DS 3 - Biologie
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DS 3 - Biologie NOM : 11a But = connaître le rôle de l'internaline Bactéries attachées à 100% (normalisé) pour WT et mutant (incertitudes) => pas d'effet de Inl sur la fixation des bactéries sur la membrane. 1 Bactéries intracelluaires à 100 % pour WT mais 35% pour le mutant => rôle de l'internaline = permettre l'entrée de la bactérie pathogène dans la cellule hôte. 11b But = trouver sur quelle molécule de la cellule épithéliale se lie l'internaline gel de chromatographie contenant de l'internaline qui va "pêcher" la protéine cible, retenue puis éluée extrait cellulaire total : nombreuses protéines des cellules épithéliales Caco-2 La colonne permet de récupérer 2 protéines P110 et P80, dans les fractions 4 à 11 témoin = BSA : rien ne s'est lié au BSA. Donc spécificité de la liaison internaline / P110 ou P80 Comparaison de séquence pour identifier P110 et P80 : E-cadhérine 11c But = relier la E-cadhérine avec l'internalisation de Listeria Ac rouges révèle la E-cadhérine en surface de la cellule : pareil pour des cellules avec ou sans internaline => il y a de la E-cadhérine dans tous les cas Ac verts révèlent les E-cadhérines qui sont à l'intérieur des cellules (rendues perméables aux Ac) : pas de Ecadhérine si pas d'internaline mais de la E-cadhérine si internaline => l'internaline est nécessaire pour faire entrer la E-cadhérine, protéine membranaire. Hypothèse d'endocytose spécifique par liaison E-cadhérine / internaline de la mb bactérienne 2 12a Comparaison des clichés bleu et vert : la bactérie de gauche est présente en vert mais pas en bleu donc elle n'est pas extracellulaire mais intracellulaire. Elle a été internalisée. 2 12b 12c 21a 21b la concentration de clathrine est importante qu niveau des bactéries, surtout celle internalisée. Pour celle de droite, elle est probablement en cours d'endocytose. Donc l'internalisation de Listeria ne se fait pas par phagocytose mais endocytose spécifique. But = préciser l'interaction E-cadhérine / clathrine figure 6a - Cellules sauvages = témoin : 85% des bactéries ont lié la E-cadhérine 55% la clathrine figure 6a - si la E-cadhérine est mutée, la bactérie peut la lier (% équivalent aux incertitudes près) mais ne recrute plus que 5% de clathrine => les tyrosines de la E-cadhérine sont importantes pour lier la clathrine. figure 6b - dans les 2 cas, la bactérie est internalisée => plus complexe ? Autre voie que endocytose ? Ac anti-tyrosine phosphorylée absent en début d'infection : absence de molécule phosphorylée Ac anti-tyrosine visible entre 5 et 30 minutes et se lie à une protéine de 130 kDa Absence de marquage si PP1 : Listeria induit donc la phosphorylation de tyrosine par la kinase Src Identification de la protéine phosphorylée = E-cadhérine car même PM (130 kDa) Cette phosphorylation des tyrosines est nécessaire pour recruter la clathrine (cf 12b) SCHEMA BILAN Travail sur des membranes => protéines membranaires détergent => on peut récupérer les protéines intrinsèques western blot => identification de GLUT1 = une bande de protéine de 55 kDa environ PM de GLUT1 = 220 kDa donc GLUT1 = protéine quaternaire de 4 sous-unités identiques de 55 kDa protéine intrinsèque avec des segments hydrophobes donc idée d'hélices transmembranires 12 hélices alpha transmembranaires (ou brins béta) car 12 domaines d'indice = 2 et 3 grandes boucles extérieuresà la membrane car hydrophiles 21c Ac fluorescent dirigé contre la boucle C-terminale. Ac ne traverse pas la membrane. témoin sans ajout d'AC : jamais de fluorescence Ac ne se fixe que si la membrane est inversée donc la boucle est cytosolique SCHEMA DE GLUT1 : 4 sous-unités et les boucles + orientation Membrane artificielle perméable => entrée proportionnelle à la concentration = diffusion simple avec une 22 pente = coefficient de perméabilité membrane d'hématie : imperméable au L-glucose donc pas de diffusion, la membrane d'hématie est imperméable au glucose 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 2 1 1 1 2 1 1 2 1 1 1 5 1 1 1 1 1 2 1 1 2 3 1 2 entrée de D-glucose très importante à faible concentration : GLUT1 fixe spécifiquement le D-glucose et permet son entrée à travers la membrane imperméable = transporteur spécifique 2 effet de saturation pour plus de 8 mM de glucose avec un flux maximal de 500 mmol/s => idée d'un transporteur saturé : à forte concentration en glucose, tous les GLUT1 sont occupés glycémie de 1 g/l = 5,5 mM = presque le plateau Rôle de GLUT1 = favoriser l'entrée du D-glucose donc l'approvisionnement des hématies 2 TOTAL 1 1 61 TOTAL 2 2 1 2 2 70 Compétences A - recueillir des informations, analyser et hiérarchiser B - Mobiliser les connaissances, structurer le raisonnement, maîtriser la causalité C - Exercer son esprit critique, identifier un problème et remettre en cause un modèle D - Présenter graphiquement les conclusions des analyses E - Communiquer (syntaxe, précision, concision, soin, orthographe, présentation...)
