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Cours 1 Arabidopsis thaliana
GFMOM 07/03/2012 Partie 2
Ce cours correspond au parties suivantes du cours 1 sur Arabidopsis Thaliana:
II- Le séquençage du génome d'Arabidopsis thaliana
3- Les propriétés du génome d’A. thaliana
III- Génétique classique d’Arabidopsis thaliana
1- Mutagenèse
2- Utilisation de la génétique pour comprendre le développement et la
physiologie de la plante
Modèle ABC et construction de la fleur
Triple réponse et perception de l’éthylène
3- De la mutation au gène muté: une longue marche
IV- Les stratégies d’étude de la fonction d’un gène
1- Génération des plantes transgéniques
La transgénèse par Agrobacterium tumefaciens
Les possibilités offertes par l’insertion d’ADN-T
II- Le séquençage du génome d'Arabidopsis thaliana
3- Les propriétés du génome d’A. thaliana
Grâce au séquençage de Arabidopsis on a pu déterminer la taille totale de son génome. Il
est d'environ 125 MB réparti en 5 chromosome. Cela correspond aux gènes nucléaires et ça
comprend donc les organisateurs nucléolaires et les centromères entre autres
Les gènes de A.Thaliana sont des gènes de petites tailles qui contiennent presque tous des introns.
Des introns sont présents dans près de 80% des gènes.
Le chromosome mitochondrial et chloroplastique ont également été séquencé. Ils contiennent
environ 200 gènes au total.
En résumé:
Génome nucléaire A. Thaliana:
125MB
5 chromosomes
80% des gènes ont des introns.
Génome mitochondrial et chloroplastique:
200 gènes au total
Pour être utile, la séquence du génome doit être annoté. Pour cela, on a besoin de repérer
la position des gènes dans le génome. On réalise cela grâce à des méthodes de bioinformatique en
repérant notamment: les codons start et stop, les sites d'épissage et les régions promotrices
( tatabox etc.. )
Une fois cette annotation réalisée on a divisé les gènes selon leur catégories fonctionnelles.
On a pu effectuer ce tri car la fonction de certains gènes était connu et certains gènes étaient
homologues de gènes identifié chez d'autres espèces.
Chez Arabidopsis 22% des protéines sont impliquées dans le métabolisme. C'est un pourcentage
important par rapport a l'homme. C'est caractéristique des plantes, autotrophes, car il est
nécessaire de posséder toute une machinerie spécifique pour réaliser la photosynthèse par
exemple et le métabolisme est donc très développé.
Fort pourcentage de gènes impliqué dans la régulation de la transcription et la transduction des
signaux. Cela est courant chez les êtres multicellulaires.
Une bonne partie des gènes de A.Thalina sont homologues de gène animal. 50% des gènes
responsable de pathologie chez l'homme se retrouvent chez arabidopsis. Dès gènes responsable
du cancer notamment, BRCA ( cancer du sein ) possèdent des homologues chez la plante. Ces
gènes sont impliqués dans des processus différents mais ont des similitudes moléculaires. C'est
donc un modèle pour l'étude de tout les organismes, y compris l'homme.
III- Génétique classique d’Arabidopsis thaliana
1- Mutagenèse
Dans une approche de génétique traditionnelle, on caractérise un phénotype particulier et
on recherche le gène responsable de ce phénotype.
Pour faire ça, on commence par générer des mutants.
Comme pour d'autres organismes des mutations chimiques sont possibles. ( mutations à l'aide de
EMS: Ethane méthyl sulfonate)
L'EMS s'insère dans l'ADN et lors de la duplication induit des erreurs: AT-> GC
Dès lors il y a des mutations gains de fonctions ou pertes de fonctions qui ont lieu..
On peut également réaliser des mutagénèses par irradiation. De nos jours elles sont très peu
utilisées, car elles présentent certains risques lors de la manipulation. Toutefois, on peut utiliser:
– Des rayons gamma qui créent des délétions, au niveau de l'ADN, de petite tailles
– Neutrons rapides qui créent des délétions de petites tailles ( décallage de cadre de
lecture etc.. )
Comment en pratique réaliser une mutagénèse chimique d'Arabidopsis ?
Graines M1: chimeriques, certaines cellules portent une mutation d’autres non
Graines M2 = graines descendant des graines M1 par autofecondation
Pour faire cette mutagénèse on met la plante en contact avec l'agent mutagène au niveau
de la graine. La graine renferme l'embryon donnant la plante,la plantule et des réserves pour la
croissance.
On met les graines à incuber avec de l'EMS pendant quelques minutes et on rince ensuite.
Si les mutations ont lieu dans les cellules du méristème, ( cellules souches chez la plante ) la plante
en grandissant deviendra une plante chimère. En effet la cellule mutagénéisé donnera de
nombreuses cellules porteuses de la mutations. Donc ces plantes ont des parties au génotype
parental et d'autres au génotype mutée. On a ensuite autofécondation chez cette plante et on
obtiendra alors plusieurs types de graines. Des graines au génotype parental et des graines avec un
allèle portant la mutation. Les graines sont diploides, dès lors les mutations peuvent être à l'état
homozygote ou hétérozygote au sein de celle ci.
Pour sélectionner les mutants on sème les graines dans un milieu in vitro et on sélectionne
celle qui ont un phénotype différent par rapport aux plantes sauvages.
2- Utilisation de la génétique pour comprendre le développement et la physiologie
de la plante
Mutations dans le développement de la fleur:
La fleur normale est organisée en 4 cercles concentriques (également appelé verticilles)
chacun de ces cercles symbolisant un organe différent.
Le cercle le plus extérieur correspond aux sépales.
On trouve ensuite les pétales
puis les étamines ( qui porte le pollen )
et enfin le plus au centre les carpelles (qui porte les ovules. )
Il existe des mutants qui présentent des mutations dans le développement de la fleur. On
peut remarquer chez ceux ci que certains de leurs cercles sont absents.
On va alors essayer de reconstituer ce qui se passe chez ces mutants.
On isole des mutants présentant:
– soit des sépales carpelles uniquement
– soit des pétales uniquement
– soit des étamines seulement
On va alors essayer de reconstituer ce qui se passe pour obtenir un tel développement de la fleur.
Cette étude est une étude que l'on réalise également en TD.
On verra que ce développement suit le Modèle ABC: Chaque mutant de développement de
la fleur est affecté alors dans un de ces groupes de gène A B ou C.
L'agencement de ces groupes de gènes donne la formation de ces différents organes.
Les combinaisons de ces groupes de gène donne les phénotypes suivants:
Expression de A seul entraine la mise en place de sépale
Expression de AB seul entraine la mise en place de pétales
Expression de BC seul entraine la mise en place de étamines
Expression de C seul entraine la mise en place de carpelles
Chez nos mutants alors, si par exemple si on a un mutant dans la fonction B (B non
fonctionnel ) seul les gènes A et C seront fonctionnels et on aura formation de sépale et de
carpelle.
NB: Les gènes impliqués dans ces mises en place particulière sont des facteurs de transcriptions
codés par des gènes homéotiques.
Autre exemple de mutants:
Mutants de biosynthèse ou de réponse a certaines hormones.
Cas de l'éthylène.
Lorsque une plante germe a l'obscurité la tige s'allonge énormément par rapport a des plantes qui
poussent a la lumière.
Avec de l'éthylène on a une absence de croissance longue et la tige est en forme de crosse petite.
Cette caractéristique est utilisé pour effectuer des cribles de sensibilité a l'éthylène.
On fait alors pousser les plantes a l'obscurité sans éthylène et on
va voir que certaines plantes répondent de façon constitutive a
l'éthylène c'est a dire que la plante pousse comme si il y avait de
l'éthylène dans le milieu alors qu'il n'y en a pas. On va isoler
ces plantes pour rechercher alors le gène responsable de ce phénotype.
Un autre crible possible consiste a faire pousser les plantes a l'obscurité
avec de l'éthylène. Certaines plantes pousseront alors comme a
la lumière.
Elles sont donc affectées pour la réponse a l'éthylène.
De la même façon de nombreux cribles existent pour voir les mutations sur de nombreuses
fonctions de la plante:
– Mutants affectant le métabolisme de base
– Mutants affectant le processus de photosynthèse
– Mutants de perception à la lumière
– Mutants affectant des processus de développement
– Mutants de réponse aux hormones
– Mutants de perception de stress abiotiques et biotiques
NB: Les différents type de stress
Biotique = biologique: Stress liés aux autres organismes comme les champignons bactéries ou
virus.
Abiotique: Non lié a la présence d'organisme, lié aux changement de l'environnement. ( Froid, etc..)
3- De la mutation au gène muté: une longue marche
Méthode de la marche chromosomique.
Comme chez les autres espèces, on veut relier la carte génétique à la carte physique.
Carte physique: Carte nucléotidique en nombre de paire de base.
Carte génétique: Nombre de recombinaison entre plusieurs loci ( en cM )
On va utilisé les marqueurs génétiques, marqueurs moléculaires.
Un marqueur est une séquence codante ou non codante polymorphe ( qui possède au moins 2
allèles différentes ) Ils doivent être identifiable facilement dans le génome.
Le polymorphisme est détectable soit car il est lié a un nombre différent de répétitions selon
l'allèle ( type AFLP Amplification fragment length polymorphism) soit car il est lié à la présence ou
non d'un site de restriction ( RFLP )
Dans le cas d'un AFLP on caractérise le polymorphisme grâce au taille des fragments des
migrations des produits de PCR.
On croise la plante homozygote mutante a la plante sauvage.
Génération 1: on obtient des hétérozygotes.
2e génétation Mélange de tout les types de plantes.
Un nombre certain de crossing over commence à apparaître à ce moment.
On va essayer par cette étude de repérer les marqueurs les plus proche de notre locus de mutation
(m) afin de le positionner:
Pour cela, on génotype chacun des marqueurs présents dans la descendance.
Si les marqueurs sont liés au locus maladie dans la descendance ( une allèle du marqueur ségrège
de façon identique à m ) alors les marqueurs sont proches du locus d'interet.
On va essayer de trouver les marqueurs les plus proches possibles de nos marqueurs. C'est à dire
ceux aux plus faibles pourcentages de recombinaison entre les 2 loci. ( C'est l'établissement de la
carte génétique )
On va ensuite voir quels marqueurs, les plus proches, entourent le locus maladies. On reporte la
position de ces marqueurs sur la carte physique et on obtient la zone dans laquelle se trouve notre
mutation.
Mais chez AT on connait le génome complet. Une fois la région identifiée, on connait les gènes
présents dans la régions. Dès lors on séquence les gènes et on observe si ces gènes sont porteurs
de la mutations. ( Si un seul gène muté, alors le gène muté est responsable du phénotype observé)
Il faut ensuite vérifier que la mutation est bien a l'origine du phénotype en générant des plantes
transgéniques. Si la mutations est récessive, on réalise des plantes mutantes hétérozygote et
restaurer le phénotype sauvage. Si dominantes, on incorpore l'allèle mutant chez le sauvage et on
vérifie que l'on obtient le phénotype mutant.
On vérifie que le gène isolé est bien responsable du phénotype observé par sauvetage
phénotypique ( = Test de complémentation fonctionnel ).
On isolé de cette façon les gènes ABC et on a déterminé qu'ils codent pour des facteurs de
transcription à homéobox.
Un des problèmes de cette génétique classique est que très peu de mutants au phénotype visible
vont être détectés.
De nombreuses mutations ne seront pas détectées par les cribles car:
– Il y a de nombreuses mutations qui sont létales et qui ne sont pas observable par cette
technique.
– Lorsqu'un grand nombre de gènes sont mutés, il n'y a pas qu'un phénotype différent et on
ne peut pas conclure.
– On a pas toujours les bonnes conditions de crible pour voir le phénotype différent.
– Lorsque l'on mute un gène, celle ci donnera une protéine non fonctionnelle mais si une
autre protéine à un rôle identique à celle ci, elle prendra le relais et on ne verra pas la
mutation.
La mutagénèse classique à donc des résultats limitant car une faible part des mutants des 25 000
gènes de Arabidopsis à été identifié.
On va donc également utilisée une autre méthode, la génétique inverse qui va nécessiter de
réaliser des plantes transgéniques.
IV- Les stratégies d’étude de la fonction d’un gène
1- Génération des plantes transgéniques
En génétique inverse on va chercher à muter un gène d'intérêt et observer si il se produit
des changements de phénotypes. Pour réaliser ces mutations on va faire des transgénèses.
Le cours du semestre 1 de biologie végétale explique également ce mécanisme.
Une maladie est observée chez les plantes, c'est la galle du collet.
Chez certaines plantes on a observé des tumeurs au niveau de la base
de la tige constituées de cellules végétales non différenciées. Cette
observation était surprenante car, au niveau de ces tissus, on savait
qu'il n'y avait aucune cellule souche. Si cette tumeur se forme ce n'est
possible que par dé-différenciation d'une cellule végétale initiale.
Après de nombreuses recherches, il a été montré que les tumeurs
étaient induites par une bactérie, agro bacterium tumefaciens.
Il a été montré que lorsqu'une plante est blessée elle sécrète un certain
nombre de composés( des sucres etc..), qui vont attirer cette bactérie qu'on trouve couramment
dans les sols. Une fois qu'on a la blessure la bactérie arrive par chimiotactisme. Elle arrive au
contact de la cellule végétale.
Cette bactérie possède au niveau de son génome de l'ADN génomique mais également un
ADN plasmidique, le plasmide Ti pour tumor induceur car ce plasmide Ti contient un grand nombre
de gènes responsables de l'attaque de la bactérie sur la plante. Ces gènes sont des gènes de
virulence.
La bactérie reconnaît lorsqu'il y a blessure chez une plante. Cette blessure facilite le contact
de la bactérie avec la cellule végétale, et quand on a ce contact l'expression des gènes de virulence
de Ti est induite et on a formation de protéines de virulence qui sont responsables de
l'attachement de la bactérie à la cellule végétale. Cela se produit grâce à des protéines qui vont
former des pores entre les 2 cellules.
Les protéines de virulences vont être responsable de la duplication d'une partie de ce
plasmide Ti qu'on appelle ADN T pour ADN de transfert. La bactérie transfert cet ADN T dans la
cellule végétale au moyens des pores formés par les protéines VIR. Une fois dans la cellule végétale
l'ADN T va aller vers le noyau grâce à la formation de pores nucléaires qui sont formés par d'autres
protéines du VIR. Une fois dans le noyau la bactérie insère cet ADN T parfaitement au hasard dans
le génome de la plante. L'insertion se fait parce que la plante ne reconnais pas l'ADN T comme
étant étranger. Elle le réplique et permet l'expression des gènes portés par cet ADN.
Les gènes de l'ADN T codent pour des synthases, des phyto-hormones ou des opines
synthases. Les opines sont des sortes d'hormones pour la bactérie. La multiplication de la bactérie
est induite par cette hormone. La synthèse des phyto-hormones va de son coté, permettre une dédifférenciation des cellules végétales et leur multiplication. Du point de vue de la bactérie il y a
donc un triple avantage à l'insertion de cet ADN T:
– l'ADN T s'insérant dans l'ADN génomique végétal il ne va pas être dégradé;
– On a synthèse de phyto-hormones qui vont permettre la multiplication de cellules
végétales
– On a également la synthèse d'opines qui va permettre la multiplication de cellules
bactériennes donc du coup ces nouvelles cellules végétales vont pouvoir être infectées par
les nouvelles bactéries.
Grâce à ce mécanisme la bactérie amplifie grandement l'infection. Elle l'amplifie à tel point
que ça provoque au final la cassure de la tige et donc la mort de la plante. Il était important de
comprendre les mécanismes de la maladie pour essayer d'y remédier dans les champs.
En ayant compris les mécanismes du fonctionnement de la bactérie, on a découvert un organisme
qui transfert de l'ADN de la bactérie vers la cellule végétale. On va donc modifier l'ADN au niveau
de la bactérie et utiliser cette bactérie modifiée pour générer des plantes transgéniques.
Comment générer les plantes transgéniques?
On a générer des Agrobactéries modifiées. On enlève le plasmide Ti. Les bactéries sans plasmide Ti
sont capables in vitro de se développer normalement. Le plasmide Ti est scindé en 2 parties:
– un plasmide qui va contenir uniquement les gènes de virulence. (On réintroduit ce
plasmide dans la bactérie. On fait cela pour pas que ces éléments interfèrent avec l'ADN
que l'on veut introduite)
– - Un deuxième plasmide qui va contenir la partie d'ADN T; c'est la partie qu'on va pouvoir
modifier pour faire les plantes transgéniques. Sur cet ADN T on enlève les gènes codant
pour les la synthèse d'opines ou les gènes codant pour la synthèse de phyto-hormones.
On a 2 bordures sur l'ADN T la bordure gauche et la bordure droite. On va d'abord rajouter
un gène de sélection sous contrôle d'un promoteur fort et constitutif (chez les plantes en général
on utilise le promoteur 35S, promoteur isolé à partir d'un virus et qui confère une expression forte
et constitutive c'est à dire qu'il va permettre l'expression du gène dans tous les tissus). On met
également un terminateur à notre gène de sélection. Un gène de sélection chez une plante c'est
un gène de résistance à un antibiotique. Le plus utilisé est la résistance à la kanamycine. Mais on
peut aussi utiliser des gènes de résistance à des herbicides et le plus utilisé est le gène de
résistance à l'herbicide Basta. Dans la deuxième partie de l'ADN T on va pouvoir mettre ce que l'on
veut intégrer à la plante pour changer son génome et voir les conséquences de ce changement.
Chez Arabidobsis la transformation se fait de manière très simple, puisqu'une fois qu'on a
généré notre agrobactérie modifiée (donc avec l'ADN T modifié) on la met en culture. Puis on
mélange nos bactéries avec un détergent et on trempe nos plants d'Arabidobsis en fleur dans cette
solution, pendant quelques minutes. Le détergent présent va déstabiliser les membranes
plasmiques donc va recréer la blessure au niveau de la cellule végétale ce qui va faciliter l'infection
par l'agrobactérie et on va avoir transformation de la cellule végétale. On fait la transformation au
niveau des fleurs, on va majoritairement transformer des gamètes ou des embryons résultant de la
fécondation. On récolte les graines issues des fleurs. Certaines graines n'auront pas été
transformées, d'autre auront été transformées. Pour sélectionner les graines transformées on va
les semer sur agent sélectif; par exemple sur antibiotique ou sur herbicide. Les plantes
transgéniques seront les seules à pousser et seront ainsi sélectionnées.