BREVET D`INVENTION B1 le imr cr) co 6

0 RÉPUBLIQUE FRANÇAISE
INSTITUT NATIONAL
DE LA PROPRIÉTÉ INDUSTRIELLE
PARIS
®
0
N° de publication :
2 694 560
(à n'utiliser que pour les
commandes de reproduction)
92 09884
0
N° d'enregistrement national :
0
Int CI 5 : C 07 K 7/00, 13/00, C 12 P 21/08, A 61 K
39/21, 39/44, 37/02, G 01 N 33/569
BREVET D'INVENTION
B1
0 NOUVEAUX PEPTIDES VIRAUX, ANTICORPS DIRIGES CONTRE CES PEPTIDES, PROCEDE DE
PREPARATION, APPLICATION A TITRE DE MEDICAMENTS, COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES ET KITS DE DIAGNOSTIC LES RENFERMANT.
0
Date de dépôt : 10.08.92.
0
Références à d'autres documents nationaux
apparentés :
0 Priorité
0 Demandeur(s) : ZAGURY JEAN-FRANCÇIS. -
FR.
't
1:0
,
0
Date de la mise à disposition du public
de la demande : 11.02.94 Bulletin 94/06.
0
Date de la mise à disposition du public du
brevet d'invention : 30.06.95 Bulletin 95/26.
0 Liste des documents cités dans le rapport
de recherche :
O
CD
le
imr
cr)
co
0 Inventeur(s) : ZAGURY JEAN-FRANCOIS.
0 Titulaire(s) :NEOVACS, Société Anonyme -
FR.
Se reporter à la fin du présent fascicule
C) Mandataire(s) : RINUY SANTARELLI
CV
6
111111111111111111111111111111111111111111111
2694560
1
La présente invention concerne de nouveaux
peptides viraux, des anticorps dirigés contre ces peptides,
leur procédé de préparation, leur application à titre de
médicaments, les compositions pharmaceutiques et les kits de
5 diagnostic les renfermant.
La lutte contre maladies, notamment virales,
reste une priorité, en particulier depuis la mise en évidence
10
15
20
25
des rétrovirus responsables du SIDA.
Le système immunitaire se présente sous deux
aspects fonctionnels: l'immunité non spécifique et l'immunité
spécifique, dite encore à mémoire. L'immunité non spécifique
consiste en une première ligne de défense, capable d'arrêter
la plupart des agents pathogènes avant que ne s'établisse une
véritable infection. Les mécanismes de l'immunité spécifique
entrent ensuite en action. Ils déclenchent une réaction
dirigée spécifiquement contre le germe responsable, entraînant sa destruction. D'une manière générale et schématique,
il existe deux grands types de réponse immunitaire spécifique
: la réponse de type humoral qui est caractérisée par la
production d'anticorps par les lymphocytes B et la réponse
immunitaire à médiation cellulaire qui met en jeu des
cellules effectrices, c'est à dire essentiellement les
lymphocytes T8 (lymphocytes cytotoxiques). Ces réponses sont
initialement activées par les cellules présentatrices
d'antigènes et modulées par les cellules régulatrices, c'est
à dire les lymphocytes T4 (lymphocytes T auxiliaires) et les
lymphocytes T suppresseurs.
Dans ses très grandes lignes, la réponse immuni-
taire spécifique fonctionne comme suit:
Les cellules présentatrices d'antigène appelées APC
30 (monocytes, macrophages et lymphocytes B) capturent l'antigène, le digèrent et en réexposant des fragments à leur
surface, en association avec des molécules du complexe majeur
d'histocompatibilité de classe I ou II. (CMH1 OU CMH2).
35 - Quand les lymphocytes T4 "voient" les fragments d'antigènes associés au complexe majeur
d'histocompatibilité de
2694560
2
classe II, ils prolifèrent, passent sous forme activée (et
notamment synthétisent de l'Il-2). Ce passage à l'état activé
dépend essentiellement d'interactions moléculaires fines
entre les 3 molécules CD4, CMH, et récepteurs des cellules T
5 (TCR). Les lymphocytes T stimulent alors la prolifération
des lymphocytes B producteurs d'anticorps et celle des
lymphocytes T8 (lymphocytes cytotoxiques ou CTL) grâce à des
facteurs tels que IL2 ou IFNT, le tout étant régulé par
d'autres facteurs tels que l'IFNa.
10 - Les lymphocytes B produisent des anticorps qui vont
interagir avec les antigènes circulants de manière à les
neutraliser.
- Enfin, les lymphocytes T8 détruisent les cellules infectées
quand ils reconnaissent les fragments d'antigènes associés au
15 complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH1).
La réponse immunitaire standard à un agent
microbien quelconque peut donc être schématiquement résumée
comme suit: l'intervention de l'immunité non spécifique est
quasi-immédiate puis, si besoin est, elle est suivie dans les
20 48 à 72 heures de l'apparition de la réponse immunitaire
spécifique. Toutefois, il y a de notables exceptions, en
particulier lorsque l'agent microbien est un virus.
Dans le cas de SIDA, cette induction n'est pas
réalisée correctement car le virus HIV-1 peut interférer au
25 niveau moléculaire avec le bon développement de cette réponse
spécifique.
C'est pourquoi la présente demande a pour objet
de nouveaux peptides viraux, caractérisés en ce qu'ils
présentent une identité avec une partie de la molécule dite
30 CD4 située dans une zone essentielle à l'activation des
lymphocytes T dans la réponse immunitaire ou avec une partie
adjacente à cette zone en permettant l'élaboration d'anticorps bloquant cette zone, et en ce qu'ils comportent de 4 à
200 acides aminés, et de préférence de 4 à 20 acides aminés,
35 notamment 5 à 12 acides aminés ainsi que les dérivés les
renfermant.
2694560
3
Ces peptides correspondent de préférence à des
virus à enveloppe, notamment de rétrovirus.
Par "présentent une identité", l'on entend que le
peptide présente une homologie d'au moins 60% et de préfé5 rence au moins 80%, selon la matrice de Dayhoff, avec ladite
partie de la molécule CD4.
Par "viraux" l'on entend que les peptides
proviennent de virus, mais peuvent être préparés par synthèse
ou peuvent être modifiés, dans la mesure où les peptides
10 présentent l'identité définie ci-dessus.
La molécule CD4 est classiquement considérée
comme comprenant 4 domaines extracellulaires (domaines 1 à
4). Des peptides préférés selon l'invention sont caractérisés
en ce que la partie de la molécule CD4 correspond à une zone
15 de ces quatre domaines extracellulaires, et de manière
priviligiée du premier domaine (résidus 1 à 100).
On a découvert de manière surprenante une
identité entre certaines parties de la molécule CD4 et de
l'enveloppe gp160 du virus HIV-1: SLWDQ (acides aminés 110 à
20 114 dans HIV-1 souche LAI, et 60 à 64 dans CD4). (Cette
identité se trouve, (cf exemple 1) sur un site d'interaction
du récepteur CD4 avec le CMH2 lors de la présentation de
l'antigène à la cellule T4 par l'APC. Donc, lorsqu'un
antigène est présenté à la cellule T par l'APC, d'une part le
25 CMH2 présente l'antigène au TCR spécifique de l'antigène,
d'autre part, l'interaction CD4-CMH permet l'activation
finale de la cellule T4 ; cette interaction se fait peut-être
un changement de la confirmation de la molécule CD4, comme
c'est le cas dans d'autres modèles de récepteurs connus (LFA
30 1 et 2), où on peut imaginer que le tryptophane (W) normalement rentré au repos devient exposé à l'état activé. En cas
de présence du HIV-1 ou de ses produits de dégradation, il
peut alors y avoir compétition avec ce site du CD4 pour
l'interaction avec le CMH2, et blocage de l'activation finale
35 de la cellule T. Cela conduit à bloquer l'immunité spécifique
(cf Exemple 1).
2694560
4
De même on a retrouvé chez les patients séropositifs et atteints du SIDA de très fortes réponses anticorps
face aux peptides HIV-1 et CD4 issus de cette région commune
(cf Exemple 2). Ces anticorps ne réagissent pas avec les
5 cellules T4 au repos et cela est compatible avec le changement de conformation du CD4 lors de l'activation des cellules
T4 mentionnée ci-dessus. Ces anticorps peuvent eux aussi
induire un blocage de l'activation des cellules T en bloquant
l'interaction CD4-CMH2 (cf exemple 1). De plus ces anticorps
10 en reconnaissant la molécule CD4 sur les lymphocytes T4
peuvent induire une mortalité directe des cellules T4 soit
par Toxicité Cellulaire Anticorps Dépendante (ADCC) soit en
induisant des phénomènes de transduction léthaux. En conclusion cette identité au niveau d'un site critique du récepteur
15 CD4 permet au virus Hrv-1 la destruction progressive du
système immunitaire spécifique.
Le HIV-2, cause lui aussi d'immunodéficience,
contient au niveau de sa partie gag une très forte similitude
avec une séquence du CD4 adjacente au site défini précédem20 ment. Cette séquence existe, elle aussi, dans le HIV-1:
HIV-2 (Gag) : GNYPV
CD4 : 65 GNFPL 69
Elle est, elle aussi, inhibitrice de l'activation
des cellules T in vitro et elle présente une réponse anti25 corps chez le malade.
On retient donc aussi particulièrement les
peptides caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence
commune à une protéine virale et au CD4, en particulier une
séquence issue de Gag, Env, Tat, Vif, Nef du HIV-1 ou du HIV30 2 (il existe des anticorps contre ces protéines chez les
malades d'ailleurs). Parmi les séquences ci-dessus on
retiendra notamment celles caractérisées comme faisant partie
du premier domaine de la molécule CD4 (résidus 1 à 100 de la
molécule CD4). Parmi les peptides et dérivés ci-dessus on
35 retiendra tout particulièrement ceux comprenant une séquence
présentant une identité avec la séquence SLWDQ (CD4 : résidus
2694560
5
17-21 et Env HIV-1), la séquence TASQK CD4 : résidus 17-21 et
Env HIV-1), ou la séquence GNFPL (CD4 : résidus 65-69 et Gag
HIV-1 ou HIV-2).
Parmi les peptides ci-dessus, on retient tout
5 particulièrement ceux comprenant la séquence SLWDQ(IS1) et
ceux contenant la séquence GNFPL(IS2).
On peut associer dans une même molécule des
peptides selon l'invention d'autres peptides qui renforcent
leur action: par exemple, le site CD4-binding de liaison du
10 HIV-1 au récepteur CD4 permettra un meilleur ancrage à la
cellule T et ainsi l'action des peptides suppressifs SLWDQ ou
GNFPL sera renforcée. Cette association dans une même
molécule peut se faire de multiples façons, par exemple en
associant les deux séquences par une autre séquence telle que
15 (G)n, ou en réalisant des structures peptidiques "en candélabres" notamment par des résidus lysine (K)
Les peptides selon l'invention peuvent être
utilisés tels quels ou sous forme de dérivés, associés par
exemple à des saccharides, des peptides, des noyaux. De tels
20 dérivés entrent dans le cadre de la définition des peptides
selon l'invention.
C'est pourquoi parmi les peptides ci-dessus, on
retient notamment ceux comprenant une séquence issue du site
de liaison de gp/20 avec la molécule CD4, provenant de HIV-1
25 ou de HIV-2 (résidus 423-450 dans Env HIV-1 LAI).
On retient aussi tout particulièrement ceux
identifiés ci-après par IS 3 à 5
DIISLWDQSLK
IS3
IS4
IS5
HEDII
La présente demande a aussi pour objet les
SLKPCVKLTPL
30
anticorps, notamment monoclonaux, dirigés contre les peptides
ci-dessus décrits, aussi qu'un procédé de préparation desdits
anticorps selon lequel l'on prépare, selon des opérations
35 connues en elles mêmes, les anticorps désirés.
Ces anticorps peuvent être préparés chez l'ani-
2694560
6
mal, tel que le singe, la souris, le cheval, etc....
La présente invention a également poiir objet un
procédé de préparation des peptides et de leurs dérivés cidessus décrits, caractérisé en ce que l'on prépare, selon des
5 méthodes connues en elles-mêmes, des peptides ou leurs
dérivés tels que définis ci-dessus.
La présente invention a aussi pour objet un
procédé de préparation des peptides ci-dessus décrits,
caractérisé en ce que l'on prépare lesdits peptides ou leurs
10 dérivés par synthèse chimique classique.
On peut pour cela par exemple opérer une synthèse
en phase solide à partir d'un support solide aminés et des
acides aminés désirés.
La présente demande a aussi pour objet un procédé
15 de préparation des peptides ci-dessus décrits, caractérisé en
ce que l'on prépare lesdits peptides par recombinaisons
génétiques.
Les peptides objet de la présente invention et
les anticorps dirigés contre ces peptides présentent de
20 remarquables propriété : ils sont en effet capables d'interférer dans la présentation de l'antigène aux lymphocytes T en
perturbant la relation CD4-CMH (Complexe majeur d'histocompatibilité) et empêchent ainsi l'activation des lymphocytes T ; par des phénomènes de transduction activateurs ou
25 inhibiteurs, ils peuvent créer des états d'anergie ou
d'activation non spécifique de l'immunité.
De ce fait, ils ont selon le cas des propriétés
immunosuppressives ou vaccinantes - comme illustré ci-après
dans la partie expérimentale qui justifient leur emploi comme
30 médicaments, et leur incorporation dans des compositions
pharmaceutiques.
En effet, en ce qui concerne les propriétés
immunosuppressives des peptides issues d'une molécule CD4
selon la présente invention, ceux-ci, administrés à un
35 mammifère malade entrent en compétition avec les lymphocytes
porteurs de CD4, et empêchent la coopération CD4-CMH. En ce
2694560
7
qui concerne les anticorps dirigés contre ces peptides, ceuxci se fixent sur le segment concerné du CD4 et peuvent
bloquer aussi son interaction avec le CMH, ou sinon par
action directe sur le CD4 induire des phénomènes de transduc5 tion inhibiteurs (anergie) ou activateurs. Les peptides et
anticorps selon l'invention trouvent de ce fait de remarquables applications pour induire des immunosuppressions. Cela
s'applique donc aux cas suivants :
- immunosuppression pour les greffes (on sait d'ailleurs que
10 l'anticorps OKT4A est utilisé avec un certain succès dans ce
but), maladies auto-immunes telles que le lupus ou la
polyarthrite rhumatoïde (pour inhiber l'activation T autoimmune), rejets de greffe, leucémies et particulièrement
leucémies T pour bloquer la prolifération cellulaire".
15 En ce qui concerne les propriétés vaccinales des
peptides et anticorps selon l'invention, l'administration à
faible dose de certains peptides, dénués de pouvoir immunosuppresseur par modification d'un ou plusieurs acides aminés
par rapport à la séquence naturelle du CD4 ou de la séquence
20 correspondante de l'agent infectieux, notamment viral telle
celle du HIV 1 ou 2 permet la création d'anticorps dirigés
contre l'agent infectieux. Par exemple, le peptide SLVDQ
n'est pas immunosuppresseur, contrairement à SLWDQ.
L'immunisation de l'homme avec un peptide conte25 nant un site adjacent à la zone essentielle à l'activation
lymphocytes T, par exemple HEDII peut bloquer l'action de la
séquence SLWDQ.
Ces immunisations se font classiquement avec des
quantités allant de 10 gg à 20 mg mais il est possible de
30 donner de plus fortes ou de plus faibles doses.
- Il est enfin possible d'immuniser avec de très fortes
quantités d'antigène pour créer un état d'anergie face à ce
site: en donnant, par exemple, 500 mg de molécule contenant
le peptide SLWDQ sous forme immunogène, on supprime toute
35 réactivité de l'organisme face à ce peptide: les anticorps
qui bloquent donc l'interaction CD4-CMH2, lors de l'activa-
2694560
8
tion des cellules T chez les malades séropositifs, seront
donc inexistants.
Les peptides selon l'invention sont à utiliser de
préférence "protégés" pour augmenter leur durée de vie et à
5 donner en quantité suffisante (de l'ordre de plusieurs mg)
pour obtenir une concentration inhibitrice suffisamment
élevée.
Les peptides peuvent être utilisés directement
dans des émulsions eau dans huile ou enchâssés au sein
10 d'adjuvants aqueux de phosphate de calcium ou encore adsorbés
dans un phosphate d'alumine. Les peptides peuvent aussi être
présentés conjugués à des protéines porteuses, comme le
tétanos toxoïde ou encore le KLH. Enfin, les peptides peuvent
également être présentés au sein de bactéries dans des
15 constructions de recombinaison génétique, après l'insertion
de séquences nucléotidiques appropriées dans des plasmides.
Une composition pharmaceutique selon l'invention
est avantageusement destinée à la prévention ou au traitement
d'une infection à HIV, plus particulièrement destinée au
20 traitement d'une infection à HIV au stade ARC ou SIDA.
L'immunogénicité d'un peptide selon l'invention
peut être conférée par la préparation de protéosomes ou par
l'utilisation d'un composé lipidique acceptable d'un point de
vue pharmaceutique qui a de préférence les propriétés d'un
25 adjuvant.
Par exemple, on peut préparer une composition
selon l'invention en diluant un peptide selon l'invention
dans une suspension eau/huile. D'autre part, des protéosomes
appropriés sont tels que décrits et obtenus dans Lowell et
30 al, J.Exp.Med., (1988) 167 : 658. Lorsqu'un peptide selon
l'invention est associé à des protéosomes, il est de préférence préparé sous forme de conjugué, c'est à dire qu'il est
lié par liaison covalente à un groupement hydrophobe tel
qu'un radical acide gras, par exemple un radical lauryl ou
35 lauryl-Cys, ou bien il comprend outre la séquence caractérisante, une séquence-pied composée d'acides aminés hydrophobes
2694560
9
par exemple le pied Phe-Leu-Leu-Ala-Val-Phe-Cys ; la séquence-pied est de préférence liée par liaison peptidique à
l'extrémité NH2-terminale de la séquence caractérisante.
Les produits ci dessus sont dotés de remarquables
-
5 propriétés qui justifient leur utilisation comme médicament.
Inactivés et rendus immunogènes ils peuvent être
utilisés pour provoquer dans l'organisme considéré une réaction immunitaire, cellulaire et
humorale neutralisant les effets biologiques de
ces peptides et des virus qui les renferment.
10
Les peptides sous forme inactivée mais immunogènes pourront être utilisés comme ci-dessus.
C'est pourquoi la présente demande a aussi pour
objet les médicaments caractérisés en ce qu'ils sont consti15 tués par les peptides natifs ou modifiés définis ci-dessus,
ainsi que les compositions pharmaceutiques les renfermant.
Les médicaments ci-dessus peuvent être utilisés, pour ce qui
concerne les peptides immunogènes, à titre de traitement pour
créer une immunisation active vis à vis d'agents pathogènes
20 les renfermant : par exemple vis à vis des glycoprotéines gp
160, 120 ou 41 de HIV-1 qui contient par exemple le site avec
son récepteur SLWDQ homologue au CD4.
De manière similaire, on peut aussi créer une
immunisation vis à vis de peptides issus de site actifs
25 d'autres virus à enveloppe induisant une immunosuppression,
notamment ceux de la famille de l'Herpès, HIV-2, HTLV1 et le
virus de la grippe.
Il peuvent être administrés à titre curatif ou
préventif.
30
Les peptides immunogènes ont une très faible
toxicité ; administrés à la dose de 20 gg à la souris, aucune
toxicité n'a été observée.
Une composition pharmaceutique selon l'invention
2694560
10
peut en outre contenir un agent conventionnel anti infectieux, destiné à vacciner contre une infection à rétrovirus,
notamment HIV. Pour usage à l'encontre d'une infection à HIV,
un agent vaccinal conventionnel avantageux est par exemple la
5 protéine env sous la forme de la protéine gp160 non-clivable,
la sous unité gp 120 de la protéine env, un fragment de la
gp120 comportant la boucle V3 ou des virions HIV déplétés de
leur ARN génomique.
Enfin, une composition pharmaceutique vaccinale
10 selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe un peptide selon l'invention en quantité suffisante pour être efficace d'un point de
vue thérapeutique, avec un solvant ou un support acceptable
d'un point de vue pharmaceutique. Une composition selon
15 l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie
conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en
particulier par voie sous-cutanée, par voie intramusculaire,
par voie intraveineuse ou par voie intradermique, par exemple
sous forme de suspension injectable, ou encore par voie orale
20 selon l'application que l'on veut mettre en oeuvre. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou
plusieurs fois après une certain intervalle. Le dosage varie
en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu
traité ou du mode d'administration. A titre d'exemple, on
25 indique toutefois que, chez des mammifères présentant un
infection à HIV, on obtient des résultats satisfaisants avec
une dose de chacun des peptides des IS N° 1, 2, 3, 4, 5, à 20
gg/Kg de poids corporel, de manière avantageuse de 4 à 16
gg/kg de poids corporel, de préférence de 8 à 12 gg/Kg de
30 poids corporel, tant présentés sous forme de protéosomes que
couplés à des toxoïdes ou qu'émulsionnés.
Les doses les plus faibles sont avantageusement
administrées en présence d'adjuvants et/ou à intervalles
répétés tandis que les doses les plus fortes peuvent être
35 administrées une seule fois et/ou en absence d'adjuvant.
De même l'invention propose :
2694560
11
(1)
L'usage d'un peptide selon l'invention pour
prévenir ou traiter une infection à virus à
enveloppe, particulièrement à rétrovirus, notamment à HIV.
Une méthode pour prévenir ou traiter une infection à virus à enveloppe, particulièrement à
rétrovirus, notamment à HIV, qui comprend l'acte
d'administrer un peptide selon l'invention en
quantité suffisante pour être efficace d'un
point de vue thérapeutique et en association
avec un élément capable d'inhiber l'activité
potentiellement cytostatique dudit peptide, à un
sujet ayant besoin d'un tel traitement.
L'utilisation d'un peptide selon l'invention
15 pour préparer une composition pharmaceutique
destinée à la prévention ou au traitement d'une
infection à virus à enveloppe, particulièrement
10
à rétrovirus, notamment à HIV, de préférence
HIV-1 ou 2, notamment au stade ARC ou SIDA
20
notamment par le procédé de fabrication défini
plus haut.
L'invention propose également l'usage de ces
peptides ou dérivés dans les tests, in vitro,
notamment de type ELISA pour évaluer l'évolution
25 de la maladie, sachant que de fortes réponses en
ELISA face à ces peptides peuvent être corrélées
à une forte défaillance de l'immunité. De tels
peptides sont notamment DIISLWDQSLK (IS3) our
TASQK (IS12) qui présentent des réponses extrê30
35
mement élevées chez certains malades (cf Exemple
4)
La présente demande a donc enfin pour objet les
kits de diagnostic utilisant l'un au moins des
peptides ou de leurs dérivés ou anticorps définis ci-dessus.
Les exemples qui suivent illustrent la présente
2694560
12
invention, sans toutefois la limiter.
Exemple 1
On prépare classiquement du peptide SLWDQ (IS1)
et du peptide HEDIISLWDQSLXK (IS8) inclus dans des protéo5 sonies, aux souris. On injecte par voie intramusculaire 50gg
du produit couplé à JO, J30, J60 aux souris. On prélève le
sérum à J70 pour faire des ELISA. Les résultats obtenus sont
les suivants en réponse ELISA par rapport à des sérums
témoins de souris non immunisées et à des peptides témoins.
10 Les souris de la série 1 ont été immunisées par
SLWDQ (IS1), les souris de la série 2 ont été immunisées par
HEDIISLWDQSLK (IS9), les souris de la série 3 sont des
témoins non immunisés.
Souris 1
Peptide
15
IS1
IS10
IS11
HEDIISLWDQSLK
Souris 2
Souris 3
+++
+++
-
+++
+++
-
Les résultats montrent que les peptides sont
20 imunogènes et on a pu obtenir des anticorps contre ces
peptides par immunisation chez la souris. L'exemple 4 montre
d'ailleurs l'existence d'anticorps dirigés contre ces
peptides chez les malades infectés.
Exemple 2
25
Inhibition par des peptides suppresseurs de
l'activation des cellules T.
- Des cellules monocuclées du sang frais de
sujets non infectés (PBMC) ont été isolées par Ficoll-
Hypaque. Les monocytes macrophages ont été ensuite purifiés
30 par adhérence sur plastique. Les cellules adhérentes ont été
incubées 6 heures à 37° avec 1µg/ml de SEB (Entérotoxine B de
2694560
13
staphylocoque ou de la tuberculine (PPD) Mérieux à 0,02%.
Après lavage, ces cellules ont été utilisée comme cellules
présentatrices. Des cellules T répondeuses ont été obtenus
par sélection immunomagnétique négative : les cellules PBMC
5 ont été incubées avec le l'anticorps monoclonal anti-HLA-DR
et lavées puis mélangées avec des billes recouvertes par des
anticorps anti (IgG de souris).
Les cellules HLA DR (+) ont été enlevées avec un
aimant pendant 5 mn. Les cellules HLA DR (-) ont ainsi pu
10 être récupérées.
- Des cellules autoloques présentatrices sont
cultivées en mélange avec des cellules répondeuses HLA DR (-)
avec différents peptides pendant 5 jours à 37°. Les réponses
en prolifération sont mesurées par l'incorporation de
15 thymidine tritiée. Les résultats consignés dans le tableau
suivant montrent l'effet inhibiteur des peptides contenant la
séquence SLWDQ. Ces expériences montrent aussi le rôle
inhibiteur des peptides issus du site de liaison de la gp/20
avec le CD4. Le site de liaison du CD4 avec la gp/20 (résidus
20 40-59 du CD4) pourra lui aussi être inhibiteur.
TABLEAU 1
PEPTIDES
(souche LAI)
25
env 105-107
env 110-114
env 110-125
4320 ± 1500
5500 ± 1780
6070 ± 1580
14670 ± 4470
12330 ± 3280
16760 ± 2530
env 312-320
4. IRIQRGPGRAF
5. KQIINMWQEVGKAMYA env 429-440
6. CRIKQINMWQEVKAMY
APPISGQIR
env 423-447
7. SSGGDPEIVTHSFNC
env 369-383
8. gp120
No peptide
12200 ± 2370
6650 ± 1880
27180 ± 5360
15130 ± 3430
5780 ± 2110
14180 ± 2300
3400 ± 1220
15400 ± 1900
14210
33360
10230
31990
1. DIISLWDOSLK
2.
SLWDO
3. SLWDOSLKPCVKLTPL
30
35
Proliferation des
lymphocytes T
PPD
SEB
± 2770
± 3460
± 2710
±
780
2694560
14
Exemple 3
On immunise des souris, comme dans l'exemple 1,
par le peptide HEDII (IS5) qui est adjacent à SLWDQ (IS1)
5 dans le HIV-1 (séquence 105-109).
On utilise les anticorps de souris dans des
expériences d'inhibition décrites à l'exemple 2 : on arrive
à diminuer l'effet inhibiteur de la gp120 grâce à ces
anticorps.
En effet, au lieu d'une inhibition de 80% en
10
présence de 300 gg de gp120, on voit une inhibition de
seulement 50% en présence d'anticorps : ces anticorps
diminuent l'efet suppresseur de la gp120.
Proliferation des
lymphocytes T
SEB
PPD
15
20
gp120
gp120 + anticorps
témoin
3400
8220
10230
17450
15400
31900
Exemple 4
Des tests ELISA ont été faits à partir des sera
25 de 14 sujets séronégatifs (contrôle), 14 sujets infectés par
le HIV-1 asymptomatiques, 14 sujets atteints de SIDA.
Les Densités optiques (D.O.) obtenues par ELISA
ont été rapportées au sérum non dilué. Pour chaque groupe, la
moyenne des réponses obtenues pour chaque peptide a été
30 calculée. Le tableau suivant présente les rapports des
moyennes obtenues pour les groupes des sujets infectés
asymptomatiques ou SIDA sur les moyennes obtenues pour les
séronégatifs.
2694560
15
On note les fortes réponses anticorps contre
DIISLWDQSLK (IS3) et contre TASQK (IS12) par rapport aux
autres peptides.
5
10
ASYMPTOMATIQUES
PEPTIDES
SIDA
SSGGDPEIVTHSFNC
(Env 365-383 HIV-1 LAI)
2.5
2
KAKRRVVQREKRAVG
(Env 505-519 HIV-1 LAI)
2.4
2.1
SLWDQ
(Env 101-117 HIV -1 LAI)
3.5
3
15
DIISLWDQSLK
(Env 107-117 HIV-1 LAI)
20
20
11
NMWQEVGKAMYA
(Env 430-441 HIV-1 LAI)
1.9
1.5
TASQK
(CD4 17-21)
5
4
25 IDENTIFICATIONS DE SEQUENCES : Les numérotations sont faites
par rapport à la souche LAI ou bien HXB2 (G. Myers et al
1991).
IS1) Peptide HIV-1 : enveloppe 110-114 (5 acides aminés)
SLWDQ
30 IS2) Peptide CD4 : GNFPL (CD4 65-69) (5 acides aminés)
IS3) Peptide donnant une réponse ELISA très forte chez les
sujets infectés par le VIH-1 : enveloppe 107-117 (11 acides
aminés)
DIISLWDQSLK
2694560
16
IS4) Peptide adjacent à SLWDQ : enveloppe 115-125 (11 acides
aminés)
SLKPCVKLTPL
IS5) Peptide HIV-1 : enveloppe 105-109, adjacent à SLWDQ (5
5 acides aminés)
HEDII
IS6) Peptide holomogue à SLWDQ (5 acides aminés)
SLVDQ
Ce peptide perd de son activité inhibitrice
10 IS7) Peptide HIV-1 : enveloppe 105-114 (10 acides aminés)
HEDIISLWDQ
IS8) Peptide contenant à la fois une partie active de
l'enveloppe pour la liaison avec le CD4 (cf exemple 2) et le
peptide IS7 suppresseur, séparés par des résidus inter15 médiaires, par exemple G (Enveloppe (426-441) et Enveloppe
(105-107) :
KQIINMWQEVGKAMYA(G)nHEDIISLWDQSLK
IS9) Peptide HIV-1 : Enveloppe 105-117 (13 acides aminés)
HEDIISLWDQSLK
20 IS10)
HEDLQ (5 acides aminés)
IS11)
PRTSV (5 acides aminés)
IS12)
TASQK (CD4 17-21) (5 acides aminés)
2694560
17
REVENDICATIONS
1. Peptide, ainsi que les dérivés le renfermant,
caractérisé en ce qu'il présente une identité avec une partie
de la molécule dite CD4 située dans une zone essentielle à
5 l'activation des lymphocytes T dans la réponse immunitaire ou
avec une partie adjacente à cette zone dans un virus HIV1 ou
HIV2 en permettant l'élaboration d'anticorps bloquant cette
zone, en ce qu'il comporte de 5 à 12 acides aminés et en ce
qu'il comprend une séquence présentant une identité avec
10 l'une des séquences SLWDQ (CD4 : résidus 17-21 et Env HIV-1),
TASQK CD4 : résidus 17-21 et Env HIV-1), GNFPL (CD4 : résidus
65-69 et Gag HIV-1 ou HIV-2), DIISLWDQSLK, SLKPCVKLTPL, ou
HEDII.
2. Peptide ainsi que les dérivés le renfermant,
15 selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient
une séquence commune à une protéine virale et au CD4.
3. Peptide selon l'une des revendications 1 et 2,
caractérisé en ce qu'il comprend en plus d'un peptide défini
à la revendication 1 ou 2, une séquence issue du site de
20 liaison de gp120 avec la molécule CD4, provenant de HIV-1 ou .
deHIV-2(résiu4350dansEvHIV-1LA).
4. Dérivé d'un peptide selon la revendication 1,
_2 ou 3, caractérisé en ce que le dérivé correspond à l'association de dits peptides à l'aide de ponts polyglycine (G)n
25 linéaires, ou à l'aide de bras polylysine créant une structure "en candélabre".
5. Anticorps dirigés contre les peptides ou leurs
dérivés tels que définis à l'une des revendications 1 à 4.
6. Procédé de préparation de peptides ou de leurs
30 dérivés, caractérisé en ce que l'on prépare, selon des
méthodes connues en elles-mêmes, des peptides ou leurs
dérivés tels que définis à l'une des revendications de 1 à 4.
7. Procédé de préparation d'anticorps, caractérisé en ce que l'on prépare, selon des méthodes connues en
35 elles-mêmes, l'un au moins des anticorps tels que définis à
2694560
18
la revendication 5.
8. Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont
constitués par l'un des peptides ou leurs dérivés définis à
l'une des revendications 1 à 4.
5
9. Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont
constitués par l'un des anticorps définis à la revendication
5.
10. Compositions pharmaceutiques caractérisées en
ce qu'elles renferment à titre de principe actif, l'un au
10 moins des médicaments tels que définis à l'une des revendications 8 ou 9.
11. Kits de diagnostic caractérisés en ce qu'ils
renferment l'un au moins des peptides, leurs dérivés ou des
anticorps définis à l'une des revendications 1 à 5.
15 12. Médicaments caractérisés en ce qu'ils sont
constitués d'un peptide ou de l'un des dérivés le renfermant,
ledit peptide présentant une identité avec une partie de la
molécule dite CD4 située dans une zone essentielle à l'activation des lymphocytes T dans la réponse immunitaire ou avec
20 une partie adjacente à cette zone dans un virus HIV1 ou HIV2 .
enprmtal'éboindatcrpsbloqunetz,
et en ce qu'il comporte de 4 à 200 acides aminés.
13. Médicaments selon la revendication 12,
-caractérisés en ce que ledit peptide comporte de 4 à 20
25 acides aminés.
14. Médicaments selon la revendication 12 ou 13,
caractérisés en ce que ledit peptide comprend une séquence
présentant une identité avec l'une des séquences SLWDQ (CD4 :
résidus 17-21 et Env HIV-1), TASQK CD4 : résidus 17-21 et Env
30 HIV-1), GNFPL (CD4 : résidus 65-69 et Gag HIV-1 ou HIV-2)
DIISLWDQSLK, SLKPCVKLTPL, ou HEDII.
15. Médicaments selon l'une des revendications 12
à 14, caractérisés en ce que ledit peptide comprend, en plus
d'un peptide défini selon l'une des revendications 12 à 14,
35 une séquence issue du site de liaison de gp120 avec la
molécule CD4, provenant de HIV-1 ou de HIV-2 (résidus 423-450
2694560
19
dans Env HIV-1 LAI).
16. Médicaments selon l'une des revendications 12
à 15, caractérisés en ce qu'ils sont constitués d'un dérivé
de peptide qui correspond à l'association de tels peptides à
5 l'aide de ponts polyglycine (G)n linéaires, ou à l'aide de
bras polylysine créant une structure "en candélabre".
N°d'enregistrement national:
92 09884
N'ide publication:
2694560
RAPPORT DE RECHERCHE
articles L.612-14 et L.612-17 du code de la propriété intellectuelle;
articles 40 à 53 du décret n° 79-822 du 19 septembre 1979 modifié
OBJET DU RAPPORT DE RECHERCHE
Après l'accomplissement de la procédure prévue par les textes rappelés ci-dessus,
le brevet est délivré. L'Institut National de la Propriété Industrielle n'est pas habilité, sauf
dans le cas d'absence manifeste de nouveauté, à en refuser la délivrance. La validité d'un
brevet relève exclusivement de l'appréciation des tribunaux.
L'I.N.P.I. doit toutefois annexer à chaque brevet un "RAPPORT DE RECHERCHE"
citant les éléments de l'état de la technique qui peuvent être pris en considération pour
apprécier la brevetabilité de l'invention. Ce rapport porte sur les revendications figurant au
brevet qui définissent l'objet de l'invention et délimitent l'étendue de la protection.
Après délivrance, l'I.N.P.I. peut, à la requête de toute personne intéressée, formuler
un ''AVIS DOCUMENTAIRE" sur la base des documents cités dans ce rapport de recherche
et de tout autre document que le requérant souhaite voir prendre en considération.
CONDITIONS D'ÉTABLISSEMENT DU PRÉSENT RAPPORT DE RECHERCHE
Le demandeur a présenté des observations en réponse au rapport de recherche
préliminaire.
❑
Le demandeur a maintenu les revendications.
Cg
Le demandeur a modifié les revendications.
1E3
Le demandeur a modifié la description pour en éliminer les éléments qui n' étaient
plus en concordance avec les nouvelles revendications.
D
Les tiers ont présenté des observations après publication du rapport de recherche
préliminaire.
❑
Un rapport de recherche préliminaire complémentaire a été établi.
DOCUMENTS CITÉS DANS LE PRÉSENT RAPPORT DE RECHERCHE
g
Les documents énumérés à la rubrique 1 ci-après sont susceptibles d'être pris en
considération pour apprécier la brevetabilité de l'invention.
❑
Les documents énumérés à la rubrique 2 ci-après illustrent l'arrière-plan
technologique général.
❑
Les documents énumérés à la rubrique 3 ci-après ont été cités en cours de
procédure, mais leur pertinence dépend de la validité des priorités revendiquées.
❑
Aucun document n'a été cité en cours de procédure.
BT563/0 41093
La répartition des documents entre les rubriques 1, 2 et 3 tient compte, le cas
échéant, des revendications déposées en dernier lieu et/ou des observations présentées.
2694560
N° d'enregistrement national :
92 09884
N° de publication
1. ELEMENTS DE L'ETAT DE LA TECHNIQUE SUSCEPTIBLES D'ETRE PRIS EN
CONSIDERATION POUR APPRECIER LA BREVETABILITE DE L'INVENTION
Référence des documents
(avec indication, le cas échéant, des parties pertinentes)
Revendications
du brevet concernées
EP-A-O 344 006 (ORTHO PHARMACEUTICAL CORPORATION)
page 3, ligne 24 - ligne 31 ;
revendications
1 à 16
WO-A-9 013 562 (GENELABS, INC.)
exemple 8
1à4,8,10,
12à16
WO-A-9 000 566 (THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA)
revendications
là4,8,10,
12à16
EP-A-0 448 099 (KUREHA CHEMICAL INDUSTRY JCO, LTD.)
page 10, ligne 1 - ligne 5 ;
revendications
là4, 8,10,
12 à 16
THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION vol. 88, n° 3,
Septembre 1991, NEW YORK, US, pages 876-884
J. BERZCFSKY ET AL. 'Construction of peptides encompassing
multideterminant clusters of human immunodeficiency virus
envelope to induce in vitro T cell response in mice and
humans of multiple MHC types.'
abrégé ; tableau 1
1à4, 8,10,
12 à 16
2. ELEMENTS DE L'ETAT DE LA TECHNIQUE ILLUSTRANT
L'ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE GENERAL
NEANT
3. ELEMENTS DE L'ETAT DE LA TECHNIQUE
DONT LA PERTINENCE DEPEND DE LA VALIDITE DES PRIORITES
Référence des documents
(avec indication, le cas échéant, des parties pertinentes)
Revendications
du brevet concernées
BT159/100694
NEANT