Application of Modern Enzyme Design - ETH E

Diss. ETH No. 21428
Application of Modern Enzyme Design
Technologies and Strategies
for their Refinement
A dissertation submitted to
ETH Zurich
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
NATHALIE PREISWERK
M.Sc. in Chemistry, EPF Lausanne
born on January 23rd, 1984
citizen of Switzerland and Bolivia
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. D. Hilvert, examiner
Prof. Dr. D. Neri, co-examiner
Zürich, 2013
Abstract
ABSTRACT
Enzymes are the most powerful catalysts. Their use as alternatives to
small molecule and metal-based catalysts for industrial processes is very
appealing but often limited by the narrow range of substrates they convert and
their limited stability in industrial settings. Scientists have therefore developed
strategies to generate artificial enzymes with tailored properties. This thesis
describes the study of three artificial enzymes.
In order to mimic natural enzymes efficiently, a precise understanding of
the processes responsible for their remarkable activities is necessary. The
cotranslational incorporation of selenocysteine in natural proteins is extremely
costly and requires the expression of complex machineries. The higher
nucleophilicity of selenium is often claimed to justify its insertion into proteins.
In Chapter 2, we compare the reductive activity of an engineered dithiol oxidase
DsbA variant in which the catalytic cysteine at position 30 was replaced by
selenocysteine with that of its cysteine-containing counterpart. This system
allows unbiased comparison of nucleophilicity between selenocysteine and
cysteine since, in this protein environment, both side chains are in their
deprotonated state under physiological conditions. We show that selenocysteine
provides a 10-fold catalytic advantage over cysteine for the reduction of a
variety of oxidants such as hydroperoxides, disulfides and diselenides. Although
a 10-fold difference in nucleophilicity between selenols and thiols seems rather
modest to justify the energy-demanding selenocysteine incorporation into
proteins, its combination with the lower pKa of selenols which increases the
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Abstract
concentration of deprotonated reactive species, together with the novel redox
properties of the 21st proteinogenic amino acid, under physiological conditions
apparently make this energy expense worthwhile.
One enticing goal in enzyme design is the generation of proteins with
catalytic activities unknown to Nature. In Chapter 3, we describe the
optimization
Diels-Alderase
by
directed
that
evolution
catalyzes
the
of
a
computationally
non-biological
4-carboxybenzyl-trans-1,3-butadiene-1-carbamate
designed
cycloaddition
and
of
N,N-
dimethylacrylamide. In order to evolve this Diels-Alderase, we have developed
a medium throughput tandem-mass spectrometry screening assay consisting of
three consecutive steps. First, the desired reaction is carried out in cell lysate.
The product of the reaction is then extracted in a solvent compatible with
electrospray ionization (ESI) and finally analyzed without further work-up by
tandem mass spectrometry. By applying this assay to the laboratory evolution of
the initial computational design and of a computationally refined version of the
design, we have generated DA CE20, a Diels-Alderase variant with an effective
molarity (kcat/kuncat) 100-fold higher than that of the initial computational design.
The evolved DA CE20 is 100-fold more efficient at catalyzing the target DielsAlder reaction than the catalytic antibodies generated for the same reaction and
has the same levels of activity than the best biocatalysts ever generated for any
Diels-Alder reaction. Structural characterization of DA CE20 in complex with a
product analog has allowed us to confirm that the catalytic machinery of the
enzyme, consisting of two residues, a tyrosine and a glutamine, that interact
with the diene and dienophile, respectively, is very similar to what was intended
by design. Nevertheless, the catalytic activity of DA CE20 remains modest
compared to other evolved computational designs and natural enzymes. The
remarkable rigidity of its scaffold may have limited the extent to which it could
be improved. It is also possible that the catalytic mechanism based on hydrogen
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Abstract
bond interactions chosen during computational design is not optimal. Future
investigation of other protein scaffolds and alternative mechanisms, particularly
metal ion catalysis, may yield highly efficient Diels-Alder biocatalysts.
An alternative approach to the design of enzymes with novel activities
relies on redesigning the substrate specificity of an existing enzyme while
retaining its catalytic machinery. Applying this strategy to computationally
redesign the substrate specificity of human guanine deaminase towards
ammelide has yielded hGDA-des, a protein that hydrolyzes the new substrate,
albeit seven orders of magnitude less efficiently than the native activity of
wild-type guanine deaminase towards guanine. In Chapter 4, we describe our
efforts to develop a medium-throughput screening assay for directed evolution
of hGDA-des. We first attempted to adapt the mass spectrometry assay
described in Chapter 3 but the strong similarities between the substrate,
ammelide, and the product, cyanuric acid, in terms of solubility and molecular
weight rendered the implementation of this mass spectrometry assay
problematic. We therefore explored the utility of a glutamate dehydrogenasecoupled colorimetric assay for detecting the ammonium ions that are produced
upon ammelide deamination. Glutamate dehydrogenase catalyzes the reductive
amination of α‐ketoglutarate to glutamate in the presence of ammonium while
simultaneously oxidizing NADH. Cofactor oxidation is easily monitored by a
decrease in absorbance at 340 nm. Although the developed medium-throughput
method is not yet fully optimal, it was successfully used to probe the validity of
the computational approach. We found that while computational design
succeeded at remodeling the flexible loop of guanine deaminase to recognize
ammelide, it failed at predicting the orientation of one crucial side-chain with
the atomic-level precision needed for high catalytic efficiency. Future
improvements in the screening method and its application to the evolution of
hGDA-des are expected to yield considerable improvements in activity and
xi
Abstract
provide concrete suggestions for the refinement of the current computational
approaches.
In summary, this thesis has contributed clues for the refinement of several
current strategies for enzyme design. Rational introduction of novel
functionalities in enzymes will extend the range of transformations they
catalyze. Iterations of computational design with ever-more sophisticated
algorithms followed by directed evolution is a promising approach for the
generation of highly efficient enzymes in the future.
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Résumé
RÉSUMÉ
Grâce à leur capacité à accélérer les nombreuses réactions nécessaires à la
vie avec une efficacité et une spécificité spectaculaires, les enzymes sont les
catalyseurs les plus puissants connus à ce jour. Leur application dans l’industrie
en tant qu’alternatives aux catalyseurs organiques et organométalliques est
attrayante mais souvent limitée par leur sélectivité pour un éventail restreint de
substrats et par leur instabilité sous haute température, dans des solvants
organiques et sous pH non-physiologiques. Par conséquent, de nouvelles
stratégies visant à générer des enzymes artificiels aux propriétés adaptées ont
été développées ces dernières décennies. Au cours de cette thèse de doctorat,
nous avons étudié et optimisé trois enzymes artificiels.
Afin d’imiter efficacement les enzymes naturels, il est nécessaire de
comprendre avec précision les caractéristiques responsables de leurs
impressionnantes efficacités. Par exemple, l’incorporation de sélénocystéine
dans les protéines est un processus complexe qui requière beaucoup d’énergie.
Malgré tout, de nombreuses sélénoprotéines ont été découvertes chez toutes les
espèces sur Terre. Dans le Chapitre 2, nous étudions une caractéristique du
sélénium souvent avancée pour justifier l’utilisation de la sélénocystéine dans
les enzymes naturels : la nucléophilicité. Il s’agit d’une comparaison de
l’activité réductrice d’une variante de l’oxydoréductase DsbA dans laquelle la
cystéine catalytique à la position 30 a été remplacée par une sélénocystéine,
avec celle de son homologue non-modifiée. Nous montrons que la
sélénocystéine fourni une efficacité catalytique 10 fois supérieure à celle de la
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Résumé
cystéine pour la
réduction
d’une palette d’oxydants
tels
que des
hydroperoxydes, disulfures et diséléniures. Bien qu’une différence de
nucléophilicité de 10 fois entre sélénols et thiols puisse paraître modeste pour
justifier l’incorporation couteuse de sélénocystéines dans les protéines, sa
combinaison avec le faible pKa des sélénols qui augmente la concentration
d’espèces déprotonées et réactives sous conditions physiologiques, semble
justifier cette dépense énergétique.
Un objectif ambitieux lors de la conception d’enzymes artificiel est la
génération de protéines aux propriétés catalytiques absentes dans la nature.
Dans le Chapitre 3, nous décrivons l’optimisation par évolution dirigée d’une
Diels-Aldérase conçue par modélisation numérique catalysant la cycloaddition
non-naturelle du 4-carboxybenzyl-trans-1,3-butadiene-1-carbamate et du N,Ndimethylacrylamide. Afin d’optimiser cette Diels-Aldérase par évolution
dirigée, nous avons développé une procédure de sélection par spectrométrie de
masse comportant trois étapes consécutives. Premièrement, la réaction
catalytique est effectuée dans un lysat de cellules. Le produit de la réaction est
ensuite extrait à l’aide d’un solvant compatible avec l’ionisation par
électrospray (ESI) qui est directement injecté dans un spectromètre de masse
sans étape de purification supplémentaire. Cette méthode fiable et rapide a
permis l’évolution dirigée de la Diels-Aldérase générée in silico. Nous avons
trouvé un mutant – DA CE20 – dont la molarité effective (kcat/kuncat) est 100 fois
supérieure à celle de la Diels-Aldérase initiale. DA CE20 est par ailleurs
100 fois plus efficace que les anticorps catalytiques conçus pour catalyser la
même réaction et a le même niveau d’activité que les meilleurs biocatalyseurs
jamais générés pour une réaction de Diels-Alder. L’élucidation de la structure
de DA CE20 en complexe avec un analogue du produit de la réaction nous a
permis de confirmer que sa machinerie catalytique est très similaire à celle du
modèle in silico. Néanmoins, l’activité catalytique de DA CE20 reste modeste
xiv
Résumé
comparée à celle des enzymes naturels. Il est possible que la remarquable
rigidité de son architecture globale ait limité l’évolution de son activité. Par
ailleurs, le mécanisme catalytique (basé sur des liaisons hydrogènes) choisi lors
de la conception numérique peut potentiellement être optimisé. L’investigation
de structures protéiques alternatives ainsi que d’autres mécanismes catalytiques,
basés par exemple sur l’utilisation d’ions métalliques, pourraient engendrer des
biocatalyseur encore plus puissants pour la réaction de Diels-Alder.
Une approche alternative pour la conception d'enzymes avec des activités
catalytiques innovantes consiste à remodeler le site actif d’une protéine
naturelle pour lui permettre d’accepter des substrats non-natifs tout en
conservant sa machinerie catalytique. En appliquant cette stratégie, la guanine
désaminase humaine a été remodelée in silico pour reconnaître l’ammélide
comme substrat à la place de la guanine. Son activité envers l’ammélide est
néanmoins sept ordres de grandeur inférieure à l'activité native de la guanine
désaminase. Dans le Chapitre 4, nous décrivons le développement d’une
procédure de sélection pour l’évolution dirigée de la guanine désaminase
modifiée. Nous avons premièrement essayé d’adapter la méthode par
spectrométrie de masse décrite dans le Chapitre 3 mais les grandes similarités
entre le substrat, ammélide, et le produit, l’acide cyanurique, en termes de
solubilité et de masse moléculaire ont rendu son application problématique.
Nous avons donc développé une méthode colorimétrique utilisant la glutamate
déshydrogénase pour détecter les ions ammonium produits lors de la
désamination de l’ammélide. La glutamate déshydrogénase catalyse l’amination
réductrice de l’ α-ketoglutarate en glutamate en présence d’ammonium en
oxydant simultanément une molécule de NADH. L’oxydation de ce cofacteur
est mesurée facilement par une diminution de l’absorbance à 340 nm. Bien que
cette méthode ne soit pas encore optimale, elle a été utilisée pour tester la
validité du design in silico. Cette recherche a démontré que la méthode
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Résumé
informatique utilisée n’es pas encore capable de prédire l’orientation d’acides
aminés cruciaux avec la précision nécessaire à assurer une efficacité catalytique
importante. L’optimisation de la méthode de sélection et son application pour
l'évolution de la guanine désaminase modifiée devraient permettre des
améliorations considérables de son activité et fournir des suggestions concrètes
pour l'amélioration des méthodes computationnelles actuelles.
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