n°18 - Institut de Biosciences et Biotechnologies de Grenoble (BIG)

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Institut de Recherches en Technologies et Sciences pour le Vivant
Direction des Sciences du Vivant
Résultats scientifiques
Cytosquelette
Rajaa Boujemaa-Paterski
Page 1
Lettre n° 18 - Mars 2010
AT_Chloro
Jacques Joyard
Page 2
Immunoprotéomique
Thierry Rabilloud
Page 3
Moteurs moléculaires
Danielle Gulino
Pages 3 - 4
En bref
Revue
Page 4
De l’organisation architecturale du
cytosquelette au mouvement cellulaire
Pour mieux comprendre les phénomènes
allant de l’acquisition de forme au mouvement cellulaire, l'équipe dirigée par Laurent
Blanchoin du laboratoire de Physiologie Cellulaire Végétale a observé en microscopie à
onde évanescente (méthode hautement résolutive), la génération d’un réseau spécifique
de filaments d’actine en temps réel. In vivo,
c’est l’assemblage coordonné de ces polymères biologiques qui est directement
responsable de la production de force de
poussée qui déforme puis propulse la membrane plasmique et engendre ainsi le déplacement de la cellule.
repose sur des lois physiques simples et fondamentales. Elle est la conséquence de l’allongement
spontané selon une orientation libre des polymères
d’actine issus d’un réseau précurseur. L’augmentation de matière due à l’assemblage de ce polymère
biologique au sein d’un volume limité et in fine
saturé, engendre la force de poussée de la particule
biomimétique et, par extension, de la membrane
cellulaire.
Ces chercheurs ont utilisé comme outil biomimétique des fibres de verre ou des billes de polystyrène
rendues motiles grâce à l’auto-assemblage spontané d’un réseau d’actine à leur surface (Figures 1 et
2). De façon surprenante, l’observation et la modélisation mathématique extensive des données expérimentales (Figure 2), ont démontré sans ambiguïté et contrairement au modèle préétabli, que la
production de force ne résultait pas nécessairement d’une architecture imposée et contrainte de
ce réseau. Bien au contraire, la génération de force
Figure 1 : Reconstitution in vitro de l'assemblage d'un
réseau de filaments d'actine à la surface d'une fibre de
verre, dans un milieu constitué de protéines purifiées. Ce
réseau, observé simultanément en lumière transmise et en
épifluorescence, génère une force suffisante pour propulser
l'objet bio-mimétique dans ce milieu. Les images révèlent
le réseau polymérisé en 58 minutes. La flèche indique le
sens de déplacement de la baguette de verre.
Références
Achard et al. A "primer"-based mechanism underlies branched-actin filament networks formation and motility. Current Biology, 2010, 20(5):
423-428
Discuté dans News and Views, 2010, 464: 365-366
Contact : Rajaa Boujemaa-Paterski
UMR 5168 CEA - CNRS - Inra - UJF
Figure 2 : L'observation en temps réel en microscopie à
onde évanescente (TIRFM) montre que la coque de filaments d'actine assemblée autour d'une bille de polystyrène dans les mêmes conditions qu'en figure 1 finit par
se rompre, propulsant alors l'objet vers l'extérieur (à
t=12 minutes). L'existence de cette première coque catalyse alors l'assemblage des suivantes. On observe alors
que la motilité reconstituée de la bille résulte de la rupture des coques de réseau de filaments polymérisés successivement à la surface de l'objet bio-mimétique. Le
code couleur utilisé pour les têtes de flèche correspond à
celui des coques successives de réseau d’actine matérialisées dans le dessin modèle.
Un modèle mathématique prenant en considération la
cinétique d'assemblage des filaments d'actine ainsi que
leurs caractéristiques mécaniques rend compte des résultats expérimentaux, notamment que les filaments d'actine possèdent une orientation libre au sein du réseau.
Voir également lettres scientifiques de l'iRTSV n° 6, n° 8 et n° 12
Cytosquelette
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AT_Chloro : première base de données AMT
des protéines du chloroplaste
Thylacoïdes
L’essentiel du carbone renouvelable est fixé
par les organismes photosynthétiques grâce à
leurs chloroplastes. Les plastes sont des organites semi-autonomes présents dans les
plantes terrestres, les algues et quelques protistes. Site de la photosynthèse, les chloroplastes réalisent de nombreuses autres fonctions essentielles comme la synthèse d’acides
gras, de lipides, d’acides aminés, de vitamines, etc. Ces biosynthèses nécessitent le fonctionnement coordonné de trois compartiments : les thylacoïdes, le stroma et l’enveloppe. L’approfondissement des connaissances des voies métaboliques du chloroplaste et
de leur régulation est considéré comme déterminant dans la perspective d’une
meilleure valorisation de la biomasse végétale. Enfin, comprendre les processus métaboliques du chloroplaste est essentiel si l’on
veut analyser l’impact des modifications de
l’environnement sur les plantes. Dans ce
contexte, l’analyse protéomique s’est révélée
être un outil de choix pour faire progresser
de manière significative la connaissance du
chloroplaste.
mettra de réaliser les
analyses ultérieures par
nanoLC-FT-MS, en évitant le recours systématique à la MS/MS, ce qui
permet
d’augmenter
significativement le débit
d’analyse et la couverture du protéome étudié.
Dans l’optique d’analyses protéomiques comparatives, la méthode
AMT présente l'avantage
de pouvoir comparer
directement entre elles
les intensités des signaux MS obtenus lors
de l’analyse de différents
échantillons protéiques
complexes.
Enveloppe
Figure 2 : Compartimentation du métabolisme des composés terpéniques
dans le chloroplaste déterminée à partir des données de protéomique semiquantitative. L’analyse protéomique par « spectral count » montre que les premières étapes (voies du méthylérythritol phosphate, du shikimate ou du protoporphyrinogène IX, par exemple) se déroulent dans le stroma (les protéines sont indiquées
par des ronds oranges) ; puis, dès que les molécules deviennent hydrophobes, les
voies métaboliques impliquent les membranes : soit les thylacoïdes (ronds verts), soit
l’enveloppe (ronds jaunes). Les ronds bleus correspondent à des protéines dont la
localisation fine n’a pas été possible. Les résultats démontrent en particulier le rôle
majeur de l’enveloppe dans la biosynthèse des caroténoïdes (précurseurs entre autres
de l’hormone ABA), des prénylquinones (plastoquinone, α-tocopherol) et de la protochlorophyllide, précurseur de la chlorophylle.
L'association de l'AMT
et du Spectral Count a
permis d'obtenir à partir
d’une seule et même
analyse, les données
d’identification et de
quantification.
Cette
stratégie mise en œuvre
pour la première fois a permis de déterminer la
localisation sub-chloroplastique des protéines
Depuis plusieurs années, les chercheurs des laboidentifiées pour construire la base AT_Chloro.
ratoires de Physiologie Cellulaire Végétale et
Dans cette étude, un effort majeur d’annotation a
d'Étude de la Dynamique des Protéomes contriété réalisé plus spécifiquement pour les protéines
buent de manière significative à l’établissement de
de l’enveloppe des chloroplastes, site privilégié
répertoires protéiques pour
des interactions
divers compartiments de la
entre les plastes et
cellule d’Arabidopsis thaliana.
le reste de la celCependant, un des enjeux
lule. Ainsi, près
actuels de la protéomique est
de 500 protéines
la réalisation d’études compa(sur les 1323 proratives afin de suivre des protéines identifiées
cessus dynamiques. Parmi les
dans le chlorostratégies d'analyses protéoplaste) ont été
miques quantitatives qui ont
identifiées
dans
été développées, la méthode
l’enveloppe alors
AMT (Accurate Mass and time
qu’elles ne repréTags) (lettre thématique de
sentent (en masse)
l'iRTSV sur l'Analyse protéo- Figure 1 : Carte peptidique massique des ions (pepque 1 à 2% des
mique) et celle dite de Spectral tides) détectés par LC-MS dans le chloroplaste. Axe
protéines du chlocount ont permis à ces cher- des abscisses : temps de rétention des peptides sur la
roplaste. Ces récheurs d'établir la première colonne nanoLC (min) ; Axe des ordonnées : masse isotosultats confirment
base de données AMT pour un pique des différents peptides (Da). Les différents états de
l’importance foncorganite spécifique de la cel- charge (z) des peptides sont représentés par différentes
tionnelle de ce
lule végétale, le chloroplaste.
couleurs : z=1 en bleu ; z=2 en rouge ; z=3 en vert.
système membraLa base de données AT_Chlonaire.
L’analyse
ro a été établie en réalisant
protéomique réalisée a permis de replacer les proprès de 500 analyses sur des fractions hautement
téines identifiées dans le contexte fonctionnel des
purifiées des compartiments majeurs du chlorovoies métaboliques et du rôle que jouent l’enveplaste (enveloppe, stroma et thylacoïdes). Des
loppe, le stroma ou les thylacoïdes dans le foncinformations précises ont ainsi été obtenues pour
tionnement du chloroplaste (Figure 2).
10654 peptides distincts (Figure 1) correspondant à
1323 protéines validées. L'ensemble des données a
Contacts : Norbert Rolland
ensuite été structuré dans AT_Chloro, une base de
UMR 5168 CEA - CNRS - Inra - UJF
données spécifique du chloroplaste d’Arabidopsis
Myriam Ferro, Christophe Masselon
thaliana. La création de cette base de données perUnité mixte CEA - Inserm U880 - UJF
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Stroma
La base AT_Chloro va au-delà d’un simple
répertoire de protéines en présentant des données semi-quantitatives qui permettent de déterminer dans quel compartiment (enveloppe,
stroma, thylacoïdes) se trouve une protéine du
chloroplaste. Il est donc possible de préciser le
rôle de chacun des compartiments dans les
voies métaboliques du chloroplaste.
La base AT_Chloro, qui renferme une
somme importante d’informations sur les protéines de l’enveloppe des chloroplastes, constitue une base de connaissance unique sur ce
système membranaire.
AT_Chloro représente une avancée significative en ouvrant la voie à des études quantitatives systématiques permettant de comparer les
protéomes chloroplastiques de mutants ou de
suivre la dynamique de ces protéomes au cours
du développement et dans des plantes soumises
aux modifications de leur environnement.
Références
Ferro et al. AT_CHLORO: A comprehensive
chloroplast
proteome
database
with
subplastidial
localization
and
curated
information on envelope proteins. Molecular and
Cellular Proteomics, 2010
Joyard et al. Chloroplast proteomics and the
compartmentation of plastidial isoprenoid
biosynthetic pathways. Molecular Plant, 2009, 2:
1154-1180
Joyard et al. Chloroplast proteomics highlights
the subcellular compartmentation of lipid
metabolism. Progress in Lipid Research, 2010,
49(2): 128-158
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Pourquoi vous avez mal aux pieds, ou les surprises
de l'analyse immunoprotéomique
certains sucres particuliers, comme l'héparane que
l'on retrouve dans la matrice extracellulaire de nos
tissus, mais aussi le chitosane qui est un constituant des parois de certains champignons, mais
aussi des parois de formes enkystantes de certains
protozoaires. Cette découverte ont immédiatement
amené ces chercheurs à réaliser certaines expériences visant à comprendre l'effet du chitosane sur les
cellules dendritiques.
Ces expériences ont alors montré que le chitosane
était capable d'induire une réponse partielle des
cellules dendritiques. Celles ci actionnent leur
programme d'activation membranaire, comme
pour tout démarrage d'une réponse immune, mais
s'avèrent incapables de sécréter les
cytokines nécessaires. En conséquence,
les cellules dendritiques traitées par le
chitosane sont incapables de stimuler
les lymphocytes T, et donc d'activer
une réponse immune efficace. Cependant, cette immunosuppression n'est
pas dominante : des cellules dendritiques traitées en même temps par du
chitosane et des produits bactériens
L'équipe dirigée par Thierry Rabilloud du labora- comme le lipopolysaccharide, activateur puissant,
toire Biochimie et Biophysique des Systèmes Inté- sont capables de stimuler normalement les lymgrés et des chercheurs de l'Institut Albert Bonniot, se phocytes T.
sont en effet intéressés au fonctionnement des cellules dendritiques. Ces cellules jouent un rôle clé dans Replacés dans un contexte physiologique, ces réla réponse immune en étant capables d'activer les sultats suggèrent que le chitosane peut induire une
cellules effectrices de la réponse immune, en parti- immunodulation négative et localisée aux sites où
culier les lymphocytes T, qui activent à leur tour les il est présent en fortes concentrations, typiquement
autres cellules effectrices de la réponse immune.
les sites d'infection par des organismes en conteEn étudiant par des techniques d'analyse protéomi- nant dans leur paroi, et donc participer aux phéque les protéines sécrétées par les cellules dendriti- nomènes de survie de ces organismes en présence
ques (analyse du secrétome), ces chercheurs ont du système immunitaire. Ceci pourrait contribuer
retrouvé les cytokines communément décrites, mais à expliquer la persistance de ces parasites, par un
aussi trouvé des protéines peu caractérisées, comme mécanisme d'adaptation fin jouant sur les mécala lectine YM1. Cette protéine a la capacité de lier nismes de contrôle interne du système immuni-
Les mycoses cutanées, comme le pied
d'athlète, font partie des ces petites affections
dont il est difficile de se débarrasser, mais qui
restent bénignes. Ce n'est hélas pas le cas de
toutes les mycoses, qui peuvent être fatales
aux sujets immunodéprimés, ou d'autres infections par des parasites comme les amibiases. Ce qui caractérise ces affections, c'est leur
grande résistance au système immunitaire.
Celui-ci arrive souvent à les contrôler, mais
difficilement à les éradiquer, alors même que
ces parasites, non intracellulaires
et à croissance lente, devraient être
facilement éliminés par notre système immunitaire.
Cette question peut sembler éloignée des analyses fondamentales
en immunologie, et pourtant le lien
est plus court qu'il n'y paraît.
taire, tout en évitant une immunosuppression
massive qui serait dommageable pour l'hôte et
pour le parasite.
Gel 2D.
Analyse protéomique des protéines sécrétées par les
cellules dendritiques.
Contact : Thierry Rabilloud
UMR 5092 CEA - CNRS - UJF
Référence
Villiers C, Chevallet M, Diemer H, Couderc R,
Freitas H, Van Dorsselaer A, Marche PN and
Rabilloud T. From secretome analysis to
immunology:
Chitosan
induces
major
alterations in the activation of dendritic cells via
a TLR4-dependent mechanism. Molecular and
Cellular Proteomics, 2009, 8(6): 1252-1264
Moteurs moléculaires
La plasticité tissulaire se traduit par la migration des cellules les unes par rapport aux
autres sans que l’intégrité de ce tissu soit
rompue. Ce remodelage est vraisemblablement corrélé au comportement dynamique
des jonctions intercellulaires et plus particulièrement à leurs connexions au cytosquelette d'actine.
Le tissu modèle utilisé par les chercheurs de
l'équipe dirigée par Danielle Gulino du laboratoire
Angiogenèse et Physiopathologie Vasculaire est
l’endothélium vasculaire dont le rôle est de contrôler les échanges entre le sang et les tissus. Sa cohésion est maintenue en partie par la VE-cadhérine,
un récepteur adhésif localisé spécifiquement aux
jonctions intercellulaires endothéliales. La VEcadhérine élabore, via sa partie extracellulaire, des
interactions homophiliques entre molécules appartenant à des cellules voisines et s’associe, par son
domaine cytoplasmique, à des protéines appelées
caténines. La connexion des complexes à base de
Immuno-protéomique - Moteurs moléculaires
cadhérine au réseau d’actine via les caténines a
pour effet de renforcer la cohésion de l’endothélium.
Depuis plusieurs années ces chercheurs étudient
les mécanismes à l’origine de la formation des
complexes jonctionnels à base de VE-cadhérine. Ils
crées pour cela des lésions au sein de monocou-
ches endothéliales qui miment l’endothélium vasculaire et étudient la réparation de ces lésions. Ces
chercheurs ont observé que sur le pourtour des
lésions, les cellules explorent leur environnement
en émettant des filopodes (i.e. de fines et longues
extensions membranaires) sur lesquels circulent
très rapidement des « patches » de VE-cadhérine.
Transport du complexe à base de VE-cadhérine le
long des filaments d’actine intrafilopodiaux.
La protéine moteur Myosine-X se déplace à une vitesse moyenne de 700 nm/s vers l’extrémité barbée des
filaments d’actine intrafilopodiaux (mouvement antérograde A) mais également à une vitesse moyenne de
30 nm/s vers la base des filopodes lorsqu’elle est soumise au flux rétrograde d’actine (mouvement rétrograde R). Elle transmet ces deux types de mouvements au complexe de VE-cadhérine en interagissant
directement, par l’intermédiaire de son domaine
FERM, avec la partie cytoplasmique de la VE-cadhérine. βcat : β-caténine ; αcat : α-caténine.
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Lorsqu’un filopode touche une cellule voisine, les
molécules de VE-cadhérine sont projetées à l’extrémité de ce filopode et interagissent avec leurs
homologues de la cellule cible. Ce type de transport permet de multiplier les contacts adhésifs
intercellulaires et d’arrimer les cellules les unes
aux autres. Ces chercheurs ont montré que la myosine X, une protéine moteur de la famille des myosines, régissait le transport des molécules de VEcadhérine le long des filopodes. (Détails dans la
légende de la Figure page précédente).
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Le concept du transport de la VE-cadhérine par la
Myosine-X semble pouvoir être étendu à d’autres
cadhérines qui s’expriment dans des tissus variés. Ceci suggère que l’accumulation des cadhérines à l’extrémité des filopodes semble un processus général utilisé par les cellules pour construire de nouvelles jonctions intercellulaires ou
remanier celles déjà existantes. Ces connaissances apportent un éclairage nouveau sur les mécanismes à la base du remodelage, de la réparation
tissulaires et de l’angiogenèse.
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Référence
Almagro et al. The motor protein Myosin-X
transports VE-cadherin along filopodia to allow
the formation of early endothelial cell-cell contacts. Molecular and Cellular Biology, 2010, 30(7):
1703-1717
Contact : Danielle Gulino
Unité mixte CEA - Inserm U882 - UJF
En bref
Plant Systems Biology
Publication d'un numéro spécial (Focus
Issue) sur le thème Plant Systems Biology de
la revue américaine Plant Physiology.
La complexité des
systèmes biologiques
et la production en
masse de données
expérimentales
ont
mené au développement de nouvelles
approches intégratives
et pluridisciplinaires et
à l’utilisation de la
modélisation
pour
chercher à comprendre
le fonctionnement des organismes vivants placés
dans diverses conditions environnementales. Cette
manière d'aborder l'étude des questions biologiques n'en est qu'à ses premiers pas, en particulier
dans le domaine végétal.
4
Dans un numéro spécial de Plant Physiology, "Focus
Issue on Plant Systems Biology", édité par Jacques
Joyard du laboratoire de Physiologie Cellulaire
Végétale et Sheila McCormick (UC Berkeley), une
série de mini revues (Updates) et des articles originaux traitent de ces questions qui vont de la quantification et l'intégration de données moléculaires
complexes (expression de gènes, protéomique, etc.)
à l'identification de réseaux de régulation (signalisation, métabolisme) et leur modélisation. Ce numéro vient enrichir la série Focus Collections disponible en ligne. Ainsi, Plant Systems Biology 2010
recensera à terme tous les articles publiés sur ce
thème dans Plant Physiology depuis février 2008 et
jusqu'à février 2012.
Référence
Joyard J and McCormick S. Plant Systems Biology. Plant Physiology, 2010, 152(2): 401
Moteurs moléculaires - En bref
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Les laboratoires de l’iRTSV
LAPV
LEDyP
Laboratoire Angio- Laboratoire Étude
genèse et Physiopa- de la Dynamique
thologie Vasculaire des Protéomes
LBBSI
LBIM
GPC
Groupe Physiopathologie du Cytosquelette
GIPSE
Laboratoire Biochi- Laboratoire BioloGroupe Informatimie et Biophysique gie, Informatique et que Pour les Sciendes Systèmes Inté- Mathématiques
tifiques du sud-Est
grés
LPCV
Biopuces
Laboratoire Biopuces
LCBM
Laboratoire Chimie
et Biologie des Métaux
GPMS
Laboratoire Physio- Groupe Plate-forme
logie Cellulaire Vé- et Moyens Scientifigétale
ques et techniques
communs
LTS
Laboratoire Transduction du Signal
Directeur de la publication
Dr. Jérôme Garin
Éditeur et format électronique
Pascal Martinez — [email protected]
Comité de rédaction
Rajaa Boujemaa-Paterski, Danielle Gulino, Jacques Joyard,
Thierry Rabilloud.
Institut de Recherches en Technologies et
Sciences pour le Vivant
http://www-dsv.cea.fr/irtsv
http://www-dsv.cea.fr/irtsv/lettres
CEA Grenoble
17 rue des Martyrs
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