« Toxicologie Génétique : Essais de Mutation Létale Récessive liée

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LIGNE DIRECTRICE DE L’OCDE
POUR LES ESSAIS DE PRODUITS CHIMIQUES
Adoptée :
4 avril 1984
« Toxicologie Génétique : Essais de Mutation Létale
Récessive liée au Sexe chez Drosophila melanogaster »
1. I N T R O D U C T I O N
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Connaissances requises
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Etat physique de la substance d'essai : solide, liquide, gaz ou vapeur
Identification chimique de la substance d'essai
Degré de pureté (impuretés) de la substance d'essai
Caractéristiques de solubilité
Point de fusion/point d'ébullition
pH (le cas échéant)
Données relatives à la pression de vapeur (si elles sont disponibles)
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Documents de référence
Il n'existe pas de normes internationales à ce sujet.
2. M É T H O D E
A. INTRODUCTION, OBJET, PORTÉE, INTÉRÊT,
APPLICATION ET LIMITES DE L'ESSAI
L'essai de mutation létale récessive liée au sexe (LRLS) sur l'espèce Drosophila
melanogaster détecte l'apparition de mutations (mutations ponctuelles et petites délétions) dans la
lignée germinale de l'insecte. Il s'agit d'un essai de mutation directe, qui permet de rechercher des
mutations survenant sur environ 800 loci du chromosome X. Ceci représente environ 80 pour cent
de l'ensemble des loci du chromosome X. Le chromosome X représente approximativement un
cinquième du génome total (1).
Les utilisateurs de cette ligne directrice doivent consulter la préface
en particulier les paragraphes 3, 4, 7 et 8.
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Récessive liée au Sexe chez Drosophila melanogaster »
Définitions
Une mutation létale est une altération du génome qui, quand elle s'exprime, entraîne la mort
de l'individu qui la porte.
Une mutation récessive est une altération du génome qui s'exprime à l'état homozygote ou
hémizygote.
Les gènes liés au sexe se trouvent sur les chromosomes sexuels (X ou Y). Dans le contexte
de cette Ligne directrice, les gènes liés au sexe se limitent à ceux qui sont situés sur le
chromosome X.
•
Substances de référence
Exemples de substances pouvant être utilisées comme témoin positif :
– méthanesulfonate d'éthyle
– N-nitrosodiméthylamine
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Principe de la méthode d'essai
Les mutations qui ont lieu sur le chromosome X de Drosophila melanogaster s’expriment
dans le phénotype des mâles qui portent le gène mutant. Quand la mutation est létale à l'état
hémizygote, sa présence est déduite de l'absence d'une des deux classes de descendants mâles qui
sont normalement produites par une femelle hétérozygote.
L'essai de mutation LRLS tire avantage de ces faits grâce à des chromosomes spécialement
marqués et arrangés.
B. MODE OPÉRATOIRE
Des méthodes permettant de réaliser l'essai de mutation LRLS chez la Drosophila sont
décrites dans les références (1) et (2). Des mâles de type sauvage sont traités et accouplés avec des
femelles appropriées. Les femelles obtenues à la première génération sont accouplées individuellement avec leurs frères, et à la génération suivante, on dénombre, dans la progéniture issue de
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chaque croisement séparé, les mâles dont le phénotype correspond au type sauvage. L'absence de
ces mâles indique qu'une mutation létale récessive liée au sexe a eu lieu dans une cellule germinale
du mâle de la génération P1.
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Préparations
Souches
On peut utiliser des mâles d'une souche bien définie de type sauvage et des femelles de la
souche Muller-5. On peut également employer d'autres souches de femelles marquées de façon
appropriée, avec des chromosomes X à inversions multiples.
Substances d’essai
Les substances d'essai doivent être dissoutes dans l'eau. Les substances qui sont insolubles
dans l'eau peuvent être dissoutes ou mises en suspension dans des véhicules appropriés (par
exemple un mélange d'éthanol et de Tween 60 ou 80), puis diluées dans l'eau ou dans une solution
saline avant d'être administrées. On doit éviter d'utiliser comme véhicule le diméthylsulfoxyde.
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Conditions d'essai
Voie d’administration
L’administration peut se faire par voie orale, par injection ou par exposition à des gaz ou à
des vapeurs. L'administration par ingestion peut se faire dans une solution sucrée. Le cas échéant,
les substances peuvent être dissoutes dans une solution de NaC1 à 0,7 pour cent et injectées dans le
thorax ou l'abdomen.
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Niveaux d’exposition
Pour l'évaluation initiale du pouvoir mutagène, on utilise une seule exposition à la
substance d'essai, cette exposition correspondant à la concentration maximale tolérée ou, si
possible, à celle qui produit quelque indice de toxicité. Si l'essai est utilisé comme méthode de
vérification, on doit employer au moins deux niveaux d'exposition supplémentaires.
Témoins
On doit inclure des témoins négatifs (et, le cas échéant des témoins pour le véhicule).
Cependant, si des données appropriées sont disponibles sur des essais témoins réalisés
antérieurement dans le laboratoire, il n'est pas nécessaire d'effectuer des essais témoins en même
temps que les essais réels.
•
Exécution de l'essai
Des mâles de type sauvage (âgés de 3 à 5 jours) sont traités avec la substance d'essai, puis
accouplés individuellement à un excès de femelles vierges de la souche Muller-5 ou d'une autre
souche marquée de façon appropriée (avec des chromosomes X à inversions multiples). Les
femelles sont remplacées par d'autres femelles vierges tous les deux ou trois jours afin de couvrir
le cycle entier des cellules germinales. Dans la progéniture de ces femelles, on dénombre les effets
létaux correspondant aux effets sur le sperme mature, sur les spermatides dans leur phase moyenne
ou finale, sur les spermatides dans leur première phase, sur les spermatocytes et sur les
spermatogonies au moment du traitement.
On accouple individuellement (c'est-à-dire une seule femelle par récipient) les femelles
hétérozygotes F1, obtenues par les croisements décrits ci-dessus, avec leurs frères. Chaque groupe
de la génération F2 est examiné pour l'absence de mâles de type sauvage. S'il se trouve qu'un
groupe provient d'une femelle F1 porteuse d'un gène létal dans le chromosome X parental (c'est-àdire qu'on n'observe pas de mâles porteurs du chromosome traité), on doit tester les filles de cette
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Récessive liée au Sexe chez Drosophila melanogaster »
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femelle, porteuses du même génotype, afin de s'assurer que la létalité se répète à la génération
suivante.
Cet essai doit être conçu avec une sensibilité et une puissance déterminées à l'avance. Le
nombre d'animaux utilisés dans chaque groupe doit refléter ces paramètres définis au préalable. La
fréquence des mutants spontanés observée dans le groupe témoin approprié influera fortement sur
le nombre de chromosomes traités que l'on doit analyser pour détecter des substances donnant des
taux de mutation proches de ceux des témoins.
Les résultats de l'essai doivent être confirmés par une expérience indépendante.
3. R É S U L T A T S E T R A P P O R T
•
Traitement des résultats
Les résultats doivent être présentés sous forme d'un tableau indiquant, pour chacun des
mâles traités, le nombre de chromosomes testés, le nombre de mâles non fertiles et le nombre de
chromosomes létaux pour chaque concentration d'exposition et pour chaque période
d'accouplement. On doit indiquer pour chaque mâle le nombre et la taille des différents groupes de
descendants.
Plusieurs techniques statistiques sont acceptables pour l'évaluation des résultats d'essai de
mutation létale récessive liée au sexe. La formation de groupes de mutants létaux récessifs dans la
descendance d'un même mâle doit être étudiée et évaluée par une méthode statistique appropriée.
•
Évaluation des résultats
Il existe plusieurs critères qui permettent de déterminer si un résultat est positif ; l'un d'entre
eux consiste en une augmentation liée à la dose et statistiquement significative de la fréquence des
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mutations létales récessives liées au sexe. Un autre critère peut consister en une réponse positive
reproductible et statistiquement significative pour l'une au moins des concentrations de la
substance d'essai.
Une substance d'essai est considérée comme non mutagène dans le système étudié si elle
n'entraîne ni une augmentation liée à la dose et statistiquement significative de la fréquence des
mutations létales récessives liées au sexe, ni une réponse positive statistiquement significative et
reproductible pour l'une quelconque des concentrations d'essai.
Dans l'évaluation, il faut prendre en compte à la fois la signification biologique et
statistique.
•
Rapport
Le rapport d'essai doit également contenir les renseignements suivants :
– souche : souche ou lignées de Drosophila utilisées, âge des insectes, nombre de mâles traités,
nombre de mâles stériles, nombre de groupes de reproduction F2 constitués, nombre de groupes
de reproduction F2 sans progéniture, nombre de chromosomes testés, nombre de chromosomes
porteurs d'un gène létal décelés à chacune des phases des cellules germinales ;
– conditions de l'essai : description détaillée du programme de traitement et de prélèvement des
échantillons, niveaux d'exposition, données relatives à la toxicité, témoins négatifs (solvant) et
positifs, le cas échéant ;
– critères utilisés pour compter les mutations létales ;
– relation exposition/effet, si possible ;
– évaluation statistique.
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Interprétation des résultats
Des résultats positifs obtenus lors de l'essai de mutation LRLS chez la Drosophila indiquent
qu'une substance induit des mutations dans la lignée germinale de cet insecte. Des résultats
négatifs indiquent que, dans les conditions de l'essai, la substance étudiée n'induit pas de mutation
dans la lignée germinale de l'insecte.
4. B I B L I O G R A P H I E
1.
F.H. Sobels and E. Vogel, Mutation Res. 41, 95-106 (1976).
2.
F.E. Würgler, H. Sobels and E. Vogel, Handbook of Mutagenicity Test Procedures (edited
by B.J. Kilbey, et al.), pp. 335-373, Elsevier, Amsterdam (1977).