Données actuelles sur l`analyse hormonale salivaire

Données actuelles sur l’analyse hormonale salivaire
Current status of salivary hormone analysis
M. Gröschl
Department of Pediatrics,
University of Erlangen-Nürnberg,
Erlangen, Germany
Articlereçule13octobre2008,
accepté le 18 mai 2009
Résumé. La salive offre une alternative non invasive et non traumatisante à
l’utilisation du plasma et du sérum pour les dosages biologiques. Elle est une
source largement acceptée d’échantillons pour le dosage des hormones stéroï-
des, mais également de certaines amines et de peptides. Ces dernières années,
de nombreuses publications ont décrit des dosages salivaires d’hormones dans
des domaines cliniques variés ainsi qu’en recherche médicale. Cet article de
synthèse fournit une vue d’ensemble des applications courantes du dosage
salivaire d’hormones. Une description des différentes origines des hormones
présentes dans la salive est suivie d’une revue détaillée des méthodes analyti-
ques et des modes de prélèvement fiables de la salive. Différentes utilisations
du dosage biologique des hormones salivaires sont décrites dans des domaines
aussi variés que la psychiatrie, l’endocrinologie, la médecine du sport et la
médecine vétérinaire. En effet, bien que la salive ne soit pas encore devenue
une source usuelle d’échantillons pour les dosages hormonaux, elle s’est avé-
rée être fiable et dans certains cas même supérieure à l’utilisation d’autres flui-
des biologiques. Néanmoins, des progrès sont encore nécessaires pour que cet
échantillon biologique soit accepté par tous, en particulier par les cliniciens.
Il convient de développer des outils analytiques spécifiques et standardisés,
et d’établir des valeurs de référence pour les principaux biomarqueurs qui
seront dosés au niveau salivaire ; l’analyse de transférabilité entre différentes
méthodologies d’une part et les autres liquides biologiques d’autre part, est
également à réaliser. La non compliance observée chez certains patients
implique une stricte standardisation des procédures de recueil et des méthodes
analytiques.
Mots clés : salive, dosage biologique, hormone
Abstract. Saliva, which offers a noninvasive and stress-free alternative to
plasma and serum, is a widely accepted sample source for analysis of steroids
and also of certain amines and peptides. In recent years, numerous publica-
tions have described the use of salivary hormone analysis in many fields of
clinical and basic research. This review provides an overview of the current
applications of salivary hormone analysis. A description of the different of
hormone entry into saliva is followed by a detailed description of analytical
methods and approaches for reliable collection of saliva, including several
interesting applications in diverse fields including psychiatry, stress research,
clinical endocrinology, sport medicine, and veterinary medicine. Although
saliva has not yet become a mainstream sample source for hormone analysis,
revue générale abc
Ann Biol Clin 2009 ; 67 (5) : 493-504
doi: 10.1684/abc.2009.0357
Cet article a été traduit par J.-L. Beaudeux et D. Lamiable (Laboratoire de pharmacologie-
toxicologie, CHU de Reims) avec l’autorisation de l’AACC. L’AACC n’est pas responsable de
la qualité de cette traduction. Les opinions exprimées dans ce texte sont celles des auteurs, et
n’engagent ni l’AACC, ni le journal.
Cet article a été repris de Clinical Chemistry sous la référence : Gröschl M. Current status of sali-
vary hormone analysis. Clin Chem 2008 ; 54 : 1-11 avec l’accord de l’éditeur. Original copyright
© 2008 American Association for Clinical Chemistry, Inc.
Pour citer cet article, indiquer la publication originale dans Clinical Chemistry.
Pour toute correspondance : <[email protected]>
Tirés à part : J.-L. Beaudeux
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it has proven to be reliable and, in some cases, even superior to other body
fluids. Nevertheless much effort will be required for this approach to receive
acceptance over the long term, especially by clinicians. Such effort includes
the development of specific and standardized analytical tools, the establish-
ment of defined reference intervals, and implementation of round-robin trials.
One major problem, the lack of compliance sometimes seen in outpatient
saliva donors, requires strict standardization of both collection and analysis
methods to achieve better comparability and assessment of published salivary
hormone data.
Key words: saliva, hormone, biological measurement
L’utilisation de la salive comme échantillon biologique
pour le dosage d’hormones est devenue de plus en plus
intéressante pour les cliniciens et les chercheurs, car il
s’agit d’une alternative non invasive et non traumatisante
par rapport au prélèvement sanguin, fournissant habituel-
lement le plasma et/ou le sérum qui sont les fluides usuels
pour la détermination des biomarqueurs endocriniens tels
que les hormones stéroïdes, les amines et les peptides.
Durant ces quarante dernières années, les biologistes ont
utilisé la salive comme prélèvement biologique annexe et
peu courant. Les revues antérieures de Riad-Fahmy en
1982 [1] et de Lewis en 2006 [2] se sont attachées à l’ana-
lyse salivaire de nombreuses hormones stéroïdes, mais de
nombreuses études ont également démontré que l’échan-
tillon salivaire est une alternative intéressante pour l’ana-
lyse d’hormones non stéroïdiennes. Cette revue fournit
une vue d’ensemble des méthodologies bien établies et
de celles en perspective pour l’analyse salivaire d’hormo-
nes, et montre l’application de ces méthodes à des domai-
nes aussi divers que la psychologie, l’endocrinologie, la
fertilité, la médecine du sport et la recherche comporte-
mentale expérimentale.
Principe du passage des hormones
dans la salive
La salive a des fonctions multiples y compris d’assurer
l’humidification de la muqueuse de la sphère digestive
supérieure, ce qui est indispensable pour la mastication
et la déglutition des aliments. Des enzymes assurant une
digestion initiale des nutriments, par exemple l’amylase,
sont ainsi présentes au niveau salivaire. La salive participe
également à la réaction immunologique locale, par la pré-
sence d’immunoglobulines A et de molécules peptidiques
antibactériennes, dont l’action est d’inhiber la proliféra-
tion de la flore microbienne orale. Enfin, la salive contient
de nombreuses molécules endogènes, notamment hormo-
nales, qui soit proviennent de la circulation sanguine, soit
sont synthétisées et sécrétées par les glandes salivaires
elles-mêmes (figure 1).
La vitesse de transfert des molécules hormonales de la
circulation sanguine dans le liquide salivaire est régie
par la diffusion à travers les couches lipidiques des capil-
laires et des cellules épithéliales glandulaires. Des molécu-
les lipophiles telles que les hormones stéroïdes passent ces
barrières beaucoup plus rapidement que les molécules
hydrophiles telles que des peptides [3]. Il s’agit réellement
d’une diffusion passive à travers la paroi capillaire, la
membrane basale et les cellules acinaires, selon un gra-
dient de concentration. Ainsi, les concentrations salivaires
des hormones stéroïdes liposolubles non conjuguées telles
que le cortisol reflètent les concentrations plasmatiques
des mêmes formes non liées aux protéines plasmatiques
(10 %), alors que les stéroïdes conjugués hydrophiles tels
que le sulfate de déhydroépiandrostérone ne sont présents
au niveau salivaire qu’à moins de 1 % de sa concentration
plasmatique [4].
Les stéroïdes ne sont habituellement pas métabolisés en
molécules plus polaires, hydrosolubles, par les glandes
salivaires, à l’opposé de molécules excrétées par voie
rénale. La salive est donc un milieu biologique préférable
àl’urine pour une alternative non invasive de mesures des
stéroïdes hormonaux. Une transformation significative de
cortisol en cortisone au niveau des glandes salivaires par
la 11β-hydroxystéroïde-deshydrogénase-II, entraîne néan-
moins la transformation du cortisol en une forme céto-
nique inactive [5]. Cette transformation enzymatique est
souvent sous-estimée lorsque le cortisol salivaire est
mesuré, ce qui peut expliquer certaines discordances des
concentrations de cortisol rapportées dans la littérature.
Selon la réactivité croisée des anticorps utilisés dans les
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immunodosages, les résultats peuvent refléter non seule-
ment les concentrations de cortisol mais également celles
d’autres glucocorticoïdes aussi présents.
Certaines hormones peptidiques telles que l’insuline [6]
sont transportées activement dans la salive, alors que
d’autres, notamment certaines cytokines [7, 8] sont pro-
duites par les glandes salivaires elles-mêmes. Des transpor-
teurs spécifiques pour l’insuline sont présents dans la
muqueuse buccale, comme cela a été démontré après
application sublinguale de l’hormone chez des rats [9].
La sélectivité de ce transport actif est démontrée par le
fait que l’insuline est présente dans la salive à des concen-
trations similaires aux concentrations plasmatiques après
ingestion de glucose, mais le produit de clivage de l’insu-
line, le peptide C qui est de taille similaire, n’est pas pré-
sent dans la salive.
Les peptides sécrétés par les glandes salivaires le sont par
exocytose directe dans la lumière acinaire. Un transport
actif existe également, ce qui pose des problèmes d’inter-
prétation des concentrations salivaires des peptides qui ne
sont pas toujours corrélées à leur concentration plasma-
tique comme c’était le cas pour les hormones stéroïdes.
Pour certaines cytokines telles que le TNFαet la leptine,
les concentrations salivaires apparaissent plus faibles que
les concentrations plasmatiques [10, 11]. En fait, puisque
les concentrations fréquentes au niveau salivaire de diffé-
rents peptides hormonaux ne sont actuellement pas dispo-
nibles, l’évaluation de ces peptides au niveau salivaire est
plus utilisée qualitativement comme marqueur de la pré-
sence de ces molécules dans différentes pathologies inté-
ressant la sphère buccale (ou la sphère digestive haute)
plutôt que comme une alternative non invasive au dosage
plasmatique [12, 13].
Prélèvement et analyse de la salive
Techniques de prélèvement
Bien que le prélèvement sélectif de la salive d’une glande
salivaire soit possible, soit par aspiration soit par canulation,
la salive mélangée des glandes salivaires est en pratique la
méthode utilisée en routine à la fois en recherche clinique et
pour une activité de soin. Dans de nombreuses études, le
prélèvement a été réalisé en demandant aux patients de cra-
cher directement dans le récipient de prélèvement.
Dosages hormonaux salivaires
Conjugué de stéroïdes et de
l'amine
Capillaire
Acini
Gaine striée
Non conjugué de stéroïde et de l'amine
Après conversion du stéroïde
Peptide de transport de sérum
Peptide produit par les glandes
salivaires
Tunnel de transport des protéines
Enzyme de conversion de
stéroïdes
Expression et sécrétion
Transport actif
Difussion passive
Ecoulement du sang
Flux de salive
Figure 1. Mécanismes de transport des hormones dans la salive. Les hormones stéroïdes conjuguées aux protéines de transport
spécifiques pénètrent dans les glandes salivaires par diffusion passive (avec éventuellement une conversion enzymatique comme c’est
le cas pour le cortisol qui est transformé en cortisone) ou active (insuline par exemple). Une expression par les glandes salivaires elles-
mêmes a également été décrite (EGF).
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La volonté de cracher est considérée comme un stimulus
suffisant, produisant plus de 1 mL/min de salive, alors que
le simple fait de baver est réputé fournir de la salive sans
stimulation des glandes salivaires. Ce mode de prélève-
ment direct a différents inconvénients, en particulier une
réticence culturelle de certains patients à cracher [14], par-
ticulièrement chez les patients en milieu gériatrique.
De plus, une sécheresse buccale rend souvent très difficile
le prélèvement salivaire, en particulier chez les sujets âgés
[15]. Pour augmenter le flux salivaire, l’application
d’acide citrique sur la langue a été fréquemment utilisée,
induisant une sécrétion salivaire de 5 à 10 mL/min.
Cependant l’utilisation de l’acide citrique peut induire
des interférences avec les immunodosages en diminuant
le pH de l’échantillon [16]. Finalement, dans la majorité
des études, la salive est recueillie en utilisant un tissu
absorbant placé à l’intérieur de la bouche, qui est ensuite
centrifugé pour récupération du liquide salivaire.
Dispositifs de prélèvement commerciaux
Différents dispositifs de prélèvement de la salive ont été
commercialisés, qui apparaissent tout à fait utilisables
pour les examens salivaires hormonaux. Bien sûr, il faut
veiller à utiliser des matériels qui n’absorbent pas ou ne
modifient pas les analytes à doser. Certaines matières tel-
les que le Parafilm
®
[17] et le coton [18] sont connues
pour absorber les molécules d’intérêt, conduisant à des
concentrations faussement abaissées. A l’heure actuelle,
les systèmes de prélèvement les plus utilisés sont : la
Salivette
®
(Sarstedt, figure 2A), le Quantisal
®
(Immunaly-
sis, figure 2B), et l’Intercept
®
(Orasure Technologies,
figure 2C). Ces systèmes utilisent un tampon de prélève-
ment à insérer à l’intérieur de la bouche soit sous la lan-
gue, soit contre la joue. Ce tampon absorbant est conservé
dans la bouche pendant une période fixe (en général 1 à 2
minutes) pour s’imprégner de la salive, puis il est transféré
dans le récipient de stockage. Après centrifugation, la
salive est récupérée. Ces systèmes commerciaux ont mon-
tré leur intérêt en fournissant des résultats reproductibles
pour la majorité des hormones salivaires de nature stéroï-
dienne et peptidique [19]. Cependant, la version « coton »
de la Salivette
®
doit définitivement être proscrite, en rai-
son d’interférences avec de nombreux immunodosages. À
l’opposé des systèmes que nous venons de décrire, le
revue générale
AB
CD
1
7
8
9
10
11 12
2
3
45
6
Figure 2. Dispositifs commerciaux de collection de la salive.A: trois versions du Salivette
®
avec des supports du polyester (1),
polyéthylène (2), ou coton (3) et les tubes récipients. B: le Quantisal
®
se compose d’une garniture de cellulose (4) sur une tige en
plastique avec une fenêtre (5) d’indication du volume d’échantillon. Un récipient témoin incluant le conservateur (6) fait partie du sys-
tème. C:l’Intercept
®
se compose également d’une garniture de cellulose (7) sur une tige en plastique, le récipient du système ne
contient pas de conservateur (8). D: le SCS
®
se compose d’une solution de rinçage de la bouche (9), d’une solution de collection (10),
d’un récipient de collection (11), et d’une unité de conservation contenant le conservateur (poudre lyophilisée (12).
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Saliva Collection System
®
(Greiner BioOne, figure 2D)
utilise une procédure plus élaborée comprenant des liqui-
des de rinçage et liquides de prélèvement. Les résultats
analytiques obtenus avec ce système de prélèvement
sont tout à fait comparables pour la majorité des hormo-
nes peptidiques et stéroïdiennes [19].
Méthodes analytiques pour le dosage
des hormones dans la salive
Aspect préanalytique
L’analyse salivaire fiable exige le recueil, le stockage et la
préparation des échantillons, ainsi que les procédures pour
chacune de ces étapes bien définies, mais pouvant varier
selon la molécule d’intérêt à doser. Les stéroïdes, en fonc-
tion de leur grande stabilité dans le fluide salivaire, posent
le moins de problème. Les androgènes et glucocorticoïdes
sont stables pendant plusieurs jours, même dans des
échantillons maintenus à température ambiante, mais le
stockage pour une période plus longue doit tout de
même être proscrit [20]. L’addition d’agents conservateurs
prolonge significativement la stabilité des stéroïdes sali-
vaires [21], permettant ainsi l’envoi au laboratoire par
voie postale, pour des patients non hospitalisés [22].
Le dosage de peptides salivaires ou d’amines telles que
l’insuline [6] et la mélatonine [23] nécessite plus de pré-
cautions pour l’étape de prélèvement et l’étape de transfert
au laboratoire. Les peptides ont tendance à s’absorber à la
surface des tubes de prélèvement (de façon plus impor-
tante que les stéroïdes), et cette absorption entraîne une
perte significative avant le dosage. De plus, la salive
contient des enzymes protéolytiques qui peuvent dégrader
rapidement les peptides [24], particulièrement les hormo-
nes à demie-vie brève telles que la ghréline [13]. La perte
par absorption et/ou dégradation peut être prévenue par
l’utilisation de tubes de prélèvement appropriés, de cryo-
tubes à faible fixation des protéines pour le stockage, et
par l’addition de conservateurs tels que l’EDTA.
Méthodes immunologiques
Les immunodosages ont été très largement utilisés pour
l’analyse salivaire en raison de leur simplicité, du faible
volume d’échantillon nécessaire (≤100 μL) et de leur bas
niveau de détection analytique. Néanmoins, il convient
d’être vigilant sur la spécificité de ces dosages qui ne
sont pas forcément à même de différencier les hormones
dont on désire le dosage et d’éventuels interférents (cross-
reactants) que l’on peut retrouver chez certains patients :
(nouveau-nés, femmes enceintes) et dans certaines patho-
logies. Les premiers immunodosages développés pour
l’analyse des hormones stéroïdes dans la salive étaient
des méthodologies de type « Elisa maison » utilisant des
anticorps et des traceurs développés dans des laboratoires
de recherche [25, 26] ou des adaptations de trousses com-
merciales RIA à la matrice salivaire [27]. Dans la majorité
des cas, l’adaptation de trousses RIA commerciales
incluait l’ajustement de la concentration protéique du tam-
pon de la gamme d’étalonnage et la dilution des échantil-
lons, permettant ainsi une meilleure précision des dosages.
Ces méthodes RIA « ajustées » ne pouvaient cependant
pas être utilisées pour l’analyse des peptides salivaires.
La RIA a maintenant été complètement remplacée par
des méthodes de type Elisa non radioactives. Différents
fournisseurs de laboratoire (www.salimetrics.com ; www.
drg-diagnostics.de ; www.dslabs.com) proposent des
immunodosages agréés par la FDA pour des stéroïdes
salivaires. Les immunodosages salivaires pour les hormo-
nes peptidiques et les facteurs de croissance semblent
intéresser beaucoup moins ces fournisseurs de laboratoire.
Ils sont pourtant d’importance dans le cadre de certaines
pathologies, en particulier des pathologies tumorales de la
sphère ORL [28-30]. Il est probable que les nouvelles
méthodologies, utilisant des systèmes de type biopuce
[31] ou des microbilles pourront très rapidement permettre
le développement de dosages des hormones peptidiques
salivaires.
Méthodes chromatographiques
La détection par spectrométrie de masse couplée à la chro-
matographie en phase liquide a considérablement amé-
lioré ces dernières années la spécificité et la sensibilité
analytique des méthodes chromatographiques. Ces métho-
des, basées sur la formation d’ions gazeux de la molécule
ou de fragments spécifiques caractérisés et quantifiés par
leur ratio masse/charge (m/z) ont été proposées pour deux
applications distinctes. La première application, utilisée
pour les échantillons salivaires, est la détection de nou-
veaux peptides ou protéines pouvant être identifiés par
spectrométrie de masse de type MALDI-TOF [32] ou de
type SELDI-TOF [33]. Cette approche a été utilisée pour
l’exploration du protéome salivaire, mais est essentielle-
ment qualitative et la quantification des hormones détec-
tées est en général très difficile. Une seconde application a
été l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la
spectrométrie de masse en tandem pour la quantification
des hormones stéroïdes [34, 35] et de petits peptides et
amines ayant une masse moléculaire inférieure à 5 kD,
tels que la ghréline [36] et la mélatonine [37]. Il semble
que la chromatographie en phase liquide couplée à la
spectrométrie de masse en tandem (LC-MS-MS) pourrait
pallier les problèmes analytiques et/ou méthodologiques
rencontrés avec les immunodosages, et fournir un criblage
complet de l’ensemble des composés hormonaux stéroï-
diens d’un échantillon salivaire unique.
Dosages hormonaux salivaires
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