MANIP MYCORHIZES : MATERIEL ET METHODES COMPLET

UNIVERSITÉ FRANÇOIS-RABELAIS DE TOURS
FACULTÉ DES SCIENCES ET TECHNIQUES
MASTER Biologie évolutive et intégrative, infectiologie
SPECIALITE Sciences de l'insecte
La mycorhization favorise-t-elle l´accès à des formes d´azote complexes ?
Étude sur la nutrition du pin parasol Pinus pinea
par Rafael E. CÁRDENAS
juin 2010
Stage de M2 Recherche
Réalisé sous l´encadrement de Sylvain Coq et la direction de Stephan
Hättenschwiler UMR-CNRS 5175 Centre d´Ecologie Fonctionnelle et Evolutive,
Equipe Bioflux,
1919 Route de Mende 34293 Montpellier Cedex 5
A
Eduardo y Matilde
Paco y Enmita
REMERCIEMENTS
Mónica, por estar siempre conmigo, fortalecerme en mis debilidades, y hacer que la
distancia no haya sido tan grande durante este año.
Mi familia, por ser mi mayor soporte incondicional.
Verónica Crespo, por su sincera amistad, compañía y apoyo académico.
Secrétariat National de Science et Technologie de l´Équateur (SENACYT), pour le
financement de la bourse qui m´a permis d´étudier dans le cadre de ce Master. Un
remerciement à la Pontificale Université Catholique de l´Équateur, Laura Arcos Terán
(PUCE) et Olivier Dangles (IRD) pour leur appui et leur confiance.
Claudio Lazzari (directeur du Master à UFR-Tours), pour son accueil, et ses
recommandations précises au niveau académique, mais aussi dans le quotidien.
Laurette Sonie pour son chaleureux coup de main tout au long de la récolte et des
analyses des échantillons
Raphaëlle Leclerc et Bruno Buatois pour leur accueil et encadrement dans la plateforme
d´analyses chimiques.
Daniel Mousain, Frank Richard et Marc-André Sélosse, d´avoir bien voulu répondre à
toutes mes questions concernant les mycorhizes.
Marie Pierre Dubois pour son accueil dans la plateforme de génétique.
Mathieu Sauve pour son encadrement dans la plateforme génétique, son expertise, et
pour son attachement à atteindre les meilleurs résultats.
Cédric Gonneau pour sa collaboration dans l´organisation de l´envoi des échantillons au
séquençage.
Sebastián Tello pour m´avoir fourni un certain nombre d´articles.
L´équipe Bioflux (CEFE-CNRS) pour leur accueil, et plus particulièrement :
Sandra Barantal et Tanya Handa pour leur amitié, leurs conseils et les enthousiastes
discussions statistiques que nous avons pu avoir ensemble.
Stephan Hättenschwiler pour la direction du stage, son expertise au moment de prendre
les décisions importantes, et pour l´amélioration d´une version antérieure du manuscrit.
Finalement je veux remercier très spécialement Sylvain Coq pour son encadrement très
personnalisé, son amitié, sa confiance, ses recommandations, ses discussions, pour
toujours être prêt a répondre à mes questions (même durant les week-ends de
randonnée), pour avoir discuté sur les analyses et les résultats, pour son aide au travail
au laboratoire et en serre, et enfin pour ses révisions et améliorations des versions
antérieures du manuscrit.
SOMMAIRE
PARTIE I – RAPPORT BIBLIOGRAPHIQUE ..................................................... 1
1. Le cycle des nutriments dans le fonctionnement des écosystèmes .....................
1.1. Le cycle de l´azote.............................................................................................
2. Les mycorhizes........................................................................................................
2.1. Les types de mycorhizes et leurs différents stratégies pour la prise et le
transport des métabolites organiques et inorganiques ..............................................
3. Les polyphénols et les complexes tannins protéines ............................................
3.2. Rôle des polyphénols et des tannins dans le fonctionnement des écosystèmes
3.2. Rôle des TPC dans les cycles des nutriments....................................................
3.3. Les mycorhizes et l´utilisation de l´azote contenu dans les TPC ......................
4. Perspectives .............................................................................................................
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PARTIE II – RAPPORT DE STAGE ...................................................................... 13
Résumé ......................................................................................................................... 14
Abstract......................................................................................................................... 15
Resumen ....................................................................................................................... 16
1. Introduction ............................................................................................................
2. Matériel et méthodes ..............................................................................................
2.1. Design expérimental ..........................................................................................
2.2. Mesures sur les plantules...................................................................................
2.2.1. Croissance...................................................................................................
2.2.2. Mesures de biomasse ..................................................................................
2.2.3. Analyses C, N .............................................................................................
2.3. Vérification du statut mycorhizien ....................................................................
2.3.1. Morphotypage et estimation de la densité de mycorhization .....................
2.3.2. Identification moléculaire : extraction de l´ADN et amplification PCR ....
2.3.3 Identification moléculaire : séquençage ......................................................
2.4. Analyses statistiques..........................................................................................
2.4.1. Différences de croissance, biomasse et d´allocation C, N sur (L) et (Fr)...
3. Résultats ..................................................................................................................
3.1. Densité et identité des inoculums à la fin de l´expérience ................................
3.2. Effet du statut mycorhizien des plantes sur l´acquisition de l´azote .................
3.2.1. Croissance et RGR .....................................................................................
3.2.2. Allocation de la biomasse...........................................................................
3.2.3. Réparation des concentrations de N et C dans les plantes..........................
4. Discussion ................................................................................................................
4.1. Les contaminations par des champignons mycorhiziens exogènes...................
4.2. Mycorhization et croissance des plantes ...........................................................
4.3. L´allocation de la biomasse dans les plantes .....................................................
4.4. Nutrition azotée et croissance des plantes .........................................................
4.4.1. Vers un rejet partiel de Northup et al. (1995) ?......................................
4.4.2. L´importance de la structure des TPC ....................................................
4.4.3. Les formes d´azote facilement accessibles.............................................
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4.4.4. Allocation des ressources .......................................................................
4.5. Au-delà des capacités saprotrophes...................................................................
5. Conclusions .............................................................................................................
6. Bibliographie...........................................................................................................
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ANNEXES ...................................................................................................................
Annexe 1 – Terrain d´expérience du CEFE-CNRS......................................................
Annexe 2 – Parties aériennes et souterraines de Pinus pinea.......................................
Annexe 3 – Broyage et analyses C, N ..........................................................................
Annexe 4 – Trois types de mycorhization ....................................................................
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46
FIGURES – RAPPORT BIBLIOGRAPHIQUE
Figure A. Le cycle biogéochimique de l´azote............................................................
Figure B. Relations phylogénétiques entre les Phyla des champignons......................
Figure C. Détail de la structure arbusculaire d´une endomycorhize ...........................
Figure D. Transport et échange de nutriments entre les hyphae du champignon
et les cellules végétales d´une AM. ..............................................................................
Figure E. Modèle du mécanisme de transformation et transport des éléments
azotés inorganiques (NO3– et NH4+).............................................................................
Figure F. Détail de la structure d´une ectomycorhize. ................................................
Figure G. Utilisation et mobilisation des nutriments par action des ECM..................
Figure H. Modèle de prise et transfert d´éléments azotés dans les
interfaces sol-champignon-plante.................................................................................
Figure I. Relation entre les concentrations phénoliques et le DON ............................
Figure J. Le rôle des tannins dans le cycle de l´azote .................................................
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TABLEAUX ET FIGURES – RAPPORT STAGE
Tableau 1. GLM-ANOVA des variables de croissance et biomasse........................... vii
Tableau 2. GLM-ANOVA des patrons d´allocation de la biomasse...........................viii
Tableau 3. GLM-ANOVA des patrons d´allocation de C, N ...................................... x
Clé des Figures ............................................................................................................ xi
Figure 1. Croissance et RGR ....................................................................................... xii
Figure 2. Effet interactif des traitements pour la croissance de la tige et le RGR.......xiii
Figure 3. Patrons d´allocation de la biomasse des plantules .......................................xiv
Figure 4. Leaf Mass Ratio (LMR) ...............................................................................xvi
Figure 5. Concentrations finales de C, N dans (L) et (Fr) ...........................................xvii
Figure 6. C:N ratio des (L) et (Fr) ............................................................................... xix
Figure 7. Concentration de N final et C:N des (Fr) ..................................................... xx
Figure 8. Quantité de N stockée dans les (L)............................................................... xxi
PARTIE I
RAPPORT BIBLIOGRAPHIQUE
1
1. Le cycle des nutriments dans le fonctionnement des écosystèmes
Le fonctionnement des écosystèmes repose sur l´interaction entre trois niveaux trophiques :
les producteurs primaires, les consommateurs et les décomposeurs. En particulier, la
production primaire, qui soutient l´ensemble des autres niveaux trophiques, dépend du
recyclage des nutriments, qui dépend de l´activité des micro-organismes décomposeurs.
L´entrée, la sortie et la perte de ces éléments du système, ainsi que leur transfert entre les
niveaux trophiques est appelé « cycle des nutriments » (Chapin III et al. 2002). Dans ce
contexte, on définit par nutriment tout composé chimique nécessaire pour la croissance et
fonctionnement physiologique d´une plante, notamment l´azote (N), le phosphore (P) et le
potassium (K), les trois éléments les plus importants en quantité à part C, O, et H . À
différence du carbone (C), fixé à partir du CO2 atmosphérique via la photosynthèse, ces trois
éléments essentiels sont prélevés dans le sol par le système racinaire et les micro-organismes
qui lui sont associés. Dans les sols bien développés (généralement pauvres en minérales), la
plupart des nutriments sont stockés dans la matière organique (SOM : Soil Organic Matter)
(Cebrian 1999 ; Chapin III et al. 2002) et c´est grâce à la décomposition de la SOM qu´ils
deviennent accessibles aux plantes, par dilution enzymatique des nutriments, et des processus
de minéralisation. Ainsi, Begon et al. (2006) soulignent de manière imagée que les stocks des
nutriments seraient rapidement épuisés, et la vie sur Terre compromise, si les décomposeurs
(faune du sol, champignons, bactéries) de la matière organique morte et principalement
végétale disparaissaient soudainement. De manière générale, les flux des différents composés
chimiques essentiels à la vie sont assez bien compris. Cependant certaines de ses étapes
intermédiaires, notamment celui de l´azote, élément chimique à la base du fonctionnement de
la vie, restent encore mal compris (Vitousek et al. 1997).
1.1 Le cycle de l´azote
L´azote, contenu dans l´ADN, l´ARN, les acides aminés et les protéines de tous les êtres
vivants, est un élément clé contrôlant la composition, la diversité, le dynamisme et le
fonctionnement des écosystèmes terrestres et aquatiques de la planète (Vitousek et al. 1997).
De manière naturelle, la plupart de l´azote fixé dans la biosphère provient de l´atmosphère où
il se trouve en forme gazeuse (N2) alors qu´il est difficilement disponible de façon directe
pour la majorité des organismes (Begon et al. 2006). La fixation de l´azote, c´est à dire, la
transformation du diazote ou du protoxyde d´azote en une molécule plus assimilable, peut
2
Figure A. Le cycle biogéochimique de l´azote (d´après Lin et al. 2000).
Figure B. Relations phylogénétiques entre les différents Phyla des champignons. Le
rectangle rouge indique les groupes qui forment des mycorhizes. Les clades ayant des
branches tâchées indiquent des groupes non-monophylétiques (d´après Blackwell et al.
2009).
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avoir lieu grâce à des processus abiotiques comme les éclairs qui transforment le diazote en
acide nitrique HNO3 (~3–4% ; Begon et al. 2006), mais la majeure partie de cette fixation se
fait par des processus biotiques (Vitousek et al. 2002). La fixation biologique de l´azote est
réalisée exclusivement par certaines Bactéries et Cyanobactéries (dites diazotrophes), parfois
libres, mais le plus souvent associées aux racines de certaines plantes (Vessey et al. 2005).
Les diazotrophes utilisent la nitrogénase, un complexe enzymatique, pour catalyser la
transformation du diazote atmosphérique en ions ammonium NH4+ utilisable par les plantes
(Vessey et al. 2005). Une fois entré dans le système sol, l´azote peut subir de nombreuses
transformations. D´une autre part, l´azote contenu dans les protéines du SOM peut aussi être
libéré sous forme d´ammonium grâce à un processus appelé minéralisation microbienne ou
ammonification (Figure A). Suivant les cas, l´ammonium peut (1) être absorbé par les racines
des plantes et être transformé en azote organique (acides aminés puis protéines) contenu dans
les cellules des différents tissus, ou (2) être transformé en Nitrites (NO2–) et Nitrates (NO3–).
Ce dernier processus, appelé nitrification, est un processus d´oxydation de l´ammonium
réalisé par des bactéries spécialisées, notamment les archæbactéries (Leininger et al. 2006).
Les nitrates et les nitrites peuvent également être absorbés par les organismes du sol, et
notamment les plantes, et incorporés dans des molécules organiques. Dans certaines
conditions, ces molécules peuvent également être réduites en azote gazeux (N2 ou N2O) via la
dénitrification, un processus par lequel l´azote retourne vers l´atmosphère. (Figure A).
Dans les dernières années un nombre croissant d´études montre que ce modèle
classique du cycle de l´azote (Figure A) doit être complexifié, notamment par la capacité des
certaines espèces de plantes à prélever directement des composés organiques azotés du sol,
soit directement par endocytose, soit par l´intermédiaire d´une exsudation enzymatique
(Paungfoo-Lonhienne et al. 2008 ; Sorensen et al. 2008). Cependant, la plupart des plantes
ont besoin d´une association avec d´autres organismes (bactéries, champignons) pour accéder
à l´azote contenu dans des molécules azotées complexes du sol (acides aminés-protéines)
(Hawkins et al. 2000 ; Sorensen et al. 2008 ; Näsholm et al. 2009). C´est particulièrement le
cas des mycorhizes (association du système racinaire d´une plante avec des champignons),
des associations symbiotiques qui existent chez 80% des plantes terrestres (Landeweert et al.
2001).
3
Figure C. Détail de la structure arbusculaire d´une endomycorhize dans les cellules
d´Aglaophyton major, plante du Dévonien. Cette découverte montre que ce type de
symbiose existe depuis l´origine des plantes terrestres il y a plus de 400 millions
d´années (d´après Remy et al. 1994).
Figure D. Sites de transport et d´échange de nutriments entre les hyphae du
champignon et les cellules végétales d´une AM. 1, prise du phosphate par les
membranes des hyphae externes ; 2, exportation du phosphate de la membrane
arbusculaire ; 3, prise du phosphate par la plante à travers la membrane periarbusculaire ; 2 et 4, sites possibles de prise de glucose par le champignon (d´après
Harrison 1999).
ii
2. Les mycorhizes
Une mycorhize est l´association symbiotique entre un champignon terrestre et l´apex racinaire
d´une plante. Ce type d´association est généralement non spécifique, et naît de la colonisation
des racines d´une ou plusieurs espèces de plantes par des hyphes (filaments mycéliens) d´une
ou plusieurs espèces de champignons (Bruns et al. 2002). Les hyphes du champignon
s´étendent bien au-delà des racines colonisées pour exploiter les ressources du sol (hyphes
extramatriciels). Cette association est généralement considérée comme une interaction
mutualiste, dans laquelle les éléments carbonés issus de la photosynthèse de la plante, sont
échangés contre les nutriments minéraux et l´eau du sol acquis par le champignon. Une
caractéristique commune des mycorhizes est la formation de réseaux complexes liant les
racines des différentes plantes de la même ou des différentes espèces. Ces réseaux, appelés
Common Mycorrhizal Network (CMN), proviennent à la fois de la colonisation multiple des
organismes individuels clonés (Selosse et al. 2006) et des propriétés de fusion des hyphes des
individus déjà présents auparavant (Hickey et al. 2002).
Les
champignons
qui
forment
des
mycorhizes
appartiennent
aux
Phylla
Basidiomycota, Ascomycota et Glomeromycota et sont encore classifiés dans une même
branche phylogénétique (Figure B) bien que nombreuses études moléculaires suggèrent qu´ils
ne forment pas un groupe monophylétique (Blackwell et al. 2009). Les mécanismes
complexes conduisant à l´évolution des mycorhizes ne sont pas encore tout à fait compris et
plusieurs hypothèses ont été formulées, telles que la protection réciproque contre le stress du
sol, les échanges hormonales et de vitamines, etc. (Selosse et al. 2006). Wang & Qiu (2006)
expliquent que cette association symbiotique est issue de plusieurs origines indépendantes à
partir de l´apparition du groupe des Glomeromycota (groupe basale), et que la vaste
diversification d´espèces de mycorhizes (apparition des Basidiomycota et Ascomycota) est le
résultat des interactions isolées amenant à différents mécanismes coévolutifs « plantechampignon ».
2.1 Les types de mycorhizes et leurs différentes stratégies pour la prise et le transport des
métabolites organiques et inorganiques
On reconnaît deux types majeurs de mycorhizes qui se différencient principalement par l´ultra
structure de contact entre le champignon et la racine (Selosse et. al. 2006) : les
endomycorhizes (AM), et les ectomycorhizes (ECM) dont on parlera plus en détail.
4
Figure E. Modèle du mécanisme de transformation et transport des éléments azotés
inorganiques (NO3– et NH4+) du sol par action des AM qui bénéficie à la plante-hôte
(d´après Jin et al. 2005). ERM = Mycélium extraradical ; IRM = Mycélium
intraradical ; PolyP = Polyphosphate ; Pi = orthophosphate.
Figure F. Détail de la structure d´une ectomycorhize. (a) Les champignons (en marron)
entourent le bout d´une racine et pénètrent l´espace intercellulaire des cellules corticales
(b ; vert) en formant un (c) réseau de Hartig (Hartig net) ou réseau d´hyphes (d´après
Landeweert et al. 2001). Analyses moléculaires suggèrent que ce type de symbiose date
de 180 millions d´années (Taylor & Alexander 2005).
iii
Les endomycorhizes ont la capacité de former des ramifications arbusculaires dans les
cellules racinaires en pénétrant les parois cellulaires, raison pour laquelle on les appelle aussi
mycorhizes arbusculaires (AM, Figure C-D). Tous les AM se forment à partir des
champignons appartenant au Phylum Glomeromycota (Schüßler et al. 2001) et sont
considérés comme le type mycorhizien ancestral (Wang & Qiu 2006). Ce sont des
champignons asexués, symbiontes obligatoires, dont on reconnaît jusqu´à présent à peine
~200 espèces, mais qui sont les plus répandues (60–80% des espèces des plantes forment des
AM) (Smith & Read 1997). Öpik et al. (2006) affirment que la plus grande richesse d´AM par
plante hôte existe dans les forêts tropicales (en Panamá, 18.2 espèces de champignons par
plante), suivi par les prairies (8.3) et les forêts tempérées (5.6). Les AM jouent un rôle
essentiel dans le fonctionnement des écosystèmes terrestres. Ainsi, nombreux études montrent
qu´elles ont par exemple une influence positive directe sur la biodiversité végétale (van der
Heijden et al. 1998), aident à réduire les dommages occasionnés par des organismes nuisibles
comme les nématodes et des espèces de champignons pathogènes (Azcón-Aguilar & Barea
1996), et augmentent la fitness des plantes dans des environnements pollués (Hildebrandt et
al. 1999). La symbiose AM-plante a lieu à partir du moment où les hyphes entrent en contact
avec les racines de celles-ci. Les hyphes forment immédiatement une structure de pression
appelée « appressorium » d´où se développe un hyphe spécialisé dans la pénétration de la
paroi cellulaire du parenchyme corticale de la racine. Une fois dans les cellules, les hyphes
terminales se différencient pour développer des branches hyphales connues comme
« arbuscules » (Figure D, Harrison 1999). C´est ici, dans les arbuscules, que les scientifiques
pensent qu´a lieu l´échange des nutriments entre les deux symbiontes, par exemple phosphate
contre glucose (source de carbone pour les champignons) (Harrison 1999). Dans le cas du
phosphate, source de phosphore (P) pour la plante, sa consommation implique la circulation à
travers plusieurs membranes : la prise a lieu premièrement au niveau des hyphae
extraradicales (prise par le champignon), puis il est transporté par les hyphae internes, et
finalement relâché à travers la membrane arbusculaire dans les cellules végétales (Figure D).
Pour le cas des substances azotées inorganiques, Jin et al. (2005) ont montré que NH4+ et
NO3–, sont pris au niveau du mycélium extraradical (ERM : Extra-radical mycellium) et
assimilés via nitrate réductase pour être incorporés dans de l´Arginine (ARG) et transportés
dans le mycélium intraradical (IRM : Intra-radical mycellium; Figure E). À ce niveau-là,
l´ARG est cassée, transformée en urea et en NH4+ pour finalement passer à la plante grâce à
des transporteurs-ammonium (Figure E).
5
Figure G. Utilisation et mobilisation des nutriments par action des ECM. (a) Utilisation
d´azote (N) et phosphore (P) par la voie d´excrétion enzymatique ; (b) Mobilisation du
Phosphore, Potassium, Calcium et Magnésium par la voie d´excrétion d´acide organique
(d´après Landeweert et al. 2001).
iv
À l´inverse des AM, les ECM ne rentrent pas dans les cellules végétales. D´après
Taylor & Alexander (2005), seulement 3% des spermatophytes (plantes qui produisent des
graines) forment des ECM et 95% des espèces de champignons colonisateurs appartiennent à
la Classe Homobasidiomycètes (Phylum Basidiomycetes), et 4.8% environ aux Ascomycètes.
Les ECM sont surtout abondantes dans les écosystèmes boréaux et tempérés, bien qu´elles
aient probablement été sous-estimées dans les écosystèmes alpins, arctiques, méditerranéens
et surtout tropicaux. La formation des ECM se fait à partir de la colonisation des hyphes des
champignons sur les racines d´une plante. Le champignon se développe en formant un
manteau qui entoure l´apex racinaire (Figure Fa), mais ne pénètre pas dans les cellules. Ce
manteau contrôle le flux des solutés entrant et sortant des racines. Les hyphes qui s´étendent
au delà des racines, appelées mycelia extra-racinaires ou extra-matriciels, constituent le
principal site pour l´obtention et le transport de l´eau et des nutriments (Read & PerezMoreno 2003) grâce à leurs capacités de pénétration des microsites inaccessibles pour les
racines des plantes (Landeweert et al. 2001). Dans la racine, le champignon se développe en
se ramifiant entre les cellules corticales et forme aussi le « réseau de Hartig », un réseau
d´hyphes qui élargit la surface de contact entre le champignon et les cellules de son hôte et
permet ainsi un transfert efficace des métabolites avec la plante (Figure Fc). En dehors de la
racine, le mycélium des ECM (Figure Fa) peut subir une différentiation morphologique en des
structures appelées « rhizomorphes » (hyphes rassemblées) ce qui permet au champignon
d´atteindre une plus grande surface du sol. Avec la production et sécrétion des hormones tels
que la hypaphorine, les ECM peuvent même empêcher la croissance des poiles des racines de
sa plante hôte (Dauphin et al. 2007) pendant qu´induisent la ramification de ses propres
hyphes (Landeweert et al. 2001). Ainsi, les ECM contrôlent le flux et le transfert d´eau et de
nutriments vers les plantes (Figure Fb).
Comment les ECM extraient-elles les nutriments du sol ? On distingue deux
stratégies en partie revues par Chalot & Brun (1998), Landeweert et al. (2001), Hoffland et al.
(2004), Miller & Cramer (2004) et Näsholm et al. (2009). La première stratégie repose sur
l´utilisation d´enzymes protéolytiques et hydrolytiques secrétées par les ECM pour dégrader
et utiliser le N et le P contenus dans des macromolécules organiques non disponibles pour les
plantes (Figure Ga). Des études montrent que la production et l´activité des enzymes
protéolytiques sont corrélées positivement avec la concentration protéique du sol, et suggèrent
qu´elles sont contrôlées par le pH de celui-ci (une baisse du pH accélère la dégradation des
acides aminés par exemple) (Chalot & Brun 1998 ; Näsholm et al. 2009). Étant donné que
95% de l´azote du sol se trouve sous forme de protéines, peptides et acides aminés libres,
6
Figure H. Modèle hypothétique de prise et transfert des éléments azotés organiques à
travers les interfaces sol-champignon-plante. (1) Transporteurs d´acides aminés de la
membrane du champignon ; (2) activités protéolytiques pour l´hydrolyse des protéines
et peptides extracellulaires ; (3) transporteur des oligopeptides de la membrane du
champignon ; (4) transporteurs d´ ammonium/nitrate de la membrane du champignon ;
(5) système d´efflux des acides aminés de la membrane du champignon ; (6) et (7)
transporteurs des acides aminés de la membrane végétale ; (8) transporteurs des sucres
(d´après Chalot & Brun 1998). fpm : plasma de la membrane du champignon ; rpm :
plasma de la membrane de la racine.
v
notamment dans les sols des forêts boréales et tempérées, et que les besoins en azote des
plantes sont significativement plus importants que les réserves inorganiques stockées dans le
sol, on s´attend à ce que l´utilisation de l´azote organique soit prépondérant (Näsholm et al.
2009). La digestion des protéines s´effectue au niveau extracellulaire par action des protéases
secrétées par le champignon. Oligopeptides, peptides et acides aminés, résultants de telle
digestion, sont transportés intacts à travers la membrane plasmique du champignon par des
transporteurs membranaires de basse spécificité (Figure H). Dans les cellules fongiques, les
peptides doivent être hydrolysés par action des peptidases cytosoliques pour générer des
acides aminés libres. Ces peptidases cytosoliques doivent être produites à partir des éléments
carbonés (sucres), issus de la plante hôte. Finalement, les acides aminés passent vers les
cellules des racines par action des transporteurs de haute spécificité et rentrent dans le
système végétal (Chalot & Brun 1998). Il faut souligner que la plupart de ce qu´on connaît a
propos du transport des nutriments dans les membranes des champignons formant des
mycorhizes provient de l´étude de quelques espèces modèles comme Neurospora crassa, soit
0.0001% de la diversité des champignons mycorhiziens (Chalot & Brun 1998).
La deuxième stratégie permet la mobilisation de phosphore (P), potassium (K),
calcium (Ca) et magnésium (Mg) inorganiques a partir des substrats minéraux solides grâce à
l´excrétion d´acides organiques comme l´acide oxalique, et des composés phénoliques (Figure
Gb) qui désintègrent la roche (Landeweert et al. 2001 ; Hoffland et al. 2004). Ces acides, dont
sa plupart de léger poids moléculaire (LMWOA : Low Molecular Weight Organic Acids),
proviennent d´un mélange de CO2 dissolu, protons et anions organiques (e.g. HCO3-) qui
contribuent à la désintégration de la matière minérale par un processus (bio) physicochimique connu comme « altération » (weathering). L´altération des minéraux du sol par
action des ECM peut avoir lieu au niveau du manteau des racines ou au niveau des hyphes
mycorhiziennes qui entourent les particules minérales et pénètrent les micro-espaces, voire
même, creusent des micro-tunnels pour exploiter les minéraux (Figure Gb). L´exsudation des
LMWOA à deux niveaux libèrent des cations essentiels pour la plante tels que le K+, Ca2+ et
Mg2+ contenus entre autres dans les biotites, le feldspath, le mica, et l´apatite, cette dernière,
importante source de P (Landeweert et al. 2001 ; Hoffland et al. 2004). D´autre part,
Thompson et al. (2001) mettent l´accent sur l´importance de la prise des éléments azotés à
partir des roches tels que les buddingtonites, riches en N.
7
Figure I. Relation entre les concentrations phénoliques (Totales et CT) de la litière de
Pinus muricata (qualité de la litière) versus le ratio entre l´azote libéré dans la forme
d´azote organique dissous (DON : Dissolved Organic Nitrogen) et l´azote minérale
(NH4+ et NO3–) du substrat (d´après Kraus et al. 2003).
Figure J. Le rôle des tannins dans le cycle de l´azote des écosystèmes terrestres. Les
carrés représentent les formes de stockage du nutriment, et les flèches représentent les
flux. L´effet « contrôleur » des tannins est représenté par la ligne verticale en tirets
(d´après Kraus et al. 2003).
vi
3. Les polyphénols et les complexes tannins-protéines
3.1 Le rôle des polyphénols et des tannins dans le fonctionnement des écosystèmes
Parmi les milliers de substances chimiques produites par les plantes, les polyphénols sont les
métabolites secondaires les plus répandus, mais leurs rôles dans les écosystèmes terrestres et
leur potentielle implication dans divers processus écologiques, dont certains, liés au
fonctionnement du sol, restent peu connus (Hättenschwiler & Vitousek 2000 ; Kraus et al.
2003). Les polyphénols sont des molécules exclusivement carbonées portant un ou plusieurs
anneaux aromatiques à six carbones (phénols) et une ou plusieurs fonctions hydroxyles (OH).
Ils sont souvent différenciés en deux grands groupes : ceux de faible poids moléculaire
(LMW : Low molecular Weight ; e.g. phénols simples, acides phénoliques, flavonoïdes), et les
oligomères et polymères de fort poids moléculaire (HMW : High Molecular Weight ; e.g.
tannins) (Hättenschwiler & Vitousek 2000). Les polyphénols ont longtemps été considérés
principalement comme des composés impliqués dans la défense des plantes. En effet, ils
engendrent une réduction de la disponibilité des protéines pour les herbivores (Robbins et al.
1987) et l´inhibition des enzymes digestives des insectes phytophages (Major & Constabel
2008). D´autres fonctions des polyphénols sur la biologie des plantes ont été également
décrites, comme la protection contre les effets nocifs des UV sur les feuilles, leur action en
tant qu´antioxydants naturels ou de support structural, leur contribution à la couleur et la
saveur ainsi que la tolérance au gèle ou la résistance à la sécheresse (Kraus et al. 2003).
Actuellement, un nombre croissant d´études suggère également une forte interaction entre les
polyphénols et les cycles des nutriments ; c´est cette thématique-là celle qui sera abordée dans
la suite.
Après la cellulose, l´hemicellulose, et la lignine, composés primaires synthétisés par les
plantes, les tannins (polyphénols HMW) sont les composés secondaires les plus abondants. Ce
sont des molécules complexes et énergétiquement coûteuses à fabriquer, ce qui suggère, du
point de vue adaptatif/évolutif, qu´elles jouent un rôle important pour la survie et le
fonctionnement des plantes (Kraus et al. 2003). Classiquement, on divise les groupes des
tannins en deux grandes catégories : les tannins condensés (CT : Condensed Tannins) et les
tannins hydrolyzables (HT : Hydrolyzable Tannins). Leurs différences sont structurales : les
CT sont des polymères de flavonoïdes, tandis que la structure des HT est basée sur la présence
d´acide gallique ou ester hexahydroxydiphénique. Les CT sont produits par les
Gymnospermes, les Monocotylédones et les Dicotylédones, tandis que les HT sont produits
8
uniquement par ces dernières. Ce qui fait leur unité est leur capacité à former des complexes
hydrophobes avec les protéines, que l´on appelle complexes tannins-protéines (TPC : Tannin
Protein Complexes) notamment par le biais de liaisons hydrogène. La capacité des tannins à
former des complexes dépend à la fois de leur structure et des protéines impliquées (Asquith
& Butler 1986). Des études classiques (Handley (1954) et Benoit et al. (1968) in Kraus et al.
2003) ont démontré un rôle négatif des tannins sur le processus de décomposition dans les
écosystèmes terrestres. Les différents mécanismes impliqués sont décrits ci-dessous.
3.2 Rôle des TPC dans les cycles des nutriments
Plusieurs études, synthétisées par Kraus et al. (2003), ont montré que les tannins interfèrent
avec le processus de décomposition. Les auteurs ont distingué cinq voies par lesquelles les
tannins agissent sur la limitation de la décomposition de la matière organique : (1) par leur
propre résistance face aux agents décomposeurs, (2) en séquestrant les protéines dans des
TPC résistants à la décomposition, (3) en formant une couche autour des composés tels que la
cellulose pour les protéger de l´action des microbes, (4) par un effet toxique direct sur les
invertébrés détritivores et les microbes décomposeurs (diminution de la palatabilité des
litières), et (5) en complexifiant et désactivant les exo-enzymes microbiennes. Cette
« immobilisation de l´azote » est ainsi interprétée comme une stratégie par laquelle les plantes
conservent et puis utilisent directement l´azote organique stocké grâce aux micro-organismes
associés (e.g. ectomycorhizes), dans des milieux appauvris en nutriments (infertiles).
Effectivement, en 1995, Northup et al. suggèrent qu´en complexant les protéines des litières,
les polyphénols peuvent dans certains cas modifier la disponibilité de l´azote pour les plantes.
Ils proposent que les composés polyphénoliques et les CT en particulier jouent un rôle dans le
contrôle des formes de l´azote libéré par la litière de Pinus muricata. Ce conifère présente des
adaptations aux différents milieux californiens : l´espèce peut pousser sur une gamme de sol
allant de fertile à extrêmement infertile, dans les marges des prairies ouvertes, ainsi que dans
l´ombre des grandes forêts. Quelle stratégie permet à cette espèce survivre dans des
conditions aussi différentes ? Dans cette étude, les auteurs ont montré que la quantité de TPC
formés dans les aiguilles sénescentes pourrait constituer l´une de ces adaptations. Ils ont en
effet trouvé une corrélation positive entre la quantité de polyphénols dans les litières, et le
ratio entre DON : N-minéral (DON : Dissolved Organic Nitrogen ; Azote minéral : NH4+ et
NO3–). Ainsi, plus la concentration des CT dans la litière est importante, plus la proportion de
DON dans le sol est importante par rapport à l´azote minéral (Figure I). De plus, Northup et
9
al. (1995) ont mis en évidence une plus forte concentration en polyphénols dans les feuilles
sénescentes sur les sols pauvres que sur les sols riches. Les auteurs déduisent de ces résultats
que la quantité de composés polyphénoliques formés dans les aiguilles sénescentes contrôle la
proportion d´azote libérée par la litière du sol en forme organique (DON). Ils proposent, que
les plantes pourraient via leurs mycorhizes avoir accès à cette source d´azote récalcitrant
(Figure J), leur conférant ainsi un avantage compétitif face à l´utilisation de cette ressource
par rapport aux autres organismes (e.g. bactéries capables de fixer et minéraliser l´azote
organique par la voie de la décomposition) en permettant de court-circuiter le cycle de
l´azote ; la production de polyphénols par les plantes pourrait constituer donc une adaptation
aux sols infertiles.
Cette hypothèse proposée par Northup et al. (1995) a été testée par des études récentes
qui trouvent que la quantité d´azote stocké et utilisé par les plantes dépend du type de TPC
impliqué et les mycorhizes à elles associées (voir Joanisse et al. 2009 ; Wurzburger &
Hendrick 2009). Les auteurs suggèrent que les mycorhizes des plantes auraient une capacité
intrinsèque pour exploiter efficacement les TPC issus des feuilles de sa plante hôte, en
empêchant de cette façon l´accès à cette source d´azote aux systèmes mycorhiziens des
plantes du voisinage, ce qui améliorerait leurs habilités compétitives au sein de la
communauté. Étant donné que la productivité des plantes est normalement limitée par la
disponibilité en nutriments, et que la décomposition des litières est une des sources nutritives
les plus importantes pour elles, celles avec la capacité d´influencer la décomposition de leur
propre litière sont donc capables de « contrôler » leur propre nutrition (feedback).
3.3 Les mycorhizes et l´utilisation de l´azote contenu dans les TPC
Bien qu´il existe des cas particuliers de plantes qui peuvent avoir accès aux nutriments des
protéines du sol (azote organique) sans dépendre de micro-organismes tels que les
champignons mycorhiziens (Paungfoo-Lonhienne et al. 2008),
il a été démontré que
l´utilisation de N et P contenu dans ce type de molécules organiques est en grande partie
assuré par l´action des enzymes exsudées par leurs mycorhizes associées, notamment par les
mycorhizes ericoïdes (ERM), un groupe particulier d´AM symbiotiques des Ericales (Bending
& Read 1996; Wurzburger & Hendrick 2009). Les ERM seraient potentiellement plus
saprotrophes que les ECM, ce qui les permettrait de mieux exploiter le N des substrats
organiques (Read & Perez-Moreno 2003). Read (1991) a montré à l´échelle mondiale que les
biomes caractérisés par les relations symbiotiques du type ERM ou ECM présentent des sols
10
riches en matière organique avec une basse disponibilité en N, tandis que le patron contraire a
été trouvé pour les sols dominés par les relations symbiotiques du type AM. L´habilité des
champignons mycorhiziens à dégrader des formes complexes de substrats organiques suivrait
de ce fait le patron : AM < ECM < ERM (Read & Perez-Moreno 2003). Du point de vue
biochimique, les analyses d´activité enzymatique des sols ont montré que l´exploitation de
l´azote contenu dans les TPC est assurée par l´action des polyphénol-oxidases, péroxidases,
tannin-carboxyl-esterases et protéases propres de l´exsudation mycorrhizienne (Bending &
Read 1996). Il existe de même une voie non-enzymatique de dissociation des TPC qui
implique la sécrétion des acides gras agissant comme des biosurfactants qui affaiblissent les
ponts hydrogène et les interactions hydrophobiques des TPC (Cooper & Zajic 1980 in
Bending & Read 1996).
La capacité à utiliser et stocker l´azote des TPC dépend de l´espèce de plante et donc
de leur symbiontes comme le suggèrent Joanisse et al. (2009). Ainsi, les espèces de plantes
susceptibles de stocker une grande quantité d´azote dans les TPC présenteraient également
des associations symbiotiques (i.e. mycorhiziennes) performantes les permettant d´exploiter
les nutriments ainsi protégés. Wurzburger & Hendrick (2009) par exemple, dans une étude de
comparaison de l´habilité compétitrice d´utilisation de ressources par des plantes strictement
associées à des ERM, ECM ou AM, concluent que les plantes Ericacées (ERM), ont un
avantage compétitif face aux autres dans la mesure où (1) elles utilisent plus efficacement les
TPC de leur propre litière en la rendant accessible (décomposable) à leurs propres mycorhizes
associées ; ceci, (2) entraverait donc la disponibilité de N pour les individus du voisinage
mycorhizés par des ECM et des AM. Les auteurs suggèrent en conséquence que ce type de
plantes créeraient des complexes protéiques stables qui resteraient dans le sol mais qui
finalement seront en grande partie exploitables que par les mycorhizes et autres microorganismes décomposeurs associés à elles mêmes.
4. Perspectives
Il faut signaler que l´altération anthropogénique et globale du cycle de l´azote, par
l´utilisation de fertilisants dans les sols agricoles, est parmi les principaux conducteurs du
changement planétaire (Galloway et al. 2008). Récemment Rockström et al. (2009), en vue de
la Conférence sur le Changement Climatique de l´ONU à Copenhague, ont identifié neuf
issues anthropogéniques qui doivent se maintenir sous un seuil donné pour éviter une
catastrophe écologique mondiale irréversible. Parmi ces issues, trois d´entre elles, dont
11
l´interférence sur le cycle de l´azote, est de loin au-delà du seuil maximal d´ingérence
humaine. La manufacture de fertilisants pour la production de nourriture et l´élevage des
plantes légumineuses conversent chaque année 120 millions de tonnes d´azote gazeux
atmosphérique en plusieurs formes azotées, parmi elles, des formes réactives comme le
protoxyde d´azote (N2O) –un des gaz responsables de l´effet de serre naturelle de la planète–
ou d´autres formes combinées qui polluent gravement les systèmes aquatiques (Rockström et
al. 2009).
Dans ce contexte, et étant donné que (1) la disponibilité d´azote limite la production
primaire nette des systèmes forestiers (Vitousek et al. 1997), (2) que la plupart de l´azote
utilisé par les plantes est issue de la décomposition de la matière organique (Chapin III et al.
2002), et (3) que les ectomycorhizes (ECM et ERM) semblent jouer un rôle actif essentiel
dans l´utilisation d´azote peu disponible par les plantes en assurant ainsi le fonctionnement
des écosystèmes naturels (Finlay 2005 ; Taylor & Alexander 2005), l´étude de leurs rôles et
influences sur le cycle de l´azote est alors d´intérêt générale de recherche pour le futur (Kraus
et al. 2003).
12
PARTIE II
RAPPORT DE STAGE
13
RÉSUMÉ
Les associations mycorhiziennes (symbiose entre une espèce de champignon et les racines
d´une plante vasculaire) sont essentielles dans le prélèvement de nutriments dans le sol et en
conséquence dans la nutrition des plantes. L´objectif de ce travail était de tester la capacité de
ectomycorrhizes (ECM) associées à des plantules Pinus pinea (L.) à avoir accès à l´azote des
molécules récalcitrantes que sont les complexes tannins-protéines (TPC), qui constituent un
stock d´azote organique naturellement présent dans les litières. Trois traitements mycorhiziens
ont été considérés : inoculation artificielle par Pisolithus tinctorius, mycorhization naturelle et
absence d´inoculation initiale. La même quantité d´azote a été apportée aux plantes, mais sous
des formes différentes : azote minéral, protéines seules, et deux types de complexes tanninsprotéines, l´un impliquant des tannins commerciaux et l´autre des tannins extraits de Pinus
pinea. L´effet des traitements sur la croissance, l´allocation et concentrations en azote et
l´allocation de biomasse au sein des plantules a été mesuré.
Les plantes ne semblent pas avoir eu accès à l´azote contenu dans les TCP, quelque soit leur
statut mycorhizien, bien qu´elles aient fortement investit dans la production de racines fines
par rapport à celles traitées avec des nutriments non-récalcitrants. Lorsque l´azote était
apporté sous une forme facilement accessible, les plantules avec mycorhization naturelle ont
eu une plus forte croissance, ont stocké davantage d´azote dans leur biomasse (azote minéral
ou protéines seules) et ont plus investit dans la production d´aiguilles et de racines fines
(compartiments liés à l´acquisition des ressources).
Nos données contredisent donc une hypothèse selon laquelle la production de tannins foliaires
constitue une adaptation des plantes de sols pauvres car ces complexes tannins-protéines
constituent une réserve d´azote stable et accessible. Le rejet de cette hypothèse ne concerne
néanmoins que les ectomycorhizes, seules testées ici, et non d´autres types d´associations
mycorhiziennes. De plus, ces résultats remettent en question la capacité saprotrophe des
ECM, spécialement en ce qui respecte à l´utilisation du TPC issu de P. pinea, et suggèrent que
les relations symbiotiques ici étudiées, pourront ne pas être tout à fait mutualistes, et que les
ECM auraient la capacité de moduler la physiologie des plantes-hôtes pour qu´elles
investissent pour le bénéfice des champignons associés.
14
ABSTRACT
Mycorrhizal association (symbiosis between fungus species and vascular-plant roots) has
been shown to be pivotal for soil nutrient uptake and plant nutrition. The main goal of this
project was to study the capacity of ectomycorrhizas (ECM) associated to Pinus pinea (L.)
seedlings to gather nitrogen from recalcitrant compounds such as tannin-protein complexes
(TPC).
We compared the effect of three treatments of mycorrhizal association –one artificial
inoculation with Pisolithus tinctorius fungus species, and two controls, one with initial natural
mycorrhization, and one without inoculation– on the assimilation of four nutrient
contributions: mineral nitrogen, pure proteins, commercial TPC, and P. pinea TPC. Capacity
of nutrient acquisition was estimated through seedling growth, relative biomass, and relative
allocation of biomass and N-resources.
Seedlings had no access to TPC nutrients on any of the mycorhization treatments, but plants
treated with TPC invested more in fine roots production as compared to plants nourished with
less recalcitrant nutrients. Plants subject to natural mycorrhization developed more (height
and biomass relative growth), invested more in leaf and fine roots production (plant resources
acquisition parts) and stocked more N when nourished with non-recalcitrant nutrients. No
differences in N-resources assignation between leaves and fine roots were found.
These results are contradictory to formulated hypothesis that state that leaf tannin production
constitutes an adaptation of plants living in infertile soils, since tannin-protein complexes
ensure access to N-resources through mycorrhizal assocations. However, rejection of this
hypothesis concerns only the ECM studied here and not other mycorrhizal associations such
as Ericoid myrorrhizas (ERM). Likewise, these results question the saprophitic capacity of
ECM, especially in regards to host plant TPC use. They also suggest that these symbiotic
relationships may not be completely mutualistic, and that mycorrhizas may even alter the
physiology of the host plant to their own benefit.
15
RESUMEN
Se ha demostrado que la asociación micorrízica (simbiosis entre una especie de hongo y la
raíz de una planta vascular) es indispensable para la captación de ciertos nutrientes del suelo y
el desarrollo vegetal. El objetivo principal de este trabajo fue estudiar la capacidad de
ectomicorrizas (ECM) asociadas a plántulas de Pinus pinea (L.) para captar los nutrientes
nitrogenados de moléculas recalcitrantes de complejos taninos-proteínas (TPC).
Para esto, se llevaron a cabo tres tratamientos de asociaciones micorrízicas– una inoculación
artificial con Pisolithus tinctorius, una especie de hongo, y dos controles, uno con
micorrización inicial natural, y otro sin micorrización inicial– y se comparó su efecto sobre la
capacidad de asimilación de cuatro tratamientos de aportes nutritivos: nitrógeno mineral,
proteína animal, TPC comercial y TPC de P. pinea. La capacidad de asimilación de los
nutrientes de cada combinación de tratamientos fue reflejada en función del desarrollo, la
biomasa relativa, y la asignación relativa de recursos nitrogenados de las plántulas.
Las plántulas nutridas con TPC, independientemente del tipo de micorrización, presentaron
menor crecimiento primario, secundario y relativo de la biomasa y, pese a que invirtieron más
en la producción de raíces finas con respecto a las tratadas con nutrientes no recalcitrantes,
acumularon menos recursos nitrogenados. Por otra parte se encontró que las plántulas con
micorrización natural se desarrollaron más (altura y aumento relativo de la biomasa),
invirtieron más en la producción de hojas y raíces finas (órganos relacionados con la
adquisición de nutrientes) y reservaron más cantidad de nitrógeno cuando se las aportó con
nutrientes menos recalcitrantes.
Estos resultados contradicen la hipótesis que la producción de taninos foliares facilitan el
acceso a recursos nitrogenados a las plantas de suelos pobres en nutrientes por medio de
micro organismos como las micorrizas. Los resultados, ponen en duda además, la capacidad
saprofítica de las ECM (mas no de otros tipos de asociación micorrízica como ericoideas o
ERM), especialmente con respecto al uso de TPC propio de la especie de planta huésped, y
sugieren que las relaciones simbióticas aquí estudiadas podrían no ser del todo mutualistas, e
incluso, que estos hongos micorrízicos habrían alterado la fisiología de la planta huésped para
su propio beneficio.
16
1. INTRODUCTION
La production primaire, c´est-à-dire la production de matière organique par les organismes
autotrophes, est à la base du fonctionnement des écosystèmes terrestres et donc de l´ensemble
des niveaux trophiques supérieurs. Cette matière organique est principalement constituée de
carbone (C), qui provient de la fixation de CO2 atmosphérique par la photosynthèse,
d´oxygène et hydrogène provenant de molécules d´H2O, mais également d´autres éléments
comme le phosphore (P) et l´azote (N) qui par contre, sont prélevés directement dans le sol
par un processus de recyclage des nutriments (décomposition, minéralisation et utilisation de
la matière organique, e.g. la litière) ou dans le cas de l´azote fixé à partir de N2 de
l´atmosphère grâce aux microorganismes symbiotiques. Ces processus sont essentiellement
assurés par l´action de micro-organismes décomposeurs libres comme les bactéries et les
champignons saprotrophes, qui minéralisent l´azote. (Begon et al. 2006).
Dans de nombreux écosystèmes, la production primaire est limitée par la disponibilité
de l´azote dans les sols (Chapin III et al. 2002). Selon les modèles classiques du cycle de
l´azote à l´échelle de l´écosystème, les plantes prélèvent exclusivement de l´azote minéral
rendu disponible grâce à l´activité des micro-organismes décomposeurs. Des travaux plus
récents ont démontré cependant que les plantes peuvent utiliser directement l´azote contenu
dans les molécules organiques, court-circuitant ainsi l´étape de minéralisation (voir Chapin III
1995 ; Näsholm et al. 2009). Étant donné que la décomposition des litières est une des sources
nutritives les plus importantes pour les plantes (Chapin III et al. 2002), celles avec la capacité
d´influencer la décomposition de leur propre litière et d´exploiter leurs propres ressources,
seront donc capables de « contrôler » leur propre nutrition (feedback). Comment ? On suppose
depuis longtemps que les mycorhizes ont une place significative dans ce processus (Frank
1885 dans Finlay 2005). Parmi les formes d´azote organique présentes dans le sol, les
complexes formés par l´association entre tannins et protéines foliaires constituent un stock
considérable de cet élément essentiel. Ces complexes se formant lors de la sénescence des
feuilles, sont relativement récalcitrants, c´est-à-dire difficilement dégradables par les
décomposeurs (Kraus et al. 2003a). La capacité présumée des mycorhizes à exploiter l´azote
contenu dans des composés organiques récalcitrants du sol tels que les complexes tanninsprotéines (TPC) et leur possible rôle sur le cycle des nutriments, a été l´objet de quelques
travaux sans qu´il existe encore un consensus au niveau de la communauté scientifique (c.f.
Bending & Read 1996 ; Bending & Read 1997 ; Read & Perez-Moreno 2003 ; Wu et al.
2003 ; Finlay 2005 ; Koide et al. 2008 ; Wurzburger & Hendrick 2009).
17
Tableau 1. GLM-ANOVA de l´effet de la mycorhization (mic), l´apport nutritif (nut),
et l´interaction des deux traitements (mic * nut) sur la croissance en hauteur, croissance
en diamètre de la tige et la croissance relative de la biomasse de Pinus pinea.
Type III
Sum of
Squares
df
Mean Square
F
p
R2
(adjusted)
.920
croissance en hauteur
Model
20740.739
12
1728.395
102.812
.000
mic
1395.319
2
697.660
41.499
.000
nut
1872.115
3
624.038
37.120
.000
.716
.638
mic * nut
72.172
6
12.029
Error
1580.261
94
16.811
Total
22321.000
106
croissance en diamètre de
la tige
Model
646.868
12
53.906
297.701
.000
mic
5.577
2
2.789
15.400
.000
nut
21.381
3
7.127
39.360
.000
2.307
.040
68.958
95.720
.000
mic * nut
2.507
6
.418
Error
17.021
94
.181
Total
663.889
106
0.971
croissance relative de la biomasse
vii
Model
827.491
12
mic
16.533
2
8.266
11.475
.000
nut
78.942
3
26.314
36.527
.000
mic * nut
11.125
6
1.854
2.574
.032
Error
30.978
43
.720
Total
858.468
55
0.954
En particulier, Northup et al. (1995) ont suggéré que dans des milieux pauvres en
azote, la complexation des protéines par des tannins serait un mécanisme de stockage des
nutriments (azote organique) qui, d´une part, réduirait le lessivage (leaching) de l´azote du
sol, et d´autre part pourrait permettre de court-circuiter l´étape de minéralisation de l´azote par
les microorganismes libres grâce à l´action des mycorhizes conférant à la plante un avantage
compétitif d´utilisation de cette ressource face aux autres organismes.
Bending & Read (1996) ont démontré que l´utilisation de l´N (et du P) contenu dans
ce type de molécules organiques est effectivement assuré par l´action des enzymes exsudées
par leurs mycorhizes associées, mais que cette capacité est plus importante chez les
mycorhizes ericoïdes (ERM), un type de mycorhizes caractéristique des plante de l´ordre des
Ericales. Ces auteurs ont affirmé que l´exploitation de l´azote contenu dans les TPC serait
assurée par des polyphénol-oxidases, péroxidases, tannin-carboxyl-esterases et protéases,
enzymes caractéristiques de l´exsudation mycorhizienne, témoignant ainsi leurs capacités
saprotrophes. Bending & Read (1997) expliquent que les polyphénol-oxidases causent la
polymérisation des polyphénols, facilitant leur oxydation en quinones beaucoup plus
réactives. Plus généralement, les capacités saprotrophes d’un organisme désigne leur capacité
à exploiter des ressources organiques. Cette capacité saprotrophe est généralement associée au
niveau d´activité enzymatique des exsudats des micro-organismes décomposeurs. Ainsi, plus
la diversité et le niveau d´activité enzymatique est élevé, plus la capacité saprotrophe est
importante et plus la quantité de nutriments exploités sera forte (Cullings & Courty 2009).
Dans ce contexte, Read & Perez-Moreno (2003) ont suggéré que les ERM seraient
potentiellement plus saprotrophitiques que les ECM, et donc plus capables d´exploiter le N
des substrats organiques. D´autre part, Wu et al. (2003) ont montré avec une série
d´expériences que les ECM seraient capables d´avoir accès à l´azote complexé seulement en
présence de micro-organismes saprotrophes libres (bactéries et champignons), ce qui suggère
que les ECM n’ont pas cette capacité intrinsèque. Enfin, Koide et al. (2008) proposent que du
point de vu évolutif, les différentes espèces d´ECM constituent un continuum entre le
biotrophisme (transfert de ressources carbonées de la plante aux champignons associés) et le
saprotrophisme (capacité à décomposer des macromolécules nutritives tels que protéines,
lipides, sucres) ce qui mettrait en cause le rôle fonctionnel essentiel des ECM dans
l´utilisation et le recyclage des nutriments contenus dans des molécules complexées puisque
la capacité saprotrophe de certaines espèces de champignons les rendrait autonomes, et leur
association aux racines des plantes pourrait donc être interprétée comme parasitique (voir
Johnson et al. 1997). Joanisse et al. (2009) observent que Kalmia angustifolia est une espèce
18
Tableau 2. Suite.
Type III Sum
of Squares
df
Mean Square
F
p
R2
(adjusted)
.988
LMR (Leaf Mass Ratio)
Model
3.205
12
.267
370.230
.000
mic
.014
2
.007
9.941
.000
nut
.003
3
.001
1.400
.256
mic * nut
.018
6
.003
4.240
.002
Error
.031
43
.001
Total
3.236
55
RMR (Root Mass Ratio)
Model
9.876
12
.823
956.055
.000
mic
.011
2
.005
6.271
.004
nut
.004
3
.001
1.396
.257
mic * nut
.006
6
.001
1.161
.345
Error
.037
43
.001
Total
9.913
55
.995
SMR (Shoot Mass Ratio)
Model
5.045
12
.420
176.324
.000
mic
.072
2
.036
15.159
.000
nut
.004
3
.001
.532
.663
mic * nut
.024
6
.004
1.665
.153
Error
.103
43
.002
Total
5.147
55
.975
FrLR (Fine roots Leaf Ratio)
Model
62.894
12
5.241
142.945
.000
mic
.106
2
.053
1.452
.245
nut
.957
3
.319
8.698
.000
mic * nut
.401
6
.067
1.824
.117
Error
1.577
43
.037
Total
64.470
55
.969
SRR (Shoot Root Ratio)
Model
viii
29.337
12
2.445
101.665
.000
mic
.651
2
.325
13.529
.000
nut
.038
3
.013
.530
.664
mic * nut
.186
6
.031
1.290
.282
Error
1.034
43
.024
Total
30.371
55
.956
produisant une plus grande quantité de TCP que Picea mariana, mais également présentant un
plus fort développement de ses mycorhizes. Ils suggèrent ainsi que la capacité à utiliser et
stocker l´azote des TPC dépend de l´espèce de plante, et que les espèces de plantes
susceptibles de stocker une grande quantité d´azote dans les TPC présenteraient également
des associations mycorhiziennes performantes les permettant d´exploiter les nutriments ainsi
protégés.
D´autre part, Wurzburger & Hendrick (2009) suggèrent que les plantes Ericales
associées à des mycorhizes du type ERM créeraient des complexes protéiques stables,
récalcitrants, qui resteraient dans le sol jusqu´à ce qu´elles ne soient pas finalement exploitées
par les mycorhizes et autres micro-organismes décomposeurs associés à elles mêmes dans un
processus de feedback. Dans leur étude de comparaison de la capacité compétitrice
d´utilisation de ressources par des plantes strictement associées à des ERM, ECM ou AM, les
auteurs trouvent que les plantes Ericacées (ERM), auraient un avantage compétitif face aux
autres dans la mesure où : (1) elles ont la capacité pour utiliser plus efficacement les TPC de
leur propre litière en la rendant accessible (décomposable) à leurs propres mycorhizes
associées, ce qui (2) entrave la disponibilité de N pour les plantes du voisinage qui sont
mycorhizées par des ECM et des AM. Bending & Read (1997) expliquent que les polyphénoloxidases de Hymenoscyphus ericae, une ERM, qui causent la polymérisation des polyphénols,
entraîne la formation de polymères de lourd poids moléculaire qui inhibent les enzymes des
champignons
mycorhiziens
alentour,
contribuant
à
l´accumulation
des
molécules
polyphénoliques récalcitrantes, particulièrement abondantes des écosystèmes tempérés. Dans
le cas des ECM associés à des espèces de pin, Abuzinadah et al. (1986) et Finlay et al. (1992)
ont prouvé que la mycorhization de Pinus contorta est essentielle pour l´utilisation de l´azote
contenu dans des protéines animales comme le BSA (Bovine Serum Albumin), mais ont
montré aussi que cette relation est espèce-dépendante ; il reste pour connaître le rôle des
champignons mycorhiziens dans l´accès au N contenu dans les TPC.
Dans ce contexte, et prenant en compte que la limitation des ressources est une pièce
clé pour les analyses « coût : bénéfice » des effets des mycorhizes dans le fitness des plantes
(Johnson et al. 1997), et que la structure chimique des TPC, très hétérogène entre espèces,
détermine leur rôle fonctionnel dans les processus écologiques (Zucker 1983 ; Kraus et al.
2003b), cette étude cherche à savoir si (i) le statut mycorhizien des Pins est lié à leur capacité
à utiliser l´azote contenu dans les TPC ; (ii) s´il existent des différences dans les patrons
d´allocation de biomasse et de C, N entre les compartiments des plantes en fonction du type
19
Tableau 2. Suite. GLM-ANOVA de l´effet de la mycorhization (mic), l´apport nutritif
(nut), et l´interaction des deux traitements (mic * nut) sur le patron d´allocation de la
biomasse des plantules de Pinus pinea. LMR = Aiguilles vertes : biomasse totale ;
RMR = Système racinaire : biomasse totale ; SMR = Tige + branches : biomasse totale ;
FrLR = Racines fines : aiguilles vertes ; SRR = Tige + branches : Système racinaire ;
SuFrR = Structure de support : racines fines.
SuFrR (Support Fine roots Ratio)
Model
ix
234.296
12
19.525
88.043
.000
mic
4.847
2
2.424
10.929
.000
nut
4.758
3
1.586
7.151
.001
mic * nut
2.396
6
.399
1.801
.122
Error
9.536
43
.222
Total
243.831
55
.950
de nutrition et de mycorhization ; (iii) si le type de tannin impliqué dans le TPC module la
capacité des mycorhizes à utiliser l´azote, plus précisément, si des mycorhizes de Pins ont
plus facilement accès à l´azote contenu dans des complexes impliquant des tannins de Pin que
des tannins extraits d´une autre espèce de plante. Pour cela, nous avons travaillé avec le Pin
parasol Pinus pinea (L.), un arbre méditerranéen vivant généralement dans des milieux
sableux pauvres en nutriments et associé à des champignons ectomycorhiziens (Maremmani
et al. 2003).
2. MATÉRIEL ET MÉTHODES
2.1. Design expérimental
Des plantules de Pinus pinea artificiellement mycorhizées (8 traitements de mycorhizes) ont
été élevées en serre (Annexe 1) à partir de juillet 2008, avec 4 traitements d´apports azotés.
Chaque répétition a été répétée 10 fois, pour un total de 8×4×10 = 320 échantillons. La
mycorhization des racines a été effectuée par inoculation en juillet 2007 suivant la
méthodologie décrite par Boukcim & Mousin (2001). Les 8 traitements de mycorhization,
correspondaient
à
six
espèces
de
champignons
mycorhiziens inoculés:
Hebeloma
cylindrosporum (Hc) ; Laccaria bicolor (Lb) ; Laccaria laccata (Ll) ; Lactarius deliciosus
(Ld) ; Pisolithus tinctorius (Pt) ; Telephora terrestris (Tt) et deux contrôles dont les racines
présentaient soit une mycorhization « naturelle » (M), soit absence totale d´inoculation (Co).
Brièvement, les inoculations consistaient d´abord en une multiplication des champignons
issus de collections de recherche dans des boites de Pétri. Parallèlement, des plantules ont été
élevées en condition stérile dans un mélange tourbe-vermiculite. Deux mois plus tard, un
fragment d´inoculum fongique est placé sur les racines des plantules. Au bout de 10 mois, les
plantes les mieux mycorhizées ont été sélectionnés pour être inclus dans l´expérience. Les
contrôles non inoculés (Co) ont subi exactement le même traitement, mais aucun inoculum
n´a été placé sur les racines. Enfin, des plantes provenant du même lot ont été placées sur le
terrain dans des pots enfoncés dans le sol et remplis de terre locale sur le site de Mas-Vilar
(Pyrénées Orientales), afin de leur permettre de capter la communauté mycorhizienne locale.
Ces plantes constituaient le traitement « mycorhization naturelle » (M).
Les plantes sélectionnées ont été repiquées en mai 2008 dans des pots plastiques de 4L
(15.7×15.7×23.3cm) remplis de sable dépourvu de nutriments (SIFRACO, particules 0.4–
20
Tableau 3. GLM-ANOVA de l´effet de la mycorhization (mic), l´apport nutritif (nut),
et l´interaction des deux traitements (mic * nut) sur le patron d´allocation de la
concentration de l´azote et le ratio C : N dans les aiguilles vertes et les racines fines, et
le stockage d´azote dans les aiguilles vertes.
Type III Sum
of Squares
df
Mean Square
F
p
R2
(adjusted)
3.278
261.921
.000
.968
[N]final des aiguilles vertes
Model
39.335
12
mic
.146
2
.073
5.852
.004
nut
3.187
3
1.062
84.896
.000
.828
.551
203.680
.000
mic * nut
.062
6
.010
Error
1.139
91
.013
Total
40.474
103
[N]final des racines fines
Model
29.752
12
2.479
mic
.039
2
.019
1.583
.218
nut
.786
3
.262
21.511
.000
mic * nut
.195
6
.033
2.675
.029
Error
.475
39
.012
Total
30.227
51
729.988
.000
.979
C : N des aiguilles vertes
Model
964442.425
12
mic
2741.809
2
1370.905
12.452
.000
nut
51124.083
3
17041.361
154.784
.000
.556
.764
217.008
.000
mic * nut
80370.202
367.235
6
61.206
Error
10018.912
91
110.098
Total
974461.338
103
.988
C : N des racines fines
Model
210977.770
12
mic
17581.481
253.728
2
126.864
1.566
.222
nut
5076.987
3
1692.329
20.888
.000
mic * nut
1347.637
6
224.606
2.772
.024
Error
3159.696
39
81.018
Total
214137.466
51
.981
[N] stocké dans les aiguilles vertes
Model
1260.190
12
105.016
32.070
.000
mic
27.468
2
13.734
4.194
.018
nut
756.355
3
252.118
76.991
.000
.505
.803
mic * nut
x
9.926
6
1.654
Error
297.991
91
3.275
Total
1558.181
103
0.784
0.8mm) et stérilisé à la vapeur. Afin de limiter la réallocation d´azote entre les différentes
parties de la plante, une partie des aiguilles des tiges ont été retirées au début de l´expérience.
Quatre traitements azotés ont été apportés : azote minérale (N-min.), protéine animale
BSA (Bovine Serum Albumin) (Prot.) et deux types de complexes tannins-protéines (TPC) :
tannins issus du pin P. pinea-BSA (TPC-Pin.), et tannins issus du Quebracho Schinopsis sp.BSA (TPC-Queb.). A l´exception de l´azote, les plantes ont reçu une fertilisation identique et
optimale tout au long de l´expérience. Toutes les plantes ont été arrosées avec de l´eau
distillée et les nutriments de base par un système de goutte-à-goutte réglé à 60ml/j. Par an,
chaque plante aurait reçu 2085.7 ml d´une première solution (N = 0, P2O5 = 10g/L, K2O =
100g/L) (Dynaflor, Fontignan, France) ; 365 ml d´une deuxième solution de MgSO4 (à
246g/L ) ; 11.97 ml d´une troisième solution de micronutriments (Fe : 2% ; B, Cu et Mn à
3000 ppm ; Mo et Zn à 1500 ppm) (Oligodyn, Dynaflor, Fontignan, France), 521.43 ml de
NaCl ( 7.95g/L) et 521.43 ml de CaCl2 (15.9g/L).
2.2. Mesures sur les plantules
2.2.1. Croissance
Les mesures de taille des plantes ont été prises au début (mesures initiales : 14 mai 2008) et à
la fin (mesures finales : 10 janvier 2010) de l´expérience. Pour les mesures de croissance
primaire (hauteur), la longueur de la tige principale a été mesurée à 0.5cm près, à partir de
1cm sous la cicatrice des cotylédons. Les mesures de diamètre de la tige ont été prises au
même point en utilisant un pied à coulisse numérique à 0.01cm près. Les tiges n´étant pas
parfaitement circulaires, 3 mesures prises à des angles différents ont été moyennées.
2.2.2. Mesures de biomasse
Pour chaque traitement de mycorhize, 10 plantes ont été sacrifiés au début de l´expérience,
séparés en tiges, racines et feuilles. Ces différents compartiments ont été pesés.
A la fin de l´expérience, les plantes ont été déterrées, les racines lavées, et les plantes
ont été séparées en différents compartiments. Les parties aériennes ont été séparées en tiges (S
pour shoot), aiguilles vertes (L pour leaf) et aiguilles brunes ou sénescentes (sans abréviation).
Les parties souterraines ont été séparées en racines fines (Fr pour fine roots, < ~2mm de
diamètre) et racines grossières (Tr pour thick roots, > ~2mm de diamètre) (Annexe 2B).
21
FIGURES
Clé pour l´ensemble des figures qui suivent :
Facteur « Mycorhization initiale »
Co : absence d´inoculation initiale ; M : mycorhization naturelle ; Pt : inoculation par
Pisolithus tinctorius.
Facteur « Apport nutritif azoté »
N-min. : azote minéral ; Prot. : protéine BSA (Bovine Serum Albumin) ; TPC-Pin. :
complexes tannins-protéines (tannins issus du pin Pinus pinea-BSA) ; TPC-Queb. :
complexes tannins-protéines (tannins commercial extraits du Quebracho Schinopsis sp.BSA).
Les caractères (a, b, c) correspondent aux résultats de l´analyse post-hoc Tukey HSD
(différences pour p < 0.01).
xi
Chaque compartiment a été mis à sécher dans des sacs en papier individuels à 60° C pendant
72 heures. Le poids sec de chaque partie a été mesuré à 0.01g près (PRECISA, 3610CD-FR,
Zurich, Suisse). 40% des Fr et Tr ont été gardés fraîches pour caractériser leur statut
mycorhizien.
2.2.3. Analyses C, N
L´ensemble des racines fines et des feuilles vertes (les plus susceptibles de répondre fortement
à des modifications de disponibilité en azote) et un sous échantillon de 10% S et Tr ont été
broyées (Cyclotec Sample Mill, Tecator, Höganäs, Suède) afin d´obtenir une poudre de
particules de 1mm (Annexe 3A). Les S et les Tr, plus ligneux et volumineux, ont d´abord subi
un pré-broyage grâce à un broyeur centrifuge (Retsch ZM 1000, Haan, Allemagne). Les
concentrations de C et N ont été mesurées avec un Analyseur Élémentaire (Flash EA1112
Series, NC Soil analyzer, ThermoFinnigan, Milano, Italie) (Annexe 3B).
2.3. Vérification du statut mycorhizien
2.3.1. Morphotypage et estimation de la densité de mycorhization
Pour quatre individus par traitement de mycorhization (soit un individu par traitement
d´azote) le morphotypage de la mycorhization de l´ensemble des racines a été effectué suivant
la classification proposée par Agerer (2001) en utilisant un stéréoscope (Leica MZ16,
11.5×10X, Wetzlar, Allemagne). La reconnaissance des mycorhizes est basée sur la couleur
du pédicelle et de l´extrémité de la mycorhize, le type de bifurcation (monopodale, bifurcation
opposée ou bifurcation alterne), la longueur des hyphes du mycélium (contact, courtes,
moyennes ou longues) (Annexe 4). Pour l´estimation de la densité de mycorhization, entre 8
et 10 fragments de Fr de ~ 7cm ont été prélevées au hasard et le nombre d´apex mycorhizés et
non mycorhizés a été comptabilisé. Le nombre d´individus de chaque morphotype des
champignons mycorhiziens ont été systématiquement quantifiés sur le total d´apex
comptabilisés pour estimer le pourcentage de mycorhization dans le système racinaire de
chaque traitement (Rincón et al. 2001). Pour chaque traitement d´inoculation, un exemplaire
de chaque morphotype de mycorhize a été photographié (Leica DFC280, Wetzlar,
Allemagne), prélevé dans des tubes Eppendorf et placé au congélateur (-20°C) pour analyse
moléculaire. Au total, 210 échantillons ont ainsi été prélevés.
22
25
A
b
a
.Croissance primaire (cm)
a
20
a
15
b
a
b
10
5
0
4
n = 36
n = 38
n = 32
n = 28
n = 26
Co
M
Pt
N-min.
Prot.
n = 28
n = 24
TPC-Pin. TPC-Queb.
B
.Croissance secondaire (mm)
a
a
a,b
b
b
2
1
0
8
n = 36
n = 38
n = 32
n = 28
n = 26
Co
M
Pt
N-min.
Prot.
n = 28
n = 24
TPC-Pin. TPC-Queb.
C
a
b
6
a
,
(RGR) - Croissance relative
de la biomasse (g g-1)
a
b
3
a
a
4
b
b
2
n = 19
n = 18
n = 18
n = 16
Co
M
Pt
N-min.
0
Mycorhization initiale
n = 13
Prot.
n = 13
n = 13
TPC-Pin. TPC-Queb.
Apport nutritif azoté
Figure 1. Effets du type de mycorhization (gauche) et de l´apport de différents types de
nutriments azotés (droite) sur A. la croissance en hauteur, B. la croissance en diamètre
de la tige et C. la croissance relative de la biomasse de Pinus pinea. Moyennes ± écartstypes.
xii
2.3.2. Identification moléculaire : extraction de l´ADN et amplifications PCR
L´identification des espèces de mycorhizes présentes à la fin de l´expérience a été basée sur
des analyses moléculaires de la séquence du gène ITS (Internal Transcribed Spacer).
L´utilisation de ce marqueur moléculaire pour l´identification des espèces d´ECM est
particulièrement recommandée par Horton & Bruns (2001).
L´ADN des mycorhizes de P. pinea a été extrait en utilisant le Kit REDExtract-NAmp™ Plant kit (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, EU), dont le protocole décrit par le
fournisseur a été optimisé avec la collaboration de M. Sauve (CEFE-Plateforme Marqueurs
Génétiques) lors d´une précédente étude. Le protocole d´extraction consistait donc à (1)
déposer les échantillons dans des puits individuels d´une plaque d´incubation, (2) ajouter à
chaque puit 50µl de solution d´extraction, (3) incuber l´ensemble à 95° C pour 10 minutes
dans un thermocycleur (Eppendorf® Mastercycler, Hambourg, Allemagne), et (4) ajouter
50µl de solution de dilution. La solution d´ADN extrait a été ensuite diluée à 2X avec de l´eau
distillée pour affaiblir l´effet des inhibiteurs propres des racines du Pin.
L´amplification du gène ITS a été réalisée selon le protocole suivant. À 4µl de solution
d´ADN extrait de chaque échantillon ont été ajoutés (1) 10µl de solution de mix PCR
REDExtract-N-Amp™ PCR Mix (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, EU), (2) 2µl d´eau
stérile, (3) 2µl de solution d´amorces universelles spécifiques des champignons ITS1f (10µM)
et 2 µl de ITS4 (10µM) (Horton & Bruns 2001). L´amplification a été réalisée dans un
thermocycleur (Eppendorf® Mastercycler, Hambourg, Allemagne) en 30 cycles : dénaturation
initiale à 94°C pendant 4 min, suivi de 34 cycles de dénaturation à 94°C pendant 30s,
hybridation (annelage) à 55°C pendant 30s, et extension à 72°C pendant 30s (d´après la
méthodologie utilisée par Selosse et al. 2002). Finalement, 6.5µl de produit amplifié de
chaque échantillon a été chargé pour migration en gel d´agarose 2% dans du 0.5X Tris borate
EDTA pour vérifier le succès de l´amplification.
2.3.3. Identification moléculaire : Séquençage
67.6% des échantillons présentaient une bande d´amplification claire et unique, et ont été
choisis pour être séquencés (Laboratoire LGC Genomics, Berlin, Allemagne) tandis que ceux
présentant 0, 2, ou plusieurs bandes ont été éliminés. Les séquences ainsi obtenues ont été
alignées et groupées automatiquement selon leur ressemblances au niveau nucléotidique avec
le logiciel Sequencher® 4.10.1 (Genes Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan, USA) ; le
23
.Croissance secondaire (mm)
4
A
3
a
a
a
(M) Mycorhization naturelle
(Co) Sans mycorhization initiale
(Pt) Pisolithus tinctorius
a
b
b
a
b
2
a
a
b
b
1
0
N-min.
TPC-Pin. TPC-Queb.
B
a
a
6
,
(RGR) - Croissance relative
de la biomasse (g g-1)
8
Prot.
b
4
b
b
b
a
a
2
a
a
a
a
0
N-min.
Prot.
TPC-Pin. TPC-Queb.
Apport nutritif azoté
Figure 2. A. Croissance en diamètre de la tige et B. croissance relative de la biomasse
(RGR) des plantes (M), (Co) et (Pt) en fonction du type d´apport nutritif azoté. Les
symboles représentent les valeurs moyennes et les bâtons leurs écarts type. Les
différences des analyses post-hoc sont indépendantes pour chaque traitement d´apport
nutritif.
xiii
critère d´alignement et de groupement multiple était 85% de concordance et 20% de
superposition. Les séquences ont été corrigées manuellement dans le même logiciel, et celles
présentant trop d´aberrations chromatographiques ont été éliminées. Au total, 61.4% des
séquences ont été comparées à la base des données GenBank (NCBI, Rockville Picke,
Maryland, USA) de façon à déterminer l´espèce(s) présente(s) sur chacune des myorhizes
analysée.
2.4. Analyses statistiques
2.4.1. Différences de croissance, de biomasse et d´allocation C, N sur (L) et (Fr)
Les variables suivantes ont été étudiées pour tous les traitements:
- la croissance en hauteur, définie comme la différence (Δ) entre les hauteurs finales et
initiales
- la croissance en diamètre de la tige, définie comme la différence (Δ) entre les diamètres
finales et initiales
- croissance massique relative (RGR pour « Relative Growth Rate », défini par (Biomasse
Totalefinale – Biomasse Totaleinitiale) / Biomasse Totaleinitiale
- la LMR pour Leaf Mass Ratio défini par LMR = Biomasse des aiguilles vertes (L) /
biomasse totale
- la RMR pour Root Mass Ratio défini par RMR = Biomasse des racines fines (Fr) +
racines grossières (Tr)) / biomasse totale
- la SMR pour Shoot Mass Ratio défini par SMR = Biomasse de la tige + branches (S)) /
biomasse totale
- la FrLR pour Fine roots Leaf Ratio défini par FrLR = Biomasse des racines fines (Fr) /
biomasse des aiguilles vertes (L)
- la SRR pour Shoot Root Ratio défini par SRR = Biomasse de la tige + branches (S) /
biomasse des racines grossières (Tr) + racines fines (Fr))
- la SuFrR pour Support Fine roots Ratio défini par SuFrR = (Structure de support : Su =
S + Tr) / Racines fines (Fr)
- les différences entre les concentrations finales de C et N des (L) et (Fr)
- le ratio C : N des (L) et (Fr)
24
0.4
A
0.35
b
LMR
0.3
a
a
a
a
a
a
0.25
0.2
0.15
n = 19
n = 18
n = 18
n = 16
n = 13
Co
M
Pt
N-min.
Prot.
0.52
B
0.48
a
b
a
n = 13
n = 13
TPC-Pin. TPC-Queb.
a
a
a,b
RMR
a
0.44
0.4
0.36
0.32
n = 19
Co
0.5
C
0.4
a
n = 18
n = 18
M
Pt
n = 16
n = 13
N-min.
Prot.
n = 13
n = 13
TPC-Pin. TPC-Queb.
a
a
a
a
a
b
SMR
0.3
0.2
0.1
n = 19
n = 18
n = 18
n = 16
n = 13
Co
M
Pt
N-min.
Prot.
n = 13
n = 13
0
Figure 3. Suite.
xiv
TPC-Pin. TPC-Queb.
- la quantité de N stocké par les feuilles des plantes au cours de l´experience défini par
Nstocké = (biomassefinale x [Nfinale]) – (biomasseinitiale x [Ninitiale]))
Suivant les recommandations d´Hector et al. (2010) on a choisi le GLM-ANOVA Type III à 2
facteurs (type de mycorhization et traitement d´azote comme facteurs fixes) parmi les
modèles scrutés puisque c´était celui qui mieux s´ajustait à nos jeux de données. Les GLM ne
nécessitent pas la normalité et l´homoscedasticité des résidus (Crawley 2007), ce qui
effectivement n´est pas le cas de l´ensemble de nos données. De plus, les modèles du type III
permettent d´analyser des données non-orthogonales (unbalanced data). En dépit d´un design
de l´expérience orthogonal, la mortalité du 11% du total des individus l´a rendu faiblement
non-orthogonal. Dans les cas où on a trouvé des interactions entre les deux facteurs, des oneway ANOVA ont été effectués pour analyser l´effet d´un facteur pour chaque niveau de
l´autre facteur. Pour tous les cas, des comparaisons post hoc (Tukey HSD) ont été réalisés
pour préciser les différences entre les traitements (à p < 0.01). Toutes les analyses ont été
effectuées avec le logiciel SPSS v15.0 (SPSS Inc. Chicago Illinois, USA).
3. RÉSULTATS
3.1. Densité et identité des inoculums à la fin de l´expérience
L´analyse génétique couplée au morphotypage a montré à la fin de l´expérience que tous les
traitements, sauf les traitements d´inoculation Pisolithus tinctorius (Pt) et mycorhization
naturelle
(M),
ont
été
sévèrement
contaminés
par
des
champignons
exogènes
ectomycorhiziens ; des champignons saprotrophes et pathogènes ont également été identifiés.
Les mycorhizes inoculées initialement n'ont pas été retrouvées sur les traitements Hc, Lb, Ld,
Ll et Tt. Le morphotypage et les résultats d´identification par séquençage d´ADN n´ont pas
coïncidé, ce qui a rendu le calcul de densité de mycorhization inexact. Parmi les espèces
invasives identifiées, l´ectomycorhize Trichophaea abundans (Ascomycota : Pezizomycetes :
Pyronemataceae) était la plus commune, suivie par des champignons pathogènes des genres
Penicillium et Gibberella (Ascomycota : Trichocomaceae et Nectriaceae, respectivement).
Ces contaminations nous ont conduit à ne présenter que les résultats des trois
traitements restants, à savoir (Co), (M) et (Pt). Les individus du traitement (Co) ont été
envahis par Trichophaea abundans à la fin de l´expérience ; les individus de (M) ont présenté
25
2
D
c
a
a
1.6
Fr L R
a
a,b
b,c
a
1.2
0.8
0.4
1.2
n = 19
n = 18
Co
M
n = 18
Pt
n = 16
n = 13
N-min.
Prot.
n = 13
n = 13
TPC-Pin. TPC-Queb.
E
a
a
a
a
a
a
1
SRR
0.8
b
0.6
0.4
0.2
n = 19
n = 18
n = 18
n = 16
n = 13
Co
M
Pt
N-min.
Prot.
n = 13
n = 13
0
5
TPC-Pin. TPC-Queb.
F
b
a
4
Su Fr R
a,b
3
b
a,b
a
a
2
1
n = 19
n = 18
n = 18
n = 16
Co
M
Pt
N-min.
n = 13
n = 13
n = 13
0
Mycorhization initiale
Prot.
TPC-Pin. TPC-Queb.
Apport nutritif azoté
Figure 3. Suite Patrons d´allocation de la biomasse des plantules de Pinus pinea en
fonction du type de mycorhization (gauche) et de l´apport nutritif en azote (droite). A.
LMR (Leaf Mass Ratio) = Aiguilles vertes (L) : biomasse totale ; B. RMR (Root Mass
Ratio) = Racines fines (Fr) + racines de support (Tr) : biomasse totale. C. SMR (Shoot
Mass Ratio) = Tige + branches (S) : biomasse totale ; D. FrLR (Fine roots Leaf Ratio) =
Racines fines (Fr) : Aiguilles vertes (L) ; E. SRR (Shoot Root Ratio) = Tiges + branches
(S) : (Racines grossières (Tr) + Racines fines (Fr)) ; F. SuFrR (Support Fine roots
Ratio) = Structure de support (Su) : Racines fines (Fr).
xv
quatre types de mycorhization : par Tomentella ellisii (Basidiomycota : Agaricomycetes :
Telephoraceae),
Geopora
tenuis
(arenicola ?)
(Ascomycota
:
Pezizomycetes
:
Pyronemataceae), d´une espèce indéterminée de la Classe Pezizomycetes (Ascomycota), et de
Trichophaea abundans, plus une légère contamination des pathogènes des genres Penicillium
et Gibberella ; finalement, les individus inoculés initialement avec (Pt), ont présenté
effectivement de Pisolithus tinctorius (Basidiomycota : Agaricomycetes : Sclerodermataceae),
et de Trichophaea abundans.
3.2. Effet du statut mycorhizien des plantes sur l´acquisition de l´azote
3.2.1. Croissance et RGR
Les traitements de mycorhization (mic) et d´apport d´azote (nut) ont significativement affecté
la croissance des plantes (croissance en hauteur et en diamètre de la tige, RGR, Tableau 1). La
figure 1 (A–C) montre les différences entre les moyennes de chacune des variables pour
chacun des traitements. On observe que pour la croissance en hauteur et la RGR (Figures 1A
et 1C) les plantes avec mycorhization initiale naturelle (M) se sont significativement mieux
développées que les autres traitements. En moyenne, les plantes (M) ont grandit de 17.45cm
(±6.77), soit environ 7cm de plus que les plantes avec un autre type de mycorhization. Ces
plantes « M » ont augmenté leur masse relative en 4.33g·g-1 (±2.04), soit environ 1g·g-1 de
plus que le reste des plantes. Concernant la croissance en diamètre de la tige (Figure 1B), les
plantes (Co) ont grossit environ 20% de plus que les plantes (M) et (Pt), lesquels ne montrent
pas de différence significatives. L´interaction mic * nut était significative (p < 0.05) pour la
croissance en diamètre de la tige et le RGR, c´est à dire que l´effet sur le développement d´un
type d´apport nutritif azoté dépend du type de mycorhization. (Tableau 1). La Figure 2 nous
montre l´effet des traitements d´azote pour chaque modalité de mycorhization. La croissance
en diamètre de la tige des plantes (Co) a été significativement supérieure aux autres
traitements de mycorhization pour les traitements (Prot.) et (TPC-Pin.), et seulement
supérieure à (M) pour le traitement (TPC-Queb.) (Figure 2A). Le RGR des plantes (M) a été
supérieure aux autres deux traitements (Co) et (Pt) pour les apports nutritifs (N-min.) et
(Prot.), mais pas différente pour les apports (TPC-Pin.) et (TPC-Queb.) (Figure 2B).
En moyenne, les plantes ayant reçu (N-min.) et (Prot.) ont crût environ le double en
hauteur et en biomasse, et ont également plus augmenté leur diamètre, que les plantes ayant
reçu (TPC-Pin.) et (TPC-Queb.) (Figure 1).
26
0.4
(M) Mycorhization naturelle
(Co) Sans mycorhization initiale
(Pt) Pisolithus tinctorius
0.35
LMR
0.3
a
a
a
a
0.25
a
a,b
b
b
a
0.2
b
b
a
0.15
N-min.
Prot.
TPC-Pin. TPC-Queb.
Apport nutritif azoté
Figure 4. Leaf Mass Ratio (LMR) des plantes (M), (Co) et (Pt) en fonction du type
d´apport nutritif azoté. Les symboles représentent les valeurs moyennes et les bâtons
leurs écarts type. Les différences des analyses post-hoc sont indépendantes pour chaque
traitement d´apport nutritif.
xvi
3.2.2. Allocation de la biomasse
Les GLM-ANOVA de la Tableau 2 montrent que le traitement de mycorhization (et non le
traitement en apports nutritifs) a eu un effet significatif sur les patrons d´allocation de la
biomasse entre les différentes parties fonctionnelles des plantes des variables LMR, RMR,
SMR et SRR. Le contraire a pu être observé pour le FrLR où le traitement d´apport en azote
(et non le traitement de mycorhization) a eu un effet significatif sur les patrons d´allocation de
la biomasse. Pour le SuFrR cependant, les deux facteurs ont affecté le patron d´allocation de
la biomasse. Parmi les traitements de mycorhization initiales, les plantes avec inoculation
naturelle (M) sont celles qui ont distribué le plus de ressources pour développer les feuilles et
leur système racinaire ; respectivement, ~26% et ~44% de leur biomasse totale finale
correspondent à ces compartiments (Figures 3A (LMR) et 3B (RMR)). La figure 3C et 3E
(SMR et SRR respectivement) montre qu´au contraire, les plantes avec inoculation naturelle
(M) sont celles qui ont investit le moins pour le développement des tiges et branches (24% de
la biomasse totale pour SMR) et un ratio de ~2 : 1 pour la relation SRR. La figure 3D (FrLR)
montre que la relation racines fines vs. aiguilles vertes est d´environ 1 : 1 en moyenne pour
tous les traitements de mycorhization. Comme le montrent les GLM-ANOVA, des effets des
différents apports nutritifs sur l´allocation des ressources par l ont pu être observés
uniquement dans (FrLR). La figure 3D montre que les plantes nourries avec des TPC ont plus
investit sur le développement des racines fines (substrat mycorhizien) que sur la production
d´aiguilles. La Figure 3F (SuFrR) montre que les plantes des deux traitements (Pt) et surtout
(M) ont en moyenne plus investit sur la production des Fr que sur la structure de support Su
(S + Tr) par rapport au traitement Co. Les mêmes résultats ont pu être observés pour les
plantes nourries avec les deux types de TPC par rapport aux autres types d´apports azotés,
notamment au (Prot.).
À part le LMR, on ne trouve pas un effet interactif des traitements (mic * nut : p >
0.05 ; Tableau 2) ce qui suggère que l´allocation des ressources des plantes a répondu de
façon similaire aux limitations nutritives en azote indépendamment du type de mycorhization
initiale. La Figure 4 qui illustre l´interaction des facteurs pour LMR nous montre que les
plantes (M) ont plus investit sur la production des aiguilles vertes que les traitements (Co) et
(Pt), particulièrement pour le traitement (TPC-Pin.).
27
1
A
a
N final aiguilles vertes (%)
a
0.8
a
a
b
0.6
0.4
1
n = 36
n = 35
n = 32
n = 25
n = 26
Co
M
Pt
N-min.
Prot.
a
a
Ba
a
N final racines fines (%)
c
n = 28
n = 24
0.2
0
TPC-Pin. TPC-Queb.
a
0.8
b
b
0.6
0.4
0.2
0
Figure 5. Suite.
xvii
c
n = 18
n = 18
n = 15
n = 15
n = 12
Co
M
Pt
N-min.
Prot.
n = 12
n = 12
TPC-Pin. TPC-Queb.
3.2.3. Répartition des concentrations de N et C dans les plantes
La concentration finale en N des aiguilles vertes (L) et racines fines (Fr) n´ont pas été
affectées par le traitement de mycorhization (figures 5A et 5B). Par contre, les plantes
nourries avec (N-min.) et (Prot.) présentaient plus de concentrations de N dans ces
compartiments de la plante par rapport à celles nourries avec les TPC (Figures 5A et 5B et
Tableau 3). Une interaction significative entre mycorhization et apport nutritif a été observée
pour la concentration en azote des racines fines, mais pas des aiguilles vertes (Tableau 3). La
concentration en C dans les (L) et les (Fr) était constante quelque soit le traitement (Figures
5C et 5D).
Le rapport C : N des (L) et des (Fr) a été affecté par le type d´apport nutritif apporté
aux plantes. En effet, les plantes nourries avec les TPC ont un rapport C/N inférieur par
rapport à celle ayant reçu des protéines ou de l´azote minéral (figures 6A et 6B). Pour les (L)
on observe que les plantes (M) et (Pt) on mieux assimilé le N que les plantes (Co), tandis que
pour les (Fr) il n´a pas eu différences entre les trois types de mycorhization (figure 6A et 6B).
La figure 7 résume les résultats de l´interaction mic * nut du Nfinal et du ratio C : N des
(Fr). Malgré la significativité de l´interaction (P < 0.001, Table 3), nous n´avons pas pu faire
émerger de patron clair concernant cette interaction.
Finalement, la quantité en grammes de N stocké dans les (L) pendant l´expérience (en
relation à la différence de concentration de N dans la biomasse finale et initiale) a présenté un
effet significatif de la part du type d´apport nutritif distribué aux plantules. La quantité de N
stocké par les plantes (TPC-Pin.) et (TPC-Queb.) a été significativement plus basse que celui
stocké par les plantes (N-min.) et (Prot.) (Figure 8). Le traitement de mycorhization a eu un
effet significatif sur le stockage de N dans les (L) (Table 3). En particulier, les plantes N ont
eu tendance à stocker plus d azote (Figure 8).
4. DISCUSSION
4.1. Les contaminations par des champignons mycorhiziens exogènes
À la fin de l´expérience, les racines des pins des traitements Hc, Lb, Ld, Ll et Tt ont été
contaminées par des champignons exogènes différents de ceux initialement inoculés. Rincón
et al. (2001 ; 2007) ont également trouvé que les taux de colonisation finales des ECM
28
60
C
C final aiguilles vertes (%)
a
a
a
a
n = 36
n = 35
n = 32
n = 25
n = 26
Co
M
Pt
N-min.
Prot.
a
a
a
a
a
a
n = 18
n = 18
n = 15
n = 15
n = 12
n = 12
n = 12
Co
M
Pt
N-min.
a
40
20
0
50
C final racines fines (%)
a
a
Da
n = 28
n = 24
TPC-Pin. TPC-Queb.
40
30
20
10
0
Mycorhization initiale
Prot.
TPC-Pin. TPC-Queb.
Apport nutritif azoté
Figure 5. Suite. Effets de différents types de mycorhization (gauche) et d´apport de
nutriments azotés (droite) sur A. le pourcentage de Nfinal dans les aiguilles vertes, B. le
pourcentage de Nfinal dans les racines fines C. le pourcentage de Cfinal dans les aiguilles
vertes et D. le pourcentage de Cfinal dans les racines fines de Pinus pinea. Moyennes ±
écarts-types.
xviii
inoculés végétativement sur des racines de pins peuvent être très variables en fonction de
l´espèce de champignon, de la densité initiale des inoculums, du type de fertilisation utilisé
(nutriments), et de l´espèce de plante hôte (Pinus pinea ou Pinus pinaster). Ils ont trouvé par
exemple que le succès de mycorhization de Pinus pinea (mesuré en pourcentage de
mycorhization de l´espèce inoculée à la fin de l´expérience) par Pisolithus tinctorius était
possible uniquement avec des grandes quantités d´inoculum initiale ; ce n´était pas le cas pour
une espèce d´Hebeloma dont le taux de mycorhization finale était toujours très grande
indépendamment de la quantité d´inoculum initiale, ou le cas de Laccaria laccata qui a
présenté des taux de mycorhization ~ 50% avec des quantités moyennes d´inoculums initiales.
Dans notre étude les plantes (Pt) ont été les seules à avoir succès de mycorhization à la fin de
l´expérience ce qui suggère que la méthodologie d´inoculation utilisée était correcte, qu´elle a
bien marché, et que la contamination qu´on a témoigné dans le reste des traitements a été
casuelle, dû probablement au manque d´hermétisme de la serre utilisée pour la mise en place
de l´expérience et la virulence des champignons ectomycorhiziens colonisateurs. Les
mycorhizes installées étant généralement stables, il est aussi probable que l´origine des
contaminations soit à rechercher dans les premiers stades suivant l´inoculation (F. Richard,
comm. pers.).
Il faut signaler que la plus grande contrainte de cette contamination, c´est qu´elle ne
nous a pas permis d´évaluer l´impact de la « présence vs. absence » de mycorhization, dans la
mesure où les contrôles sans mycorhizes (Co) ont été eux aussi contaminés par des
mycorhizes exogènes. Cette contamination est assez normale dans la mesure où l´état
mycorhizé représente l´état de base des apex racinaires de Pin dans la nature. Aurait-il été
judicieux d´utiliser un fongicide pour assurer les conditions sceptiques du traitement (Co) dès
le début de l´expérience? Une telle mesure aurait permis de véritablement contrôler l´impact
de la mycorhization en soi, mais aurait également diminué la colonisation des champignons
saprotrophes libres ; l´élimination de ces organismes dans un seul traitement aurait ainsi
empêché de considérer leur présence comme un bruit de fond commun à tous les traitements,
et aurait donc rendu moins rigoureuse la comparaison entre les traitements.
La discussion de ce rapport spécifiquement se base donc sur la présence de
Trichophaea abundans pour le traitement de mycorhization (Co), Tomentella ellisii, Geopora
tenuis (arenicola ?), Pezizomycetes sp., Trichophaea abundans, et Penicillium et Gibberella
pour le traitement de mycorhization (M), et Pisolithus tinctorius et Trichophaea abundans
pour le traitement de mycorhization (Pt).
29
150
A
a
c
b
c
C : N (aiguilles vertes)
b
120
b
60
30
120
C : N (racines fines)
a
90
n = 36
n = 35
n = 32
n = 25
n = 26
Co
M
Pt
N-min.
Prot.
a
a
n = 28
n = 24
TPC-Pin. TPC-Queb.
B
b
b
90
a
a
60
30
n = 18
n = 18
n = 15
n = 15
Co
M
Pt
N-min.
Mycorhization initiale
a
n = 12
Prot.
n = 12
n = 12
TPC-Pin. TPC-Queb.
Apport nutritif azoté
Figure 6. Effet du type de mycorhization (gauche) et de l´apport de différents types de
nutriments azotés (droite) sur A. le ratio C : N dans les aiguilles vertes (L) et B. le ratio
C : N dans les racines fines (Fr) de Pinus pinea.
xix
4.2. Mycorhization et croissance des plantes
Les plantes ayant subi une inoculation naturelle (M) semblent avoir été plus efficaces pour
utiliser les nutriments du sol. En effet, ces plantes ont eu une croissance en hauteur et une
RGR plus importantes. Or elles avaient également une plus grande diversité de mycorhizes
sur leurs racines. Cela suggère donc un rôle positif de la diversité des mycorhizes sur leur
efficacité. Ce résultat est cohérent avec van der Heijden et al. (1998) et Baxter & Dighton
(2001) qui montrent que la diversité des champignons mycorhiziens augmentent la
productivité végétale et la quantité de nutriments absorbés. Dans le cas de la croissance en
diamètre de la tige, par contre, on a observé que les plantes (M) ont moins grossi par rapport à
(Co) et (Pt) (Figure 1) particulièrement pour les deux traitements TPC (Figure 2A). Ceci est
associé, de manière plus globale, au fait que les plantes (M) ont plus investit dans la
production des aiguilles vertes et le système racinaire que sur le système de transport par
rapport à (Co) et (Pt). Ce point sera discuté dans le paragraphe suivant, consacré à l´allocation
de biomasse.
4.3. L´allocation de la biomasse dans les plantes
Les plantes (M) ont plus investi dans la production des aiguilles vertes et le système racinaire
que sur le système de transport par rapport à (Co) et (Pt). Étant donnée que les plantes (M)
étaient apparemment plus efficaces pour exploiter les nutriments azotés, spécialement (Nmin.) et (Prot.), il est possible qu´elles ont plutôt favorisé le développement des parties de la
plante impliquées dans le captage des ressources, comme le système racinaire ou les aiguilles
vertes, pour profiter des nutriments acquis et favoriser leur croissance en hauteur nécessaire
pour atteindre la lumière et ainsi augmenter la photosynthèse. On peut noter que cette
stratégie est favorable aux mycorhizes, car l´augmentation de la photosynthèse implique une
augmentation de la production des produits carbonés indispensables pour la survie des
champignons ECM associés (Finlay 2005).
L´interaction entre la mycorhization initiale et l´apport nutritif azoté pour la LMR
(Figure 4) nous ferait penser que l´investissement des plantes (M) sur la production des
aiguilles vertes servirait à assurer et maintenir l´activité des ECM associées puisque les
ressources ont été également employées pour le développement de ces deux compartiments
liés à l´acquisition des ressources des plantes qui sont théoriquement liées de façon directe à
la biologie et survie des champignons mycorhiziens. Par contre que la biomasse des racines
30
N final racines fines (%)
1.2
A
(M) Mycorhization naturelle
(Co) Sans mycorhization initiale
(Pt) Pisolithus tinctorius
1
a
a
a
0.8
a
a
a
a
a
a
a
0.6
a
b
0.4
N-min.
100
Prot.
TPC-Pin. TPC-Queb.
B
90
C : N (racines fines)
a
a
80
a
a
70
a
a
60
50
a
a
a
a
a
a
40
N-min.
Prot.
TPC-Pin. TPC-Queb.
Apport nutritif azoté
Figure 7. A. Concentration de N finale et B. ratio C : N des racines fines (Fr) des
plantes (M), (Co) et (Pt) en fonction du type d´apport nutritif azoté. Les symboles
représentent les valeurs moyennes et les bâtons leurs écarts type. Les différences des
analyses post-hoc sont indépendantes pour chaque traitement d´apport nutritif.
xx
fines en relation à la biomasse des aiguilles vertes est ~ 1 : 1 pour les traitements de
mycorhization, mais qu´elle est plus grande pour les deux traitements TPC, spécialement pour
(TPC-Queb.), nous indiquant que les plantes certainement développent plus leur racines fines
(compartiment d´acquisition des ressources du système racinaire) en présence des ressources
difficiles à accéder comme une réponse physiologique à la carence des ressources. Ceci
s’observe également dans la Figure 2A où les plantes de tous les traitements de
mycorhization, spécialement les (M) ont moins investi sur le système de transport en présence
de molécules récalcitrantes (TPC) ce qui ce reflète par une croissance inférieure du diamètre
de la tige.
4.4. Nutrition azotée et croissance des plantes
4.4.1. Vers un rejet partiel de l´hypothèse de Northup et al. (1995) ?
L´objectif de notre étude était de tester si les champignons mycorhiziens (ECM) associés à
des plantules de Pinus pinea ont la capacité d´avoir accès à l´azote contenu dans des
molécules récalcitrantes tels que les complexes tannins-protéines (TPC). Cette étude avait
pour but d´apporter des éléments nouveaux vis-à-vis de l´hypothèse de Northup et al. (1995).
Selon ces auteurs, l´avantage compétitif lié à la capacité des ECM à utiliser l´azote contenu
dans les TCP pourrait constituer une pression évolutive aboutissant à la production de tannins
foliaires. Cependant, notre étude montre que les plantes ectomycorhizées utilisées n´ont pas
eu accès à cette forme d´azote complexe, et nos conclusions sont donc plutôt opposées à
l´hypothèse de Northup et al. (1995). Ce résultat s´observe de manière très nette pour
l´ensemble des variables : croissance en hauteur et en diamètre de la tige, augmentation
relative de la biomasse, concentration en azote des feuilles et des racines fines, et quantité
d´azote stocké dans les aiguilles. Les plantes en présence de TPC n´ont vu aucune
augmentation de leur stock d´azote des aiguilles : l´augmentation de biomasse des aiguilles
s´est d´ailleurs accompagnée d´une baisse de la concentration en azote. Ainsi, la quantité
d´azote est restée constante, et la croissance s´est accompagnée d´un processus de dilution et
de réallocation de l´azote initialement présent. Ce résultat n´a pu être observé grâce à que le
sable initial était parfaitement pur et dépourvu d´azote. L´ensemble de l´azote était donc
apporté par les traitements expérimentaux.
Nos résultats sont partiellement en accord avec des études antérieures. La capacité des
ECM à capturer et utiliser l´azote stocké dans des TPC a été mise en doute par Bending &
31
N stocké dans les aiguilles vertes (g)
6
a
a
a
a
4
b
2
c
c
0
-2
n = 36
n = 35
n = 32
n = 25
Co
M
Pt
N-min.
Mycorhization initiale
n = 26
Prot.
n = 28
n = 24
TPC-Pin. TPC-Queb.
Apport nutritif azoté
Figure 8. Effets du type de mycorhization (gauche) et de l´apport de différents types de
nutriments azotés (droite) sur la quantité de N stockée dans les aiguilles vertes (L) de
Pinus pinea pendant l´expérience. Moyennes ± écarts-types.
xxi
Read (1996), et plus récemment par Wu et al. (2003) qui ont démontré que plusieurs ECM
n´étaient pas capables d´hydrolyser de tels complexes, à la différence d´autres microorganismes plus saprotrophes. Une grande originalité de notre étude provenait de l´utilisation
de plantes mycorhizées par un large panel de mycorhizes, ce qui aurait pu permettre de
moduler ou de renforcer les conclusions de ces auteurs. Malheureusement, une majorité de ces
traitements ont été perdus à cause des contaminations.
À l´inverse de ce qui a été observé pour les ECM, Bending & Read (1996) et
Wurzburger & Hendrick (2009) ont montré par contre, que les mycorhizes éricoïdes (ERM)
sont capables d´utiliser cette forme d´azote. L´ensemble de ces données suggère donc que
l´hypothèse de Northup et al. (1995) pourrait être valide dans les écosystèmes dominés par les
ERM, mais peu probable dans les milieux dominés par les ECM comme montré par Read
(1991) qui constate que les environnements contenant le plus de matière organique
récalcitrante sont souvent totalement dominés par des plantes éricacées. Ainsi, notre étude
suggère qu´il est peu probable qu´une rétroaction via la nutrition azotée soit une pression de
sélection majeure pour la production de tannins dans les feuilles de plantes vivantes sur des
milieux pauvres en azote.
4.4.2. L´importance de la structure des TPC
La plupart des études visant à évaluer l´impact de la mycorhization sur l´accès de l´azote des
TPC (Bending & Read 1996 ; Wu et al. 2003) ont utilisé des tannins commerciaux utilisés
dans l´industrie (i.e. acide tannique). Or un certain nombre d´études montrent que les
propriétés des tannins sont fortement influencés par leur structure (Zucker 1983 ; Kraus et al.
2003b). Par exemple, Wurzburger & Hendrick (2009) ont trouvé que les mycorhizes ont un
meilleur succès à exploiter les TPC issus de leurs propres plantes hôtes. Ainsi, nous avons
comparé deux formes de TPC, l´un fabriqué à partir de tannins de Quebracho (un autre type
de tannin commercial), l´autre à partir des tannins de Pinus pinea. Bien que nous n´ayons pas
détecté d´effet important de la structure des tannins, certains traitements de mycorhization ont
répondu différemment aux deux types de TPC, surtout en ce qui concerne l´azote des racines
et la LMR, où les plantes mycorhizées naturellement (M) par rapport à (Co) et (Pt), ont moins
assimilé l´azote issu du TPC-Quebracho, et plus investit sur la production des aiguilles en
présence du TPC-Pin, résultats qui sont discutés dans les paragraphes qui suivent.
32
4.4.3. Les formes d´azote facilement accessibles
Mis à part les TPC, qui constituaient les traitements centraux de cette expérience, les autres
traitements d´azote étaient de l´azote minéral et des protéines seules. Même si les plantes
semblent avoir globalement mieux exploité l´azote minérale, ces deux traitements ont
engendré des réponses statistiquement similaires. Notre étude ne permet pas clairement de
savoir si l´utilisation de l´azote des protéines est due à l´activité enzymatique propre des
mycorhizes, ou si cette utilisation fait suite à une minéralisation préalable des protéines en
azote minéral par des organismes saprotrophes libres. D´autres auteurs ont démontré la
capacité des ECM à avoir accès à l´azote contenu dans des protéines animales non
complexées avec des substances polyphénoliques (Abuzinadah et al. 1986 ; Finlay et al.
1992).
4.4.4. Allocation des ressources
Nous avons montré que la concentration de N finale allouée aux aiguilles et racines fines était
indépendante du type de mycorhization, mais dépendante du type d´apport nutritif, où plus de
concentration de N a été trouvée dans les plantes nourries avec l´azote minéral et les protéines
animales, ce qui a été confirmé par les valeurs de C : N où le ratio était significativement plus
important dans les aiguilles et racines des plantes nourries avec du TPC ce qui réaffirmerait
qu´effectivement celles-ci ont moins assimilé le N complexé.
Concernant les concentrations finales de C dans les racines fines, Johnson et al. (1997)
mettent en évidence le rapport entre l´allocation de C dans les différents compartiments des
plantes et le SRR. Ils expliquent que les plantes ayant des SRR élevés ont un fort besoin de
mycorhization et que celles qui auraient intérêt à élargir la colonisation des mycorhizes
auraient donc la tendance à allouer plus de C dans leur système racinaire par rapport à ce qui
est alloué sur la tige, ce qui se réfléchirait sur leur SRR qui forcément devrait être < 1. Dans
cette logique, les plantes (Co) seraient justement celles qui auraient plus intérêt à distribuer
ressources sur le système racinaire, spécialement sur les racines fines (compartiment
d´acquisition des ressources) par rapport aux structures de support et transport (Su)
puisqu´elles n´ont pas reçu d´inoculation mycorhizienne au début de l´expérience. Ceci est
discutable dans le sens où bien que le développement des racines peut-être lié à favoriser la
colonisation des mycorhizes, il peut être aussi lié à la recherche de ressources assimilables par
elles mêmes comme par exemple de l´azote minérale. Nos résultats montrent que ni les
33
plantes (Co) ni les plantes (N-min.) ont alloué plus de ressources pour développer
significativement leur système racinaire et leur racines fines par rapport aux plantes (M) et
aux plantes (TPC).
4.5. Au-delà des capacités saprotrophes
Johnson et al. (1997) expliquent que l´association plante-champignon mycorhizien aurait
évolué du fait d´un gain commun entre les deux symbiontes (mutualisme), voire même, aurait
contribué à la diversification des plantes terrestres comme a été suggéré par Wang & Qiu
(2006). Dans la plupart des cas, il a été prouvé que l´association mycorhizienne améliore la
production des plantes, des systèmes agricoles en particulier, mais que ce n´est pas toujours le
cas, et que l´association devienne parasitique dans le moment où les coûts nets de la symbiose
dépassent les bénéfices nets (Johnson et al. 1997). Du point de vue évolutif, ceci est tout à fait
possible étant donné que les ECM par exemple, ont convergé plusieurs fois après leur
dérivation des AM, et que les stratégies de survie ont été indépendantes et très plastiques
(Wang & Qiu 2006). Le continuum mutualisme-parasitisme dans les associations
mycorhiziennes est un fait qui dépend des caractéristiques propres des symbiontes, comme
leur état de développement (immatures, adultes), les facteurs environnementaux (limitation
des ressources), et leurs facteurs génétiques (combinaison des deux génotypes) ce qui fait que
la position de chaque association dans le continuum soit « individuelle » (Johnson et al.
1997). Dans cette étude on a vu que le statut mycorhizien (M) a plus grandit, plus cumulé de
biomasse, et plus investit dans les compartiments impliqués dans le captage des ressource tels
que les aiguilles et les racines fines. Cependant, malgré ces signes de performance productive,
au moins au niveau des aiguilles vertes, les plantes (M) n´ont pas stocké plus d´azote que le
reste des traitements. De plus, ils n’ont pas eu accès aux TPC. Ces résultats suggèrent que les
plantes (M) ont plus développé leur système racinaire et photosynthétique pour maintenir les
mycorhizes déjà présentes plutôt que pour la recherche de ressources plus assimilables. Ces
résultats nous fait penser à plusieurs hypothèses : soit (1) l´effet « diversité » de
mycorhization naturelle offre aux plantes une capacité supérieure à chercher et exploiter du N
moins récalcitrant ainsi que d'autres ressources comme P, C, H2O, ce qui pourrait
s´interpréter comme une relation mutualiste dans le sens où mycorhizes et plantes, en
présence de ressources plus assimilables, assurent mutuellement leur nutrition ; (2) dû à
l´inefficacité des plantes à exploiter les ressources azotées limitantes telles que celles stockées
dans les TPC, elles ont investit sur le système racinaire pour augmenter le foraging dans un
34
milieu apparemment pauvre en nutriments ; (3) les plantes (M) ont été contrôlées par leurs
mycorhizes associés dans le sens où obligent à la plante à investir sur la croissance en hauteur
et les feuilles vertes pour augmenter les niveaux de photosynthèse et ainsi augmenter le
biotrophisme (le transfert des ressources carbonées de la plante aux champignons), ce qui a eu
comme effet collatéral une faible croissance en diamètre de la tige (allocation de C pas
utilisée pour produire plus de tissu vasculaire nécessaire pour les transport des nutriments et la
stabilisation de la plante) bénéficiant le maintien des mycorhizes et ne compromettant pas de
manière significative la survie de la plante (~ commensalisme).
5. CONCLUSIONS
Nous avons mis en évidence que les plantes ectomycorhizées n´ont pas accès à des formes
d´azote complexes et récalcitrantes comme les TPC, ce qui est en accord avec d´autres études
qui ont testé les capacités saprotrophes des ECM (Bending & Read 1996 ; Wu et al. 2003).
Nos résultats contribuent donc à la remise en question du rôle des ectomycorhizes dans la
mobilisation des produits azotés complexés, et donc aux hypothèses de court-circuitage du
cycle de l´azote comme cela avait été suggéré par Northup et al. (1995). Cela, cependant, ne
rejette en rien l´hypothèse pour d´autres types de mycorhizes, comme par exemple des
mycorhizes éricoïdes.
Bien que le rôle des saprotrophes libres n´a pas été étudié ici, et notre expérience n´a
jamais cherché à les exclure, leur présence éventuelle n´a pas amélioré davantage
l´exploitation des TPC par les organismes ectomycoriziens, contrairement à ce que Wu et al.
(2003) ont constaté ; l´absence d´azote stockée dans les feuilles en présence de TPC
confirmerait cette affirmation.
tte étude a confirmé que le type d´association mycorhizienne modifie les performances
des plantes, et pourrait notamment améliorer l´utilisation de nutriments moins récalcitrants
comme l´azote minéral ou les protéines animales. En particulier, la présence d´un plus grand
nombre d´espèces de mycorhizes sur les racines des plantes (M) semble avoir été associée
avec une plus grande performance de ces plantes.
Ce travail ouvre de nombreuses perspectives. L´extension d´expériences de ce type à
une large palette de champignons mycorhiziens, notamment des ERM, permettraient d´élargir
notre vision sur l´utilisation de formes d´azote complexe et continuer à tester ainsi des
hypothèses d´importance écologique telles que le court-circuitage du cycle de l´azote. En
particulier, la fabrication de TPC marqué au
15
N permettrait de quantifier précisément la
35
capacité de plantes mycorhizées à avoir accès à cet azote. Enfin, l´activité des mycorhizes est
fortement modulée par l´action d´autres organismes associés aux racines, comme par exemple
des bactéries (Wu et al. 2003). Ainsi, il est nécessaire de valider la pertinence de nos résultats
sur le terrain si l´on souhaite comprendre la complexité du cycle de l´azote et des liens
complexes entre sol, plantes et organismes associés.
36
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42
ANNEXES
Annexe 1. Terrain d´expérience du CEFE-CNRS, pourvu de serres pour des expérimentations
sous conditions climatiques contrôlées (gauche), et les plantes élevées de Pinus pinea à la fin
de l´étude (droite).
43
Annexe 2. Parties aériennes (A) et souterraines (B) de Pinus pinea séparées pour le calcul
localisé de la biomasse et des concentrations de C et N.
44
Annexe 3. A. Broyage des parties aériennes (aiguilles vertes sur photo) et souterraines pour
obtenir des particules de matériel végétal en poudre (< 1mm). B. Pesage du matériel végétal
pour l´analyse de C et N.
45
Annexe 4. Différents types de mycorhization. Le morphotypage a été basé sur la couleur du
pédicèle et de l´extrémité de la mycorhize, le type de bifurcation (monopodale, bifurcation
opposée ou bifurcation alterne) et la couleur et longueur des hyphes du mycélium (contact,
courtes, moyennes ou longues) selon Agerer (2001). A. Apex d´un fragment de racine sans
mycorhizes. B. Mycorhizes monopodales à hyphes longues. C. Mycorhizes avec bifurcation
opposée à hyphes de longueur moyennes.
46