étude qualitative et quantitative par spectrométrie de masse des

 ÉTUDE QUALITATIVE ET QUANTITATIVE PAR SPECTROMÉTRIE DE MASSE DES ACIDES AMINÉS INCORPORÉS LORS DE LA TRANSLECTURE David Cornu1, Sandra Blanchet2, Manuela Argentini3, Jean‐Pierre Rousset2, Olivier Namy2 1 ‐ FRC 3115, ICSN, avenue de la Terrasse, 91190 Gif‐sur‐Yvette 2 ‐ Institut de Génétique et Microbiologie, Université Paris‐Sud 11, 15 Rue Georges Clemenceau, 91405 Orsay 3 ‐ IFR 115, ICSN, avenue de la Terrasse, 91190 Gif‐sur‐Yvette La terminaison de la traduction des protéines est un processus fidèle mais qui est systématiquement en compétition avec l’incorporation d’ARNt «proche cognat » au niveau du codon stop, on parle alors de translecture des codons stop. L'efficacité d'incorporation de chaque ARNt dépend non seulement de la complémentarité codon stop/anticodon mais aussi du contexte nucléotidique entourant le codon stop. De nombreuses maladies génétiques sont provoquées par l’apparition de codons stop prématurés (PTC) qui sont depuis une dizaine d’années devenus une cible thérapeutique. En effet le franchissement de ces codons par translecture peut restaurer la synthèse complète de la protéine mais avec une activité qui peut être fortement influencée par la nature de l’acide aminé incorporé au niveau du PTC. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la translecture, nous avons identifié et quantifié de façon relative par spectrométrie de masse les acides aminés incorporés lors de la translecture chez Saccharomyces cerevisiae. Après protéolyse des protéines purifiées, les analyses LC‐MS/MS ont permis de montrer que pour l’ensemble des contextes nucléotidiques testés, les acides aminés majoritairement insérés sont la glutamine, la tyrosine et la lysine pour les codons stop UAA et UAG, la cystéine, le tryptophane et l’arginine pour le codon UGA. Ainsi la nature du codon stop détermine le choix des acides aminés majoritairement insérés dans le site de translecture. Dans les cas des codons stop UAA et UAG une quantification relative des peptides qui chevauchent les sites de translecture a été effectuée par nanoLC‐MS. Après correction des données de quantification par un facteur de réponse à l’ionisation déterminé à partir de standards, les résultats montrent que l’efficacité relative d’incorporation des acides aminés Q et Y varie selon le codon stop. L’ensemble de ces résultats en accord avec les prédictions du modèle génétique ont permis de valider la pertinence de la levure S. cerevisiae comme modèle de choix pour l’étude de la translecture. L’approche de quantification relative des peptides issus de la translecture sera étendue aux différents contextes afin d’évaluer l’effet de l’environnement nucléotidique sur l’efficacité d’incorporation des acides aminés déjà identifiés. À long terme nous espérons que cette étude contribuera à améliorer les traitements thérapeutiques de maladies liées à l’apparition de codons stop prématurés.