Résumé Les lymphocytes de type «Natural Killer» (NK)

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Résumé
Les lymphocytes de type «Natural Killer» (NK) sont des effecteurs de l’immunité innée,
capables de lyser les cellules cancéreuses grâce au relargage de la sérine protéase Granzyme
B (GzmB). Récemment, de nouvelles stratégies anti-cancéreuses, basées sur l’utilisation des
cellules NK, ont émergé et se sont révélées très prometteuses. Il est actuellement clairement
établi que le microenvironnement tumoral hypoxique influence la réponse immunitaire et
constitue, de ce fait, un obstacle majeur pour établir des protocoles d’immunothérapie
efficaces. Nous avons démontré que les cellules du cancer du sein cultivées dans un
environnement hypoxique sont résistantes à la lyse dépendante des cellules NK par un
mécanisme impliquant l'activation de l'autophagie. De manière intéressante, l’inhibition de
l’autophagie supprime cette résistance et restore la lyse dépendante des cellules NK. Nous
avons démontré que la résistance des cellules tumorales hypoxiques à la lyse par les cellules
NK n'est liée ni à un défaut de reconnaissance des cellules cibles, ni à une altération de
l’activité cytotoxique des cellules NK. Nous avons mis en évidence que l'activation de
l’autophagie dans les cellules cancéreuse sous stress hypoxique conduit à la dégradation de
GzmB dans les lysosomes, rendent ainsi les cellules tumorale résistantes à la mort cellulaire
dépendent des NK . L’invalidation génétique et pharmacologique de l'autophagie permet de
restaurer le niveau intracellulaire de GzmB et réduit la résistance des cellules cibles
hypoxiques in vitro. Nos résultats prouvent que l'autophagie est un régulateur important de
la réponse immunitaire anti-tumorale dépendante des cellules NK. Nous avons validé ce
concept in vivo en démontrant que l’inhibition de l'autophagie diminue significativement la
croissance tumorale dans des modèles murins de mélanome et de carcinome mammaire.
Nous avons démontré que cette diminution du volume tumorale est due à une amélioration
de la réponse immunitaire dépendent des cellules NK. . Cette étude contribue à l’avancé des

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connaissances sur la manière dont l'autophagie, induite par l'hypoxie, affecte la lyse
dépendante des cellules NK et ouvre la voie à la formulation de nouvelles stratégies
thérapeutiques anti-tumorales combinant l’utilisation des cellules NK avec des inhibiteurs
d'autophagie.
L’obstacle majeur pour définir un protocole d'immunothérapie efficace pour le traitement
des tumeurs solides est la capacité du microenvironnement tumorale à inhiber la réponse
immunitaire de l'hôte au niveau local et systémique. Le microenvironnement tumoral est une
structure dynamique et complexe composée de cellules malignes et de cellules qui
influencent l'évolution du cancer, tels que les cellules endothéliales et les cellules
immunitaires. Le microenvironnement tumoral est ainsi considéré comme un aspect
important de la biologie du cancer, car il peut promouvoir la transformation néoplasique,
soutenir la croissance de la tumeur et augmenter sa capacité invasive, protéger les tumeurs
contre l'immunité de l'hôte et induire la résistance à la chimiothérapie. Les cellules
immunitaire de type NK sont des larges lymphocytes granulaires CD3-/TCR-/CD56+, qui jouent
un rôle fondamental dans l'immunité antitumorale innée et participent à
l'immunosurveillance des tumeurs. Ils peuvent induire directement la mort des cellules
tumorales par l'engagement des récepteurs de mort (Fas et TRAIL) et la libération de granules
contenant le granzyme B et la perforine; ou indirectement par cytotoxicité cellulaire
dépendante des anticorps (ADCC).
Le rôle des cellules NK dans la régression tumorale a été étudié par plusieurs groupes de
recherche montrant que l'infiltration de la tumeur par les cellules NK prédit un pronostique
favorable dans plusieurs types des cancers. L'activité cytolytique des cellules NK est régulée

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par l'expression des récepteurs activateurs et inhibiteurs qui dictent ensemble le sort des
cellules tumorales cibles. Ainsi, l'activité cytolytique des cellules NK est inhibée par
l'interaction entre les molécules HLA de classe I exprimées à la surface des cellules cibles, et
les récepteurs de type Immunoglobulines (KIR) et/ou CD94/NKG2A, exprimés à la surface des
cellules NK. L'activation des cellules NK est déclenchée par NKp46, NKp30, NKp44 ainsi que
CD226 et NKG2D. L’augmentation, à la surface des cellules cancéreuses, des protéines
inductibles par le stress, telles que MICA/B et les protéines ULBPs, conduit à l'activation des
cellules NK par l'engagement de NKG2D. La perte de l'allèle HLA de classe I et l’augmentation
de MICA/B et ULBP1 est une caractéristique commune des tumeurs ciblées par les cellules
NK.
Les données accumulées suggèrent qu’un microenvironnement hypoxique protège les
cellules cancéreuses de la réponse immunitaire anti-tumorale par des mécanismes multiples.
Nous avons récemment rapporté que, dans des conditions hypoxiques, les cellules tumorales
résistent à la lyse par les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) d’une façon dépendante de STAT3.
L’hypoxie contribue également à la reprogrammation des cellules dendritiques (DC) et
maintient l'inflammation via l'induction d'un phénotype pro-inflammatoire des DCs. En
hypoxie, les cellules tumorales secrètent différentes chimiokines, tels qu’EMAP-II, VEGF,
endothéline 2, et MCP-1/CCL2. La sécrétion de ces cytokines conduit à l'accumulation de
macrophages associés aux tumeurs (TAM) et de lymphocytes T régulateurs (Treg). Les TAM
et les Treg produisent du TGF-β qui influence négativement la prolifération et l'activité des
cellules NK. De plus, il a été proposé que l'hypoxie contribue à l'échappement des cellules de

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cancer de la prostate à l'immunosurveillance par les cellules NK du fait l'augmentation du
clivage des molécules MIC à la surface des cellules tumorales.
Il est désormais établi que l'adaptation des cellules cancéreuses au stress hypoxique peut
également se produire au travers de l'activation de l’autophagie, qui est un processus
responsable de la dégradation et du recyclage de protéines à longue durée de vie et
d’organites cytoplasmiques, au sein de structures bien caractérisées nommés
autophagosomes. Récemment, le rôle de l'autophagie a été élargi aux fonctions
immunologiques et aux interactions avec les cellules immunitaire dans le
microenvironnement tumoral.. Ces études mettent en évidence l'autophagie comme un
acteur important dans la régulation de l'immunité antitumorale, néanmoins aucune donnée
n'est actuellement disponible pour expliquer les mécanismes par lesquels l'autophagie régule
la réponse immunitaires des cellules NK en hypoxie.
Bien que des essais cliniques utilisant l'immunothérapie basée sur les cellules NK aient montré
des résultats prometteurs pour le traitement des hémopathies malignes, les tumeurs solides
sont fréquemment résistantes à ce type de thérapie. Comprendre les mécanismes
moléculaires qui permettent l'échappement des tumeurs à la surveillance par les cellules NK
est une question primordiale. Nous avons démontré in vitro que l'hypoxie réduit la
susceptibilité à la lyse NK des cellules du cancer du sein grâce à un mécanisme impliquant
l'activation de l'autophagie et la dégradation subséquente de la protéine granzyme B (GzmB)
dérivée des NK. Nous avons montré in vivo que l’inhibition de l'autophagie dans les tumeurs
hypoxiques induit une régression tumorale en facilitant l'élimination des cellules cancéreuses

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par les NK. Cette étude met en évidence l’autophagie comme un mécanisme important de la
résistance des cellules tumorales à la lyse par les cellules NK.
Nous avons examiné si l'hypoxie influence la lyse par les cellules NK des cellules MCF-7
dérivées d'adénocarcinome du sein. En utilisant des cellules NK isolées à partir de cellules
mononuclées de sang périphérique (PBMC) de huit donneurs sains (D1 à D8 ), nous avons
démontré que, malgré la variabilité du potentiel cytolytique des cellules NK entre donneurs ,
le pourcentage de lyse des cellules MCF- 7 hypoxiques a été diminué par rapport à celui des
cellules MCF- 7 en normoxie dans tous les cas.
Cette diminution est corrélée avec l'induction du flux d’autophagie caractérisée par la
dégradation de la protéine p62/sequestosome 1 (SQSTM1), l'accumulation de la protéine LC3
–II dans les cellules traitées à la chloroquine (CQ), et la formation d’autophagosomes dans les
cellules hypoxiques. La vidéomicroscopie de cellules MCF-7 normoxiques ou hypoxiques
exprimant la protéine recombinante GFP-LC3 co-cultivées avec des cellules NK marquées en
rouge à l’aide du marqueur fluorescent PKH-26 a confirmé que les cellules tumorales
normoxiques sont efficacement lysées par les cellules NK par rapport à des cellules tumorales
hypoxiques dans lesquelles plusieurs autophagosomes sont observés. En outre, la
vidéomicroscopie réalisée dans les mêmes conditions en présence d'iodure de propidium a
fourni des preuves convaincantes que les cellules tumorales normoxiques meurent par un
mécanisme apoptotique induit par les cellules NK comparé aux cellules tumorales
hypoxiques. Des résultats similaires ont été obtenus avec la lignée cellulaire de cancer du sein
T47D, ce qui confirme que la diminution de la sensibilité des cellules tumorales à la lyse par
les cellules NK en hypoxie n'est pas limitée à la lignée cellulaire MCF-7. Nous avons montré
qu’indépendamment de l'hypoxie, l'induction d’autophagie par d'autres stimuli (par exemple