Donaldson GC. et al, 2005 ; Gan WQ. et al, 2004 ; Pinto-Plata VM. et al, 2007) Le nombre de LT CD4+ augmente également tout au long de la pathologie. Cette augmentation est associée à la genèse d‟auto-anticorps, et en particulier d‟auto-anticorps anti-élastine, ainsi qu‟à la diminution du nombre de LTreg (Lee SH. et al, 2007). Ceci suggère que la BPCO est associée à une diminution du système immunitaire avec pour conséquence une perte de la tolérance aux antigènes du "soi" et une persistance de l‟état inflammatoire. Cette diminution est difficilement réversible même plusieurs années après l‟arrêt du facteur étiologique principal, le tabac. L‟ensemble des évènements physiopathologiques décrit ci-dessus conduit à l‟installation d‟un mécanisme inflammatoire chronique (schéma 27) qui génère des manifestations cliniques difficilement réversibles (Grumelli S. et al, 2004). Ainsi, la fibrose qui se développe au niveau des petites voies aériennes entraine un rétrécissement de ces voies. Parallèlement, la destruction du parenchyme pulmonaire permet de relier plusieurs sacs alvéolaires entre eux ce qui génère un élargissement des espaces aériens. Cette altération du 67 Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive parenchyme est également associée à une perte de l‟élasticité pulmonaire (Eid AA. et al, 2001). Dans les voies aériennes périphériques, l‟infiltration par les cellules inflammatoires, la fibrose et l‟exsudat inflammatoire sont à l‟origine de l‟obstruction des voies aériennes (Agustí AG. et al, 2003 ; Barnes PJ., 2003). Schéma 27 : BPCO et inflammation chronique (d‟après Barnes PJ., 2004). 3. Genèse de la BPCO Les mécanismes à l‟origine de la BPCO participent d‟un processus complexe pas encore totalement élucidé. Plusieurs données de la littérature montrent que pour un faible pourcentage de patients (environ 2%) la BPCO peut s‟expliquer en partie par un facteur génétique (Sampsonas F. et al, 2006). Ces patients ont une déficience en synthèse d‟α1antitrypsine qui conduit à une activation constante de certaine sérines protéases et en particulier de la NE. Ceci est à l‟origine d‟une dégradation importante et incontrôlée de la MEC. Ceci s‟exprime au niveau du poumon par une détérioration intense du parenchyme pulmonaire (Sampsonas F. et al, 2006). Une autre hypothèse suggère que l‟origine de la BPCO se trouve dans un déséquilibre de la balance protéases/anti-protéases en faveur des protéases ce qui conduirait à une perte du contrôle de l‟inflammation basale existant chez tous les fumeurs (Sampsonas F. et al, 2006). Ceci est soutenu par l‟existence d‟un modèle murin d‟emphysème induit par instillation intra-nasale de NE (Janoff A. et al, 1977). Cependant, 68 Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive chez l‟homme, le processus est très probablement plus complexe impliquant de nombreux facteurs incluant d‟autres protéases, des cytokines pro-inflammatoires, des radicaux libres… qui tous sont surexprimés chez les patients BPCO (Roth M., 2008). Une hypothèse plus récente implique les protéines de la MEC. Le processus inflammatoire initié de façon chronique par l‟exposition quotidienne au tabac conduirait à la genèse de protéases capables de dégrader différents composants de la MEC. Plus particulièrement, les protéases à activité élastinolytique engendreraient une intense dégradation de l‟élastine fortement représentée dans le tissu pulmonaire. Les peptides issus de cette dégradation et dont certains d‟entre eux ont été décrits dans la littérature pour leurs propriétés biologiques (Abboud RT. and Vimalanathan S., 2008 ; O'Reilly PJ. et al, 2008), majoreraient le processus inflammatoire et déborderaient les mécanismes de contrôle de ce processus. 4. PE et BPCO Les cellules inflammatoires infiltrées dans le parenchyme pulmonaire sécrètent de nombreuses protéases impliquées dans les lésions tissulaires (Owen CA., 2005 ; Shifren A. and Mecham RP., 2006). Certaines de ces protéases (NE, MMP-2 et 9) participent à la dégradation de l‟élastine qui assure l‟élasticité du poumon (Owen CA., 2005 ; Lombard C. et al, 2006). La forte excrétion de desmosine, marqueur spécifique de la dégradation de l‟élastine (Gottlieb DJ. et al, 1996), et les taux élevés de peptides d‟élastine dans différents liquides biologiques (sang, LBA, expectorations) sont le reflet d‟une dégradation intense de l‟élastine pulmonaire chez les patients atteints de BPCO (Schriver EE. et al, 1992 ; Betsuyaku T., et al, 1996). Au cours de l‟emphysème humain, les fortes concentrations de PE dans les LBA corrèlent avec le niveau élevé d‟élastase du PN dans les mêmes fluides mais aussi avec la sévérité de la pathologie (Betsuyaku T., et al, 1996). Les PE au travers de leurs nombreux effets biologiques (chimioattraction des monocytes, régulation de la synthèse de protéases et de cytokines…) pourraient ainsi être directement impliqués dans la pathogenèse de la BPCO. 5. PN et BPCO Plusieurs données de la littérature montrent que le nombre de PN dans les LBA de patients atteints de BPCO est associé au degré de sévérité de la maladie (Barnes PJ., 2000), et que le recrutement des PN dans le tissu pulmonaire est directement corrélé à la progression de 69 Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive l‟emphysème (Abraham E. et al, 2000). L‟infiltrat neutrophilique qui est présent dans les poumons de patients BPCO à l‟état stable est majoré au cours des épisodes d‟exacerbations (Barnes PJ., 2004). Le recrutement de ces PN est sous le contrôle de médiateurs chimiotactiques tels que l‟IL-8, GRO-α (Rot A. and Von Andrian UH., 2004) ou RANTES (Pan ZZ., et al, 2000) mais également de peptides issus de la dégradation de la matrice extracellulaire et en particulier du collagène et de l‟élastine (Chang C. and Houck JC., 1970 ; Laskin DL. et al, 1986). Le rôle bénéfique des PN au cours de la BPCO et en particulier aux cours des exacerbations (élimination des agents pathogènes) est limité (Hirai K. et al, 1997 ; Macedo RC. et al, 2010) du fait de la capacité des ces cellules à sécréter des quantités importantes de protéases et en particulier de NE qui participe à la destruction du tissu conjonctif du parenchyme pulmonaire et à la dégradation de l‟élastine. Les PN produisent également des MMP-2 et 9 dont l‟activité élastinolytique renforce le rôle délétère des PN au cours de la BPCO (Faurschou M. and Borregaard N., 2003). 6. CD et BPCO La BPCO a longtemps été considérée comme une pathologie exclusivement inflammatoire. Des données récentes semblent indiquer que l‟immunité adaptative est fortement mise en jeu au cours de la pathologie. Ainsi, les patients atteints de BPCO ont une infiltration importante du parenchyme pulmonaire par des lymphocytes T CD8 + organisés en follicules lymphoïdes. Par ailleurs, ces patients ont un nombre élevé de CD immatures dans leurs expectorations (Tsoumakidou M. et al, 2009 ; Demedts IK. et al, 2007). Ceci semble indiquer une forte capacité de présentation d‟antigènes dans le tissu pulmonaire au cours de la BPCO (Tsoumakidou M. et al, 2008). La présence chez les patients atteints de BPCO d‟autoanticorps circulants dirigés contre l‟élastine et d‟autres composants de la matrice extracellulaire indique l‟existence d‟une composante auto-immune au cours de la pathologie et la potentialité des CD à présenter des antigènes du "soi" au cours de la maladie. L‟existence d‟une rupture de la tolérance et d‟une composante auto-immune au cours de la BPCO est aussi confortée par l‟existence d‟un modèle auto-immun d‟emphysème chez le rat (Taraseviciene-stewart L. et al, 2005) et par l‟altération de la fonction des lymphocytes T régulateurs chez les patients BPCO (Barcelo B. et al, 2007) 70 But du travail BUT DU TRAVAIL 71 But du travail La dégradation des fibres élastiques et la genèse de peptides d‟élastine (PE) issus de cette dégradation est un processus complexe qui a été décrit au cours des réactions inflammatoires siégeant dans les tissus riches en élastine (poumon, artères, peau…). Les données de la littérature montrent que les PE sont doués d‟activités biologiques diverses qu‟ils exercent par le biais de l‟interaction avec une récepteur spécifique présent à la surface de nombreux types cellulaires. Plusieurs travaux réalisés dans notre laboratoire et en relation avec l‟unité CNRS 6198 ont permis de montrer que différentes cellules impliquées dans l‟inflammation et dans la réponse immunitaire expriment le récepteur à l‟élastine. C‟est en particulier le cas pour les lymphocytes T et les monocytes humains. La présence de ce récepteur à la surface de ces cellules confère aux PE un rôle clé dans la régulation de la synthèse des cytokines et donc dans la régulation du processus inflammatoire et de la réponse immune. Sur la base de ce travail, il nous est apparu important de montrer que les effets régulateurs des PE sur la réponse inflammatoire et immune n‟étaient pas limités aux seuls lymphocytes et monocytes mais pouvaient être étendus à d‟autres cellules telles que les PN, cellules essentielles de la réponse immune innée, et les CD, cellules pivôts de la réponse adaptative. Par ailleurs, la thématique principale de notre laboratoire est centrée sur l‟étude de la réponse inflammatoire et immunitaire au cours de la BPCO. Cette pathologie touche un organe riche en élastine et la physiopathologie de la maladie implique une forte dégradation des fibres élastiques constituant le parenchyme pulmonaire. Dans ce contexte, nous avons émis l‟hypothèse que les produits de dégradation de l‟élastine pouvaient être impliqués dans la régulation de l‟immunité innée et adaptative. - La régulation de la réponse innée a été abordée au niveau des PN et dans le cadre de la BPCO. - La régulation de la réponse adaptative a été étudiée au niveau de la régulation des fonctions effectrices des CD. 72 Matériels et méthodes MATERIEL ET METHODES 73 Matériels et méthodes Les matériels et méthodes présentant les différentes techniques et approches expérimentales utilisées dans le cadre de ce travail de thèse sont détaillés dans les deux articles intégrés à ce document. En conséquence, nous nous sommes restreints dans la partie "matériels et méthodes" de la thèse à la seule description détaillée des méthodologies ayant permis d‟obtenir avec une grande pureté les différentes populations cellulaires que nous avons utilisées au cours de ce travail. Les PN ont été obtenus par une technique de centrifugation en gradient de densité. Les monocytes humains différenciés en CD ont été obtenus par la technique d‟élutriation à contre-courant. Par ailleurs l‟analyse phénotypique des différentes populations cellulaires étudiées a été réalisée par la technique de cytométrie en flux. I. Isolement des PN de patients BPCO et de sujets non BPCO Les PN ont été isolés à partir du sang périphérique de patients BPCO à différents stades de leur pathologie et à partir de sujets sains. Le sang des patients BPCO a été prélevé chez des patients à l‟état stable ou en phase d‟exacerbation de leur pathologie dans le service de Pneumologie du CHU R. Debré de Reims (Service du Pr F. Lebargy) à la suite d‟une consultation dans le cadre du suivi de leur pathologie. Le sang des sujets non BPCO a également été prélevé dans le service de Pneumologie du CHU de Reims à la suite d‟une consultation n‟ayant révélé aucun signe de BPCO. Les prélèvements de sang ont été réalisés après consentement éclairé des patients BPCO et des sujets non BPCO et en accord avec le comité d‟éthique du CHU. A. Isolement des polynucléaires totaux humains L‟isolement des polynucléaires totaux (neutrophiles, éosinophiles et basophiles) à partir du sang total veineux de patients BPCO ou de sujets non BPCO a été réalisé par la technique de centrifugation en gradient de densité en utilisant le réactif Polymorphprep TM (Abcys, France) dont la viscosité et la densité (d=1,113 g/ml) permettent une séparation simple et en une seule étape des cellules polynucléées et des cellules mononucléées (monocytes, lymphocytes) du sang périphérique (Schéma 28). 74 Matériels et méthodes Afin de séparer les deux populations cellulaires, 6 ml de sang total non dilué ont été déposés sur un coussin de 6 ml de PolymorphprepTM. Le mélange sang dilué/PolymorphprepTM est centrifugé à 500 g pendant 45 min et à température ambiante. Cette étape permet l'obtention de deux anneaux distincts. L‟anneau supérieur contient les cellules mononucléées, l‟anneau inférieur contient les polynucléaires. L‟anneau inférieur a été prélevé par aspiration et les cellules ont été lavées deux fois dans du tampon PBS 1X (Invitrogen, France) par deux centrifugations de 10 min à 400 g et à + 4°C. Entre les deux lavages, une lyse hypotonique des globules rouges contaminant la suspension cellulaire a été réalisée. Après le deuxième lavage, les polynucléaires ont été repris dans du milieu RPMI 1640 (Invitrogen) complémenté de 5 mM de L-glutamine (Invitrogen) et les cellules ont été comptées en présence de bleu trypan afin d‟apprécier la viabilité cellulaire et d‟estimer la concentration de la solution. Les cellules utilisées dans notre étude avaient toutes une viabilité supérieure à 98 %. Sang dilué Centrifugation 500 g ; 45 min ; 20°C Cellules mononucléées Cellules polynucléées PolymorphprepTM Globules rouges, plaquettes, débris cellulaires Schéma 28 : Isolement des polynucléaires par le Polymorphprep TM (d‟après la fiche technique d‟Abcys). 75 Matériels et méthodes B. Analyse de la pureté et de la proportion de polynucléaires neutrophiles au sein des polynucléaires totaux 1. Principe de la technique de cytométrie en flux La cytométrie en flux est une technique multiparamétrique permettant l‟étude de plusieurs caractéristiques d‟une cellule isolée (taille, complexité et fluorescence) entraînée par un flux liquide. Les mesures sont effectuées lorsque les cellules passent, les unes derrière les autres, dans une chambre d‟analyse traversée par une source lumineuse excitatrice (généralement un Laser) (Schéma 29). Après passage d‟une cellule dans la chambre d‟analyse, le cytomètre en flux permet d‟obtenir trois types d‟informations. Tout d‟abord, le cytomètre renseigne sur la taille relative de la cellule, (Forward Scatter, FSC), qui est évaluée à partir de la diffraction aux petits angles de la lumière incidente. Il renseigne également sur la complexité relative de la cellule (Side Scatter, SSC), c'est-à-dire sur son dégré de complexité interne (nombre et taille des organites, rapport nucléo-cytoplasmique,…) qui est appréciée à partir de la diffraction aux grands angles de la lumière incidente. Enfin, le cytomètre renseigne sur l‟intensité de la fluorescence relative de la cellule qui est obtenue après excitation de marqueurs fluorescents ou fluorochromes fixés à la cellule et qui vont réémettre des photons d‟une longueur d‟onde supérieure à celle de la lumière incidente. Leurs longueurs d‟onde d‟excitation et d‟émission sont connues, ce qui permet leur utilisation seuls ou groupés lorsque leurs longueurs d‟onde d‟émission sont différentes. L‟analyse de la fluorescence due à ces fluorochromes permet par exemple d‟identifier une population cellulaire, de s‟assurer de son degré de pureté ou encore de marquer spécifiquement certains de ses composants et d‟analyser leur quantité relative. Les informations recueillies sont la conséquence de l‟émission, par la cellule excitée, de signaux optiques qui sont récupérés par différents détecteurs (photomultiplicateurs) spécifiques d‟une longueur d‟onde donnée. Les photomultiplicateurs convertissent alors les photons captés en électrons puis en signaux numériques analysables sur un ordinateur à l‟aide du logiciel (Cell Quest, BD Biosciences). L‟ordinateur mémorise toutes les données individuelles, dans l‟ordre de passage de chaque cellule. Le cytomètre utilisé dans le cadre de cette thèse est un cytomètre FACSCaliburTM (BD Biosciences) qui possède 2 sources d‟excitation Laser : un Laser Argon bleu (longueur d‟onde 488 nm), et une Diode Laser rouge (longueur d‟onde de 633 nm). Le cytomètre est équipé de 76 Matériels et méthodes détecteurs lui permettant de détecter 6 paramètres dont 4 paramètres de fluorescence et les paramètres de taille et de complexité FSC et le SSC. Le photomultiplicateur FL1 détecte un spectre de fluorescence allant de 515 à 545 nm, FL2 un spectre allant de 564 à 606 nm, FL3 un spectre allant de 653 à 669 nm et FL4 détecte les spectres de fluorescence supérieur à 670 nm. Etape 1 Etape 2 Etape 4 Etape 3 Schéma 29 : Principe de l‟analyse cellulaire par cytométrie en flux (d‟après http://www.pasteur.fr/ip/easysite/pasteur/fr/recherche/ la-plate-forme-de-cytometrie/cytometrie-en-flux). Etape 1 : la suspension cellulaire est lentement injectée au centre d‟un flux de liquide (liquide de gaine). Etape 2 : la création d‟une mince veine porteuse dans le liquide de gaine contraint les cellules à s‟aligner les unes derrières les autres : c‟est la focalisation hydrodynamique. Etape 3 : le jet de liquide, à l‟air libre, croise un faisceau Laser qui excite les cellules . Etape 4 : les signaux lumineux émis par les cellules sont captés et transmis par des photomultiplicateurs. 77 Matériels et méthodes 2. Marquage des PN et analyse de la pureté Afin de nous assurer de la pureté des polynucléaires isolés par gradient de densité et de la proportion de PN au sein des polynucléaires totaux, nous avons analysé par cytométrie en flux la présence relative des lymphocytes T et B, des monocytes et des PN au sein de la population cellulaire isolée. Nous avons effectué sur un échantillon de cette population des marquages permettant d‟identifier les marqueurs de surface CD3 (marqueur spécifique des lymphocytes T), CD14 (marqueur des monocytes), CD19 (marqueur des lymphocytes B) et CD15 (marqueur des neutrophiles). Pour réaliser les marquages membranaires, 5 x 10 5 cellules ont été incubées avec 2 µg/ml des anticorps monoclonaux fluorescents suivants : antiCD3 couplé à la phycoérythrine (PE) (IgG2a de souris, clone HIT3a, BD Biosciences) ; antiCD14 couplé à la fluorescéine isothiocyanate (FITC) (IgG2a de souris, clone M5E2, BD Biosciences) ; anti-CD19 couplé au FITC (IgG1 de souris, clone HIB19, BD Biosciences) ; anti-CD16 couplé au FITC (IgM de souris, clone HI98, BD Biosciences). Après une incubation de 20 min à + 4°C et à l‟abri de la lumière, les cellules ont été lavées deux fois en présence de PBS 1X par centrifugation pendant 10 min à 400 g et à + 4°C. Le culot cellulaire a alors été repris dans 500 µL d‟une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 1% avant l‟analyse par cytométrie en flux. L‟analyse de la pureté des polynucléaires isolés par la technique du Polymorphprep TM a été réalisée à partir du sang périphérique de sujets inclus dans les différentes cohortes de l‟étude (patients BPCO n=8 ; sujets non BPCO n=6). La figure 1 présente les résultats de cytométrie en flux d‟une expérience représentative. L‟analyse réalisée sur l‟ensemble de la population isolée par la technique du Polymorphprep TM montre des pourcentages de lymphocytes B, de lymphocytes T et de monocytes respectivement de 0,0 ; 0,1 et 0,4 % (Fig. 1A et 1B). L‟analyse réalisée sur la fenêtre délimitant la population des polynucléaires totaux montre que la population est composée à plus de 99 % par des PN (Fig. 1C). Une analyse statistique réalisée sur la base des pourcentages d‟expression cellulaire du marqueur CD15 obtenus à partir des PN isolés du sang périphérique des patients BPCO et des sujets non BPCO montre une représentation des PN au sein des polynucléaires totaux entre 97 et 99% (figure 1D). 78 Matériels et méthodes B A Analyse sur l’ensemble Analyse sur l’ensemble de la population de la population 0% CD3-PE SSC totaux 0,1 % CD3-PE Polynucléaires totaux 0,1 % 0% 0% 0,4 % FSC CD14-FITC CD19-FITC Monocytes Lymphocytes B D C Analyse sur la fenêtre des polynucléaires totaux CD3-PE 0% 99,2 % CD15-FITC Polynucléaires neutrophiles Figure 1 : Pourcentage de lymphocytes, de monocytes et de PN dans la population polynucléaire totale obtenue par la technique de PolymorphprepTM. 79 Matériels et méthodes II. Mise au point d’un modèle de cellules dendritiques immatures obtenues à partir de monocytes d’élutriation A. Isolement de monocytes humains par la technique d’élutriation à contre-courant Les cellules mononuclées humaines ont été isolées du sang périphérique de donneurs sains séronégatifs pour le VIH-1, le VIH-2, le virus de l‟hépatite B et C, ainsi que pour les virus HTLV. Les cônes (30 ml environ) ont été prélevés en fin de cytaphérèse, par le personnel dédié de l‟Etablissement de Transfusion Sanguine (ETS) de Reims. L‟obtention des cônes de cytaphérèse, leur utilisation à des fins de recherche ainsi que l‟élimination des populations cellulaires étudiées a fait l‟objet d‟une convention établie entre l‟ETS et notre équipe de recherche. 1. La technique d’élutriation à contre-courant : le principe L‟élutriation à contre-courant est un procédé de séparation visant à isoler les différentes populations de cellules mononucléées du sang périphérique. Cette technique combine deux principes physiques : la centrifugation, qui est un procédé de sédimentation accélérée sous l‟effet d‟une force centrifuge, et l‟élutriation, qui est un procédé de séparation sous l‟effet d‟un flux de tampon dont la vitesse d‟écoulement est contrôlée par une pompe péristaltique. Les différentes populations cellulaires sont séparées en fonction de leur taille et de leur densité. Le contenu du cône de cytaphérèse est introduit, à l‟aide d‟une pompe péristaltique, dans une chambre d‟élutriation conique tournant à grande vitesse. Le système d‟élutriation qui a été utilisé pour isoler les monocytes est un élutrieur Beckman J6-MC (Beckman-Coulter®, USA). Le rotor de la centrifugeuse (Rotor JE-6B Beckman-Coulter®, USA) est réfrigéré à + 4°C tout au long de la manipulation. Le schéma 30 présente le montage réalisé pour l‟élutriation. Le tampon d‟élutriation est un tampon phosphate glucosé contenant 1% d‟albumine sérique humaine. Les cellules sont collectées en fin d‟élutriation dans un système collecteur réfrigéré à + 4°C. 80 Matériels et méthodes A une vitesse de rotation et à un débit du flux de tampon constant, les cellules introduites dans la chambre d‟élutriation forment un gradient de répartition qui est fonction de leur taille et de leur densité. Les cellules les plus petites se situent au sommet de la chambre et les cellules les plus grosses se placent au fond de la chambre. Lorsque le débit du fluide est augmenté, l‟équilibre dynamique dans lequel se situent les cellules est rompu. Les cellules vont alors être éluées selon un ordre croissant de taille et de densité. Cette technique permet d‟isoler les cellules mononucléées avec un rendement de l‟ordre de 85 à 90% et une pureté supérieure à 90%. Etape 1 Etape 2 Etape 4 Etape 3 Schéma 30 : Le système d‟élutriation (d‟après la fiche technique de Beckman-Coulter®). Etape 1 : injection des cellules dans le système et entraînement des cellules par le tampon d‟élutriation. Etape 2 : le débit du tampon d‟élutriation est régulé par une pompe péristaltique. Etape 3 : les cellules pénètrent dans la chambre d‟élutriation qui est soumise à une force centrifuge. Etape 4 : les cellules sont éluées en fonction de leur taille et collectées dans des tubes collecteurs. 81 Matériels et méthodes 2. Elutriation des monocytes humains Le débit du tampon d‟élutriation est ajusté à 45 ml/min au moment de l‟introduction des cellules dans la chambre d‟élutriation qui, elle, est soumise à une force centrifuge constante de 1800 g. Une première fraction d‟élutriation contenant des plaquettes, des hématies et des débris cellulaires est alors récoltée. Puis le débit du flux de tampon est augmenté par paliers pendant 30 min afin de récolter une seconde fraction d‟élutriation contenant principalement des lymphocytes. Une fois ceux-ci collectés, une nouvelle augmentation du débit (jusqu‟à 49 ml/min) est effectuée afin d‟éliminer progressivement tous les lymphocytes résiduels. Cette étape dure entre 2 et 3 heures. Après quoi, le débit et la vitesse de centrifugation sont réduits respectivement à 30 ml/min et à 1400 g afin d‟éluer l‟ensemble des monocytes. Cette étape dure 45 min. La taille des cellules éluées est contrôlée tout au long de l‟élutriation à l‟aide d‟un Multisizer II (Beckman-Coulter®) et chaque variation de débit est effectuée en fonction des populations cellulaires observées. B. Purification des monocytes par technique de billes magnétiques Les monocytes humains isolés par la technique d‟élutriation à contre-courant sont ensuite soumis à un tri par billes magnétiques afin de purifier les monocytes CD14 qui seront ensuite différenciés en cellules dendritiques in vitro. Parmi la population cellulaire d‟élutriation, 10 8 cellules sont prélevées, lavées en PBS 1X puis centrifugées à 300 g pendant 10 minutes. Les cellules sont ensuite incubées en présence de 50 μl d‟un cocktail de billes magnétiques CD14 + (Miltenyi Biotec) et 200 μl de tampon MACS filtré (Miltenyi Biotec). Les cellules sont ensuite lavées par 1 à 2 ml de tampon MACS filtré, puis centrigugées à 300 g pendant 10 min. Le culot cellulaire est alors repris par 500 μl de tampon MACS filtré. L‟aimant utilisé pour sélectionner les billes magnétiques (MidiMACS™ Separator, Miltenyi Biotec) est fixé sur un portoir spécifique (MACS® MultiStand, Miltenyi Biotec). Les colonnes (LS Columns, Miltenyi Biotec) se fixent à l‟aimant et un filtre de pré-séparation (Pre-Separation Filters, 30 µm, Miltenyi Biotec), destiné à éliminer les amas cellulaires et les bulles d‟air pouvant potentiellement boucher la colonne, est posé au dessus de la colonne. Une fois le montage effectué, la colonne est mouillée par 3 ml de tampon MACS filtré et le filtre par 500 μl de tampon MACS filtré. 82 Matériels et méthodes Dès que le tampon s‟est écoulé du filtre et de la colonne, les cellules marquées par les billes CD14+ et reprises dans 500 μl de tampon MACS filtré sont versées dans le filtre de préséparation. Une fois l‟ensemble de la suspension cellulaire écoulée le long de la colonne, le filtre est lavé 3 fois par 500 μl de tampon, puis la colonne est lavée 3 fois par 3 ml de tampon. L‟éluat récupéré contient les cellules CD14 négatives. Une fois l‟ensemble de l‟éluat écoulé de la colonne, celle-ci est retirée de l‟aimant puis posée sur un tube collecteur. La suspension cellulaire de monocytes CD14+ jusqu‟alors fixée à la colonne est extraite en ajoutant rapidement 5 ml de tampon MACS filtré puis en éjectant le contenu en appuyant fermement sur le piston selon le protocole de Miltenyi Biotec. La suspension cellulaire ainsi récupérée est lavée 2 fois en PBS stérile 1X, puis le culot cellulaire est repris dans du milieu RPMI 1640 complémenté de 15% de SVF (Gibco) décomplémenté et filtré, de 1% de pénicilline/streptomycine (Lonza) et de 5mM de L-Glutamine (Lonza). C. Analyse de la pureté des monocytes CD14+ obtenus après tri magnétique Afin d‟analyser la pureté des monocytes obtenus après tri magnétique, les cellules triées ont été marquées avec un anticorps monoclonal anti-CD14 humain couplé à l‟allophycocyanine (APC) (IgG2a de souris, Clone M5E2, BD Biosciencess) et analysées par cytométrie en flux. Les cellules ont été incubées 20 min à + 4°C et à l‟abri de la lumière puis lavées 2 fois avec du PBS 1X par centrifugation à 400 g pendant 10 min et à + 4°C. Le culot cellulaire a alors été repris dans 500 µL d‟une solution de PFA à 1% avant l‟analyse par cytométrie en flux. Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 2. Les monocytes CD14+ obtenus après tri magnétique ont une pureté supérieure à 99%. 83 Matériels et méthodes A B Isotype contrôle 99.29% Cellules CD14+ Counts CD14-APC 0.20% 0.51% FL-3 CD14-APC Figure 2 : Pourcentage de monocytes CD14+ obtenus après tri magnétique sur colonne. D. Différenciation des monocytes CD14+ en CD immatures 1. Préparation des cellules Seules les populations monocytaires constituées de plus de 98% de monocytes CD14 + après tri magnétique ont été utilisées pour l‟obtention de CD immatures. La population cellulaire récupérée à partir de la colonne de tri est ajustée à la concentration cellulaire de 5 x 106 cellules par ml de milieu RPMI 1640 complémenté de 15% de SVF décomplémenté et filtré, 1% de pénicilline/streptomycine, et 5mM de L-Glutamine. Les cellules ont alors été été réparties dans des plaques 24 puits et traitées avec le cocktail cytokinique GM-CSF (800 UI/ml, R&D) et IL-4 (400 UI/ml, R&D) capable d‟initier la différenciation des monocytes en cellules dendritiques immatures après 5 jours d‟incubation à 37°C sous atmosphère humide contenant 5% de CO2. 2. Vérification de la différenciation des monocytes en CD immatures Après l5 jours de culture en présence de GM-CSF et d‟IL-4, nous avons vérifié l‟efficacité de la différenciation des monocytes en CD immatures. Pour cela, les cellules ont été marquées avec différents anticorps monoclonaux permettant d‟identifier des marqueurs caractéristiques des CD immatures : anti-CD14 humain couplé à l‟APC (IgG2a de souris, clone M5E2, BD Biosciences) ; anti-CD1a humain couplé au FITC (IgG1 de souris, clone HI149, BD Biosciences) ; anti-CD83 humain couplé au FITC (IgG1 de souris, clone HB15e, 84 Matériels et méthodes BD Biosciences) ; anti-CD86 humain couplé au PE (IgG1 de souris, clone 2331, BD Biosciences). Les cellules ont été incubées en présence des différents anticorps 20 min à +4°C et à l‟obscurité de la lumière puis lavées 2 fois avec du PBS 1X par centrifugation à 400 g pendant 10 min à + 4°C. Le culot cellulaire a alors été repris dans 500 µl d‟une solution de PFA à 1% avant l‟analyse par cytométrie en flux. Les CD immatures obtenues à partir de monocytes CD14+ in vitro sont caractérisées par une perte du marqueur de surface CD14, par l‟apparition du marqueur de surface CD1a et par une diminution du niveau d‟expression du marqueur CD86. Le marqueur de maturation CD83 absent des monocytes ne doit pas non plus être exprimé par les CD immatures. La figure 3 montre que les monocytes différenciés dans nos conditions expérimentales donnent des CD immatures CD1a+, CD14- et CD83-. A B C 3.11% FL-2 CD14-APC 0.05% 7% - CD14 99.21% 92.93% CD1a-FITC 96.67% FL-3 0.76% CD83-FITC Figure 3 : Pourcentage de cellules exprimant les marqueurs CD1a, CD14 et CD83 après différenciation des monocytes en CD immatures. E. Protocole de maturation des CD immatures 1. Préparation des cellules Après 5 jours de différenciation en présence de GM-CSF et d‟IL-4, les CD immatures sont prélevées puis centrifugées à 1200 rpm pendant 12 minutes. Le culot cellulaire est ensuite repris dans du milieu RPMI 1640 complémenté de 15% de SVF décomplémenté et filtré, 1% de pénicilline/streptomycine, et 5mM de L-Glutamine. Les cellules sont déposées dans les puits d‟une plaque 24 puits à raison de 5.10 5 cellules par ml et par puits. Les cellules 85 Matériels et méthodes sont mises au repos pendant la nuit. Puis les CD immatures sont mises au contact de LPS (Sigma) (1 µg/ml) à 37°C sous atmosphère humide contenant 5% de CO2 pendant 48 h afin de les différencier en CD matures. 2. Vérification de la différenciation des CD immatures en CD matures Au terme de la maturation, le profil d‟expression des marqueurs de surface des CD a été évalué. Pour cela, les cellules ont été marquées avec les anticorps monoclonaux suivants : anti-CD14 humain couplé à l‟APC (IgG2a de souris, clone M5E2, BD Biosciences) ; antiCD1a humain couplé au FITC (IgG1 de souris, clone HI149, BD Biosciences) ; anti-CD83 humain couplé au FITC (IgG1 de souris, clone HB15e, BD Biosciences) ; anti-CD86 humain couplé au PE (IgG1 de souris, clone 2331, BD Biosciences). Les cellules ont été incubées en présence des différents anticorps 20 min à +4°C et à l‟abri de la lumière puis lavées 2 fois avec du PBS 1X par centrifugation à 400 g pendant 10 min à + 4°C. Le culot cellulaire a alors été repris dans 500 µL d‟une solution de PFA à 1% avant l‟analyse par cytométrie en flux. La maturation des CD est caractérisée par une augmentation significative du marqueur de surface CD86 et par l‟apparition du marqueur de surface CD83. Nous avons vérifié l‟efficacité de la maturation sous l‟effet du LPS en étudiant le niveau d‟expression de ces deux marqueurs. La figure 4 montre que dans nos conditions expérimentales l‟activation par le LPS a pour conséquence une augmentation du niveau d‟expression du marqueur CD86 et l‟apparition du marqueur CD83 à la surface des CD matures par comparaison avec les CD immatures validant ainsi notre modèle de maturation des CD par le LPS. 86 Matériels et méthodes A B C 1.92% Counts 95.06% Counts CD86-PE 3.02% 0% CD83-FITC CD86-PE Isotype contrôle CD86-PE CD83-PE CD immatures CD matures Figure 4 : Pourcentage de CD immatures et matures exprimant les marqueurs de surface CD86 et CD83. III. Tri cellulaire de lymphocytes T CD4+ autologues pour les tests de présentation d’antigène par les CD matures A. Principe du tri cellulaire par cytométrie en flux Une fois les populations cellulaires analysées par cytométrie en flux, il est possible de les trier, c'est-à-dire de les séparer physiquement les unes des autres en fonction des caractéristiques déterminées lors de l'analyse. Ce tri est réalisé grâce au fractionnement d‟un jet liquide contenant les cellules. Ce jet va se rompre, à un point précis (point de rupture), pour donner des gouttes caractérisées par leur position et leur moment d'apparition. Lors de l‟analyse, le programme de tri décide si la cellule doit être isolée ou non selon les critères définis par l'utilisateur. Si une cellule d'intérêt devant être triée est détectée, le cytomètre charge électriquement le jet au moment de la formation de la goutte contenant cette cellule. Les gouttes chargées, contenant une cellule à trier, passent entre des plaques de déflection fortement chargées, et sont déviées du coté de la plaque de polarité opposée, puis collectées dans un tube. En revanche, les gouttes ne contenant pas de cellules d‟intérêt, ne sont pas chargées. Elles ne sont donc pas déviées par les plaques de déflection et tombent, par gravité, dans une poubelle (Schéma 31). Le cytomètre-trieur utilisé dans le cadre de cette thèse est un cytomètre-trieur FACSAria (BD Biosciences) qui possède 3 sources d‟excitation Laser : un Laser violet 87 Matériels et méthodes (longueur d‟onde d‟excitation de 407 nm), un Laser bleu (longueur d‟onde d‟excitation de 488 nm), un Laser rouge (longueur d‟onde d‟excitation de 633 nm). 1. Préparation des cellules Pour chaque expérience, 108 lymphocytes isolés par la technique d‟élutriation à contre-courant ont été marqués avec 2 anticorps couplés à 2 fluorochromes différents. Un anticorps anti-CD3 humain couplé au PE et un anticorps anti-CD4 humain couplé à l‟APC. Les cellules ont été incubées en présence des différents anticorps 20 min à +4°C et à l‟abri de la lumière puis lavées 2 fois avec du PBS 1X par centrifugation à 400 g pendant 10 min à + 4°C. Le culot cellulaire a alors été repris dans 500 µL d‟une solution de PFA à 1% avant l‟analyse par cytométrie en flux. Schéma 31 : Principe du tri cellulaire (d‟après www.cytometry.be/Cours2002/COURSNAM.pdf). Etape 1 : fragmentation contrôlée du flux de liquide qui conduit à l‟emprisonnement de chaque cellule dans une goutte. Peu après l‟analyse et dans un délai défini par le trieur, la décision de charger électriquement chaque goutte contenant une cellule viable répondant aux critères définis par l‟utilisateur sera prise. Etape 2 : déviation, par un champ électrique constant, des gouttes chargées de leur chute initiale et récupération des gouttes contenant une cellule d‟intérêt dans des tubes collecteurs. 88 Matériels et méthodes 2. Analyse des populations cellulaires Nous avons dans un premier temps déterminé les propriétés de dispersion des lymphocytes par une représentation graphique de la taille relative des cellules en fonction de leur complexité relative. La population homogène principale a été sélectionnée pour la suite de l‟analyse (population P1) (Figure 5). Puis les propriétés de fluorescence des cellules dans P1 ont été déterminées par des représentations bi-paramétriques de l‟intensité de la fluorescence PE par rapport à l‟intensité de la fluorescence APC. La population doublement marquée PE/APC représente la population lymphocytaire CD3 +CD4+ à trier (Figure 6). Figure 5 : Représentation bi-paramétrique de la taille (FSC) en fonction de la complexité (SSC) des cellules de la fraction lymphocytaire d‟élutriation. Figure 6 : Représentation bi-paramétrique de la fluorescence PE en fonction de la fluorescence APC. 89 Matériels et méthodes 3. Tri des lymphocytes T CD3+CD4+ Une fois la population la population lymphocytaire T CD3 +CD4+ sélectionnée, le tri à 2 voies est réalisé avec une vitesse de passage des cellules réglée entre 4000 et 5000 cellules/seconde. La chambre de prélèvement de l‟échantillon est refroidie à + 4°C le temps du tri afin de minimiser la mort cellulaire. A la fin du tri, la pureté des populations cellulaires est contrôlée par une nouvelle analyse en cytométrie en flux (Figure 7). Figure 7 : Vérification de la pureté des lymphocytes T CD3+CD4+ après tri cellulaire. 90 Résultats RESULTATS 91 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD Article 1 Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD 92 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD La BPCO est une pathologie pulmonaire d‟évolution lente caractérisée par une réponse inflammatoire chronique et une détérioration irréversible des petites voies aériennes et du parenchyme pulmonaire. L‟emphysème est la forme principale de la BPCO et l‟exposition à la fumée de tabac en est le principal facteur étiologique. Cependant, d‟autres facteurs participent au développement de cette maladie et en particulier les agents pathogènes ayant un tropisme pour la sphère respiratoire. La réponse inflammatoire au cours de la BPCO est caractérisée par une infiltration massive du tissu respiratoire par les PN et les lymphocytes T (LT). Le nombre de PN et de LT dans les lavages broncho-alvéolaires (LBA) et les biopsies bronchiques est corrélé avec le degré de sévérité de la BPCO. L‟activation des cellules inflammatoires au cours de la BPCO, et en particulier des PN, conduit à la sécrétion de nombreuses protéases telles que des sérines protéases spécifiques du PN (NE, cathepsine G, protéinase 3), des cystéines protéinases (caspases 3/9, cathepsines) et des métallo-protéinases matricielles (MMP 2, 7, 9 et 12). Ces protéases participent à l‟installation et à l‟entretien de la réponse inflammatoire chronique ainsi qu‟à la genèse des lésions tissulaires observées au cours la pathologie. De façon plus focalisée, l‟augmentation de la NE est associée à l‟intensité des lésions emphysémateuses. La majorité des protéases sécrétées par les cellules inflammatoires au cours de la BPCO sont également impliquées dans la dégradation du tissu conjonctif du parenchyme pulmonaire ou l‟élastine est la cible privilégiée de la NE et de la MMP-9. La forte excrétion de desmosine, marqueur spécifique de la dégradation de l‟élastine, et les taux élevés de peptides d‟élastine (PE) dans différents liquides biologiques (urine, sang, plasma, expectorations) ont permis de mettre en évidence une dégradation intense de l‟élastine pulmonaire chez les patients atteints de BPCO. Par ailleurs, le niveau de NE dans les LBA de patients atteints d‟emphysème est corrélé avec le niveau de PE dans ces mêmes fluides. La présence du récepteur à l‟élastine à la surface des PN nous a conduit à émettre l‟hypothèse que les propriétés inflammatoires et migratoires des PN pouvaient être régulées lors de l‟interaction entre les PN et les PE au cours de la BPCO. 93 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD Les principaux résultats obtenus au cours de cette étude sont les suivants : 1/ Les propriétés migratoires des PN en réponse aux effets chimio-attractants des PE sont fortement réduites chez les patients BPCO en comparaison avec celles des PN de donneurs sains. La diminution du niveau d‟expression du récepteur à l‟élastine S-Gal à la surface des PN de patients BPCO est associée à cette diminution. 2/ La production de cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6 and IL-8) par les PN en réponse à une activation par les PE est réduite chez les patients BPCO en comparaison à celle observée chez les sujets sains. Cette réduction est également liée au niveau d‟expression plus faible du récepteur S-Gal à la surface des PN des patients BPCO. 3/ Les PN isolés de patients BPCO ont une capacité renforcée à phagocyter et à éliminer les agents pathogènes tels que pseudomonas aeruginosa par comparaison avec les PN des sujets sains. Les effets des PE sur ces propriétés sont bivalents. Les PE augmentent l‟activité phagocytaire des PN mais diminuent leur capacité à produire des dérivés actifs de l‟oxygène. 4/ Les PN de patients BPCO répondent différemment à l‟activation des PE selon l‟état clinique des patients dont ils ont été isolés (état stable ou état d‟exacerbation). Ainsi, les propriétés biologiques (capacité à produire des cytokines, phagocytose, production de dérivés actifs de l‟oxygène) des PN de patients BPCO en exacerbation ne sont pas affectées par les PE. Cette différence de réponse aux PE des PN de patients BPCO à l‟état stable ou à l‟état exacerbé est proportionnellement liée au niveau d‟expression du récepteur S-Gal à la surface des PN. L‟ensemble de ces résultats a fait l‟objet d‟un article soumis dans "The European Respiratory Journal" et présenté ci-après. 94 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD A. Dupont*, S. Dury*,#, V. Gafa*, F. Lebargy*,#, M. Guenounou*, F. Antonicelli¶,¥, R. Le Naour*,¥ AFFILIATIONS * EA4303 "Inflammation et Immunité de l‟Epithélium Respiratoire", IFR53, Université de Reims Champagne-Ardenne, Reims, France # Service des Maladies Respiratoires, Centre Hospitalier Universitaire, Reims, France ¶ UMR6237, IFR53, Université de Reims Champagne-Ardenne, Reims, France ¥ These two authors equally contributed to this work CORRESPONDENCE R. Le Naour EA4303, Laboratoire d‟Immunologie et de Microbiologie UFR de Pharmacie - 1, rue du Maréchal Juin, 51096 Reims cedex Phone: (0033) 326918144. Fax: (0033) 326918164. E-mail address: [email protected] 95 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD ABSTRACT: Neutrophils are important cells in the inflammatory process that occurs during Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). Pulmonary infiltrated neutrophils secrete elastinolytic proteases which participate to elastin breakdown and genesis of elastin peptides. In the present study, we hypothesised that neutrophil activities could be modulated by elastin peptides during COPD. Neutrophils obtained from COPD patients either stable or exacerbated, and from healthy donors were cultured with or without elastin peptides. Cell chemotaxis was analyzed by Boyden method and cytokine synthesis by both ELISA and real-time RT-PCR. Phagocytosis was evaluated following incubation with Pseudomonas aeruginosa and ROS measurement and elastin receptor expression were determined by flow cytometry. Chemotactic activity of neutrophils from COPD patients towards the VGVAPG elastin peptide was reduced compared to healthy donors. VGVAPG increased pro-inflammatory cytokine synthesis and phagocytosis but reduced ROS production in neutrophils from healthy donors and from stable COPD patients. Exacerbated COPD patients were unresponsive to VGVAPG treatment. These were in keeping with the decrease or the nearly totally reduction of the S-Gal elastin receptor in neutrophils from stable or exacerbated COPD patients, respectively. The present study demonstrates that neutrophils from COPD patients varied in their responses to VGVAPG accordingly to S-Gal level and COPD phases. KEYWORDS: Airway inflammation, Cytokine expression, Innate immunity, Neutrophils, SGal receptor, VGVAP 96 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD INTRODUCTION Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is a disease characterized by a progressive airflow limitation associated with an abnormal inflammatory response of the lung to noxious particles or gases [1]. COPD includes chronic bronchitis, with obstruction of small airways, and emphysema, characterized by the destruction of lung parenchyma responsible of loss of its elasticity. The inflammatory process occurring during COPD is characterized by 1/ an activation of peripheral blood neutrophils and T lymphocytes [2], 2/ an increased level of pro-inflammatory cytokines in plasma and bronchoalveolar lavage (BAL) [3, 4] and 3/ by a massive infiltration of neutrophils, macrophages and T lymphocytes in the pulmonary parenchyma [5]. Natural history of COPD is also characterized by recurrent phases of exacerbation. Most exacerbations involve pathogens and it is now established that 50% of exacerbations are caused by bacterial infection. Acquisition of a new strain of Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae or Pseudomonas aeruginosa is strongly associated with the occurrence of an exacerbation [6]. Several literature data show that the number of neutrophils in COPD patients BAL correlates with progression and severity of emphysema [7]. Neutrophil recruitment is controlled by chemotactic mediators such as IL-8, GRO-α or RANTES [8] and the bacterial clearance properties of neutrophils is dependent on the production of both reactive oxygen species (ROS) and granule-associated proteases [9, 10]. Pulmonary infiltrated inflammatory cells secrete number of proteases involved in the tissue damage associated to this disease [11]. Of interest, some of these proteases (neutrophil elastase (NE), MMP-2 and 9) participate to elastin degradation, a protein responsible for pulmonary elasticity [11, 12]. Accordingly, the high excretion of desmosine, a specific marker of elastin degradation [13], and the elevated levels of peptides derived from elastin degradation in different biological fluids both evidenced a massive pulmonary elastin breakdown in COPD patients [14, 15]. 97 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD Of interest, it has been shown that elastin peptides (EP) displayed a wide range of biological activities such as chemotactic activity [16, 17], regulation of cell proliferation [18] and control of vascular tone [19]. Moreover, they modulate the pro-inflammatory cytokines expression by monocytes and melanoma cells [20, 21]. These effects are largely mediated through interaction of EP with a receptor complex, which includes a 67-kDa elastin-binding protein (EBP) identified as an enzymatically inactive spliced variant of the human βgalactosidase therefore designated as Spliced-galactosidase (S-Gal) [22]. This elastin receptor complex is also composed of two others subunits named neuraminidase and protective protein/cathepsin A (PPCA) [23]. Since S-Gal is expressed on neutrophils surface [24] and EP are largely generated during COPD, we hypothesized that inflammatory and chemotactic neutrophils properties could be modulated by EP/cell interaction during COPD progression and the exacerbation phase associated with bacterial infection. In this study, we demonstrated that impairment of neutrophil reactivity to EP was related to S-Gal elastin receptor down-regulation in COPD patients. 98 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD MATERIALS AND METHODS Study population Healthy donors and COPD patients were recruited from the department of respiratory diseases, at university hospital of Reims (France). All participation was voluntary and all subjects gave written informed consent prior inclusion in this study. The ethics committees of university hospital approved this study. Healthy donors (n = 20) exhibited no respiratory symptoms, with normal spirometric values. COPD patients (n=16) were enrolled in the study on the basis of the following criteria: over 45 years old, current or ex-smoker for ≥20 packyears, FEV1/force vital capacity (FVC) <70% after bronchodilatation. COPD patients were included at exacerbation phase that was defined by the presence of at least two of the following criteria: increased dyspnoea, increased sputum production and sputum purulence. All exacerbated COPD patients were blood sampled before any specific therapy (i.e. antibiotics and corticosteroids). After inclusion, exacerbated COPD patients were clinically followed and eleven of them, who returned to a stable phase of COPD, were again evaluated and blood sampled. Patients were not eligible for the study if they had been diagnosed with asthma, had extensive pulmonary tuberculosis or neoplastic processes. Neutrophil isolation and culture Peripheral blood neutrophils were isolated from heparinized whole blood using a density gradient media (PolymorphprepTM, Abcys Biology, Paris, France). Neutrophils were shown to be > 98% by FACS analysis and cell viability was over 95% as determined by trypan blue exclusion (data not shown). Isolated neutrophils (1 x 10 6 cells.mL-1) were cultured at 37°C in 5% CO2 in 24-well culture plates and in RPMI 1640 Medium containing 5 mM L-glutamine (Fisher Bioblock Scientific, Illkirch, France). 99 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD Neutrophil treatment with elastin peptide Neutrophils cultured under experimental conditions above indicated were incubated in the presence or not of 1 or 10 µg.mL-1 VGVAPG elastin peptide (Genepep, Saint Clément de Rivière, France) during 4 h. Then, cells were either collected for total RNA extraction, or for elastin receptor staining. Cell culture supernatants were also collected for quantification of cytokine protein level by ELISA. In some experiments, pre-treatment of neutrophils for 1 hr with 10 mM lactose (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France), a galactosugar known to induce the shedding of the elastin receptor (S-Gal) from the cell surface [25], was used to appreciate the specificity of VGVAPG effects. For phagocytosis and ROS measurement, neutrophils were pre-treated 4 h with 1 or 10 µg.mL-1 of VGVAPG before incubation with Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Neutrophil chemotaxis assay Chemotactic activity of neutrophils was determined using a Boyden chamber method. Briefly, 27 µL of RANTES (0.1 µg.mL-1) or VGVAPG (1 and 10 µg.mL-1) were added to the lower wells of a 48-well Boyden chamber (Neuro Probe, Gaithersburg, USA) and covered with a 5 µm polycarbonate filter (VWR International, Fontenay-sous-Bois, France). 50 µl of neutrophil suspension (5 x 105 cells.mL-1) were then added to the upper wells of the chamber and incubated 45 min at 37°C in 5% CO2. Migrating cells, fixed and stained with eosin and bromophenol blue (RAL kit, Réactifs RAL, France) at the lower part of the filter, were counted by microscopy in five randomly selected high-power (40 x) fields per well. The experiments were performed in triplicate and results are reported as the mean number of cells per field. 100 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD Real-time RT-PCR analysis Total RNA was extracted from 5 x 106 neutrophils using MasterPurTM RNA Purification Kit (Tebu-bio, Le Perray en Yvelines, France) in accordance with the manufacturer‟s technical data sheets. Then, 1 µg of total RNA was reverse transcribed into cDNA with a reverse transcriptase using SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen Life Technologies, Cergy Pontoise, France) as described previously [26]. After reverse transcription, the cDNA product was amplified in real-time PCR. Using this approach, the mRNA levels for S-Gal, IL-6, TNF-α, and IL-8 were determined with the 7000 sequence detection system ABI Prism sequence detector (Applied Biosystems, Foster City, USA), using the double-strand-specific SYBR Green (Applied Biosystems) dye system. Data analysis was performed with the SDS software (Applied Biosystems). The amount of the target gene mRNA was calculated relative to the β-actin gene mRNA and an internal control (2 -∆∆Ct, where ∆ is change and Ct is the cycle threshold). Flow cytometric analysis Elastin binding on human neutrophils was determined after 30 min incubation of cells with Elastin-FITC (1 µg.mL-1) (Elastin Products Company, Owensville, Missouri, USA) as previously described [20] and fluorescence emission was assessed by flow cytometric analysis using a FACSCaliburTM Instrument (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France). In some experiments, neutrophils from healthy donors were 4 h pre-treated with VGVAPG (1 or 10 µg.mL-1) before incubation with Elastin-FITC. Detection of cytokine concentration Determination of IL-6, TNF-α and IL-8 in cell culture supernatants of neutrophils were performed in triplicate using commercially available high-sensitivity ELISA kit (Quantikine, 101 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD RD Systems) according to the manufacturer‟s instructions. The sensitivity of each ELISA kits was 0.70 pg/mL, 4.4 pg/mL and 1.5 pg/mL respectively. Phagocytosis and intracellular ROS measurement Neutrophils were cultured in 96-well culture plates (2.5 x 104/well) and incubated with 0.1 mL of P. aeruginosa (3-5 107 CFU.mL-1) for 30 or 90 minutes at 37°C in 5% CO2 atmosphere. For phagocytosis analysis, following incubation the plates were placed into ice to stop phagocytosis process. Then, cells were centrifuged at 400 g for 5 min at 4°C to remove non-phagocytosed P. aeruginosa, and thereafter washed twice with PBS and lysed with 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) to disrupt eukaryotic cells. The pellet was resuspended in 0.5 ml saline, and the suspension was cultured on a standard Trypic Soy Agar (Fisher Bioblock Scientific). After 24 h incubation at 37°C, the number of colonies was counted to determine the number of viable neutrophil-associated bacteria. For measurement of intracellular ROS, cells were exposed to 10 µM of the cell-permeant 2‟,7‟-dichlorofluoresceindiacetate compound (Invitrogen Life Technologies). Such molecule is oxidized by hydrogen peroxide, peroxynitrite (ONOO-), and hydroxyl radicals (OH•) to yield the fluorescent molecule 2‟,7‟dichlorofluorescein. After 15 min incubation at 37°C, cells were washed twice in PBS and resuspended in 500 µl PBS containing 1% PFA. Fluorescence emission, directly proportional to the presence of above mentioned ROS, was assessed by flow cytometric analysis using a FACSCaliburTM Instrument (BD Biosciences). Statistical analysis Data are presented as mean ± SD for n observations. Comparisons within the same groups were performed using a Wilcoxon test. Comparisons between subject groups were performed using a Mann-Whitney test. Differences were considered significant where p<0.05. 102 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD RESULTS Clinical features of study populations Clinical characteristics of COPD patients and healthy donors are summarized in table 1. As expected by the selection of the patients, there were significant differences in airway limitation and static hyperinflation between COPD patients and healthy donors. Furthermore, the cumulative smoking exposure was significantly more important in COPD patients either stable or exacerbated than in healthy donors. There was no significant difference between the three groups studied regarding the averaged-age of subjects, the percent of current smokers and the number of neutrophils in complete blood count. TABLE 1: Characteristics of the study groups Healthy donors COPD patients Subjects 20 Exacerbated 16 Age yrs 55 ± 10 66 ± 10 64 ± 8 52.6 46.1 57.1 Smoking history Pack-yrs# 23.4 ± 19.4 51 ± 18.7* 50.5 ± 14.8* FEV1 % pred 98.6 ± 10.4 - 51.2 ± 17.1* FEV1/FVC % 79.8 ± 8.2 - 48.8 ± 10.8* 5529 ± 1777 6729 ± 2326 5136 ± 1630 Current smokers % Neutrophils/mm3 Stables 11 Data are presented as mean ± SD or %, unless otherwise stated. FEV1: forced expiratory volume in 1 s; % pred: % predicted; FVC: forced vital capacity; #: 1 pack-yr represents 20 cigarettes per day for 1 yr. *: p<0.05 versus healthy donors 103 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD Neutrophil chemotactism towards VGVAPG is altered during COPD The neutrophil chemotactism was analyzed in 16 exacerbated COPD patients, 11 stable COPD patients out of the 16 exacerbated COPD patients, and on 20 healthy donors. Results showed that using VGVAPG at 1 µg.mL-1 as chemo-attractant, chemotactic activities of neutrophils from healthy subjects were statistically enhanced (fig. 1a). Pre-incubation of neutrophils with lactose totally abrogated the VGVAPG-induced chemotactic effect on neutrophils from healthy subjects (fig. 1b). However, the chemo-attractive effect of VGVAPG on neutrophils from healthy donors was not reproduced when this peptide was used at a higher concentration (10 µg.mL-1) (fig. 1a). Besides, no VGVAPG-dependent chemotactism was observed with neutrophils from COPD patients either stable or exacerbated, and whatever the peptide concentration used (fig. 1a). Nevertheless, chemotactism analysis performed towards RANTES, used as a physiopathological chemo-attractant with regard to COPD, showed that the migratory capacities of neutrophils from both COPD patient groups was preserved, and with similar magnitudes compared to healthy group (fig. 1a). This effect was not dependent on lactose pre-treatment (fig. 1b). Similar results as those above described were obtained when the statistical analysis was performed from the data obtained on the 11 COPD patients blood sampled at the exacerbation and stable phase (data not shown). 104 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD FIGURE 1 a) Number of migrating neutrophils 60 * * * 50 * 40 30 20 10 0 1 VGVAPG 10 1 (µg.mL-1 ) VGVAPG 10 1 (µg.mL-1 ) 10 VGVAPG (µg.mL-1 ) b) Number of migrating neutrophils 70 60 * 50 40 30 20 10 0 Healthy donors Stable COPD patients Exacerbated COPD patients FIGURE 1. Neutrophil chemotactism towards VGVAPG in healthy donors and COPD Patients. a) Neutrophils from healthy donors (n = 20, ) or from COPD patients either stable (n = 11, ) or exacerbated (n = 16, ) were added to the upper wells of a Boyden chamber and studied for their chemotactism towards VGVAPG (1 and 10 µg.mL-1) or RANTES (0.1 µg.mL-1; positive control) added to the lower wells. Number of migrating cells was determined following 45 min incubation and staining with eosin and bromophenol blue. * p<0.05. b) Neutrophils isolated from healthy donors (n = 7, ) and from COPD patients (n = 5) blood sampled at the exacerbation ( ) and stable ( ) phase were pre-treated ( ) or not with lactose for 1 h and studied for their chemotactism towards 1 µg.mL-1 VGVAPG. * p<0.05. 105 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD VGVAPG effects on cytokine expression by neutrophils is dependent on clinical status Knowing that EP modulated pro-inflammatory cytokines expression in human monocytes and lymphocytes [20, 27], we next investigated whether VGVAPG altered IL-6, TNF-α and IL-8 production in neutrophils from COPD patients and healthy donors. Treatment with VGVAPG (1 µg.mL-1) significantly increased IL-6 mRNA expression in neutrophils from healthy subjects and stable COPD patients, but had no effect on IL-6 expression in neutrophils from exacerbated COPD patients (fig. 2a). Such variations were also clearly observed using ELISA analysis of IL-6 protein secretion (fig. 2b). However, neutrophils treatment with higher concentration of VGVAPG (10 µg.mL-1) did not alter anymore IL-6 expression either from healthy subjects and stable COPD patients, while exacerbated COPD patients still did not respond (figs 2a and b). Similar effects were observed on TNF-α expression in neutrophils treated with VGVAPG both in healthy subjects and COPD patients (figs 2d and e). Increased of both IL-6 and TNF-α in healthy donors and stable COPD patients upon 1 µg.mL-1 VGVAPG treatment was abrogated following neutrophils pre-treatment with lactose (figs 2c and f). In contrast, although VGVAPG-induced IL-8 expression by neutrophils from healthy subjects (figs 2g and h) was again abrogated by lactose pre-treatment (fig. 2i), this peptide did not affect IL-8 expression in neutrophils from stable COPD patients whatever the concentration used. Of note, treatment with PMA increased the expression of all cytokines analyzed, but with a neutrophils susceptibility to PMA higher in exacerbated COPD patients compared to stable COPD patients and healthy donors. 106 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD FIGURE 2 IL-6 IL-6 concentration (pg.mL-1) IL-6 concentration (pg.mL-1) * * * IL-6 mRNA * 2 150 100 50 0 0 RPMI PMA 1 RPMI 10 PMA VGVAPG (µg.mL-1) c) 250 200 * * 4 200 ** # * # 6 250 300 * 8 b) * 300 # a) 10 * # # 12 150 100 50 0 Lactose - + VGVAPG + + 1 10 VGVAPG (µg.mL -1 ) - + - + ++ + + TNF-a 2 0 100 50 PMA 1 10 RPMI PMA VGVAPG (µg.mL -1 ) 1 f) 250 200 150 100 50 0 Lactose - + VGVAPG + + 0 RPMI 10 VGVAPG (µg.mL-1 ) - + - + ++ + + # # * 4 * 2 0 RPMI PMA 1 10 VGVAPG (µg.mL -1 ) 250 200 150 100 50 0 RPMI PMA 1 10 VGVAPG (µg.mL -1) IL-8 concentration (pg.mL-1) IL-8 concentration (pg.mL-1) * 6 h) * * 8 300 * g) 10 * # # 300 250 i) * 12 * IL-8 IL-8 mRNA TNF-a concentration (pg.mL-1 ) TNF-aconcentration (pg.mL-1 ) * * TNF-amRNA 4 150 ** * 200 * * 300 * * 6 250 * # 8 # # e) # # 10 300 * d) * 12 200 150 100 50 0 Lactose - + VGVAPG + + - + - + ++ + + FIGURE 2. Effects of VGVAPG on cytokine expression by neutrophils isolated from healthy donors and COPD patients. Neutrophils isolated from healthy donors (n = 16, ) and from COPD patients (n = 9) blood sampled at the exacerbation ( ) and stable ( ) phase were treated with PMA (1 µM) or VGVAPG (1 and 10 µg.mL -1). Four hours after treatment, 1) total RNA was extracted and mRNA expressions for a) IL-6, d) TNF-α and g) IL-8 were determined by real time PCR analysis, and 2) cytokine secretions for b) IL-6, e) TNF-α and h) IL-8 were determined by ELISA. * Significant difference in cytokine expression/secretion compared with RPMI in the same cohort (p<0.05); # p<0.05. In some experiments (healthy donors: n = 10 ; COPD patients: n = 6), neutrophils were pre-incubated with lactose (10 mM, 1 h) before treatment with 1 µg.mL -1 VGVAPG. Four hours after treatment, cytokine secretions for c) IL-6, f) TNF-α and i) IL-8 were determined by ELISA.* p<0.05. 107 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD VGVAPG affects neutrophil phagocytosis and ROS production only in stable phase from COPD patients To further characterize the neutrophil biological properties from each group we also investigated their capacity to phagocyte pathogens and to induce ROS production. Kinetic analysis revealed that basal phagocytic susceptibility of neutrophils from exacerbated COPD patients was already maximal after 30 min incubation with P. aeruginosa, whereas a delayed response was observed with neutrophils from stable COPD patients. Besides, the phagocytic capacity of neutrophils from healthy donors hardly changed over time (Figs 3a and c). Pretreatment of neutrophils with VGVAPG (1 µg.mL-1, 4 h) significantly increased the phagocytosis of P. aeruginosa at 30 min in both stable COPD patients and healthy donors but not in exacerbated COPD patients (Fig. 3a). This stimulatory effect of VGVAPG was conserved at 90 min in healthy donors and stable COPD patients (Fig. 3c). Whatever the time period and neutrophil groups analyzed, VGVAPG used at a concentration of 10 µg.mL-1 did not alter the basal phagocytic properties of cells (Figs 3a and c). Similarly to the phagocytic capacity, the basal ROS production level by neutrophils was significantly higher in exacerbated COPD patients compared with stable COPD patients and healthy donors (Fig. 3b). These ROS production were then decreased upon VGVAPG stimulation (1 µg.mL-1) in healthy and stable COPD groups, whereas exacerbated COPD patients were unresponsive to this treatment. These effects were similar at 30 and 90 min. Like in all experiments, VGVAPG 10 µg.mL-1 was ineffective in modulating neutrophil ROS production. 108 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD FIGURE 3 a) 2500 Mean Fluorescence Intensity 60 CFU number 50 40 # 30 * 20 ** ** * 10 b) 2000 # 1500 * 1000 * 500 ** ** 0 0 RPMI 1 RPMI 10 1 VGVAPG (µg.mL-1 ) c) 2500 CFU number 50 40 30 20 VGVAPG (µg.mL-1 ) Mean Fluorescence Intensity 60 ** * * ** 10 10 d) 2000 # * 1500 1000 * ** 500 ** 0 0 RPMI 1 VGVAPG 10 (µg.mL-1 ) RPMI 1 10 VGVAPG (µg.mL-1 ) FIGURE 3. Effects of VGVAPG on phagocytosis and ROS production by neutrophils isolated from healthy donors and COPD patients. Neutrophils isolated from healthy donors (n = 20, ) and from COPD patients (n = 11) blood sampled at the exacerbation ( ) and stable ( ) phase were pre-treated on not with VGVAPG (1 or 10 μg.mL-1, 4 h) before incubation with P. aeruginosa. Neutrophil phagocytic activities analyzed at a) 30 min and c) 90 min following P. aeruginosa incubation were determined by counting CFU number 24 h after culture of neutrophil-phagocyted bacteria in a specific medium. ROS production was analyzed by flow cytometric analysis at b) 30 min and d) 90 min following incubation. * Significant difference in phagocytosis or ROS production compared with RPMI from healthy donors (p<0.05); ** Significant difference in phagocytosis or ROS production compared with RPMI in the same cohort (p< 0.05); # p <0.05. 109 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD Elastin receptor expression on neutrophil surface is down-regulated during COPD To further address the relationship between the biological responses of neutrophils towards VGVAPG and COPD phases, we hypothesized that the elastin receptor expression on neutrophils surface could represent a critical mechanism to explain the differential effects observed. Using elastin-FITC, flow cytometry analysis revealed a high constitutive expression of elastin receptor on neutrophils surface from healthy donors (fig. 4a). This expression was largely reduced on the surface of neutrophils from stable COPD patients, and nearly totally abolished on neutrophils from exacerbated COPD patients (fig. 4a). To better characterize the receptor involved in VGVAPG effects, we then analyzed the S-Gal mRNA expression by real-time RT-PCR. Compared to healthy subjects, quantification of S-Gal mRNA expression in neutrophils from stable and exacerbated COPD patients revealed a 3.0- and 7.7-fold reduced S-Gal level, respectively (fig. 4b). With respect to the above hypothesis and results, we then wondered whether the dose-dependent VGVAPG differential effects observed in neutrophils from healthy donor were also associated to S-Gal expression level. Treatment with VGVAPG at a concentration of 10 µg.mL-1 largely decreased the basal S-Gal expression both at the mRNA and protein levels, whereas no significant effect was observed with a concentration of 1 µg.mL-1 (figs 4c and d). 110 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD FIGURE 4 50 1.0 0.8 30 S-gal mRNA 60 1.2 40 b) 10 20 Cell count a) 1.0 0.6 0.4 0.33 0.2 0.13 0 0 10 0 10 1 10 2 10 3 Elastine-FITC 10 4 Healthy donors Stable Exacerbated COPD patients d) c) 60 1.75 * Healthy donors 50 1.50 40 0.75 10 0.50 0 0.25 0.00 30 1.00 20 Cell count S-gal mRNA 1.25 0 1 10 VGVAPG (µg.mL-1 ) 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 Elastine-FITC FIGURE 4. S-Gal elastin receptor expression on neutrophils isolated from healthy controls and COPD patients. a) Neutrophils from healthy donors and from COPD patients were incubated or not ( ) with Elastin-FITC (10 µg.mL-1, 30 min). Elastin binding on neutrophils was determined by flow cytometry analysis. Data are representative of independent experiments performed with neutrophils from healthy donors (n = 8) ( , Mean Fluorescence Intensity (MFI): 198.2±54.4) and with neutrophils isolated from COPD patients (n = 6) blood sampled at the exacerbation ( , MFI: 16.5±4.3) and stable ( , MFI: 45.7±15.7) phase. b) Total RNA was extracted in neutrophils from healthy donors (n = 20) and from COPD patients either stable (n = 11) or exacerbated (n = 16) and S-Gal mRNA expression was determined by real-time PCR analysis. c) Neutrophils from healthy donors (n = 12) were treated with VGVAPG (1 or 10 µg.mL -1) for 4 h and total RNA was extracted to analyze S-Gal mRNA expression by real-time PCR analysis. * p < 0.05. d) Neutrophils from healthy donors were treated or not ( ) with 1 ( ) or 10 µg.mL-1 ( ) VGVAPG during 4 h, then incubated with Elastin-FITC (1 µg.mL-1, 30 min). Negative control ( ) was obtained with neutrophils that were neither treated with VGVAPG nor stained with elastin-FITC. Elastin binding on neutrophils was determined by flow cytometry analysis. Data are representative of 6 independent experiments. 111 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD DISCUSSION The role of peptides derived from elastin degradation in the adaptive immune response during COPD was previously evidenced through involvement of these peptides in the development of both a T-helper type 1 polarization and an auto-immune response [28]. Here, we showed that elastin peptides (EP) impact the innate immune response in COPD by modulating neutrophil migration, cytokine secretion, phagocytosis and ROS production. The inflammatory response during COPD is associated with neutrophil recruitment. We showed, herein, that the chemotactic properties of neutrophils, derived from COPD patients, towards EP were strongly reduced in comparison with healthy donors. The chemoattractive property of EP was the first biological activity reported in various cell types [19, 29]. However, even though the ability of EP to promote neutrophil migration was already described [30], to our knowledge this is the first evidence that pathological conditions such as COPD alter neutrophil chemoattraction towards EP. Among the three characterized elastin receptors (EBP, Galactin-3, αvβ3 integrin) [22, 31, 32] the critical role of EBP was pinpointed using VGVAPG, the minimal elastin sequence binding specifically EBP. Finally, decreased of elastin binding on COPD neutrophil surface was associated with reduced S-Gal mRNA expression compared to neutrophils from healthy donors. These results are in keeping with the fact that the S-Gal receptor is present on the surface of circulating immune white cells [20, 27] and notably on neutrophils [24]. Previous studies described S-Gal receptor up-regulation in different cell types [27, 33]. To our knowledge, this is the first observation of a decrease of the presence of this receptor on neutrophil cell surface, noteworthy this down-regulation occurred under pathological conditions. Up to now, lack of EP effects was related to deficient signalling pathways, which have been recently linked in fibroblast to reduced expression of the neuraminidase-1 (Neu-1), another subunit of the elastin receptor complex [34]. Then, 112 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD altogether, decrease of S-Gal elastin receptor evidences a new mechanism supporting the lower capacity of neutrophils isolated from COPD patients to migrate towards EP. Once infiltrated into the pulmonary parenchyma under physiopathological chemoattractant effects such as RANTES and IL-8, neutrophils are involved in different phases of the inflammatory process associated with COPD. Locally activated neutrophils release cytokines and proteases that contribute to inflammation and to massive pulmonary elastin breakdown leading to elastin peptides retrieved in different biological fluids, notably in the plasma [12, 13]. We here found that circulating neutrophils from COPD patients differently react to EP stimulation than those of healthy donors. Firstly, secretion of pro-inflammatory cytokines (TNF, IL-6 and IL-8) was reduced in neutrophils from COPD patients, which is in setting with the lower expression of S-Gal elastin receptor on cell surface. Such relationship between cytokine production and S-Gal receptor expression was previously established in human lymphocytes in which PHA-induced up-regulation of S-Gal expression was correlated with an increased cytokine secretion [27]. However, variations in cytokine production following cell stimulation by EP are not always associated with S-Gal level modulation. Indeed, in a previous study performed in human monocytes, we demonstrated that the VGVAPG sequence decreased LPS-dependent pro-inflammatory cytokine production although S-Gal level remained constant [20]. Therefore, this suggests that EP effects depend on S-Gal expression level, on cell type and on the physiopathological environment. Accordingly, compared with healthy donors, neutrophils from COPD patients, which displayed lower level of S-Gal, had a higher capacity to phagocyte and eliminate pathogens such as pseudomonas aeruginosa. As proposed above, this might simply relies on the inflammatory environment which primeactivated neutrophils from COPD patients. In such model the effects of EP were bivalent as they decreased ROS production, while they increased the phagocytic process. Interestingly, the capacity of VGVAPG to increase the phagocytic properties of neutrophils from both 113 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD healthy donors and COPD patients seemed correlated to S-Gal expression level. In this setting, it was previously demonstrated that macrophage phagocytosis (as well as proinflammatory cytokine production) was dependent on the activity of Neu-1, a component of elastin receptor [35], which predisposed patients to develop repeated pulmonary infections with bacterial and viral pathogens Altogether, our results highlight the interrelationships between the down-expression of S-Gal elastin receptor on circulating neutrophils from COPD patients, and the reduction of their biological activities in response to EP. COPD is a chronic inflammatory disease periodically worsened by recurrent episodes of acute inflammatory disorders. On top of reacting differently from healthy donors, neutrophils from COPD patients varied in their response to EP accordingly to the COPD clinical status (i.e; stable phase or exacerbation). Indeed, pro-inflammatory cytokine production by neutrophils from exacerbated COPD patients was unaffected in response to EP stimulation in contrast to neutrophils from stable COPD patients, even if the overall corresponding response remained weaker when compared with healthy donors. This biological discrepancy was also observed with other parameters such as phagocytosis and ROS production supporting the implication of a biological common denominator, which could correspond to the S-Gal elastin receptor. Accordingly, expression level of S-Gal was highly decreased in stable COPD patients and nearly totally abrogated in exacerbated COPD patients. However, the relationships between the above biological activities and variations in S-Gal expression level could not be applied to the chemotactism properties toward VGVAPG. One potential explanation would be that each neutrophil biological effect in response to VGVAPG is associated with a threshold level of S-Gal expression. Of note, stimulation with high concentration of EP reduced S-Gal level on neutrophils from healthy donors to a value closed to those observed in COPD patients. Then, one could hypothesize that down-regulation of SGal elastin receptor on the surface of neutrophils from COPD patients may reflect the release 114 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD of high concentration of EP in blood circulation during exacerbation episodes. Accordingly, elevation of the elastinolytic protease NE has been reported during COPD exacerbation [36, 37]. Overall, our data demonstrate a correlation between the neutrophil reactivity to EP in COPD patients and the elastin S-Gal receptor expression. Interestingly, the down-regulation of S-Gal elastin receptor by EP, highly produced during exacerbations of COPD, could be interpreted as a positive mechanism limiting the EP-dependent inflammatory process. 115 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD REFERENCES 1 Global strategy for diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease, Global initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) 2010. www.Goldcopd.org. Date last updated: December 2010. Date last accessed: august 2011. 2 Agustí AG, Noguera A, Sauleda J, Sala E, Pons J, Busquets X. Systemic effects of chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J 2003; 21: 347-60. 3 Chung KF. Cytokines in chronic obstructive pulmonary disease. 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The elastin receptor complex transduces signals through the catalytic activity of its Neu-1 subunit. J Biol Chem 2007; 282: 12484-12491. 35 Seyrantepe V, Iannello A, Liang F, Kanshin E, Jayanth P, Samarani S, Szewczuk MR, Ahmad A, Pshezhetsky AV. Regulation of phagocytosis in macrophages by neuraminidase 1. J Biol Chem 2010; 285: 206-215. 36 Fujimoto K, Yasuo M, Urushibata K, Hanaoka M, Koizumi T, Kubo K. Airway inflammation during stable and acutely exacerbated chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J 2005; 25: 640-646. 37 Ilumets H, Rytilä PH, Sovijärvi AR, Tervahartiala T, Myllärniemi M, Sorsa TA, Kinnula VL. Transient elevation of neutrophil proteinases in induced sputum during COPD exacerbation. Scand J Clin Lab Invest 2008; 68: 618-623. 120 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD SUPPORT STATEMENT A. Dupont received grants for doctoral training from the Ministère de l‟Enseignement Supérieur et de la Recherche (Paris, France). 121 Article 1 : Impairment of neutrophil reactivity to elastin peptides in COPD En conclusion, nous avons montré que les PE : 1/ régulent les fonctions des PN de sujets sains en augmentant de façon significative leur capacité migratoire, leur capacité à produire des cytokines pro-inflammatoire et à phagocyter les agents pathogènes. Ces propriétes régulatrices mettent en jeu le récepteur à l‟élastine SGal présent à la surface des PN. 2/ diminuent le niveau d‟expression du récepteur S-Gal à la surface des PN des patients BPCO. Sur la base de ce résultat, nous avons émis l‟hypothèse que la production importante d‟élastine dans l‟environnement immédiat des PN circulants au cours de la BPCO pourrait expliquer le niveau d‟expression plus faible du récepteur S-gal à la surface des PN des patients BPCO en comparaison avec le niveau élevé du même récepteur chez les sujets sains. La dégradation majorée du parenchyme pulmonaire et donc de l‟élastine au cours des phases d‟exacerbation de la BPCO expliquerait également le niveau d‟expression plus faible du récepteur S-gal chez les sujets BPCO exacerbés par rapport aux sujets BPCO stables. 3/ ont des effets régulateurs limités sur les fonctions biologiques des PN de patients BPCO stables et inexistants sur les fonctions des PN de patients BPCO exacerbés. Cette diminution du récepteur S-Gal chez les patients BPCO et en particulier au cours des phases d‟exacerbation pourraient être considéré comme un mécanisme bénéfique limitant l‟infiltrat inflammatoire lié au PN et la production excessive de cytokines pro-inflammatoires. 122 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features Article 2 Elastin peptides influence the differentiation of human dendritic cells with tolerogenic features 123 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features Les cellules dendritiques (CD) sont les cellules clés du développement de la réponse immunitaire adaptative. Ce sont elles qui exercent un rôle de sentinelle au niveau tissulaire au travers de leur capacité à distinguer les antigènes du soi des antigènes potentiellement pathogènes. A la suite de la capture de l‟antigène, les CD vont initier une réponse inflammatoire puis migrer vers les organes lymphoïdes secondaires où elles présentent l‟antigène aux lymphocytes T (LT) ce qui permet la mise en place d‟une réponse immunitaire spécifique de l‟antigène. C‟est lors de cette migration que les CD acquièrent leur état mature. Cette étape de maturation est essentielle car elle permet aux CD de se trouver dans une conformation phénotypique adéquate pour présenter efficacement l‟antigène aux LT. C‟est à la suite de cette présentation que se fera l‟orientation de la réponse LT (Th1, Th2 ou Treg) qui caractérisera la réponse immunitaire spécifique de l‟antigène et donc spécifique de l‟agent pathogène qui l‟a initiée. Les PE sont capables de réguler de nombreuses fonctions des cellules immunitaires. Nous avons montré dans le premier article présenté dans ce manuscrit de thèse que les PE modulaient la réponse immunitaire innée en régulant les fonctions biologiques des PN. Par ailleurs, des travaux précédents réalisés dans notre laboratoire nous ont permis de montrer que les PE sont également capables de polariser la réponse lymphocytaire T et de contrôler la production de cytokines pro-inflammatoires par les monocytes. Enfin, des données de la littérature montrent que d‟autres peptides, également issus de la dégradation de la matrice extracellulaire, régulent les fonctions des CD et en particulier leur capacité de maturation. Sur la base de ces données, nous avons étudié la capacité des PE à influencer les fonctions biologiques effectrices des CD. 124 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features Les principaux résultats obtenus au cours de cette étude sont les suivants : 1/ Les PE ont un effet chimio-attractant vis-à-vis des CD. Cet effet met en jeu l‟interaction des PE avec le récepteur S-Gal exprimé à la surface des cellules. 2/ Les PE n‟induisent pas la maturation des CD et n‟influencent pas la maturation des CD induite par le LPS. 3/ Les PE présents dans l‟environnement des CD favorisent l‟orientation des cellules vers un profil de type tolérogénique caractérisé au niveau des ARNm et au niveau protéique par une augmentation de la production d‟IL-10, d‟IFN-α, de TGF-β et d‟IDO intracellulaire et par une augmentation du niveau d‟expression membranaire d‟ILT-3. 4/ Les PE n‟altèrent pas la capacité des CD à induire la prolifération de lymphocytes T autologues mais polarisent la réponse lymphocytaire T vers une réponse T régulatrice. L‟ensemble de ces résultats à fait l‟objet de la rédaction d‟un article qui sera soumis soumis dans "The Journal of Immunology" et qui est présenté ci-après. 125 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features Elastin peptides promote the differentiation of human dendritic cells with tolerogenic features Aurélie Dupont,* ¥ Thomas Baranek,* ¥ Valérie Gafa, * Moncef Guenounou,* Frank Antonicelli,†and Richard Le Naour2* * EA4303 "Inflammation et Immunité de l‟Epithélium Respiratoire", IFR53, Université de Reims Champagne-Ardenne, Reims, France † ¥ UMR6237, IFR53, Université de Reims Champagne-Ardenne, Reims, France These two authors equally contributed to this work Running Title: Elastin peptides promote dendritic cells towards tolerogenic state Keywords: Dendritic Cells, Antigens/Peptides/Epitopes, Cytokines, Cell Differentiation, Tolerance/Suppression/Anergy 126 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features Abstract Dendritic cells (DC) are central in the immune system to drive immune response or tolerance to antigens. Knowing that elastin peptides (EP) generated by proteolysis of elastic fibers exert regulatory properties on inflammatory and immune cells such as monocytes and lymphocytes, we here investigated whether EP might also modulate the biological properties of DC. We evidenced that EP up-regulated the migration of monocyte-derived immature DC (imDC). This effect was found to be mediated by elastin receptor (spliced galactosidase) occupancy, as being suppressed by lactose. Besides, EP neither promoted imDC maturation nor influenced the phenotypic transformation of LPS-activated imDC into mature DC (mDC). However, we showed that EP differentially regulate, both at the mRNA and protein levels, the expression of the inflammatory associated cytokines IL-10 and IL-12 in LPS-activated imDC, as IL-10 production was increased while IL-12 decreased. This EP-induced immunosuppressive effect was further observed with two others suppressive cytokines (IFN-a and TGF-involved in peripheral T cell tolerance. Meanwhile, we also found that supplementation of imDC maturation medium with EP induced an over-expression of IDO, an enzyme involved in the tolerance state of cells. Concomitantly, EP inhibited the down-regulation of the toleranceinducing molecule ILT-3 induced by LPS treatment of imDC. Finally, we evidenced that EP did not influence T cell proliferation but induced CD25 + and FoxP3+ regulatory CD4+ T cells. Altogether, these data demonstrated that presence of EP during imDC differentiation resulted in a generation of tolerogenic DC. Then, this study is the first to demonstrate the role elastin peptides in the induction of tolerance, notably by inducing regulatory T-lymphocytes. 127 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features Introduction An essential hallmark of the immune system relies in its ability to recognize and eliminate foreign antigens while not responding to self-antigens. This capacity of unresponsiveness to certain antigens, called tolerance, is driven by various mechanisms including peripheral tolerance (1). Dendritic cells (DC)3, the most potent antigen presentation cells, are main actors leading to either immune stimulation or tolerance depending on the maturation state of this cells (2,3). Immature DC (imDC), located in peripheral tissues, are specialized in sensing and capturing antigens but are unable to efficiently present these antigens to T-cells (4). Upon microbial products activation and/or pro-inflammatory cytokines stimulation, imDC undergo a maturation process leading to the up-regulation of co-stimulatory molecules and chemokine receptor surface expression (4,5). These properties allow imDC to prime naive antigen specific T-cells into lymphoid organs. In steady-state conditions imDC capture apoptotic cells and self-antigens from the environment, and can induced T-cell anergy or the generation of regulatory T-cell leading to tolerance (6,7). Induction of this tolerance is characterized by the production or expression of tolerance-inducing molecules such as IL-10 (8,9), IDO (10) and immunoglobulin-like transcript (ILT)-3 (11) by tolerogenic DC. Physio-pathological degradation of extracellular matrix (ECM) by matrix metalloproteinases (MMP) is an important source of self-issued peptides, of which some called “matrikines” display several biological activities. It has already been shown that some of these ECM-derived peptides orientate DC functions and maturation to induce either immunity or tolerance. For instances, hyaluronic acid promotes differentiation of imDC (12) and osteopontin induces a phenotypic and functional maturation of human DC (13). 128 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features Conversely, thrombospondin-1, a potent anti-inflammatory protein, is a negative regulator of DC activation and contributes to the tolerogenic functions of DC (14). Elastin, which provides elasticity to various tissues (15), was reported as an important source of “matrikines” in normal and pathologic connective tissues. Among peptides derived from elastin hydrolysis by elastases, some are particularly implicated in cell regulation. This is particularly observed with the hexapeptide VGVAPG, a sequence repeated several times in the elastin monomer which defines the receptor binding site on tropoelastin (16). It was shown that VGVAPG through its interaction with the elastin receptor S-Gal (17-19) exhibit biological activities such as i) chemotactic activity for monocytes, fibroblasts and tumour cells (20,21) and ii) up-regulation of MMP-1 and MMP-2 expressions in fibroblastic and cancer cells (22-24). In previous studies, we showed the ability of VGVAPG to orientate cytokine expression in human lymphocytes towards a Th-1 profile (25) and to inhibit pro-inflammatory cytokine production in LPS-stimulated human monocytes (26). Taken into account our own data, which highlighted the role of elastin-derived peptides (EP) on the regulation of immune and inflammatory cells and other studies that involved other ECM-derived peptides in the orientation of DC functions, we here hypothesized that EP, through their VGVAPG domain, could modulate the biological properties of imDC. In this line, we evidenced that EP induced chemo-attraction of human imDC through interaction with its receptor. Additionally, we demonstrated that EP could affect the LPS-induced imDC differentiation, thus contributing to the development of DC exhibiting a tolerogenic pattern. In this line, we also found that EP favour the conversion of CD4+CD25− T cells from healthy subjects into a regulatory T cells phenotype expressing CD4+CD25+ FoxP3+ following cell contact with LPS-induced mDC. 129 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features Materials and Methods Reagents LPS from E. coli 0111:B4, VGVAPG, mitomycin C, and lactose were purchased from SigmaAldrich. LymphoprepTM medium was obtained from Axis-Shield. The scrambled VVGPGA peptide, not found in tropoelastin sequence, was synthesized by GENEPEP. RPMI 1640 medium, FCS, L-glutamine, penicillin, streptomycin, PBS, ethidium bromide, reverse transcriptase, and all primers and probes were obtained from Invitrogen. Recombinant human GM-CSF (rhGM-CSF), rhIL-4, rhIL-2 and rhRANTES were obtained from ImmunoTools. SYBR Green for real-time RT-PCR was purchased from Eurogentec. Mouse FITC-conjugated anti-human CD14 (IgG2a, clone M5E2), mouse FITC-conjugated anti-human CD1a (IgG1, clone H1149), mouse FITC-conjugated anti-human CD2 (IgG2a, clone S5.2), mouse FITCconjugated anti-human immunoglobulin-like transcript-3 (ILT-3) (IgG1, clone 2331), mouse FITC-conjugated anti-human CD25 (IgG1, clone M-A251), mouse PE-conjugated antihuman CD3 (IgG2a, clone HIT3a), mouse PE-conjugated anti-human CD83 (IgG1, clone HB15e), mouse PE-conjugated anti-human CD86 (IgG1, clone 2331), mouse FITCconjugated anti-human FoxP3 (IgG1, clone 259D/C7), mouse Allophycocyanin (APC)conjugated anti-human CD4 (IgG1, clone RPA-T4) and corresponding isotype controls were from BD Biosciences. Rabbit anti-human IDO polyclonal antibody and AlexaFluor 488conjugated anti-rabbit IgG was provided by Chemicon and Molecular probes, respectively. Human Pan T cell Isolation Kit II and CD14 microbeads were purchased from Miltenyi Biotech. Elastin-FITC was obtained from Elastin Products Company. Isolation of human monocytes and lymphocytes and generation of immature dendritic cells Human peripheral blood monocytes and lymphocytes were obtained under sterile and endotoxin-free conditions by counter-current centrifugal elutriation (service of haematology, 130 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features Reims Hospital) from heparinized venous blood of healthy consenting donors, after protocol approval by the Ethical Committee of Reims Hospital. Monocytes obtained from the appropriated fraction of elutriation were then purified by means of a magnetic-activated cell sorting using CD14 microbeads. Immature DC (imDC) were induced by culturing purified monocytes (1 x 106/ml) for 5 days in 24-well culture plates at 37°C in 5% CO2 and in RPMI 1640 medium containing L-glutamine (2 mM), penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 µg/ml), 15% heat-inactivated FCS, 800 U/ml rhGM-CSF and 500 U/ml rhIL-4 (DC medium). In some experiments, autologous lymphocytes obtained from the appropriated fraction of elutriation were purified by Ficoll density gradient centrifugation using Lymphoprep TM (density: 1.077 g/ml). Then, the CD4+ T lymphocyte sub-population was purified using a FACSAria cell sorter (BD Biosciences). Purity of monocytes, imDC and CD4+ T cells were shown to be > 98% by flow cytometry analysis (see below) and cell viability was over 95% as determined by trypan blue exclusion (data not shown). Isolation of umbilical cord blood mononuclear cells Umbilical cord blood was obtained from the umbilical vein of uncomplicated full-term deliveries (service of maternity, Reims Hospital), after protocol approval by the Ethical Committee of Reims Hospital. Cord blood mononuclear cells (CBMC) were isolated by density gradient centrifugation (Lymphoprep) of cord blood and naive T cells were purified from CBMC by using a Pan T-cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotech). Purity of T lymphocyte was > 95 % as assessed by flow cytometry using human CD2 antibody (data not shown). Experimental design We first studied the migratory properties of imDC in response to VGVAPG using a Boyden chamber method. Then, the expression of the elastin receptor S-gal by imDC was determined at the mRNA and membrane level by RT-PCR and flow cytometry analysis, respectively. The 131 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features influence of the VGVAPG/elastin receptor interaction on the migration of imDC was appreciated after pre-treatment of cells with 10 mM lactose, a galactosugar known to induce the shedding of S-gal from the cell surface (27). Thereafter, imDC (1 x 106/ml) were cultured for 2 days in 24-well culture plates at 37°C in 5% CO2 in the DC medium supplemented with LPS (1 µg/ml) to obtain mature DC. In some experiments of maturation, LPS was replaced by VGVAPG (10 µg/ml) or imDC were treated with LPS (1 µg/ml) in the presence of VGVAPG (10 µg/ml). Following 2 days incubation, phenotypic maturation of DC was determined by flow cytometry analysis of CD14, CD1a, CD86 and CD83 surface expression. In one set of experiments, 8 h after treatment of imDC with LPS (in the presence or not of VGVAPG) cells were collected for total RNA extraction and IL-10, IL-12 or IDO mRNA expression was analyzed by real-time RT-PCR. At various time points (8, 24, 48 h) cell culture supernatants were harvested for quantification of IL-10, IL-12, IFN-a and TGF- levels by ELISA. Cells were also collected for surface ILT-3 or intracellular IDO staining. Finally, we studied the influence of VGVAPG on the biological functions of LPS-induced mature DC by analyzing autologous CD4+ T cells proliferation and the surface expression of CD25 and FoxP3 by naive T cells. ImDC chemotaxis assay Chemotactic activity of imDC was determined using a modified Boyden chamber method as previously described (28). Briefly, 27 µl of RANTES (0.1 µg/ml) or VGVAPG (0.1 to 10 µg/ml) or VVGPGA (0.1 µg/ml) diluted in RPMI 1640 was added to the lower wells of a 48well Boyden chamber (Neuroprobe) and covered with a polycarbonate filter (8 µm pore size, Nucleopore). Fifty microliters of imDC suspension (1 x 106 cells/ml) were then added to the upper wells of the chamber and incubated 60 min at 37°C in 5% CO 2. Non migrating cells, in the upper part of the Boyden chamber, were carefully washed and the filter was recovered, 132 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features fixed and stained with eosin and bromophenol blue (RAL kit, Réactifs RAL, France). Migrating cells, in the lower part of the filter, were counted by microscopy in five randomly selected high-power (40 x) fields per well. The experiments were performed in triplicate and results are reported as the mean number of cells per field. Real-time RT-PCR analysis Total RNA was extracted from 2 x 106 imDC MasterPurTM RNA Purification Kit (Tebu-bio, Le Perray en Yvelines, France) in accordance with the manufacturer‟s technical data sheets. Then, 1 µg of total RNA was reverse transcribed into cDNA with a reverse transcriptase using SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen Life Technologies, Cergy Pontoise, France) as described previously (29). After reverse transcription, the cDNA product was amplified in real-time PCR. Using this approach, the mRNA levels for S-Gal, IL-10, IL-12 and IDO were determined with the 7000 sequence detection system ABI Prism sequence detector (Applied Biosystems, Foster City, USA), using the double-strand-specific SYBR Green (Applied Biosystems) dye system. All reactions were performed according to the following thermal profile: denaturation at 95°C for 15 seconds, annealing and extension at 60°C for 1 min (data collection was performed during the annealing/extension step). Data analysis was performed with the SDS software (Applied Biosystems). The amount of the target gene mRNA was calculated relative to the -actin gene mRNA and an internal control (2-∆∆Ct, where ∆ is change and Ct is the cycle threshold). Flow cytometric analysis Analysis of the surface markers expressed on human monocyte, imDC or mature DC was determined in non-permeabilized cells (5 x 105) incubated with either FITC-conjugated antihuman CD14, FITC-conjugated anti-CD1a, PE-conjugated anti-CD83, PE-conjugated anti-CD86 or FITC-conjugated anti-ILT-3 mAb at room temperature for 20 min in the dark to prevent 133 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features fluorescence quenching. Then, cells were washed twice in PBS. Following two successive centrifugations (500 g, 10 min), cell pellets were resuspended in 500 µl PBS containing 1% PFA, and stored in the dark at 4°C until analysis. In parallel, isotype-matched controls were used to determine non-specific labeling. Flow cytometry analysis was performed with a FACSCaliburTM Instrument (BD Biosciences). For intracellular IDO expression analysis, brefeldin A (5 µg/ml) was added to the DC medium (30). Cells were resuspended successively in 500 µl FACS lysing and 500 µl FACS permeabilizing solution for 10 min each and then stained with 5 µg/ml anti-human IDO antibody at room temperature for 30 min. Cells were then washed twice, and further incubated for 1 h at room temperature in the dark with a secondary anti-rabbit Ab coupled to AlexaFluor 488 fluorochrome. Following two successive centrifugations (500 g, 10 min), pellets were resuspended in 500 µl PBS containing 1% PFA, and stored in the dark at 4°C until FACS analysis. For intracellular determination of CD25 and FoxP3 expression by naive T cells co-cultured with DC, cells were double-stained with anti-CD3 and anti-CD4 before permeabilization and then intracellularly stained with CD25 and FoxP3 monoclonal antibodies as above described. CD4+ T cells were distinguished from DC by drawing a gate on CD3 +CD4+ T cell events. Thereafter, a gate was applied on CD4+CD25+ or CD4+FoxP3+T cell population. In some experiments, Elastin binding on human imDC was determined following 20 min incubation of cells with 10 µg/ml of Elastin-FITC. Detection of cytokine concentration Determination of IL-12p70, IL-10, IFN-a and TGF- in cell culture supernatants was performed in duplicate using commercially available high-sensitivity ELISA kit (Quantikine, RD Systems) according to the manufacturer‟s instructions. The sensitivity of each ELISA 134 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features kits was 5 pg/ml, 3.9 pg/ml, 7 pg/ml and 15.4 pg/ml for IL-1p70, IL-10, IFN-a and TGF- respectively. CD4+ T cells sorting and culture Autologous PBMC (1 x 106/ml) were cultured for 6 days at 37 °C in 5 % CO2 in RPMI 1640 medium containing L-glutamine (2 mM), penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 µg/ml), 10% heat-inactivated FCS, and rhIL-2 (40 U/ml) (complete medium). Then, PBMC were stained with both PE-conjugated anti-CD3 and FITC-conjugated anti-CD4 antibodies as above described. In parallel, isotype-matched controls were used to determine non-specific labeling. Dead cells were excluded from cytometric analysis by DAPI staining. Cell sorting was performed with a FACSAria cell sorter (BD Biosciences). The mean purity of the sorted cells was always more than 99%. Isolated CD3+CD4+ T cells (1 x 106/ml) were cultured at 37 °C in 5 % CO2 in complete medium for 1 day. For experiments, cell viability was over 95% as determined by trypan blue exclusion. CD4+ T lymphocyte proliferation assay CD4+ T lymphocyte proliferation assays were performed as previously described (31). Briefly, imDC were treated with LPS (1 µg/ml) during 2 days in the presence or not of VGVAPG (10 µg/ml) or scrambled peptide (VVGPGA, 10 µg/ml). Then medium was discarded and cells were treated with 50 µg/ml mitomycin C for 45 min at 37°C and washed extensively. Purified autologous CD3+CD4+ T lymphocytes (1 x 105/well) were then added and co-cultured for 6 days. The last 16 h of incubation, 0.5 µCi [ 3H]thymidine was added to each well. Incorporation assays were performed in quadruplicate and the amount of radioactivity incorporated into CD3+CD4+ T lymphocyte DNA was counted on a liquid scintillation counter (Packard, Meriden, CT). Results were expressed as count per minute (cpm) values corrected for spontaneous incorporation of [3H]thymidine into CD4+ T cells. 135 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features CD25 and FoxP3 expression by naive T cells ImDC were cultured in 24–well plates and treated with LPS (1 µg/ml) during 2 days in the presence or not of VGVAPG (10 µg/ml) or scrambled peptide (VVGPGA, 10 µg/ml). Naive T cells obtained from umbilical cord blood were added at a 1:20 DC/T cell ratio and cocultured for 6 days. The last 4 h of incubation, co-cultures were treated with brefeldin A (5 µg/ml). Then, mixed cells were collected, washed and analyzed for surface expression of CD25 and intracellular expression of FoxP3 by CD4+ T cells. Statistical analysis Statistical analysis was performed using a Wilcoxon nonparametric test. p values of less than 0.05 were considered to be statistically significant. 136 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features Results EP induce chemo-attraction of human imDC via the elastin receptor S-Gal In keeping with the chemotactic activity of EP on various cell types (32-34), we first investigated whether EP, i.e. VGVAPG, could induce migration of imDC. To that end, human monocyte-derived imDC were generated and Boyden chamber assays were used to test the in vitro effects of VGVAPG (0.1, 1 and 10 µg/mL) on cells migration. In agreement with previous reports (35,36), RANTES (0.1 µg/mL) used as positive control strongly increased migration of imDC compared to media only (Fig. 1A). VGVAPG at concentration of 0.1 and 1 µg/mL also enhanced the chemotactic migration of imDC (p<0.05), whereas no significant chemotactic response was detected with 10 µg/mL VGVAPG nor with the scrambled peptide VVGPAG (0.1 µg/mL) (Fig. 1A). We then examined the role of VGVAPG/elastin receptor (S-gal) interaction in mediating the effects of EP on imDC migration. In this line, we first focused on the expression of S-Gal. We found that the constitutive S-Gal mRNA expression in imDC was not modified by EP treatment when compared with autologous monocytes (Fig. 1B). The expression of S-gal protein on imDC surface was then confirmed by flow cytometry analysis using FITC labelled-elastin (Fig. 1C). Specificity of elastin binding onto its receptor was demonstrated using a pretreatment with 10 mM lactose that decreased FITC-elastin signal. Statistical significance of this result was further confirmed using four different donors (Fig. 1D). The involvement of S-gal in elastin-induced imDC migration was finally demonstrated using VGVAPG, the minimal peptide motif binding to the elastin receptor Sgal. This effect was also inhibited by lactose pre-treatment (Fig. 1E). 137 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features FIGURE 1 A * * Number of migrated imDC 60 B * Ladder (pb) 50 * H2 O Monocytes ImDC 200 40 S-gal mRNA (114 pb) 100 30 500 20 -actin mRNA 400 10 0 RPMI RANTES 0.1 1 10 VVGPGA VGVAPG (µg/mL) E * 101 102 103 Elastin-FITC 104 Mean fluorescence intensity 40 60 80 100 120 * 0 100 D 250 200 150 100 50 0 Isotype Untreated Lactose-treated control imDC imDC 60 Number of migrated imDC Isotype control Untreated imDC Lactose -treated imDC 20 Cell count C 50 * Control Lactose 40 30 20 10 0 RPMI RANTES VGVAPG FIGURE 1. EP induce chemo-attraction of human imDC through interaction with elastine receptor SGal. A, Human imDC were added in the upper wells of a 48-well Boyden chamber and their migration was studied for 1 h in response to increasing concentrations of VGVAPG (0.1, 1 and 10 µg/ml) added in the lower wells of the system. RANTES (0.1 µg/ml) and the scrambled VVGPGA peptide (0.1 µg/ml), not found in tropoelastin sequence, were used as positive and negative control, respectively. Data are representative of six independent experiments.*, p<0.05 using a Wilcoxon nonparametric test. B, Human monocytes and imDC total RNA were extracted and S-gal and -actin mRNA expression were determined by RT-PCR analysis. Data are representative of three independent experiments. C, Human imDC were pre-incubated or not with lactose (10 mM) for 3 h, and then were treated 30 min with elastin-FITC (10 µg/ml) before analysis by flow cytometry method. Data are representative of six independent experiments. D, Statistical analysis of results obtained from the six independent experiments studying elastin-FITC staining on imDC pre-treated or not with lactose was performed using a Wilcoxon nonparametric test. Data are expressed as mean fluorescence intensity.*, p<0.05. E. Human imDC were pretreated or not with lactose (10 mM) for 3 h and then cellular migration was analyzed in response to 0.1 µg/ml of VGVAPG in a Boyden chamber as described above. RANTES (0.1 µg/ml) was use as positive control. Data are representative of six independent experiments.*, p<0.05 using a Wilcoxon nonparametric test. 138 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features EP do not interfere with imDC maturation To further investigate the EP-mediated effects on the biological function of imDC, we first analyzed whether VGVAPG could induce maturation of imDC. To that purpose, human monocytes (Fig. 2A) were cultured for five days in the presence of GM-CSF (800 U/mL) and IL-4 (500 U/mL) to obtained imDC as phenotypically confirmed by flow cytometry analysis of CD14, CD1a, CD86 and CD83 surface expression (Fig. 2B). Then, imDC were cultured for two days with GM-CSF and IL-4 in the presence of either VGVAPG (10 µg/mL) or LPS (1 µg/mL) used as a positive control of DC maturation (mDC). As expected, LPS clearly induced the maturation of imDC, demonstrated through the up-regulation of CD86 and CD83 expression and the down-expression of CD1a (Fig. 2C). In contrast, treatment with VGVAPG did not induce in vitro maturation of imDC (Fig. 2D). It is widely accepted that microbial infection, which is a potent activator mechanism of DC maturation, is concomitant with important elastinolytic activity (37). Thus, to further analyze the influence of EP on DC maturation, we next examined whether VGVAPG could interfere with LPS-induced DC maturation. To that purpose, imDC were generated (Fig. 3A) and activated for two days with LPS (1 µg/mL) in the presence or not of VGVAPG (10 µg/mL) (Fig. 3B and 3C). Then, CD14, CD1a, CD86 and CD83 expressions were determined by flow cytometry analysis. Results displayed in figure 3C showed that co-treatment with VGVAPG did not affect LPSinduced imDC maturation (Fig. 3B). 139 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features FIGURE 2 Isotype control Specific antibodies A CD1a CD86 99 % CD83 1% 93 % 0.05 % Monocytes 0 Cell count 30 60 90 120 150 CD14 10 0 10 1 10 2 10 4 10 0 10 3 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 Relative fluorescence intensity (Log) GM-CSF + IL-4 5 days CD14 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Cell count B CD1a 1% CD86 95 % CD83 35% 0% ImDC 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 Relative fluorescence intensity (Log) GM-CSF + IL-4 2 days + LPS or VGVAPG 60 70 80 5060 4050 3040 2030 00 10 20 CD14 CD1a 2% CD86 65 % CD83 99 % 98 % mDC 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 D : VGVAPG 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Cell count C : LPS 1% 97 % 39 % 1% ImDC 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 Relative fluorescence intensity (Log) FIGURE 2. EP fail to induce imDC maturation. Human monocytes isolated by counter-current centrifugal elutriation and magnetic cell sorting were cultured 5 days in the presence of rhGM-CSF (800 U/mL) and rhIL-4 (500 U/mL) to obtain imDC. ImDC were then treated during 48 h either with VGVAPG (10 µg/ml) or with LPS (1 µg/ml) used as positive control of maturation. CD14, CD1a, CD83, and CD86 expression was determined by flow cytometry analysis in monocytes (A), in imDC obtained following treatment of monocytes with rhGM-CSF and rhIL-4 (B), in LPS-treated imDC (C), and in VGVAPG-treated imDC (D). In all histograms, blue curves present the relative 140 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features fluorescence intensity obtained with specific antibodies and green curves present that obtained with isotype-matched controls. Percentage of positive cells was reported in each representation. All data are representative of three independent experiments. FIGURE 3 Isotype control Specific antibodies A 20 40 60 80 100 CD1a 0% CD86 93 % CD83 42 % 0% ImDC 0 Cell count CD14 10 0 10 1 10 2 10 3 10 410 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 Relative fluorescence intensity (Log) LPS VGVAPG 2 days B: LPS alone 20 40 60 80 100 CD1a 0% CD86 52 % CD83 98% 92 % mDC 0 Cell count CD14 10 0 10 1 10 2 10 3 10 410 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 20 40 60 80 100 C : LPS + VGVAPG 0% 61 % 94 % 99 % 0 mDC 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 Relative fluorescence intensity (Log) FIGURE 3. EP fail to modulate LPS-induced transformation of imDC into mature DC. Human imDC were treated with LPS (1 µg/ml, positive control of maturation) in the presence or not of VGVAPG (10 µg/ml). CD14, CD1a, CD83, and CD86 expression was determined by flow cytometry analysis in imDC (A), in LPS-treated imDC (B), and in imDC treated with LPS in the presence of VGVAPG (C). In all histograms, blue curves present the relative fluorescence intensity obtained with specific antibodies and green curves present that obtained with isotype-matched controls. Percentage of positive cells was reported in each representation. All data are representative of three independent experiments. 141 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features EP modulate cytokine production in imDC We then investigated whether VGVAPG modified cytokine expression from both imDC and LPS-stimulated imDC. To that purpose, the production of pro-inflammatory (IL-12) and antiinflammatory (IL-10) cytokines was determined at the mRNA and protein level from each cell lot cultured in the presence or not of VGVAPG. In imDC, VGVAPG induced IL-10 mRNA and protein, whereas no significant effects were observed on IL-12 expression as compared with untreated cells and with cells stimulated with the scramble control peptide VVGPGA (Fig 4 A and 4B). LPS treatment increased both IL-10 and IL-12 expression in imDC (Fig 4 A and 4B). In such stimulated cells, VGVAPG enhanced IL-10 expression, whereas it decreased IL-12 mRNA (Fig 4A). Kinetic analysis of the combined effects revealed that increased of IL10 protein occurred from the earlier time point analyzed (8 h), whereas inhibition of IL-12 protein secretion was delayed to 24 hours (Fig 4B). The specificity of VGVAPG on cytokine variation in LPS-stimulated imDC was also confirmed using the control peptide VVGPGA. To define the influence S-Gal in the regulation of these cytokines, cells were pre-treated with lactose (Fig 4C). As expected, neither IL-10 nor IL-12 expression in LPS-stimulated imDC were altered by lactose pretreatment. Conversely, up- and down-regulation of these cytokines in LPS-stimulated imDC co-treated with VGVAPG were abrogated by S-gal scavenging with lactose. However, lactose pretreatment did not affect IL-10 expression induced by VGVAPV in non-stimulated imDC. 142 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features FIGURE 4 A IL-10 IL-12 NS * 2.00 1.50 1.00 * * 0.50 0.00 NS 2.50 - B 1.50 1.00 * 0.50 ND ND LPS VGVAPG VVGPGA + - + * 2.00 Cytokine mRNA Cytokine mRNA 2.50 * 0.00 + - ND ND + - + - LPS VGVAPG VVGPGA + + + + - 8h 24 h 48 h IL-10 + - + + - + + IL-12 NS * * 2500 Cytokine concentrations (pg/mL) Cytokine concentrations (pg/mL) NS 2000 1500 1000 500 * * ND 0 LPS VGVAPG VVGPGA ND - + - + + + - + - C + + NS 2500 2000 1500 1000 500 0 LPS VGVAPG VVGPGA ND ND ND - + - + Control Lactose IL-10 + + - + - + + IL-12 Cytokine concentration (pg/mL) Cytokine concentration (pg/mL) * 2500 NS 2000 1500 1000 NS 500 0 LPS VGVAPG ND - * 2000 1500 1000 500 0 + + - + + NS 2500 LPS VGVAPG NS ND - + + - + + FIGURE 4. Involvement of S-gal receptor in LPS-induced inflammatory cytokine regulation by EP. Human imDC were cultured or not with LPS (1 µg/ml) in the presence or not of VGVAPG (10 µg/ml) or VVGPGA (10 µg/ml, scrambled peptide). A, eight hours after incubation, total RNA was extracted and IL-10 and IL-12 mRNA expressions were determined by real-time RT-PCR analysis. Data are representative of six independent experiments (ND: not detected, NS: not significant).*, p<0.05 using a Wilcoxon nonparametric test. B, eight, 24, and 48 h after incubation, IL-10 and IL-12 secretions were determined in the cell culture supernatants by ELISA. Data are representative of six independent experiments (ND: not detected, NS: not significant).*, p<0.05 using a Wilcoxon nonparametric test. C, Human imDC were pre-incubated or not during 3 h with lactose (10 mM) and then treated with LPS (1 µg/ml) in the presence or not of VGVAPG (10 µg/ml). Twenty four hours after incubation, cell culture supernatants were collected to evaluate IL-10 and Il-12 secretion. Data are representative of six independent experiments (ND: not detected, NS: not significant).*, p<0.05 using a Wilcoxon nonparametric test. 143 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features EP polarize imDC towards tolerogenic DC To define whether the EP-enhanced effects on LPS-induced IL-10 expression was also observed with others suppressive cytokines, culture supernatants were also analyzed for detection IFN-a and TGF-. ELISA analysis revealed that co-treatment with VGVAPG upregulated the secretion of IFN-a and TGF- induced by LPS, whereas VGVAPG alone had no significant effects (Fig. 5A). Because cytokines such as IL-10 and TGF- are suppressive cytokines and tolerance-inducing molecules involved in the negative regulation of the immune system (9), we wondered whether a co-treatment with VGVAPG may orientate LPSinduced mDC toward a tolerant state. To that purpose, we investigated the expression of the tolerogenic markers IDO (10) and ILT-3 (11). RT-PCR analysis revealed that untreated imDC expressed detectable levels of IDO (Fig. 5B) and that LPS treatment of these cells led to a drastic down-regulation of IDO mRNA. Conversely, co-treatment of imDC with LPS and VGVAPG led to a significant increase of IDO mRNA level (Fig. 5B). Accordingly, flow cytometry experiments showed that the constitutive expression of intracellular IDO protein by imDC (Fig. 5C, yellow curve) was highly decreased in LPS-activated cells (Fig. 5C, blue curve), whereas the presence of VGVAPG in the co-incubation medium enhanced IDO expression (Fig. 5C, green curve versus yellow curve). These reverse effects were not reproduced by a co-treatment with the control peptide VVGPGA. We also analyzed whether co-treatment with LPS displayed any influence on the expression of the cell surface marker, ILT-3. Flow cytometry analysis revealed that untreated imDC expressed detectable levels of ILT-3 (Fig. 5D, yellow curves) and that activation of cells with LPS decreased ILT-3 expression (Fig. 5D, blue curve). Co-treatment of LPS-stimulated DC with VGVAPG counteracts the reduction of ILT-3 expression induced by LPS alone (Fig. 5D, green curve versus blue curve). 144 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features FIGURE 5 A IFN-a TGF- * 2000 1500 1000 500 NS ND 0 - LPS VGVAPG + + - 2500 Cytokine Concentrations (pg/mL) Cytokine Concentrations (pg/mL) 2500 * 2000 1500 1000 500 NS 0 LPS VGVAPG + + + + - 2.50 + + Isotype control ImDC LPS treated imDC VGVAPG co-treated imDC VVGPGA co-treated imDC C 100 B - IDO 80 * NS NS 60 20 1.00 40 1.50 Cell count IDO mRNA 2.00 0 0.50 0.00 LPS VGVAPG VVGPGA - + + - 100 + - + + - + + 101 102 103 104 Relative fluorescence intensity (Log) 100 D 40 60 Isotype control ImDC LPS treated imDC VGVAPG co-treated imDC VVGPGA co-treated imDC 0 20 Cell count 80 ILT-3 100 101 102 103 104 Relative fluorescence intensity (Log) FIGURE 5. EP polarize imDC towards tolerogenic dendritic cells. Human imDC were cultured or not with LPS (1 µg/ml) in the presence or not of VGVAPG (10 µg/ml) or VVGPGA (10 µg/ml, scrambled peptide). A, Twenty four hours after incubation, IFN-γ and TGF-β secretions in the cell culture supernatants were determined by ELISA. Data are representative of four independent experiments (ND: not detected, NS: not significant).*, p<0.05 using a Wilcoxon nonparametric test. B, eight hours after incubation, total ARN was extracted and IDO mRNA expression was determined by real-time RT-PCR. Data are representative of five independent experiments (NS: not significant).*, p<0.05 using a Wilcoxon nonparametric test. C. Twenty four hours after incubation, IDO intracellular expression was determined by flow cytometry analysis. Data are representative of three independent experiments. D, Twenty hours after incubation, ILT-3 expression at the cell surface was determined by flow cytometry analysis. Data are representative of three independent experiments. 145 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features EP favour tolerance through generation of CD4+ regulatory T cells Several mechanisms are responsible for the development of immune tolerance. We then investigated the ability of EP to modulate antigen presentation by DC to T cell (Fig 6A), and to promote generation of T cells with regulatory functions (Fig 6B). To that purpose, imDC were cultured for 2 days with LPS in the presence or not of VGVAPG, and then added to naive autologous T cells cultures. After 6 days of co-cultures, the antigen presentationassociated proliferation of CD4+ T cells was evaluated, and the expression of the regulatory markers CD25 and FoxP3 was determined by flow cytometry analysis. Activation of imDC with LPS led to the generation of mature DC, which significantly increased proliferation of autologous CD4+ T cell proliferation (Fig. 6A). Specificity of the DC/T cell interaction in the proliferation of CD4+ T cells was addressed using various DC/T cells ratios. Co-treatment of LPS-activated DC with VGVAPG or with the scrambled peptide VVGPGA did not alter the ability of mature DC to induce CD4+ T cell proliferation (Fig. 6A). In contrast, co-incubation of CD4+ naive T cells with LPS-activated DC in the presence of VGVAPG up-regulated both the expression of CD25 and FoxP3 by those lymphocytes (Fig. 6B). Generation of CD25+FoxP3+ regulatory T cells was only observed when cells were co-treated with both LPS and VGVAPG. 146 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features FIGURE 6 A DC/CD4+ T cells 1/20 [ 3 H] thymidine uptake (cpm) 14000 DC/CD4+ T cells 1/50 * * * DC/CD4+ T cells 1/100 12000 10000 * 8000 * * 6000 4000 NS NS 2000 0 LPS VGVAPG VVGPGA - + - - + - + + + - + - + B 70 50 Isotype control ImDC LPS treated imDC VGVAPG co-treated imDC FoxP3 30 40 50 60 30 VVGPGA co-treated imDC 10 20 20 0 0 10 Cell count 40 CD25 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 Relative fluorescence intensity (Log) FIGURE 6. EP do not alter T cell proliferation induces by LPS-treated imDC but promote generation of CD4+ T cell with regulatory functions. Human imDC were treated or not with LPS (1 µg/ml) for 48 h in the presence or not of VGVAPG (10 µg/ml) or VVGPGA (10 µg/ml, negative control). A, forty eight hours after incubation, cells were treated with mitomycin C, washed and co-incubated with purified autologous CD4+ T lymphocytes. Six days following co-culture, incorporation of [3H]thymidine into CD4+ T lymphocyte DNA of different CD/ CD4 + T cell ratio was determined by liquid scintillation counter. Data that are expressed as count per minute (cpm) are representative of three independent experiments (NS: not significant).*, p<0.05 using a Wilcoxon nonparametric test. B, Forty eight hours after incubation, cells were co-incubated with naive T cells from umbilical cord blood. Six days following co-culture, mixed cells were collected, washed and analyzed for surface expression of CD25 and intracellular expression of FoxP3 by CD4 + T cells. Data are representative of three independent experiments. 147 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features Discussion We initially hypothesized that the presence of EP in biological fluids or tissues of patients with manifestations of severe inflammatory pathologies might contribute to the regulation of the biological properties of DC. In this setting, we found that the interaction of the VGVAPG elastin peptide with its S-Gal elastin receptor expressed on the surface of DC modulated their biological functions. Furthermore, the effects resulting from this interaction was highly dependent on the level of S-Gal expressed by DC. Thus, to our knowledge it is the first time that the constitutive expression and the regulation of elastin receptor at the surface of monocyte-derived DC had been established. In this study we found that EP alter the biological functions of both imDC and mDC. We first evidenced that EP induced imDC migration, especially when EP were used at low concentration. This chemotactic effect of EP is in setting with a previous study described by Senior and colleagues on monocytes, who found an optimal chemotactic activity with 10-8M VGVAPG (38). EP are also chemotactic for neutrophils (data not shown) showing that these peptides have the potential to attract many cells types involved in the innate immune response. As previously demonstrated with neutrophils, the chemotactic effects of EP on imDC relied on the S-Gal expression on the surface of these cells. In this setting, we here demonstrated the constitutive expression of the S-Gal elastin receptor on imDC both at the mRNA and cell surface expression level, supporting a previous study that had demonstrated the presence of the S-gal elastin receptor on human imDC treated with VGVAPG but not in untreated cells (39). However, EP/S-Gal interaction did not participate to imDC maturation. Absence of regulation of CD1a, CD83 and CD86 on the surface of imDC upon VGVAPG activation clearly eliminated the direct EP implication on the maturation process. In keeping with the potential of some other matrix molecules, such as hyaluronic acid, osteopontin and 148 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features strombospondin to either up- or down-regulate DC activation (12,13,14), we also considered EP as potent mediators enable to interfere with DC maturation in an infectious context. Again, maturation of imDC with LPS was not affected by the presence of VGVAPG. This absence of response was not related to lack of interaction between EP and S-Gal, as in the same experimental conditions, the cytokine expression pattern was altered. Especially, we found that, in LPS-induced mDC, VGVAPG enhanced IL-10 production, whereas it antagonized the LPS effects on IL-12 expression. Abrogation of the regulatory effects of VGVAPG on cytokine expression in the presence of lactose confirmed the critical role of the EP/S-Gal interaction in specific cytokine profile in LPS-activated mDC. We already showed that EP, i.e. VGVAPG, have the potential to counteract pro-inflammatory cytokine expression in LPSstimulated human monocytes (26), but also to directly regulate cytokine expression upregulate such as the IL-1 pro-inflammatory cytokine in melanoma cells (40), and to polarize a Th-1 lymphocyte response (25). Interestingly, we showed that VGVAPG also favoured IFN-a and TGF-expression from mDC. Then, conversely to lymphocyte orientation, we here evidenced that EP orientate the cytokine response of LPS-activated mDC towards à Th-2 profile (IL-10, TGF-). These discrepancies might be related to differential environmental contexts in which EP stimulate their S-Gal receptor. Then, an integrative comprehensive model should be required to each specific disease to fully understand the impact of EPs on the immune response. Overall, our data i) add further insight into the biological effects of EP reinforcing their implication in the regulation of both innate and adaptive response, and ii) demonstrate, one more time, that biological effects of EP on cytokine regulation should take into account the cell type used. Presence of EP in the microenvironment of LPS-induced mDC enhanced the expression of IL-10, TGF- and IFN-a, three well-known suppressive cytokines that exert key roles in the 149 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features negative regulation of the immune response, notably as potent inducers of peripheral T cell tolerance (41,42). The inhibitory receptor ILT-3 was shown to be expressed on DC in a tolerogenic state and to inhibit T cell activation by cell to cell contact (11). In the present study, we found that the down-regulation of ILT-3 expression in LPS-activated mDC was inhibited when VGVAPG was added in the maturation medium. Another mechanism involved in DC-induced tolerance is linked to the expression of the gene encoding indoleamine 2,3dioxygenase (IDO), which metabolizes tryptophan, an important amino-acid whose absence prevents lymphocytes from proliferation (43). In accordance with the above results, we evidenced here that VGVAPG up-regulated IDO expression in LPS-activated mDC. Interestingly, EPs-induced ILT-3 and IDO expression was concomitant to the generation of CD4+ T cells with regulatory functions following antigen presentation by EP-primed DC. Various findings suggest that tolerogenic DC are cells characterized by impaired ability to synthesize high levels of Th-1-cell-driving cytokines (such as IL-12) (44), but have acquired ability to strongly express tolerance-inducing molecules such as IL-10 (45), IDO (46) and ILT-3 (11). Based on this description, our data strongly suggest that EP could be involved in the generation of DC with tolerogenic properties. While fully mature DC are resistant to IL-10 effects, it has been shown that exposure of immature DCs to IL-10 resulted in a reduced expression of co-stimulatory and MHC class II molecules and production of pro-inflammatory cytokines, and led to the development of adaptive regulatory T cells (47-50). In the present study, we demonstrated that in presence of EP, LPS-induced mDC are able to generate adaptive regulatory T cells from CD4+CD25− T cells issued from healthy autologous subjects, showing that EP deliver additional signals on DC during their maturation responsible for regulatory T-cell conversion. The mechanisms, by which EP dynamically re-orientates LPSinduced differentiation of imDC toward tolerogenic DC, remain to be elucidated. It has been shown that the transcription factor NF-B had a major role in DC maturation and Ag 150 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features presentation, and therefore played a key role in the generation of active mDC (51,52). In this setting, drugs interfering with NF-B activation enhance the capacity of imDC to induce antigen-specific tolerance (53). We previously showed that EP induced NF-B activation leading to IL-1 expression from melanoma cells, but that NF-B activation was abrogated when cells were co-treated with a pro-inflammatory mediator (40,26). Similarly, we also previously demonstrated that VGVAPG decreased the NF-B-DNA complex formation generated in monocytes treated with LPS (26). Interestingly, this NF-B down-regulation was also associated with an increased IL-10 expression in monocytes as it was also observed here in co-stimulated DC. It is known that such heterologous signal transduction required the activation of other signaling cascades. This signalling cascade interplay was supported by the fact that EPs enhanced IL-10 production, whereas they reduced IL-12 expression in LPSstimulated DC. MAPK and AP-1 pathways were also demonstrated to be necessary in the maturation process of DC (54,55). Because the various EP-mediated regulatory effects have been associated with the regulation of NF-B, MAPK and AP-1 transduction pathways in the different cell types analysed (26,40,56), it is tempting to speculate that EP could induce a heterologous desensitization mechanism for converting LPS-mediated DC maturation into DC with a tolerogenic pattern. Altogether, the results presented in the present study show that EP favour a Th2 cytokine profile in LPS-stimulated DC. This study also shows, for the first time to our knowledge, that EPs can convert CD4+CD25− T cells from healthy subjects into T cells expressing a regulatory phenotype. 151 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features Acknowledgments The authors would like to thank Pr Philippe Nguyen, Catherine Mace and the Etablissement de Transfusion Sanguine Nord-Est (France) for providing heparinized venous blood of healthy donors. Disclosures The authors have no financial conflict of interest 152 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features References 1. Steinman, R. M. and M. C. Nussenzweig. 2002. Avoiding horror autotoxicus: the importance of dendritic cells in peripheral T cell tolerance. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 99:351-358. 2. Lutz, M. B. and G. Schuler. 2002. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23:445-449. 3. 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Mol.Pharmacol. 67:1315-1324. 159 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features Footnotes 1 A. Dupont received grants for doctoral training from the Ministère de l‟Enseignement Supérieur et de la Recherche (Paris, France). 2 Address correspondence and reprint requests to Dr. Richard Le Naour, Laboratoire d‟Immunologie et de Microbiologie, IPCM, EA3796, IFR53, UFR de Pharmacie, 1 Rue du Maréchal Juin, 51096 Reims Cedex, France. E-mail address: [email protected] 3 Abbreviations used in this paper: EPs, elastin peptides; DC, dendritic cells; S-gal, spliced galactosidase; ILT-3, immunoglobulin-like transcript-3; IDO, indoleamine 2,3-dioxygenase.Les principaux résultats obtenus dans cette étude sont les suivants : 160 Article 2 : Elastin peptides influence the differentiation of hDC with tolerogenic features En conclusion, nous avons montré que les PE : 1/ sont capables d‟attirer les CD au niveau du site inflammatoire et/ou infectieux sans influencer la maturation des cellules induite par une activation antigénique. Cet effet des PE sur la migration des CD met en jeu le récepteur à l‟élastine S-Gal présent à la surface des cellules. 2/ orientent la réponse cytokinique des CD activées par le LPS vers un profil de type Th-2 et favorisent l‟émergence d‟un profil tolérogénique des CD. Ces effets régulateurs des PE sont médiés via l‟interaction PE/S-Gal et conduisent au développement d‟une réponse adaptative T régulatrice. L‟ensemble de ces résultats montre, pour la première fois, la capacité des PE à réguler les fonctions effectrices des cellules dendritiques. Plus précisément, ils démontrent la capacité des PE à conditionner les CD lors de leur maturation et de leur différenciation afin que ces cellules puissent délivrer des signaux leur permettant d‟orienter la réponse cellulaire T vers une réponse T régulatrice. 161 Discussion - Conclusion DISCUSSION GENERALE CONCLUSION 162 Discussion - Conclusion L‟organisme est soumis en permanence à de multiples agressions extérieures dont il se défend par le biais du système immunitaire qui établit un équilibre complexe entre discrimination du soi et élimination des antigènes potentiellement pathogènes (Manicassamy S. and Pulendran B., 2011). Cette balance met en jeu différents types de cellules immunitaires dont les fonctions sont dépendantes du microenvironnement. Dans le cadre de cette interaction cellules-microenvironnement, nous nous sommes intéressés au rôle des PE sur la régulation des cellules immunitaires en situation normale et en situation pathologique dans le contexte d‟une maladie pulmonaire, la BPCO. Dans une première étude, nous avons montré que les PE modulent la migration, la production de cytokines pro-inflammatoires, la phagocytose et la production de radicaux libres par les PN de sujets sains. Ces résultats sont en accord avec des travaux précédents réalisés dans notre laboratoire montrant que les PE modulent la production de cytokines par différents types cellulaires tels que les lymphocytes T et les monocytes (Debret R. et al, 2005 ; Baranek T. et al, 2007). Pris dans leur ensemble, ces résultats démontrent le rôle important des PE à la fois dans la régulation de l‟immunité innée et de l‟immunité adaptative. La capacité des PE à exercer cette régulation est dépendante de l‟expression du récepteur SGal à la surface des cellules immunitaires. Dans le contexte de la BPCO, nous avons montré que le caractère essentiel de l‟interaction PE/S-Gal est étroitement lié au niveau d‟expression du récepteur S-Gal à la surface des cellules. Ainsi, une diminution drastique de l‟expression de ce récepteur a été corrélée avec une perte des effets régulateurs des PE sur les fonctions des PN des patients BPCO en état d‟exacerbation. La moindre diminution du récepteur S-Gal à la surface des PN des patients BPCO à l‟état stable est associée à des effets plus marqués des PE. En outre, nous avons montré que cette diminution pouvait être orchestrée par les PE euxmêmes en fonction de leur concentration dans l‟environnement des cellules exprimant le récepteur. Un tel processus pourrait être retrouvé dans d‟autres pathologies touchant des tissus riches en élastine telles que les vaisseaux et la peau, et impliquant des cellules inflammatoires et/ou immunitaires. Au cours de la réponse immunitaire innée, la clairance des agents pathogènes est initiée par les propriétés de phagocytose des cellules immunes. Nous avons observé que les PN isolés de patients BPCO ont une plus grande capacité à phagocyter et à éliminer les agents pathogènes que les PN de donneurs sains. Ceci pourrait être associé à une pré-activation des PN en relation avec le contexte clinique. Dans ce cadre, nous avons montré que les PE 163 Discussion - Conclusion influencent les fonctions phagocytaires des PN et que ces effets sont bien dépendants du niveau d‟expression du récepteur S-Gal à la surface des cellules. Au cours de l‟immunité innée, le processus phagocytaire est également assuré par les CD immatures. Dans une deuxième étude, nous avons montré que les PE participent au recrutement des CD immatures au niveau du site inflammatoire suggérant ainsi le rôle, même indirect, des peptides dans l‟élimination des agents pathogènes. Ainsi, les PE jouent un rôle important au cours de la réponse innée au travers de leur capacité à recruter les PN et les CD immatures, comme nous l‟avons observé dans les deux études décrites dans ce manuscrit, mais également les monocytes comme cela a été décrit par RM. Senior et collaborateurs (Senior RM. et al, 1980). Les effets des PE sur la réponse immune ne sont pas restreints à la réponse immunitaire innée. Le déclenchement d‟un processus phagocytaire par les CD, faisant suite au contact des cellules avec un antigène étranger, initie l‟implication de ces cellules dans la réponse immune adaptative. Cette transition entre la réponse immune innée et adaptative est marquée par la maturation des CD. Ce processus se met en place progressivement au cours de la migration des cellules vers les organes lymphoïdes périphériques où elles présentent les antigènes apprêtés aux lymphocytes. Nous avons montré que les PE n‟influencent pas la maturation des CD et n‟interfèrent pas sur celle induite par le LPS. En revanche, les PE modulent l‟expression des cytokines produites par ces cellules. Cet effet régulateur oriente les CD vers un profil d‟expression cytokinique de type Th2 caractérisé par une diminution d‟IL12 associée à une augmentation d‟IL-10. Ces résultats sont en accord avec ceux que nous avons obtenus lors de l‟étude des effets des PE sur l‟expression des cytokines par les monocytes (Baranek T. et al, 2007). Cette similitude pourrait facilement s‟expliquer par le fait que les CD et les monocytes sont des cellules voisines sur le plan hématopoïétique, et proches sur le plan fonctionnel (migration, phagocytose, production de cytokines…). Cependant, au niveau des lymphocytes nous avons observé que les PE polarisent les cellules vers une réponse de type Th1 (Debret R. et al, 2005). Ainsi, en fonction du type cellulaire les PE orientent le profil cytokinique vers un type Th1 ou Th2. Or, quelque soit le type cellulaire que nous avons étudié les effets des PE ont toujours été associés à une interaction avec le récepteur S-Gal. Plusieurs mécanismes pourraient être associés aux différents profils induits par les PE. Bien que les PE exercent des effets pléïotropiques sur l‟activation des voies de signalisation (NF-κB, Erk-1/2, p38 MAPK, PKC…), les conséquences de ces effets vont physiologiquement dépendre du type cellulaire. D‟autre part, l‟activation de ces voies dépend 164 Discussion - Conclusion de l‟interaction des PE avec le récepteur S-Gal dont le niveau d‟expression peut être réduit sous l‟influence d‟une forte concentration en PE, comme nous l‟avons montré avec les PN dans le contexte de la BPCO. Il serait donc intéressant d‟analyser la capacité des CD et des lymphocytes à exprimer le récepteur S-Gal en fonction des concentrations en PE dans leur environnement. Par ailleurs, une telle diminution pourrait favoriser l‟interaction des PE avec d‟autres récepteurs (Galactin-3 ou intégrin αvβ3) qui pourraient être différemment exprimés en fonction du type cellulaire. Une telle interaction pourrait expliquer l‟augmentation de l‟IL-10 indépendante du récepteur S-Gal que nous avons observé dans les CD immatures stimulées par les PE. Les effets modulateurs des PE sur la réponse immune adaptative ne se limitent pas à la simple dichotomie Th-1/Th2. En effet, en présence des PE la synapse immunologique initiée par les CD favorise la genèse de lymphocytes T présentant des propriétés régulatrices. Cette orientation régulatrice est liée au caractère immunosuppresseur et tolérogénique des CD obtenu sous l‟effet des PE. L‟aspect immunosuppresseur est ici défini par l‟augmentation de l‟expression de l‟IL-10 et du TGF-β. L‟aspect tolérogénique périphérique est, quant à lui, caractérisé par une augmentation de l‟expression protéique d‟IDO et d‟ILT3. Par ailleurs, cette orientation est confirmée par l‟expression caractéristique des marqueurs CD25 et FoxP3 définissant la sous-population des lymphocytes T régulateurs. Il est classiquement décrit trois types de lymphocytes T régulateurs générés à partir des lymphocytes T CD4+ naïfs périphériques : les Tr1, les Th3 et les iTreg. L‟émergence de l‟une et/ou l‟autre de ces trois sous-populations dépend à la fois de signaux d‟activation et du milieu environnant. Dans notre système expérimental, les signaux d‟activation sont représentés par l‟IL-10 et le TGF-β et le milieu environnemental par les PE. L‟IL-10 et le TGF-β ont été décrits comme des médiateurs immunosuppressifs contribuant à l‟activité régulatrice des lymphocytes T régulateurs (Miyara M. et al, 2007). Plus précisément, l‟IL-10 favorise la genèse de lymphocytes Treg1 et le TGF-β celle de lymphocytes Th3 (Yamaguchi T. et al., 2006). Lorsque les effets du TGF-β sont combinés à un mécanisme de présentation d‟antigène, les lymphocytes T CD4+ naïfs sont différenciés en iTreg (Lo C. et al., 2003). Si les PE n‟altèrent pas la présentation antigénique, comme nous l‟avons montré dans notre deuxième étude réalisée in vitro, leur capacité à augmenter l‟expression d‟IL-10 et de TGF-β par les CD montre que ces peptides peuvent être impliqués dans la genèse de ces trois types de lymphocytes régulateurs qui, agissant indépendamment ou conjointement, régulent la durée et 165 Discussion - Conclusion l‟amplitude de la réponse immune. Ces résultats extrapolés au modèle d‟étude de la BPCO permettraient d‟expliquer l‟état inflammatoire amplifié observé chez les patients BPCO présentant une exacerbation de la maladie. Lors d‟une phase d‟exacerbation, la dégradation du parenchyme pulmonaire s‟accompagne d‟une libération de PE en grande quantité. Nous avons montré que les PE diminuent de façon drastique l‟expression du récepteur S-Gal à la surface des PN. Cet effet qui s‟accompagne d‟une diminution de la production de cytokines proinflammatoires (TNF-α, IL-8, IL-6) est en inadéquation avec la persistance du processus inflammatoire. En revanche, appliquée aux CD la diminution de l‟expression du récepteur SGal limiterait les effets tolérogènes des PE favorisant ainsi la genèse de lymphocytes Th au détriment de lymphocytes T régulateurs. Un tel mécanisme pourrait participer à la pérennisation du processus inflammatoire au cours de la BPCO. 166 Bibliographie BIBLIOGRAPHIE GENERALE 167 Bibliographie 1. 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Le travail de thèse présenté ici nous a permis de montrer que les peptides d‟élastine (PE) régulent les fonctions des PN de sujets sains en augmentant de façon significative leur capacité migratoire, leur capacité à produire des cytokines pro-inflammatoire et à phagocyter les agents pathogènes. Les effets régulateurs des PE sont moindres chez les sujets BPCO et varient en fonction de l‟état clinique des patients. Les propriétés biologiques des PN de patients BPCO en exacerbation ne sont pas affectées par les PE. Cette différence de réponse aux PE des PN de patients BPCO à l‟état stable ou à l‟état exacerbé est proportionnellement liée au niveau d‟expression du récepteur S-Gal à la surface des PN. Dans un second travail nous avons montré que les PE sont capables d‟attirer les CD au niveau du site infectieux sans influencer la maturation des cellules induite par une activation antigénique. L‟effet des PE sur la migration des CD met en jeu le récepteur S-Gal présent à la surface des cellules. Par ailleurs, les PE orientent la réponse cytokinique des CD activées par le LPS vers un profil de type Th-2 et favorisent l‟émergence d‟un profil tolérogénique des CD. Ces effets régulateurs des PE sont médiés via l‟interaction PE/S-Gal et conduisent au développement d‟une réponse adaptative T régulatrice. L‟ensemble de ces résultats suggère que les PE participent activement à la régulation de la réponse immunitaire innée et adaptative. MOTS CLES Inflammation, granulocytes neutrophiles, cellules dendritiques, élastine, VGVAPG, BPCO. COMPOSITION DU JURY Rapporteurs Monsieur le Docteur Marc DIEDERICH (Luxembourg) Monsieur le Professeur Jacques AUBRY (Nantes) Membres du jury Monsieur le Docteur Christophe CARNOY (Lille) Monsieur le Professeur François LEBARGY (Reims) Directeurs de thèse Monsieur le Docteur Richard LE NAOUR (Reims) Monsieur le Docteur Frank ANTONICELLI (Reims) COORDONNEES DU LABORATOIRE Laboratoire : Inflammation et Immunité de l‟Epithélium Respiratoire EA 4303 - IFR 53 Biomolécules UFR Pharmacie - 51 Rue Cognacq-Jay 51095 REIMS Cedex
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