Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). Ministère de l’Enseignement Supérieur République du Mali et de la Recherche Scientifique Un Peuple – Un But – Une Foi …………………… Année universitaire 2008-2009 THÈSE LES SOUS POPULATIONS LYMPHOCYTAIRES ET LES CELLULES NK ( NATURAL KILLER ) CHEZ LES PATIENTS INFECTES PAR LE VIH A BAMAKO ( MALI ). Présentée et soutenue publiquement le… /…../ 2009 devant la Faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odonto-stomatologie Par Mr. Drissa KONE Pour obtenir le grade de Docteur en Pharmacie (Diplôme d’Etat) JURY Président : Pr. Flabou Membre: Dr. Mahamadou DIAKITE Co-directeur : Dr. Yeya dit Sadio SARRO Directeur de thèse : Pr. Thèse de pharmacie, Anatole BOUGOUDOGO TOUNKARA Drissa KONE. 1 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). DEDICACES Après avoir rendu grâce à Allah le tout puissant ; Je dédie ce travail : A mon père Feu Tiébakuy Koné qui reste malgré son absence pour ses enfants un modèle de réussite. Tu as guidé et continue à guider nos pas, ce travail est l’aboutissement de tes sacrifices et tes espérances, Repose en paix. A ma chère Maman, Sounlo Dakouo qui n’a jamais laissé une seule nuit sans prier que la grâce de Dieu soit sur tous les hommes. Tu es un symbole de tolérance. Chère Maman je ne pourrais guère exprimer à hauteur de souhait tout l’amour toute la reconnaissance et toute l'admiration que j’éprouve pour toi. Tu as toujours été là rendant les moments difficiles supportables. Tu as su poursuivre les efforts de notre père. Que l’Eternel t’accorde longue vie. Je t’aime Maman. A mes Tantes Aïssata Diallo et Biowé Sanou Que Dieu vous bénisse pour tout. A toutes mes sœurs en général et particulièrement à: - Oumou Koné - Salimata Koné -Aminata Koné - Djeneba Koné - Fatoumata Koné - Docteur Assétou Koné, dont le soutien et l’affection ne m’ont fait défaut une seule seconde. De tout cœur je te souhaite les merveilles du monde. - Micheline Badina Koné dont les conseils ont toujours été des meilleurs. Merci !!! A tous mes frères et en particulier à : -Amadou Koné qui m’a accompagné pour la première fois à la FMPOS. C’était précisément le 8 Novembre 2001. J’en ai encore la souvenance comme si c’était hier. -Dramane Koné qui été pour moi un confident et un conseiller prodigieux. -A Nitié Koné : que je ne cesserai de remercier pour tout ce qu’il a fait et continue de faire pour moi. - Moussa Koné que je remercie pour toute son attention à mon égard. A vous tous je souhaite un grand destin. A tous mes beaux frères parmi lesquels le Docteur Abdoulaye Dembélé que je remercie vivement pour tout ce qu’il a su et pu faire pour moi. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 2 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). A mes neveux Calvin, Charles, Leonard A mes nièces Nousso, Mallé Vos sentiments humains ne m’ont pas manqué. A tous les amis Antoine, Michel, Sissoko, Moussa. Et particulièrement à Boubacar Diamouténé avec qui j’ai partagé les moments les plus difficiles. Que Dieu t’accorde une bonne chance. A tous les voisins Oumou, Sian, Mahamed, Daffé, Binké, Aboubacar, Oumar, Hama, Hasseye. A vous tous mes vœux de bonheur parfait. A tous les Internes des CHU et spécialement ceux du Point G, tous motivés pour le même combat, avoir un avenir meilleur. A tous les autres copains et copines de peur de n’avoir pas cité certains. A tous ceux qui de près ou de loin ont contribué à la réalisation de ce travail. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 3 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). REMERCIEMENTS Difficile sinon non permis de dire tout en tous lieux. Je veux parler d’un homme à qui mes remerciements sont les plus pressants. Pédagogue avisé, le Professeur TOUNKARA est l’archétype d’un grand chercheur et un serviteur émérité du pays. En dehors des relations entre Professeur et étudiant, cet homme aux qualités énormes a précisément su être pour moi un père et un ami. M. TOUNKARA dont nous voudrions devenir le double a su mettre partout où confusions étaient la lumière. Homme de conviction le parcours de ce monsieur nous laisse voir que << seule le travail libère l’homme>>. Cher Professeur que Dieu vous accorde longue vie. A Docteur THIERO Bassira DIARRA, Gérante de la pharmacie MAMITA Merci de n’avoir compris comme personne et de me donner tout le loisir pour ce travail. Merci pour votre soutien effréné à mon endroit. Merci pour toute la bonté de votre cœur. Que l’éternel vous comble de bonheur. En plus je remercie : - Tout le Staff de SEREFO. Que le <<tout puissant>> vous accompagne dans vos nombreuses recherches - Tout le personnel de la Pharmacie MAMITA : Dah, Alima, Soungalo, Afa, Mariam Que le<< tout puissant>> vous bénisse et bénisse la Pharmacie. - Tout le personnel du Laboratoire de biologie médicale et d’hygiène du CHU du point G. Que la gloire règne dans le laboratoire. - Toute la Faculté de Médecine de Pharmacie et d’Odonto-stomatologie. - Toutes les personnes vivant avec le VIH. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 4 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). A notre maître et président du jury Professeur Flabou Bougoudogo Maître de conférences agrégé en Bactériologie-Virologie à la FMPOS Responsable de l’enseignement de la Bactériologie-Virologie à la FMPOS Directeur de l’Institut National de Recherche en Santé Publique (INRSP) Chevalier du mérite de l’ordre national de la santé Cher maître, c’est un grand honneur que vous nous faites en acceptant de présider ce jury malgré vos occupations multiples. Votre rigueur scientifique, votre disponibilité et votre sollicitude nous ont toujours fasciné et font de vous un homme respecté et admiré par vos étudiants que nous sommes. Recevez ici, cher maître notre sincère remerciement et notre plus grand respect. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 5 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). A notre maître et membre du jury Docteur Mahamadou Diakité Maître-assistant en Immunologie – Génétique à la FMPOS Chargé de cours d’Immunologie à la FMPOS Responsable du Laboratoire d’Immunologie-Génétique du MRTC Cher maître nous n’avons pas été surpris que vous ayez accepté de faire partie de ce jury, vu votre disponibilité permanente pour la formation des étudiants. Votre rigueur dans le travail et votre qualité d’homme de science vont contribuer à l’amélioration de ce travail. Cher maître je vous prie de bien vouloir trouver ici l’expression de tout notre respect. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 6 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). A notre maître et co-directeur Docteur Yeya dit Sadio Sarro Master en Santé Publique Assistant chercheur au Centre de Recherche et de Formation sur le VIH et la Tuberculose (SEREFO) Cher maître, nous avons toujours été émerveillés par la clarté de vos enseignements dans lesquels nous retrouvions d’ailleurs toute la rigueur d’un homme de science. Cher maître c’est aujourd’hui l’occasion pour nous de vous exprimer nos remerciements les plus sincères. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 7 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). A notre maître et Directeur de thèse Professeur Anatole Tounkara Professeur titulaire d’Immunologie à la FMPOS Responsable de l’Enseignement de l’immunologie à la FMPOS Doyen de la FMPOS Directeur du Centre de Recherche et de Formation sur le VIH et la Tuberculose (SEREFO) Cher maître, nous vous remercions d’avoir initié et suivi ce travail. Vous nous avez fait un grand honneur en nous acceptant. C’est aujourd’hui une fierté pour nous d’avoir séjourné à vos côtés et de profiter votre immense expérience ; Votre rigueur dans le travail et votre souci de bien former sont constants. Cher maître, acceptez nos humbles remerciements pour la qualité de l’encadrement et les conseils prodigués tout au long de ce travail. Cher maître, croyez à notre disponibilité constante à vous servir. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 8 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ADCC : Cytotoxicité Cellulaire Dépendant d’Anticorps Ag HBs : Antigènes du core du Virus de l’hépatite B Ac HCV : Anticorps dirigés contre le Virus de l’hépatite C ADN : Acide Désoxyribonucléique ARN : Acide Ribonucléique CNTS : Centre National de transfusion sanguine CRF : Circulating Recombinant Form CSRef : Centre de santé de référence CTL : Lymphocyte T cytotoxique CDC: Center for Disease Control and prevention of Atlanta EDSIII : Enquête démographique et de Santé III e édition EDSIV : Enquête démographique et de Santé IVe édition EDTA: Ethylène Diamine Tétra-acetate ELISA : Enzym Linked Immunosorbent Assay Gag : Groupe des Antigènes Gp 160 : Glycoprotéine d’enveloppe de 160 kilodaltons Gp 120 : Glycoprotéine d’enveloppe de 120 kilodaltons Gp 41 : Glycoprotéine d’enveloppe de 41 kilodaltons IL-2 : Interleukine-2 IL-6 : Interleukine-6 IL-10 : Interleukine-10 INF-α : Interféron-α INF-γ : Interféron-γ IgG : Immunoglobuline G Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 9 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). IgG1 : Immunoglobulines G1 IgG3 : Immunoglobuline G3 IgM : Immunoglobuline M IgD : Immunoglobuline D NK : Natural Killer ONUSIDA : Organisation des Nations Unies pour la Lutte contre le VIH/SIDA OMS : Organisation Mondiale de la Santé P 68 : Protéine de 68 kilodaltons codée par le gène polymérase P 66 : Protéine de 66 kilodaltons codée par le gène polymérase P 55 : Protéine de 55 Kilodaltons codée par le gène Groupe des Antigènes POL : polymérase TGF-β : Transforming Growth Factor β TNF-α: Tumor Necrosis Factor α TNF-β: Tumor Necrosis Factor-β SIV : Virus de l’Immunodéficience Simienne % : Pourcentage # : Valeur absolue Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 10 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). SOMMAIRE INTRODUCTION .........................................................................................................1 OBJECTIFS.................................................................................................................3 GENERALITES............................................................................................................4 MATERIELS ET METHODES....................................................................................26 RESULTATS .............................................................................................................42 DISCUSSION.............................................................................................................50 CONCLUSION...........................................................................................................54 RECOMMANDATIONS..............................................................................................55 BIBLIOGRAPHIE.......................................................................................................56 ANNEXES..................................................................................................................64 Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 11 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). INTRODUCTION Le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) dont il existe deux sous types (VIH-1 et VIH-2) infecte et détruit les lymphocytes T auxiliaires (T4) [1]. Ce qui entraîne une lymphopénie et un déficit de l’immunité à médiation cellulaire, favorisant ainsi le développement de nombreuses infections opportunistes [2]. Une période asymptomatique de 8 ans et parfois plus, peut séparer la contamination et les manifestations cliniques appelées SIDA. Le syndrome de l’immunodéficience acquise, plus connu sous le nom de SIDA n’est plus considéré comme un problème de santé isolé. Il est considéré aujourd’hui, par les Nations Unies, comme un handicap majeur développement humain. D’après l’ONUSIDA, bien que la pandémie et son impact aient dépassé les prédictions les plus pessimistes, le nombre de personnes vivant avec le VIH n’a cessé d’augmenter. Selon le rapport de l’ONUSIDA, publié en novembre 2006, 39,5millions de personnes vivaient avec le VIH dans le monde. Parmi elles, 4,3 millions ont contracté la maladie durant l’année 2006 (soit 400 000 de plus qu’en 2004) et près de 3 millions en sont mortes. En Afrique subsaharienne, les données indiquent que le taux d’incidence du VIH/SIDA a atteint son point culminant. Cependant, les épidémies y sont diverses et particulièrement sévères en Afrique Australe. Toutefois, la découverte des antirétroviraux fut un des plus grands espoirs dans la lutte contre le VIH et la prévention de nouvelles infections. Leur utilisation a entraîné une chute considérable de la mortalité associée au VIH/SIDA [3] avec près 2,0 millions de décès en 2008, beaucoup moins qu’en 2006. La plupart des traitements de l’infection à VIH ou du SIDA a été jusque là basée sur une approche antivirale [4]. Il n’existe à ce jour aucun vaccin ou traitement définitif. Des échecs thérapeutiques ont été enregistrés chez près d’un tiers de patients traités en Occident. Ils ont été attribués aux phénomènes de résistance virale, à la toxicité et aux effets indésirables liés aux traitements [5]. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 12 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). Par ailleurs de nouvelles thérapies visant à restaurer la réponse immune (immunothérapie passive ou active) ont vu le jour. En effet, lors de l’infection par le VIH, le système immunitaire met en jeu de nombreuses cellules dont les Natural Killer. Ce sont les composants essentiels de l’immunité innée et sont capables de fonctions effectrices directes antivirales et antitumorales [6].L’immunité innée prépare la ligne de défense de l’immunité acquise. Ainsi cette dernière constituée pour l’essentiel de lymphocytes B (production d’anticorps) et des lymphocytes CD8 (lyse des cellules infectées apparaît plus tard) [7]. A cette même période de la primo-infection, le virus se multiplie activement dans l’organisme produisant près de 10 milliards de virions par jour. Il s’ensuit la destruction de 5 milliards de lymphocytes TCD4 [8].C’est au cours de ce contact que différents sous-types de lymphocytes peuvent reconnaître l’antigène de façon spécifique, formant ainsi la mémoire immunitaire. Ainsi, toutes ces sous-populations lymphocytaires jouent des rôles clés dans le fonctionnement du système immunitaire. La connaissance du profil phénotypique lymphocytaire des patients infectés par le VIH peut permettre aux cliniciens une meilleure classification des malades et un meilleur suivi thérapeutique. Cependant, au Mali, il existe peu de données sur les taux des cellules TCD4+ et pas du tout de données sur les cellules Natural Killer, les lymphocytes B et les sous populations mémoires. Nous ne savons donc pas quel est le profil des cellules T mémoires, des Natural Killer et des lymphocytes B chez les patients infectés par le VIH au Mali. C’est pourquoi nous avons entrepris de dénombrer les sous populations lymphocytaires et les cellules Natural Killer chez les patients infectés par le VIH. Le but de cette étude est d’estimer le profil phénotypique des sous-populations lymphocytaires, chez les patients infectés par le VIH à Bamako au Mali. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 13 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). OBJECTIFS A- OBJECTIF GENERAL Etudier la fréquence des sous-populations lymphocytaires et des Natural Killer chez les patients infectés par le VIH. B- OBJECTIFS SPECIFIQUES 1-Recenser au moins 15 patients infectés par le VIH non encore soumis aux ARV et 15 personnes non infectées et en apparente bonne santé. 2- Dénombrer les différentes sous-populations lymphocytaires et les cellules Natural Killer chez les patients infectés par le VIH et chez les personnes non infectées et en apparente bonne santé. 3- Comparer la fréquence des sous-populations lymphocytaires et les cellules Natural Killer chez les patients infectés par le VIH et personnes non infectées par ce virus. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 14 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). I- GENERALITES A- LE VIRUS DE L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE 1- Rappel sur l’épidémiologie du VIH/SIDA [9] 1-1 Situation de l’infection VIH/SIDA dans le monde L’infection VIH a commencé à diffuser à la fin des années soixante dix d’une part dans la population masculine homosexuelle et bisexuelle de certaines zones urbaines d’Amérique, d’Australie et d’Europe occidentale, et d’autre part chez les hommes et les femmes à partenaires sexuels multiples des Caraïbes et d’Afrique centrale et orientale. La propagation s’est ensuite faite parmi les usagers de drogues par voie intraveineuse, puis par leurs partenaires sexuels. Dans certains pays d’Europe orientale et d’Asie centrale, la diffusion du virus n’a commencé qu’au début des années quatre vingt-dix. En fin quatre vingt-dix, le VIH était présent partout dans le monde, à des degrés divers. Ainsi, on a estimé à 33 millions [30 millions – 36 millions] le nombre de personnes vivant avec le VIH dans le monde (Rapport ONUSIDA, 2008), soit 16% de moins que l’estimation de 39,5 millions [34,7 millions – 47,7 millions] publiée en 2006 (ONUSIDA/OMS, 2006). Le nombre de nouveaux cas a été estimé à 2,7 millions [2,6 millions – 3,2 millions]. (Rapport ONUSIDA, 2008) En 2008 le nombre de décès était de 2,0 millions [1,8 million – 2,3 millions]. (Rapport ONUSIDA, 2008). Malgré les progrès accomplis pour améliorer l’accès aux traitements antirétroviraux, le sida continue sa meurtrière progression partout dans le monde. 1-2 Situation de l’épidémiologie du VIH/SIDA par région Le sida constitue de nos jours, une des causes de mortalité les plus importantes en Afrique subsaharienne (OMS, 2003). Selon le rapport ONUSIDA, 2008, sur un total mondial de 2,0 millions [1,8 million – 2,3 millions] de décès (adultes et enfants) 1,5 million [1,0 million – 2,0 millions] sont survenus en Afrique subsaharienne. Les épidémies de la région varient néanmoins de façon marquée. La prévalence chez les adultes (15 – 49 ans) va de 2% dans certains pays du Sahel à plus de 15% dans la plus grande part de l’Afrique australe. On estime à 11,4 millions [10,5 millions 14,6 Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 15 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). millions] le nombre d’enfants (0 – 17 ans) rendus orphelins par le sida dans cette région (Afrique subsaharienne) en 2007. Le Sud asiatique représente la seconde région la plus touchée, avec 450 000 nouveaux cas en 2001. Cependant, le nombre estimé de nouvelles infections a chuté en Asie du sud et du sud-est, avec 340 000 cas en 2007. Le nombre de nouvelles infections à VIH est resté à peu près stable pour 2007 dans les Caraïbes, en Amérique latine, au Moyen-orient et en Afrique du nord, en Amérique du nord et en Europe occidentale. En Europe Orientale, le nombre total de personnes vivant a atteint 1,5 million [1,1 million- 1,9 million] (Rapport ONUSIDA, 2008). De même, la prévalence du VIH continue d’augmenter dans certains pays, comme l’Indonésie, le Viêt-Nam, l’Asie de l’est et en Océanie 1-3 Situation de l’infection VIH/SIDA au Mali Depuis la découverte du premier cas de sida au Mali en 1981 [10] plusieurs études menées dans le pays ont fourni quelques données sur l’évolution de l’épidémie du VIH. Ainsi en 1999 au Mali, on estimait à 130.000 le nombre de personnes vivant avec le VIH dont 5069 cas de sida (53% des hommes) (source : EDS-III) En 2006, la population adulte séropositive était environ 66392 personnes dont 57% des femmes de 15 – 49 ans et 43% des hommes de 15 – 59 ans. Actuellement la séroprévalence nationale est estimée à 1,3% (source : EDSM-IV). Cette proportion est attribuée au VIH-1 ou au VIH-1+VIH-2 (probablement avec seulement 0,2%de VIH-2) (source : EDSM IV). 2- Historique L'épidémie de sida a été découverte le 5 juin 1981 [11, 12] par le Center for Disease Control and prevention d’Atlanta aux Etats-Unis, après l'annonce d'une recrudescence dans les villes de Los Angeles, San Francisco et de New York, de cas de pneumonies à Pneumocystis carinii et de maladie de Kaposi. Ces deux maladies ont pour particularité d'infecter les personnes immunodéprimées. Les premiers malades sont tous homosexuels, ce qui fait que ce syndrome, qui ne portait pas encore le nom de sida, était appelé le syndrome gay ou cancer gay. Mais dans les mois qui suivent, d'autres personnes sont infectées, des toxicomanes par injection, Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 16 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). des hémophiles et des haïtiens. Ce phénomène a permis d’avancer l’hypothèse rétrovirale de cette entité, caractérisée par l’altération de l’immunité cellulaire. Plusieurs virus sont mis en cause. Ainsi en 1983 l’équipe de l’Institut Pasteur dirigée par le Professeur Luc Montagnier isola le virus responsable du SIDA : HIV-1 (virus de l’immunodéficience humaine). Le 18 juillet 1986, un second virus sera découvert par l’équipe de Luc Montagnier chez un patient venant d'Afrique de l’ouest : le VIH-2. 3- Classification : Le Virus de l’immunodéficience humaine (VIH) appartient à la famille des Retroviridae et au genre Lentivirus [13]. Ces virus sont ainsi appelés ainsi en raison de la présence de transcriptase inverse, qui a la propriété de “rétrotranscrire” le matériel génétique viral (ARN) en ADN, appelé proviral. 4- Aspects structuraux Il est d’un aspect globalement sphérique pour un diamètre variant de 90 à 120 nanomètres. Le virus possède une enveloppe, une nucléocapside dense, excentrée, quelque fois en forme de trapèze ou de barreaux constituée des protéines internes du virus, de l’enzyme nécessaire à sa réplication, la transcriptase inverse et l’ARN viral [14]. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 17 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). Figure 1: Schéma structural du Virus de l’Immunodéficience Humaine selon la référence : (http://fr.wikipedia.org/wiki/Virus_de_l'immunod%C3%A9ficience_humaine) [consulté le 03 /11/2008]. 5- Transmission Le VIH est présent dans de nombreux fluides organiques. On en a retrouvé dans la salive, les larmes et l'urine, mais en des concentrations insuffisantes pour que des cas de transmission soient enregistrés. Par contre, des quantités assez importantes de VIH pour une infection ont été détectées dans le sang, le lait maternel, la cyprine, le sperme, ainsi que le liquide précédant l'éjaculation [15]. Par conséquent, les trois principales voies de contamination sont : la voie sanguine la voie sexuelle la voie de transmission materno-fœtale. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 18 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 6- Variants génétiques Le Virus de l’Immunodéficience Humaine est un virus qui a une très importante variabilité génétique. Il présente ainsi une très grande diversité. Deux types ont été découverts : ●VIH-1, le plus présent dans le monde ●VIH-2, qui sévit principalement en Afrique de l'Ouest et comprend le VIH-2A et le VIH-2B. Au sein de chaque type existent plusieurs groupes, qui à leur tour comportent des sous-types. Le VIH-1 est classé depuis 1998 en trois groupes [16], dont chacun correspondrait à des transmissions indépendantes de VIScpz du chimpanzé à l'Homme [17]. groupe M (pour major group) groupe O (pour outlier group) groupe N (pour non-M, non-O group) Le groupe M comprend 9 sous-types ou clades (de A à D, de F à H, J et enfin K). À cela s'ajoutent plusieurs formes recombinantes (en anglais circulating recombinant form ou CRF), qui ont pour origine la multiple infection d'une cellule par des soustypes différents, ce qui entraîne des mélanges dans le génome viral. En Afrique de l’ouest, plusieurs CRFs de VIH circulent ; les CRF02_AG, CRF06_cpx et CRF09_cpx ont été identifiées et caractérisées sur des souches de VIH-1 rencontrées au Mali [18]. 7- Physiopathologie de l’infection à VIH 7-1. Cycle de réplication du VIH [19] Les cellules cibles du VIH sont celles présentant des récepteurs CD4 à leur surface. Ainsi, les lymphocytes TCD4+, les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules microgliales cérébrales peuvent être infectés par le VIH. Les étapes de la réplication du virus sont communes à tous les rétrovirus. Leur connaissance est essentielle à la compréhension de la physiopathologie de cette infection et à la recherche de molécules actives bloquant une ou plusieurs étapes de ce cycle. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 19 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). La première étape correspond à la pénétration du virus dans la cellule. Cette étape nécessite la reconnaissance par l’enveloppe du virus (gp120) de molécules de surface cellulaire appelées récepteurs CD4 et corécepteurs du VIH (Molécules CXCR4 et CCR5) ; La seconde étape comporte : - La synthèse d’ADN proviral résultant de la copie de l’ARN viral grâce à la transcriptase inverse ; lors de cette synthèse des erreurs à l’origine de la variabilité génétique sont commises par cette enzyme peu fidèle. - L’intégration de l’ADN proviral dans le génome de la cellule lymphocytaire ; La troisième étape consiste en la production de nouvelles particules virales de la manière suivante : - transcription de l’ADN viral en ARN, - puis synthèse des protéines virales après activation de la protéase - et formation de nouvelles particules virales libérées dans le secteur extra-cellulaire et prêtes à infecter d’autres cellules. La réplication du virus est intense : environ 1 à 10 milliards de virus sont produits chaque jour par une personne infectée non traitée. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 20 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). Figure 2 : Cycle de réplication du virus de l'immunodéficience humaine selon la référence (http://fr.wikipedia.org/wiki/Virus_de_l'immunod%C3%A9ficience_humaine) [consulté le 03/11/2008]. 6-Conséquence de la réplication du VIH De multiples facteurs semblent jouer un rôle dans l’évolution lente de la maladie induite par le VIH. Parmi ceux-ci, les phénomènes consécutifs aux interactions virushôtes et virus-cellules apparaissent primordiaux et leur complexité reflète celle précédemment décrite pour la régularisation de la réplication virale. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 21 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). En dépit de la réponse immunitaire de l’hôte l’infection par le VIH est persistante. Cette infection chronique de l’hôte est probablement due à l’établissement précoce des réservoirs viraux [20, 21] et à la réplication constante du virus avec pour conséquence l’émergence et ou la sélection de variants viraux qui échappent aux réponses immunes de l’hôte [22, 23]. La réplication constante du virus se traduit par un accroissement régulier de la charge virale tissulaire et circulante, observé au cours de l’évolution de l’infection [24, 25]. Cette charge virale croissante est considérée comme responsable de la disparition progressive des lymphocytes T CD4+ par des mécanismes directs (effets cytopathogènes du VIH) et indirects (perturbation de l’homéostasie et activation chronique des cellules des cellules. En effet, pendant plusieurs années, les lymphocytes TCD4+ progressivement détruits par le virus semblent rapidement se renouvelés jusqu'à ce que les altérations des organes lymphoïdes centraux ne permettent plus leur régénération [26]. Devant l’importance de la charge virale, un état d’activation chronique et généralisée des cellules immunocompétentes, qui d’ailleurs est très à la réplication du virus s’établit. Cette activation chronique est probablement à l’origine des phénomènes d’anergie, d’apoptose ou encore de déséquilibre des sous-populations lymphocytaires sécrétrices de cytokines qui sont observés chez les patients [27]. Ainsi cette activation chronique est induite par la persistance et la réplication du virus dans l’organisme serait impliquée dans l’évolution vers un déficit immunitaire profond. 7-2. L’évolution de la maladie [28] 7-2-1. Infection aiguë On l’appelle aussi “infection primaire à VIH” ou “syndrome de séroconversion”. Dans 40 à 90% des cas, elle s’accompagne de symptômes cliniques. La durée d’incubation entre l’exposition et l’apparition de ces symptômes varie en général de 2 à 4 semaines. Certaines personnes présentent une fièvre avec éruption cutanée, arthralgies et adénopathies multiples lors de la séroconversion. Il arrive qu’un syndrome neurologique aigu se produise mais il évolue le plus souvent spontanément vers la guérison. La méningite aseptique, la neuropathie périphérique, l’encéphalite et la myélite font partie de ce syndrome. Des troubles graves accompagnant la séroconversion laissent présager une évolution à long terme plus défavorable. La Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 22 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). plupart des sujets qui ont des symptômes vont consulter, mais le diagnostic, pour de multiples raisons, n’est pas posé le plus souvent. Premièrement, il arrive que le praticien n’envisage pas une infection par le VIH. Deuxièmement, il peut attribuer le tableau clinique, qui n’est pas très spécifique, à une autre cause, le paludisme par exemple. Troisièmement, les tests sérologiques restent en général négatifs à ce stade. Ils ne deviennent positifs qu’entre 4 et 12 semaines après l’infection, la séroconversion intervenant pour 95% des sujets dans les six mois qui suivent la transmission. C’est la mise en évidence d’ARN viral dans le plasma qui pose le diagnostic de l’infection aiguë. 7-2-2. Infection par le VIH asymptomatique Chez l’adulte, la période de latence de l’infection par le VIH jusqu’au début de la maladie liée au virus et au SIDA est d’une durée longue et variable. Une personne infectée par le VIH peut rester asymptomatique pendant 10 ans ou plus. La grande majorité des enfants infectés par le VIH le sont pendant la période périnatale. Pour eux, la période asymptomatique est plus courte. Alors que quelques nourrissons tombent malades durant les premières semaines de la vie, la plupart des enfants évoluent vers la maladie avant d’avoir atteint l’âge de deux ans. Quelques-uns se maintiennent en bonne santé pendant plusieurs années. 7-2-3. Adénopathie généralisée persistante (AGP) Elle se définit comme une tuméfaction des ganglions localisés dans au moins deux sites en dehors de l’aine. A ce moment, la lymphe est le principal réservoir du VIH. Cette adénopathie se déclare chez environ un tiers des personnes infectées par le VIH et ne présentant pas d’autres symptômes. On note une tuméfaction persistante, généralisée, symétrique et non douloureuse des ganglions. Elle n’a aucune signification particulière pour le pronostic. 7-2-4. Evolution de l’infection à la pathologie associée au VIH et au SIDA Chez presque toutes (pour ne pas dire toutes) les personnes infectées par le VIH, la pathologie associée au VIH et au SIDA finit par s’installer. Cette progression est plus rapide chez certains sujets, la vitesse dépendant des caractéristiques du virus et de l’hôte. En ce qui concerne le virus, il s’agit du type et de la souche: le VIH-1 et, au sein de ce type, certaines souches provoquent une évolution plus rapide. Pour l’hôte, les facteurs d’une évolution plus rapide comprennent l’âge, moins de 5 ans ou plus de 40 ans, les infections concomitantes et peut-être des facteurs génétiques. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 23 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 7-2-5. Progression de l’immunodéficience A mesure que l’infection par le VIH progresse et que l’immunité décline, les sujets deviennent plus sensibles aux infections, qui comprennent la tuberculose, la pneumonie et des mycoses récidivantes de la peau, de l’oropharynx et le zona. Celles-ci peuvent survenir à n’importe quel stade de l’évolution de l’infection et de l’immunodéficience. Certains patients présentent des symptômes généraux (fièvre inexpliquée et perte de poids), que l’on a appelé “ARC” ou “para-SIDA”. Il arrive que certains développent une diarrhée chronique s’accompagnant d’une perte de poids, souvent appelée maladie de la maigreur (ou syndrome cachectisant ou syndrome d’amaigrissement). Certaines maladies liées spécifiquement au VIH surviennent le plus souvent à un stade avancé de l’immunodéficience. Il s’agit de certaines infections opportunistes (comme la méningite cryptococcique) et de certaines tumeurs (comme le sarcome de Kaposi). A ce stade tardif, les sujets meurent en général en moins de deux ans, à moins de recevoir un traitement spécifique contre le VIH. On nomme parfois ce stade “SIDA avancé. 8- Manifestations cliniques de l’infection [28] L’OMS à mis au point un système pour définir les stades cliniques ( à l’origine pour le pronostic) reposant sur des critères cliniques. La définition des symptômes, des signes et des pathologies repose sur le jugement clinique. L’état clinique ou le degré de performance détermine, en fonction du résultat le plus élevé, le stade clinique, 1, 2, 3 ou 4. Le stade clinique est un critère important pour savoir quand commencer la thérapie antirétrovirale. Les signes cliniques de l’infection à VIH varient selon le stade de la maladie. Système de l’OMS pour la définition des stades cliniques de l’infection à VIH et de la pathologie associée chez l’adulte (à partir de 13 ans) [28] Primo-infection VIH => Asymptomatique => Syndrome rétroviral aigu ou Primo-infection symptomatique Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 24 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). Stade 1 => Asymptomatique => Adénopathie généralisée persistante Stade 2 => Perte de poids (< à 10% du poids présumé ou mesuré) => Manifestations cutanéomuqueuses (par exemple aphtes, mycoses des ongles) => Infections récurrentes respiratoires (infections des voies aériennes, sinusites, bronchites, otites moyennes, pharyngites) => Zona (herpes zoster) dansles 5 dernières années => Perlèche => Ulcérations orale récurrentes => Prurigo => Dermite séborrhéique => Infections fongiques des ongles onychomycoses Stade 3 => Perte de poids sévère (> 10% du poids corporel présumé ou mesuré) => Diarrhée chronique inexpliquée de plus de 1 mois => Fièvre prolongée inexpliquée (intermittente ou constante) de plus de 1 mois => Candidose de l’oropharynx (muguet) => Leucoplasie orale chevelue => Tuberculose pulmonaire =>Infections bactériennes sévères (ex: pneumonies, pyomyosite, infection articulaire ou osseuse, méningite ...) Stade 4 => Syndrome cachectique => Pneumonie à Pneumocystis carinii => Toxoplasmose cérébrale => Cryptosporidiose avec diarrhée pendant plus d’un mois => Cryptococcose extra pulmonaire y compris méningite => Infection à cytomégalovirus (CMV) localisée dans un organe autre que le foie, la rate ou les ganglions lymphatiques Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 25 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). => Herpès Herpès cutanéomuqueux pendant plus d’un mois, viscéral quelqu’en soit la durée => Leucoencéphalopathie multifocale progressive => Toute mycose endémique généralisée (par exemple l’histoplasmose) => Candidose de l’oesophage => Infection disséminée à mycobactéries non-tuberculeuse => Septicemie à salmonelle non typhoïdique => Tuberculose extrapulmonaire => Lymphomes => Sarcome de Kaposi => Encéphalopathie liée au VIH Système de l’OMS pour la définition des stades cliniques de l’infection à VIH et de la pathologie associée chez l’enfant [28] Enfants de moins de 13ans ayant une infection VIH confirmée : • Chez les enfants > ou = 18 mois : confirmée par sérologie VIH • Chez les enfants < 18 mois : confirmée par tests virologiques ou Ag Stade 1 => Asymptomatique => Adénopathie généralisée persistante Stade 2 => Diarrhée chronique inexpliquée => Candidose grave persistante ou récurrente en dehors de la période néonatale => Perte de poids ou croissance anormalement lente => Fièvre persistante => Infections bactériennes graves et récurrentes Stade 3 => Infection opportunistes évocatrices du Sida => Croissance fortement ralentie => Encéphalopathie progressive => Pathologie malignes => Leucoplasie chevelue de la langue => Septicémies ou méningites récurrentes Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 26 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 9- DIAGNOSTIC Le diagnostic précoce de l'infection par le VIH est important pour une bonne prise en charge du VIH/Sida. Le diagnostic visant à déterminer le statut sérologique au VIH est réalisé en deux étapes : 9-1. Dépistage : Les tests de dépistage sont basés sur des techniques immunoenzymatiques de type ELISA. Ils sont dits mixtes puisqu’ils détectent les anticorps anti-VIH-1 et anti-VIH-2. 9-2. Confirmation : Si la détection se révèle positive, douteuse, ou discordante [15] une confirmation est réalisée. La méthode de référence est celle western blot (WB). Il s’agit d’un test de confirmation très spécifique. 9-3. Autres méthodes Il existe d'autres techniques de détection d'une infection par le VIH [15], comme : ●l'antigénemie p24 : utile lorsque la séroconversion n'a pas encore eu complètement lieu. Le test devient négatif une fois la séroconversion effectuée, ●la méthode combinée : qui utilise l'antigène p24 et la détection d'anticorps. Elle réduit la fenêtre sérologique jusqu’à deux à cinq jours. ●l'isolement en culture : utilisé pour les nouveau-nés de mère séropositive. L'infection est confirmée lorsqu'une activité de transcriptase inverse est détectée ou l’antigène p24 identifié. ●la détection de l'ARN viral ou l’ADN proviral : on cherche les gènes gag ou pol du VIH. B- RAPPEL SUR LE FONCTIONNEMENT NORMAL DU SYSTEME IMMUNITAIRE Le système immunitaire est l’ensemble des molécules, cellules, tissus et organes qui participent à la réponse immunitaire ou qui représentent un aspect de cette réponse (rejet des particules étrangères). Cependant, on distingue deux types d’immunité ; une immunité innée non spécifique et une immunité acquise spécifique. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 27 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). Lorsque l'organisme est soumis à une agression infectieuse banale, les mécanismes de l'immunité non spécifique sont d'abord activés. Lors d'une infection virale par exemple, les cellules infectées vont produire des interférons antiviraux, qui sont des protéines induisant une résistance au virus dans les cellules. En plus, une sous-population de lymphocytes (les tueurs naturels ou Natural Killer ou NK, composants essentiels de l’immunité innée) détruit directement une partie des cellules infectées par des agents pathogènes ou les cellules tumorales. Les NK possèdent à leur surface tout un répertoire de récepteurs activateurs et inhibiteurs qui contrôlent leur activation, leur prolifération, et leurs fonctions effectrices [7]. Dans la défense primaire contre des infections, les monocytes et macrophages (phagocytes mononucléaires), ainsi que les neutrophiles et éosinophiles (phagocytes polynucléaires) sont surtout importants [29]. Tous ces mécanismes immunitaires de la première ligne de défense ont néanmoins une capacité limitée et manquent de spécificité, ce qui explique pourquoi des infections peuvent se développer chez l'homme. Dans un deuxième temps, les agents infectieux sont confrontés au système immunitaire spécifique. Les germes sont d'abord incorporés par les cellules présentatrices d'antigène (CPA), certains monocytes et les macrophages. Par un processus de dégradation des protéines en peptides, les germes sont transformés en fragments antigéniques pour présentation aux lymphocytes T [30]. Les peptides des vésicules sont présentés aux lymphocytes TCD4+ helper en association avec les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe 2 (CMH 2). Ceux du cytosol sont reconnus par les TCD8+ cytotoxiques et aux cellules NK grâce au CMH 1 [31]. L’activation des cellules TCD4+ helper est un événement crucial dans l’induction d’une réponse immunitaire. Les T CD4+ produisent des cytokines, des protéines qui activent d'autres cellules du système immunitaire. Selon la nature des cytokines sécrétées, deux fonctions principales des cellules T helper peuvent être distinguées [32]. - La fonction dite T helper 1 (Th1), par l'intermédiaire de l'interféron gamma (interféron immun ou IFN γ ) sont impliqués dans l’activation secondaire des Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 28 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). monocytes/macrophages Cette activation est nécessaire pour la destruction de certaines bactéries et parasites. - Par leur action T helper 2 (Th2), les cellules T CD4 stimulent surtout les lymphocytes B qui vont se différencier en lymphocytes sécréteurs (plasmocytes) et en lymphocytes B mémoires. Ce sont ces cellules mémoires qui provoquent une réaction plus rapide à l’infection suivante. Quant aux plasmocytes ; ils sont capables de produire d’énormes quantités d’anticorps identiques et spécifiques de l’antigène en cause. Quand les lymphocytes T CD8+ ils sont activés, ils freinent la multiplication virale de deux façons spécifiques : soit par la suppression virale directe sans nuire à la cellule hôte, soit par la destruction des cellules infectées par l’intermédiaire de facteurs solubles [33]. A cause de cette dernière action, les lymphocytes T CD8 sont nommés aussi des cellules T cytolytiques ou CTL (cytolytic T lymphocytes). Bien que les T CD8 soient activés de préférence en cas d'infection virale, les lymphocytes T CD4 jouent aussi un rôle antiviral indirect. Par la production de cytokines de type Th1, les T CD4 +facilitent l'activation des T CD8 antiviraux et, par leur fonction Th2, les T CD4 stimulent la production d'anticorps antiviraux. Récemment une nouvelle catégorie de Th a été décrite : les lymphocytes Th 17. Ces cellules produisent, en réponse à leur activation par l’interleukine(IL)-23, de l’IL-17, de l’IL-6 et du TNF-α et semblent impliqu ées l’inflammation dans de nombreuses maladies auto-immunes ou dysimmunitaires [34]. A côté des T helper existe les lymphocytes TCD4+ CD25+ régulateurs naturels (T reg). Ces derniers jouent un rôle capital dans le maintien de la tolérance périphérique au soi, leur absence conduisant au développement de syndromes lymphoprolifératifs auto-immuns. Les T reg sont également impliqués dans le contrôle des réponses immunitaires anti-infectieuses et ont un rôle délétère lors des réponses immunitaires anti-tumorales [35]. C- INTERACTIONS DYNAMIQUES ENTRE LE VIH ET LE SYSTEME IMMUNITAIRE 1- Tropisme et récepteurs du VIH Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 29 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). Le VIH parasite le système immunitaire en utilisant à son propre compte diverses molécules de ce système. La sélectivité du VIH et la sévérité du déficit immunitaire à l’infection sont en grande partie liées à l’interaction spécifique entre la glycoprotéine d’enveloppe du VIH, la gp120, et la molécule CD4 récepteur à haute affinité au VIH [36]. Si la cellule CD4 fonctionne comme un récepteur de haute affinité pour la gp120 elle n’est pas suffisante pour l’entrée dans la cellule. Des récepteurs accessoires sont nécessaires à la réplication du virus dans la cellule hôte. Il s’agit des corécepteurs CCR5 et CXCR4 identifiés en 1996, ce sont des récepteurs de chémokines ou chémo-attractants [37, 38]. 2- Dynamique de l’activation immune et de la réplication virale L’intégration du VIH dans la cellule hôte et sa réplication nécessitent une activation préalable de cette cellule. Lors des épisodes de stimulation antigénique des lymphocytes CD4, le VIH initie sa propre réplication dans la cellule CD4+ et les macrophages infectés, en utilisant des molécules intracellulaires telles que кNF -B, régulant la transcription de cytokines. La plupart des cytokines produites par les cellules T auxiliaires de type Th1 semblent capables d’induire ou d’amplifier la réplication du VIH, au premier rang desquelles figurent l’IL-2, l’IL-6 et le TNF-ß, TNFα. D’autres cytokines telles que l’IFN- ץet l’IFN-α ou le TGF-ß semblent à l’inverse inhiber efficacement la réplication virale et pourraient être utilisées à des fins thérapeutiques. La plupart de ces cytokines régulent également la réplication du VIH dans les macrophages. Toute activation lymphocytaire ou macrophagique sera donc susceptible d’amplifier la réplication virale et le nombre de cellules infectées, comme en témoigne l’administration de vaccins chez des sujets infectés [36, 39, 40]. Ainsi, les lymphocytes CD4 infectés représentent environ 95 à 99% du stock de cellules infectées de l’organisme. Ils peuvent être divisés en cellules à réplication active (les lymphocytes CD4 activés par les antigènes ou les cytokines) et en cellules à réplication latente (cellules T mémoires, n’exprimant à leur surface aucun marqueur d’activation (CD45RO = HLA-DR-, CD25-). Des changements importants dans la compréhension de cette maladie sont survenus grâce à la modélisation mathématique des dynamiques de la réplication et de clairance du virus dans les cellules CD4 [41, 42]. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 30 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). La durée moyenne d’un cycle de réplication virale dans le pool à réplication active serait de 1 à 2 jours, et de 2 semaines voire plus dans le pool à réplication latente. Le tropisme électif du VIH pour les cellules immunocompétentes CD4+, sa persistance dans les follicules lymphoïdes par les cellules dendritiques folliculaires, l’utilisation par le VIH des voies d’activation physiologiques de ces cellules pour sa propre réplication font des organes lymphoïdes, dédiés à la présentation d’antigènes et à l’activation lymphocytaire, le site d’élection de la réplication virale. C’est pour ces raisons que la charge virale dans ces organes lymphoïdes est généralement 10 fois supérieure à celle enregistrée dans le sang périphérique [40]. 3- Réponses immunes cellulaires au VIH 3-1 Lymphocytes TCD4+ auxiliaires spécifiques du VIH Les réponses au VIH médiées par les lymphocytes TCD4+ sont indispensables au déroulement efficace de la réponse immune. En effet, le rôle des réponses CD4 auxiliaires, dites Th1, capables de produire IL-2 et lFN- ץen réponse au VIH, est apparu déterminant dans deux situations particulières. D’une part, chez les sujets asymptomatiques à long terme (ALT), où cette réponse spécifique anti-VIH semble responsable de la non-progression ou de la progression extrêmement lente de l’infection et d’autre part les primo-infections traitées précocement avec les antirétroviraux [43]. Ces lymphocytes amplifient de façon majeure les réponses cytotoxiques (CTL) au VIH. Ils jouent un rôle important en phase de primo-infection, où leur présence est déterminante pour que s’amplifient rapidement les CTL, de façon à contrôler efficacement la réplication virale. Le taux d’IFN- ץproduit par ces lymphocytes Th1 est inversement corrélé à la réplication virale et constitue aujourd’hui l’un des meilleurs indicateurs d’une réponse immune efficace. Leurs cibles antigéniques principales semblent les protéines de capside-p24 et p17- ainsi que la gp120. 3-2 Réponses T cytotoxiques au VIH Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) représentent l’un des principaux mécanismes effecteurs impliqués dans la lutte antivirale [44, 45] ; ils constituent la cible majeure des stratégies vaccinales. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 31 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). L’existence de CTL CD8+ spécifiques du VIH a pu être démontré à la fois dans le sang périphérique et dans les lymphocytes infiltrant les organes infectés. Ces réponses CTL, détectables chez plus de 90% des sujets infectés, sont essentiellement dirigées contre les protéines structurales de l’enveloppe et de la capside, la transcriptase inverse et la protéine non structurale, nef. Les protéines de régulation nef, rev, tat, par leur précocité d’apparition lors du cycle réplicatif du virus, pourraient constituer des cibles de choix pour les CTL. Ce qui leur permettra de lyser les cellules initiant le cycle de réplication virale avant même la production de particules virales. Ces CTL reconnaissent de multiples déterminants antigéniques, appelés << épitopes >>, dans les protéines du VIH présentées à la surface cellulaire lors de la réplication virale. Des mutations ponctuelles fréquentes dans le génome de ce virus hypervariable peuvent altérer la reconnaissance de ces épitopes et induire des phénomènes d’échappement. Néanmoins l’extraordinaire diversité du répertoire immun permet aux défenses de l’hôte de s’ajuster à ces modifications. Il s’ensuit une formidable coursepoursuite entre les variants viraux et les réponses capables de les éliminer, l’épuisement du système immunitaire par l’activation permanente qu’elle induit. L’existence de cellules quiescentes, ne répliquant pas le virus, permet à ce dernier d’être totalement invisible aux CTL et d’échapper à cette course-poursuite. La corrélation entre l’émergence des CTL et la diminution de la charge virale en phase de primo-infection, ou au cours des phases pauci- symptomatiques de la maladie suggèrent l’efficacité protectrice de ces réponses CTL. Un argument supplémentaire pourrait enfin provenir de la détection de ces réponses CTL chez des sujets à risque, exposés mais non infectés. L’importance de ces cellules a été démontrée récemment chez les macaques infectés par le SIV, où l’élimination totale des lymphocytes TCD8 secondaire à l’injection d’un anticorps monoclonal anti-CD8 a été suivie d’un rebond immédiat de la réplication virale [46]. Néanmoins ces réponses cytotoxiques spécifiques du VIH, en détruisant des cellules répliquant activement le virus, ont pour corollaire un effet cytopathogène important concourant à la déplétion TCD4+ et à la désorganisation du tissu lymphoïde. 4- Cellules CD8 suppressives et chémokines Les lymphocytes CD8 interviennent également dans le contrôle négatif de la réplication virale par la production de molécules dites <<suppressives>>. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 32 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). Récemment, trois molécules du groupes des ß-chémokines (RANTES, MIP-1α et MIP-1ß ont été impliquées dans cette réplication négative [47]. Leur effet passe par interaction avec les chémorécepteurs qui se trouvent être les corécepteurs du VIH. Plus récemment, l’équipe de Ho a identifié de nouvelles molécules participant à l’activité antivirale des CD8 : il s’agit de défensines 1, 2 et 3 [48]. Ces molécules sont retrouvées en grandes quantités dans les surnageants de culture de cellules CD8+ activées de patients non progresseurs à long terme. Elles sont capables d’inhiber in vitro la réplication du VIH-1. D- DEFICIT IMMUNITAIRE ET CONSEQUENCES IMMUNOPATHOLOGIQUES DE L’INFECTION PAR LE VIH La déplétion progressive en lymphocytes TCD4 constitue la principale manifestation immunopathologique induite par l’infection VIH. De nombreuses anomalies fonctionnelles y sont associées, dominées par l’altération des fonctions auxiliaires des lymphocytes T, apparaissant dès le début de l’infection. D’autres sont liées à l’hyperactivation de l’ensemble du système immunitaire. 1- Lymphopénie TCD4+ Le déficit quantitatif ou qualitatif en lymphocytes CD4, élément majeur du déficit de l’immunité cellulaire induit par le VIH, conduit, en moyenne en dix ans après la primoinfection à une déplétion absolue en lymphocytes TCD4+. Les phases de primoinfection et de progression vers le SIDA sont associées à une production virale intense et à une déplétion accrue des lymphocytes TCD4+. A l’inverse une phase de relative stabilité des lymphocytes TCD4+ est associée à un contrôle partiel de la réplication virale et à des charges virales cellulaires ou plasmatiques modérées. On peut estimer la perte moyenne des lymphocytes TCD4+ à 50 cellules /mm3 /an. La demi-vie des lymphocytes infectés a pu être évaluée in vivo entre 1 à 2 jours, et aboutit à la destruction d’environ 109 cellules CD4+ par jour [41, 42]. Une telle dévastation nécessite que l’organisme régénère quotidiennement un nombre considérable de lymphocytes CD4 pour maintenir un état d’équilibre, même relatif. Cela conduit à un épuisement progressif des capacités de régénération de l’organisme et à la déplétion absolue. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 33 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). Les mécanismes de la déplétion TCD4+ font intervenir différents mécanismes de destruction périphérique et d’absence de régénération, directement ou indirectement liés au virus. 1-1 Réponses immunes cytotoxiques Les cellules CD4+ infectées, exprimant à leur surface les antigènes du VIH, sont la cible de puissantes réponses cytotoxiques spécifiques du VIH [44]. Cependant, des cellules <<innocentes>>, non infectées, fixant la gp120 sur leur CD4 de surface peuvent également être détruites par d’autres mécanismes de cytotoxicité, tels que l’ADCC ou le complément. L’infiltration massive des organes infectés par des CTL spécifiques du VIH différenciés in vivo témoigne sans doute de l’implication de ces réponses cytotoxiques dans la déplétion CD4. 1-2 Activation pathologique et mort cellulaire L’infection VIH induit une formidable activation chronique des cellules T, spécifiques ou non du VIH, aggravant la progression de la maladie [49]. Les lymphocytes activés, même non infectés, ont une durée de vie raccourcie : l’activation chronique du compartiment CD4+ peut conduire à des phénomènes d’apoptose responsables de la mort de cellules <<innocentes>> [50]. De nombreux marqueurs d’activation sont présents à la surface de ces lymphocytes T tels que les molécules HLA-DR, CD38 ou le récepteur à l’IL-2, témoignant de cette activation chronique [51], ou la molécule Fas, impliquée dans les phénomènes d’apoptose. Ils constituent d’excellents témoins de la progression de l’infection et disparaissent sous l’effet des thérapeutiques antirétrovirales qui mettent au repos le système immunitaire. 1-3 Perte des capacités de production de lymphocytes CD4 : origine centrale et périphérique Face à la diminution de la durée de vie des lymphocytes TCD4+, les formidables capacités de régénération du système hématopoïétique et le thymus sont mises en jeu. Ce qui permet de compenser les pertes, assurer un équilibre même instable des lymphocytes CD4 et ralentir la chute des lymphocytes CD4. Ces phénomènes de compensation semblent s’épuiser avec la progression de la maladie. La capacité du VIH à infecter les lymphocytes TCD4+ du thymus paraît aujourd’hui bien établie mais Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 34 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). l’infection des précurseurs hématopoïétiques reste très hypothétique. L’infection des microenvironnements médullaires et thymiques pourrait, cependant, créer des conditions d’hématopoïèse et de différenciation T défavorables et participer au défaut de régénération CD4 [39]. La découverte récente de marqueurs périphériques de la production thymique a permis d’étayer cette hypothèse, montrant une diminution de ces marqueurs au cours de l’infection VIH [52]. L’homéostasie des lymphocytes T de l’adulte dépend, aussi, de la capacité des cellules CD4 mémoires à proliférer en réponse aux antigènes de rappel que du thymus. 1-4 Déficit fonctionnel ou anergie des cellules TCD4+ auxiliaires La lymphopénie TCD4+ ne suffit pas à elle seule pour expliquer toutes les multiples anomalies de fonctionnement des cellules TCD4+ auxiliaires qui apparaissent dès les stades précoces de l’infection. Ce déficit fonctionnel est caractérisé par un défaut de production d’IL-2, définissant un état d’anergie ou d’aréactivité des lymphocytes TCD4+, comme le montre chez les patients la très fréquente anergie cutanée à la tuberculine [39]. De plus, un défaut de production d’IFN- ץcaractérise le défaut de fonction auxiliaire Th1 des lymphocytes CD4. Un deuxième type de fonction auxiliaire Th2, produit notamment IL-4, IL-5 et IL-10. Les fonctions Th1 favorisent schématiquement l’immunité à médiation cellulaire, et les fonctions Th2 l’immunité à médiation humorale, chacune étant soumise à un contrôle précis encore mal connu. La question d’une dérive, avec la progression de l’infection VIH, des fonctions T auxiliaires vers un type Th2 prédominant a été largement débattue [53, 54]. Par ailleurs, d’autres cytokines, produites essentiellement par les cellules présentatrices d’antigènes telles que l’IL-10 ou le TGF-ß, amplifient l’anergie des lymphocytes T auxiliaires de types Th1. L’hyperactivation du système immunitaire et des cellules CD4, entretenue par la présence de particules virales à la surface des cellules dendritiques folliculaires dans les centres germinatifs des follicules lymphoïdes, paralyse les cellules CD4 et dévient source d’anergie par de nombreux mécanismes [39, 49]. Sous traitement antirétroviral efficace, la correction de l’anergie des lymphocytes CD4 mémoires aux antigènes de rappel semblent surtout secondaire à la diminution de l’activation T [55, 56]. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 35 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). L’ensemble de ces déficits a légitimé le développement d’immunothérapie par l’IL-2 associée aux antirétroviraux [57]. Ces traitements par l’IL-2 induisent une ascension notable et prolongée des taux de lymphocytes CD4+, toutefois associés à des pics de réplication virale lors des couvertures efficaces par les antirétroviraux lors de tout traitement par IL-2. 2- Lymphocytes TCD8+ Ces cellules, dès la phase de séroconversion et tout au long de l’infection, sont considérablement activées, exprimant les molécules HLA-DR ou CD38, ce dernier marqueur pouvant être corrélé à la charge virale et un pronostic défavorable [50, 52]. 3- Les lymphocytes B Plusieurs anomalies caractérisent le compartiment des lymphocytes B au cours de l’infection VIH [40]. Ces anomalies regroupent, paradoxalement, une importante hypergammaglobulinémie, et un défaut de production d’anticorps spécifiques d’antigènes en réponse à une stimulation primaire. L’hypergammaglobulinémie touche les IgG, plus particulièrement les IgG1 et les IgG3, ainsi que les IgM et les IgA. De plus, une sécrétion locale de cytokines, telles que l’IL-6 ou l’IL-10, pourrait amplifier l’activation dans les organes lymphoïdes et participer au développement de lymphomes. 4- Les cellules <<Natural Killer>> (NK) [58] Les cellules NK peuvent reconnaître les cellules cibles potentielles de deux façons différentes. Il existe sur la membrane cellulaire des NK des récepteurs activateurs (portant des séquences « ITAM » : immunoreceptor tyrosine-based activation motif) ou inhibiteurs (portant des séquences « ITIM » : immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif). Lorsqu'un NK rencontre une autre cellule, la lyse de cette cellule ne se produira que si les signaux d'activation surpassent les signaux d'inhibition. Le principal signal inhibiteur est produit par les récepteurs KIR (acronyme de l'anglais « Killer cell Ig-like Receptor »), portés par les NK, qui reconnaissent les molécules du CMH de classe I. L'activation d'un seul type de récepteur KIR suffit à empêcher l'activation du NK alors qu'il faut toujours plusieurs signaux activateurs différents pour provoquer la dégranulation du NK et la mort de la cellule non reconnue. Les signaux d'activation Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 36 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). sont variés, et comportent notamment des protéines produites par des cellules stressées, comme par exemple lors d'une infection. Ce système d'équilibre dynamique activation/inhibition permet en pratique aux cellules NK de lyser toutes cellules dépourvues des molécules du CMH de classe I (dont théoriquement tous parasites extracellulaires) ou cellules infectées par des virus ou des bactéries tout en épargnant les cellules saines. Une autre voie par laquelle les cellules NK reconnaissent les cellules cibles potentielles dépend du fait que des cellules tumorales et des cellules infectées par certains virus exposent des antigènes contre lesquels le système immunitaire a développé une réponse anticorps, de telle façon que des anticorps antitumoraux ou antiviraux soient liés à leur surface. Etant donné que les cellules NK expriment le CD16, qui est un récepteur membranaire pour l'extrémité carboxy-terminale de la molécule d'IgG, appelée Fc elles peuvent fixer à ces anticorps et, par la suite, lyser les cellules ainsi marquées. Ceci est un exemple d'un processus connu sous le nom de cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC, Antibody-Dependant Cellmediated Cytotoxicity). La lyse des cellules cibles se fait principalement par les voies perforine/granzyme, mais également par la voie Fas. Un déficit d’activité NK pourrait participer à la progression de la maladie et aux complications opportunistes. En effet les cellules NK sont responsables d’activité cytotoxique spontanée vis-à-vis de cellules tumorales ou infectées et participent aux fonctions de cytotoxicité dépendante d’anticorps (ADCC) anti-VIH dirigés contre la gp120. Ce défaut d’activité NK reflète vraisemblablement le déficit T CD4+ auxiliaire et en particulier le défaut de sécrétion d’IL-2 [40]. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 37 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). II- MATERIEL ET METHODES : 1-Type, période et lieu de l’étude : Notre étude était descriptive et transversale, allant de juin 2007 à mai 2008 et menée au Centre de Recherche et de Formation sur le VIH et la tuberculose (SEREFO). 2-Population d’étude : L’étude a porté sur deux groupes : * groupe 1 : patients VIH+ naïfs de chimiothérapie antirétrovirale et suivis en consultation externe dans les Centres de référence des 6 communes de Bamako. * groupe 2 : sujets témoins VIH- constitués de donneurs de sang volontaires du Centre national de transfusion sanguine (CNTS). 3-Critères d’éligibilité : 3-1. Critères d’inclusion : - Pour le groupe 1 ont été inclus dans l’étude tous les sujets VIH+ au GENSCREEN HIV I/II VERSION 2 confirmé par le NEW LAV BLOT I ayant donné leur consentement éclairé. - Pour le groupe 2 ont été inclus dans l’étude tous les donneurs de sang VIH- au GENSCREEN HIV I/II VERSION 2 ayant donné leur consentement éclairé. 3-2. Critères de non inclusion : - Tout sujet VIH+ confirmé et donneurs de sang VIH- n’ayant pas voulu participer à l’étude. 4- Echantillonnage : Notre étude a porté sur 15 patients séropositifs tirés au hasard. Les échantillons témoins ont été aussi tirés au sort et leur taille a été fonction du nombre de patients VIH+ inclus dans l’étude. 5- Prélèvement d’échantillons sang : Le sang total a été prélevé sur 2 tubes: - Un tube sec pour la sérologie rétrovirale. - Un tube EDTA pour l’immunophénotypage. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 38 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 6- Diagnostic sérologique de l’infection à VIH : 6-1- Méthodes d’analyses : 6-1- 1- GENSCREEN®HIV1/2 Version 2 Pour la mise en évidence des anticorps anti-VIH-1 et ou anti-VIH-2 la technique ELISA (GENSCEEN HIV1-2 Version 2) a été utilisée. 6-1-2- Principe: Genscreen HIV1/2 version 2 est une technique immuno-enzymatique basée sur le principe du sandwich en deux étapes pour la détection des différents anticorps associés aux virus VIH1 et /ou VIH2, dans le sérum ou le plasma humain. Genscreen HIV1/2 repose sur l'utilisation d'une phase solide préparée avec les antigènes purifiés (protéines recombinants gp160 et p25 du virus VIH1 et peptide mimant l'épitope immunodominant de la glycoprotéine du virus VIH2) et d'un conjugué préparé avec des antigènes marqués à la peroxydase (protéine recombinante nucléocapsidique et peptides mimant les épitopes immunodominant des glycoprotéines d'enveloppe des VIH1 et VIH2). 6-1-3- La trousse GENSCREEN/ HIV I/II V2 contient: Réactif 1 (R1) : microplaque Chaque microplaque contient 12 barrettes de 8 cupules sensibilisées par les antigènes purifiés. Réactif 2 (R2) : Solution de lavage concentrée 10 fois. Cette solution doit être diluée 10 fois dans l’eau distillée pour obtenir la solution de lavage prête à l’emploi. On prévoit alors 800 ml pour une plaque de 12 barrettes. Réactif 3 (R3) : Sérum de contrôle négatif. Sérum humain négatif en anticorps anti-VIH 1 et anti-VIH 2, en antigène HBs et en anticorps HCV. Réactif 5 (R5) : Sérum de contrôle positif. Sérum humain positif en anticorps anti-VIH, négatif en Ag HBs et en Ac-VHC. Réactif 6 (R6) : Diluant pour échantillons prêt à l’emploi. C’est une solution de sérum de veau. Réactif 7a (R7a) : Conjugué lyophilisé. Ag VIH 1 et VIH 2 purifiés ; marqués à la peroxydase. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 39 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). Réactif 7b (R7b) : Diluant du conjugué Réactif 8 (8) : Tampon de substrat. Solution prête à l’emploi d’acide citrique et d’acétate de sodium PH 4,0 contenant 0,015% d’eau oxygénée et 4% de DMSO. Réactif 9 (R9) : Solution de chromogène concentrée. Diluer 11 fois la solution dans le tampon substrat (Ex : 1 ml de réactif 9 + 10 ml de réactif R8). Réactif 10 (R10) : Solution d’acide sulfurique 1N prêt à l’emploi. 6-1-4- Mode opératoire : 1. Etablir soigneusement le plan de distribution et d’identification des échantillons. 2. Préparer la solution de lavage diluée, 3. Sortir le cadre support et les barrettes (R1) 4. Déposer directement, sans prélavage de la plaque, successivement : 25 μl de diluant dans chaque cupule 75 µl de (R3) en A1 75 μl de (R4) en B1, C1 et D1 75 µl de (R5) en E1 75 μl du premier échantillon en F1 75 µl du deuxième échantillon en G1, etc.… Homogénéiser le mélange par 3 aspirations au minimum avec la pipette de 75 μl. 5. Couvrir d’un film autocollant en appuyant bien sur toute la surface. 6. Incuber la microplaque dans un incubateur sec de microplaques pendant 30 ± 5 minutes à 37 ± 1° C. Retirer le film adhésif. 7. Aspirer le contenu de toutes les cupules dans un conteneur pour déchets contaminés et ajouter immédiatement 0,370 ml de solution de lavage. Aspirer de nouveau. Répéter le lavage au moins 2 fois (Soit un minimum de 3 lavages au total). Le volume résiduel doit être inférieur à 10 μl. Si l’on dispose d’un laveur automatique respecté le même cycle opératoire. 8. Distribuer 100 µl de la solution conjugué dans toutes les cupules. 9. Recouvrir d’un film adhésif neuf et incuber 30 ± 5 minutes à la température ambiante (18 – 30 ° C). Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 40 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 10. Retirer le film adhésif, vider toutes les cupules par aspiration et laver au moins 5 fois comme précédemment. 11. Distribuer rapidement dans toutes les cupules 80 µl de la solution de révélation de l’activité enzymatique (R8 + R9) préalablement préparée. Laisser la réaction se développer à l’obscurité pendant 30 minutes à la température ambiante (18-30°C). 12. Ajouter 100 µl de la solution d’arrêt (R10) en adoptant la même séquence et le même rythme de distribution que la solution de révélation. 13. Essuyer soigneusement le dessous des plaques. Lire la densité optique à 450/620 nm à l’aide d’un lecteur de plaques, dans les 30 minutes qui suivent l’arrêt de la réaction. 14. S’assurer avant la transcription des résultats de la concordance entre la lecture et le plan de distribution d’identification des plaques et des échantillons. 6-1-5- Interprétation des résultats : Les échantillons dont les absorbances sont inférieures à la valeur seuil sont considérés négatifs. Les échantillons dont les absorbances sont égales ou supérieurs à la valeur seuil sont considérés initialement positifs d’après le test GENSCREEN HIV1/2 Version 2.Toutefois, les résultats situés juste au dessous de la valeur seuil doivent être interprétés avec prudence et il est conseillé de tester de nouveau les échantillons correspondants en double. 6-1-6- Limites : De très faibles taux d’anticorps peuvent ne pas être détectés lors d’infection récente, en conséquence un résultat négatif signifie que l’échantillon contrôlé ne contient pas d’anticorps détectables par le test Genscreen. Un tel résultat négatif n’exclut pas la possibilité d’une infection VIH1/VIH2. La variabilité des virus VIH1 (groupe M, groupe O) et VIH2 ne permet pas d’exclure la possibilité de réactions faussement négatives. Aucune méthode connue pour l’instant ne peut offrir l’assurance que le virus est absent. Toute technique ELISA hautement sensible peut produire des réactions faussement positives. Afin de spécifier la réaction, tout échantillon trouvé positif reproductible doit être soumis à un test de confirmation (Western blot par exemple). Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 41 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 6-2- NEW LAV BLOT I: 6-2-1- Principe du test Le test repose sur le principe de l’ELISA indirect sur bandelettes de nitrocellulose contenant toutes les protéines constitutives du virus VIH-1 et un contrôle interne antiIgG. Les protéines du virus VIH-1 inactivée sont séparées en fonction de leur poids moléculaire par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en milieu dissociant et réducteur, puis électrotransférés sur membrane de nitrocellulose. La mise en œuvre du test comprend les étapes suivantes : 1. Réhydratation des bandelettes. 2. Incubation des échantillons à confirmer ou sérum de contrôle. Si des anticorps anti-VIH-1 sont présents, ils se lient aux protéines virales reconnues, présentes sur la bandelette. 3. Après lavage, on procède à l’incubation des anticorps anti-IgG humaines marqués à la phosphatase alcaline. Le conjugué se lie aux anticorps anti-VIH1 retenus sur le support solide. 4. Après lavage et élimination du conjugué en excès, la solution de révélation permet de mettre en évidence l’activité enzymatique des complexes liés à la nitrocellulose. 5. L’apparition des bandes colorées spécifiques permet de mettre en évidence la présence anticorps anti-VIH-1 dans l’échantillon. 6-2-2- Mode opératoire 1. Avant utilisation, il est nécessaire attendre 30 minutes que les réactifs s’équilibrent à la température du laboratoire (18-30°C). Eliminer le couvercle transparent du rack utilisé. S’assurer que la face des bandelettes comportant le trait de repère et la numérotation est visibles, afin que les protéines virales présentent sur cette face soient couvertes par les différents réactifs tout au long de la manipulation. Les bandelettes doivent être manipulées précautionneusement à l’aide d’une pince en plastique. Ne pas laisser les bandelettes s’assécher pendant plus de 10 minutes durant le test Les contrôles fournis doivent être utilisés en parallèle avec les échantillons pour chaque série de tests. Le contrôle positif est nécessaire pour valider la manipulation et interpréter correctement les bandes. 2. Ajouter 2 ml de solution de lavage/diluant reconstitué dans chaque Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 42 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). compartiment. Incuber 5 minutes ± 1minute à température ambiante (18-30°C) sous agitation. 3. Ajouter 20μl de chaque échantillon ou sérum dans le compartiment correspondant. Incuber 2 heures ± 5 minutes à température ambiante (18-30) sous agitation. 4. Aspirer entièrement le contenu de chaque compartiment à l’aide d’une trompe à vide munie d’un piège contenant un désinfectant (eau de javel à 25%). Veuiller ne pas entraîner la bandelette lors de l’aspiration, utiliser le puits d’aspiration prévu à cet effet. Rincer sous le robinet la pointe d’aspiration en contact avec les échantillons entre chaque aspiration pour éviter les contaminations interéchantillons. Laver chaque bandelette avec 2 ml de solution de lavage/diluant reconstitué et l’éliminer immédiatement par aspiration, en respectant les mêmes précautions. Laver 2 autres fois, en contact 5 minutes, sous agitation, chaque bande avec 2 ml de solution de lavage/diluant reconstitué (soit 3 lavage en tout).Eliminer la solution du dernier lavage. 5. Distribuer 2 ml de conjugé par compartiment, la solution de conjugé étant préalablement stabilisée à température ambiante. 6. Lavage : procéder comme en 4. 7. Distribuer 2 ml de solution de révélation par compartiment. En présence de particules en suspension laisser décanter dans le flacon avant pipetage (ces particules n’interfèrent pas dans le test). Incuber sous agitation et surveiller la coloration. Toutes les bandes correspondant aux protéines virales doivent être visualisées avec le sérum de contrôle positif. (Temps de révélation minimum 5 minutes). 8. Arrêter la réaction en éliminant la solution de révélation et en rinçant les bandelettes 3 fois à l’eau distillée. 9. Sécher les bandelettes entre 2 feuilles de papier absorbant à température ambiante (18-30°C). Classer les bandelettes, les classer à l’aide du trait de repère. Valider puis interpréter. Attention : Ne pas coller de plastique adhésif sur la partie de la bande correspondant aux protéines virales. 6-2-3- Validation lecture et interprétation des résultats 6-2-3-1-Validation Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 43 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). La bande du contrôle anti-IgG doit être présente avec une coloration forte, elle permet de valider l’addition de l’échantillon, des réactifs et du bon fonctionnement du mode opératoire. L’absence ou la faible intensité de coloration de la bande du contrôle interne anti-IgG traduit soit une absence de dépôt d’échantillon ou de réactifs, soit un non respect du protocole opératoire. 6-2-3-2- Lecture La présence d’anticorps anti-protéines constitutives du virus VIH1 dans les échantillons contrôlés se traduit par l’apparition de bandes spécifiques colorées (bleu violet). Leur position correspond aux masses moléculaires des protéines virales répertoriées dans le tableau suivant : Tableau I : Protéines constitutives du VIH-1 et leur aspect au New Lav Blot I. Dénomination Génome Nature Aspect en Western Blot Glycoprotéine GP160 ENV précurseur de la Bande nette GP110/120 et de la GP41 GP 110/GP 120 ENV Glycoprotéine Bande aux bords diffus d’enveloppe P68/66 POL Transcriptase inverse GAG Précurseur P55 P52/51 Bande nette de protéines internes Doublet POL Transcriptase inverse Bande nette ENV Glycoprotéine GP41 transmembranaire GAG P40 Précurseur Bande diffuse de protéines internes Bande diffuse P34/31 POL Endonucléase Bande nette P24/25 GAG Protéine interne Bande nette P18/17 GAG Protéine interne Parfois doublet Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 44 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 6-2-3-3- Interprétation Tableau II : Interprétation des résultats au New Lav Blot I. Interprétation Profil Positif 2ENV ± GAG ± POL ENV ± GAG± POL Indéterminé GAG+POL GAG POL Aucune bande Négatif Bandes non répertoriées NOTE ● La rubrique<< indéterminé>> peut faire suspecter une des alternatives suivantes : Séroconversion, VIH2 ou réaction croisée avec d’autres rétrovirus. ● Les profils positifs ou indéterminés peuvent être obtenus par contamination avec un sérum positif. ● L’utilisation d’autres critères d’interprétation est également possible. C’est ce qui est préconisé en Allemagne par l’association allemande pour la lutte contre les maladies virales (DVV) [positif : présence au minimum d’une protéine d’enveloppe et d’une protéine Gag ou Pol-indéterminé correspond à tout profil ne répondant pas aux critères ci-dessus – Négatif : aucune bande présente. Dans ce cadre les gp120/gp160 sont considérées comme une seule protéine]. 6-2-3-4- Limites du test ● Un respect total de la procédure technique est nécessaire pour l’obtention d’une performance optimale. ● Le contrôle doit être utilisé en parallèle avec les échantillons pour chaque série de tests. Il est nécessaire pour valider la manipulation et interpréter correctement les bandes. ● Un test de dépistage positif associé à un test de confirmation négatif peut se produire durant le premier stade de l’infection ; en conséquence, un résultat négatif indique que l’échantillon testé ne contient pas d’anticorps anti-VIH détectable par le NEW LAV BLOT I. Toutefois, un tel résultat ne permet pas d’exclure la possibilité d’une infection récente VIH1/VIH2. Un nouvel échantillon ultérieur est recommandé Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 45 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). ● La variabilité des virus VIH1 et VIH2 ne permet pas d’exclure la possibilité de réactions faussement négatives. Aucune méthode connue ne peut offrir l’assurance que le virus VIH est absent. ● L’utilisation des critères d’interprétation moins restrictifs peut induire une classification différente des échantillons. Certains échantillons classés indéterminés selon les critères de la notice seraient alors rendus positifs. ● Un profil « indéterminé » doit conduire à ne pas exclure une des situations suivantes : séroconversion, VIH2 ou réactions croisées avec d’autres rétrovirus. 6-2-3-5- Critères de diagnostic sérologique de l’infection à VIH : Le diagnostic sérologique de l’infection à VIH : Conformément aux recommandations de l‘O.M.S. (73) les différents tests de dépistage du VIH doivent se faire par deux tests utilisant deux antigènes différents à défaut de la confirmation par le Western Blot. Le premier test à été fait par le test ELISA = GENSCREEN HIV1/2 Version 2. Le deuxième test a été fait par le Western blot test qui permet d’identifier en plus, le type de virus en cause (VIH-1 ou VIH-2 ou VIH 1+2). Le diagnostic de séropositivité est donc posé par : -Genscreen positif -Western blot positif en VIH-1 ou VIH-2 ou VIH 1+2. 7- L’Immunophénotypage 7-1 Principe Le sang total est ajouté aux anticorps monoclonaux couplés à des fluorochromes. Ces anticorps se fixent spécifiquement aux antigènes de surface des globules blancs. Les échantillons marqués sont alors traités avec la solution de FACS lyse. Cette solution lyse les érythrocytes et préserve les globules blancs et qui seront par suite analysés à l’aide d’un cytomètre de flux à 4 couleurs (FACScalibur®). 7-2. Réalisation de l’immunophénotypage 7-2-1. Equipements -Hotte Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 46 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). -Agitateur -Centrifugeuse de type Eppendorf® -Portoirs -FACScalibur® 7-2-1-1. Description du FACScalibur® Le FACScalibur® est un appareil modulaire muni d’un laser à argon de 488 nm d’amplitude et d’un laser à diode rouge de 635 nm. Quatre tubes photomultiplicateurs lui permettent d’effectuer des mesures à quatre couleurs. 7-2-1-2. Principe de la Cytométrie de flux et du FACScalibur® La cytométrie de flux est une technique permettant de faire défiler des particules, molécules ou cellules à grande vitesse devant le faisceau d'un laser. La lumière réémise (par diffusion ou fluorescence) permet de classer la population suivant plusieurs critères. Elle se définit donc comme l’étude précise de particules isolées (cellules, bactéries...) entraînées par un flux liquide. C’est une technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative de particules en suspension dans un liquide. Elle consiste à analyser les signaux optiques ou physiques émis par une particule coupant le faisceau lumineux d’un laser ou d’une lampe à arc. Les signaux mesurés sont essentiellement relatifs : - aux propriétés optiques intrinsèques des particules qui correspondent aux phénomènes de diffusion lumineuse liés aux dimensions de la particule, à leur structure interne ou à l’auto fluorescence de certaines cellules comme les cellules végétales, le phytoplancton, etc. - aux propriétés optiques induites de fluorescence obtenues par des marquages spécifiques de structures ou de fonctions cellulaires. Ces signaux séparés par un système constitué de filtres et miroirs sont collectés par des photomultiplicateurs (PMT). Ils sont amplifiés, numérisés, traités et stockés par un ordinateur grâce à un logiciel Cell Quest Pro. Ce procédé d’analyse individuelle (cellule par cellule) est multiparamétrique et peut s’effectuer à la vitesse de plusieurs milliers d’événements par seconde. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 47 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). Figure 3 : PRINCIPES SIMPLIFIES DE LA CYTOMETRIE DE FLUX Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 48 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 7-2-2. Matériel et réactifs - Une solution de FACS lyse (10x) utilisée au 1/10 eme comme solution de travail. - Un sang de contrôle - Des anticorps monoclonaux : Tube-1 : Unstain (non marqué) Tube-2 : CD8 FITC …………………………………………………………………20 µl Tube-3 : CD8 PE..............................................................................................20 µl Tube-4 : CD8 Percp Cy5.5...............................................................................20 µl Tube-5 : CD8 APC……………………………………………………………...……5 µl Les cinq premiers tubes ont été utilisés pour les réglages de la machine (compensation) Tube-6: CD3/CD8/CD45/CD4………………………………………………….….20 µl Tube-7: CD3/CD16, 56/CD45/CD19……………………………………………...20 µl Tube-8: CD45RA/CD62L/CD3/CD4………………………………………………20 µl Tube-9: CD3/IgG1/ CD4 / IgG2a………………………………………………….20 µl Tube-10: CD4/CD38/CD3/HLA-DR……………………………………………….20 µl Tube-11: CD8/CD38/CD3/HLA-DR……………………..………………………..20 µl Ces anticorps sont couplés respectivement aux fluorochromes : FITC, PE, Percp Cy5.5, APC. - Des tubes en polystyrène de dimensions 12x75 mm - Des Multi-pipettes de type Eppendorf® - Des aspirateurs - Des pipettes sérologiques à volumes ajustables - Du coton tige - Des compresses non stériles - Un bécher en plastique - De l’eau distillée - Une solution de PBS (phosphate Buffered Saline) sans Ca++ sans Mg++ - Une solution de lavage (BD Wash). 7-2-3. Mode opératoire Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 49 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 1- Agiter le sang recueilli sur tube EDTA pendant 1à 2 minutes. 2- Ajouter soigneusement 100 µl de sang total lavé deux fois avec du PBS à chaque tube contenant des anticorps monoclonaux. Lors de l’ajout éviter d’y former des bulles d’air et ou faire des tâches sur les parois des tubes. Les éventuelles tâches de sang peuvent être éliminées par du coton tige. 3- Agiter soigneusement ; couvrir avec du papier aluminium et incuber à l’obscurité pendant 15 minutes et à la température ambiante. 4- A chaque tube ajouter 2 ml de solution de lyse (FACS lyse) et agiter immédiatement pendant 3 secondes 4 à 5 fois. 5- Couvrir de papier aluminium et incuber 10 minutes à l’obscurité et à la température ambiante. 6- Après incubation centrifuger à la vitesse de 1200 tours/ minute pendant 5 minutes à la température de 20- 25˚C. 7- Enlever le surnageant 8- Agiter soigneusement 9- Ajouter 2 ml de solution de lavage et agiter immédiatement. 10- Enlever le surnageant 11- Centrifuger ensuite à 1200 tours/ minute pendant 5 minutes à la température de 20- 25˚C. 12- Ajouter 200 µl de solution de lavage (BD Wash) et analyser immédiatement les échantillons au FACScalibur®. 7-3. Analyse et présentation des résultats Les données stockées par le logiciel Cell Quest Pro sont analysées sur le logiciel FlowJo Treestar version 6.3. Ce qui permet d’avoir des résultats sous forme de figures (ci- dessous) avec les pourcentages et les valeurs absolues des cellules étudiées. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 50 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 1000 1000 800 800 600 400 200 600 600 # Cells SSC-H: SSC-Height SSC-H: SSC-Height 800 400 400 28.5 200 28.6 0 0 200 400 600 800 FSC-H: FSC-Height Ungated MAL01003701.001 Event Count: 100000 27.9 0 1000 10 0 1 10 3 2 10 10 FL3-H: CD45 PerCP 10 0 4 10 Ungated MAL01003701.001 Event Count: 100000 10 4 71.5 200 1 0 10 3 2 10 4 54.7 10 36.2 10 10 2 10 1 10 1 3.55 10 1 0 10 2 3 10 10 FL2-H: CD8 PE 10 4 CD3 MAL01003701.001 Event Count: 19873 10 4 42.6 10 2 33.3 1 0 FL4-H: CD4 APC 10 40.8 10 3 3 FL2-H: CD16,56 PE FL4-H: CD4 APC 10 2 10 0.68 60.9 0 10 10 3 2 1 0 10 10 FL4-H: CD19 APC 10 10 0 4 10 0 1 10 2 3 10 10 FL3-H: CD3 PerCP 10 4 Lymphocytes MAL01003701.003 Event Count: 29147 CD3MAL01003701.002 Event Count: 8061 10 4 10 4 27.5 60.5 4 CD45 Lymph MAL01003701.002 Event Count: 28290 10 4 10 3 10 10 10 FL1-H: CD3 FITC 56.7 3.75 23.6 FL2-H: CD38 PE FL1-H: CD8 FITC FL2-H: CD62L PE 10 10 1 10 1 10 1 0 10 2 10 2 10 2 10 10 3 10 3 10 3 0.14 11.8 0 1 10 2 3 10 10 FL1-H: CD45RA FITC 10 CD3+CD4+ MAL01003701.003 Event Count: 11885 10 4 0 10 10 0 1 10 2 3 10 10 FL3-H: CD3 PerCP Lymphocytes MAL01003701.006 Event Count: 28792 10 4 0 10 36.4 0 3.2 1 10 2 3 10 10 FL4-H: HLADr APC 10 4 CD3 CD4 MAL01003701.005 Event Count: 11730 Figure 4 : Analyse à l’aide du logiciel FlowJo Treestar. Images Laboratoire SEREFO. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 51 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 7-4. Saisie des données Elle a été faite sur le logiciel Excel 2003 7-5. Analyse statistique des données Les tests statistiques et les figures ont été réalisés sur le logiciel Graph Pad Prism 5. Le Mann-Whitney U test a servi pour la comparaison des médianes des poucentages et des valeurs absolues des cellules entre les deux groupes de notre étude. Nous avons considéré comme significatives les valeurs de P< 0,05. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 52 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). III- RESULTATS: 100 P<0.0001 % T CD4+ 80 60 40 20 0 VIH - VIH + VIH- : % TCD4+= 43,4 VIH+ : % TCD4+= 17 Le pourcentage des lymphocytes TCD4+ était bas comparativement aux témoins Figure 5 : Comparaison des médianes des pourcentages des lymphocytes T CD4+ des personnes infectées et non infectées par le VIH. P<0.0001 # T CD4+ 1500 1000 500 0 VIH - VIH- : # TCD4+= 955/mm3 VIH + VIH+: # TCD4+= 392/mm3 La valeur absolue des TCD4+ était significativement diminuée. Figure 6 : Comparaison des médianes des valeurs absolues des lymphocytes TCD4+ des personnes infectées et non infectées par le VIH. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 53 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 100 % T CD4 Naïfs 80 P=0.8 60 40 20 0 VIH - VIH + Chez les VIH- : % TCD4 naïfs= 28,3 Chez les VIH+ :% TCD4 naïfs= 22,6 La baisse de pourcentage des TCD4 naïfs n’était pas significative. Figure 7 : Comparaison des médianes des pourcentages des lymphocytes T CD4 Naïfs des personnes infectées et non infectées par le VIH. P=0.0032 500 # TCD4 Naïfs 400 300 200 100 0 VIH - VIH- : # TCD4 naïfs= 226/mm3 VIH + VIH+ : # TCD4 naïfs=83/mm3 La valeur absolue des lymphocytes TCD4 naïfs était en baisse significative. Figure 8 : Comparaison des médianes des valeurs absolues des lymphocytes T CD4 Naïfs des personnes infectées et non infectées par le VIH. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 54 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 100 % T CD4 Activés 80 P=0.6 60 40 20 0 VIH - VIH + VIH- : %TCD4 Activés= 3,6 VIH+ : %TCD4 Activés= 8,9 La différence des pourcentages des lymphocytes TCD4 activés entre les deux groupes n’était pas significative. Figure 9 : Comparaison des médianes des pourcentages des lymphocytes T CD4 activés des personnes infectées et non infectées par le VIH. P=0.2 250 # T CD4 Activés 200 150 100 50 0 VIH - VIH- : #TCD4 Activés= 33/mm3 VIH + VIH+ : #TCD4 Activés=41/mm3 Il n’y avait pas de différence significative des valeurs absolues en termes de TCD4 activés. Figure 10 : Comparaison des médianes des valeurs absolues des lymphocytes T CD4 activés des personnes infectées et non infectées par le VIH. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 55 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). P<0.8 % T CD4 Mémoires 100 80 60 40 20 0 VIH - VIH + VIH- : %TCD4 Mémoires = 59,2 VIH+ : %TCD4 Mémoires = 56,5 Il n’y avait pas de différence significative des pourcentages des TCD4 mémoires. Figure 11: Comparaison des médianes des pourcentages des lymphocytes T CD4 mémoires des personnes infectées et non infectées par le VIH. 1000 # T CD4 Mémoires P<0.0001 800 600 400 200 0 VIH - VIH- : #TCD4 Mémoires = 553/mm3 VIH + VIH+ : #TCD4 Mémoires = 194/mm3 La valeur absolue des lymphocytes TCD4 mémoires était significativement diminuée Figure 12: Comparaison des médianes des valeurs absolues des lymphocytes T CD4 mémoires des personnes infectées et non infectées par le VIH. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 56 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). P<0.0001 100 % T CD8+ 80 60 40 20 0 VIH + VIH - VIH- : %TCD8+= 28,3 VIH+ : %TCD8+= 52,4 Les lymphocytes TCD8+ étaient augmentés chez les sujets VIH+. Figure 13: Comparaison des médianes des pourcentages des lymphocytes T CD8+ des personnes infectées et non infectées par le VIH. P=0.0014 4000 # T CD8+ 3000 2000 1000 0 VIH - VIH- : #TCD8+= 616/mm3 VIH + VIH+: #TCD8+= 1290/mm3 La valeur absolue des lymphocytes TCD8+ étaient augmentés chez les patients infectés par le VIH. Figure 14 : Comparaison des médianes des valeurs absolues des lymphocytes T CD8+ des personnes infectées et non infectées par le VIH. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 57 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 100 P<0.0001 % T CD8 Activés 80 60 40 20 0 VIH - VIH- : %TCD8 Activés = 8,5 VIH + VIH+ : %TCD8 Activés = 30,8 Le pourcentage des lymphocytes TCD8 activés est significativement augmenté chez les patients infectés par le VIH. Figure 15 : Comparaison des médianes des pourcentages des lymphocytes T CD8 activés des personnes infectées et non infectées par le VIH. 2000 # T CD8 Activés P<0.0005 1500 1000 500 0 VIH - VIH- : #TCD8 Activées = 48/mm3 VIH + VIH+ : #TCD8 Activées = 290/mm3 La valeur absolue des lymphocytes TCD8 activés était significativement augmentée chez les patients infectés par le VIH. Figure 16 : Comparaison des médianes des valeurs absolues des lymphocytes T CD8 activés des personnes infectées et non infectées par le VIH Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 58 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). % Lympocytes B 100 80 60 P= 0,2 40 20 0 VIH + VIH - VIH- : % Lymphocytes B= 13 VIH+: % Lymphocytes B= 10 Il n’y avait pas de différence significative entre les pourcentages des lymphocytes B des sujets infectés et non infectés. Figure 17 : Comparaison des médianes des pourcentages des lymphocytes B des personnes infectées et non infectées par le VIH. P= 0,03 # Lymohocytes B 600 400 200 0 VIH - VIH- : # Lymphocytes B= 251/mm3 VIH + VIH+: # Lymphocytes B= 190/mm3 Les lymphocytes B étaient significativement diminués chez les patients infectés par le VIH. Figure 18 : Comparaison des médianes des valeurs absolues des lymphocytes B des personnes infectées et non infectées par le VIH. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 59 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 100 % NK 80 60 P= 0,6 40 20 0 VIH- VIH+ VIH- : % NK= 14,1 VIH+ : % NK= 15,9 Il n’y avait pas de différence significatives de pourcentage des cellules NK des personnes infectées et non infectées Figure 19: Comparaison des médianes des pourcentages des cellules NK des personnes infectées et non infectées par le VIH. 1500 P= 0,2 # NK 1000 500 0 VIHVIH- : # NK= 343/mm3 VIH+ VIH+: # NK= 312/mm3 Il n’y avait pas de différence significative entre les valeurs absolues des NK chez les sujets infectés et non infectés par le VIH. Figure 20 : Comparaison des médianes des valeurs absolues des cellules NK des personnes infectées et non infectées par le VIH. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 60 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). VI- DISCUSSION Cette investigation descriptive des sous populations lymphocytaires et NK chez les personnes infectées et non infectées par le virus de l’immunodéficience humaine au MALI a été effectuée chez 30 personnes. Des modifications quantitatives des paramètres étudiés ont été observées chez nos patients. En effet nous avons observé une lymphopénie portant sur TCD4+, et les cellules B, une lymphocytose TCD8+. Les modifications de la sous population NK chez nos patients n’étaient pas très marquées. Les travaux sur les manifestations immunologiques du VIH sont nombreux dans la littérature certes, mais seulement sur les lymphocytes TCD4+ et TCD8+ et nous n’en avons pas trouvé assez se rapportant spécifiquement aux cellules B et NK. Cette insuffisance justifie notre travail dont les résultats pourraient servir à enrichir la littérature mais aussi à aider à concevoir un protocole de recherche plus avancé sur cette question difficile. A- La méthodologie utilisée La force essentielle de notre étude résidait dans la rigueur des investigations qui se sont déroulées dans un laboratoire certifié conforme aux normes internationales de niveau 2 et 3 de sécurité. Les équipements et les réactifs utilisés répondent également à des normes et un mode opératoire standardisé (SOP). Cependant la faiblesse de cette étude pourrait être la taille de l’échantillon certes suffisant mais aurait gagné à s’élargir. Nous étions malheureusement tenus par le temps. Il nous semble en conséquence nécessaire qu’une étude de plus grande envergure soit entreprise pour confirmer les résultats de notre étude qui est préliminaire. Au cours de cette étude nous avons confirmé tous les cas d’infections par le VIH à l’aide du NEW LAV BLOT I. Ceci nous a permis d’inclure dans notre étude seulement les vrais positifs et les vrais négatifs. Le dénombrement des sous populations a été réalisé par cytométrie de flux, ce qui a permis une analyse des différentes cellules d’un même prélèvement sous plusieurs dimensions (la taille, la granularité, intensités de fluorescence) Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 61 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). C’est cette même cytométrie en flux qui a été utilisée pour toutes les sous populations lymphocytaires et les cellules NK. B- Les résultats obtenus 1- Les lymphocytes TCD4+ Nous avons constaté une baisse significative des cellules TCD4+ chez nos malades en terme de pourcentage et de valeur absolue (figure 5 et 6). CAZENAVE et al. [59] trouvaient que l’infection par le VIH entrainait une diminution qualitative et quantitative des TCD4+. CARCELAIN et al. [60] trouvaient que les anomalies observées au cours de l’infection à VIH sont dominées par un déficit à la fois qualitatif et quantitatif des lymphocytes TCD4+ et que chez la plupart des patients séropositifs la valeur absolue et le pourcentage de TCD4+ diminuent progressivement au cours du temps. Tous ces auteurs s’accordent à mettre en évidence la lymphopénie TCD4+. Ce qui témoigne de la fiabilité de nos résultats. En effet cette déplétion des lymphocytes TCD4+ est l’une des caractéristiques majeures de l’infection par le VIH et est largement rapportée [61]. 1-1 Les lymphocytes T CD4 naïfs Parmi les cellules TCD4 naïves une diminution de leur nombre a été observée (figure 8). Cela se confirme par les résultats de DIGHIERO et VUILLIER [62] qui ont signalé un déficit prolifératif des lymphocytes TCD4 naïfs lors de l’infection par le VIH. 1-2 Les lymphocytes TCD4 activés Parlant des lymphocytes TCD4 activés il n’y avait pas de variations significatives de leur nombre et de leur pourcentage chez nos malades (figure 9 et 10). PANTELA et al. [63] ont observé que les TCD4+ étaient infectés et constamment détruits par le VIH. Nos résultats pourraient s’expliquer par les observations de PANTELLA et al. [63]. En effet au fur et à mesure que l’infection par le VIH progresse les lymphocytes TCD4 activés augmentent. Cependant leur augmentation serait influencée par leur destruction massive. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 62 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 1-3- Les lymphocytes T CD4 mémoires Nous avons aussi remarqué que les lymphocytes T CD4 mémoires ne semblaient pas varier significativement en proportion des différentes catégories de T mémoires (figure 11). Cependant, nous avons constaté une chute de leur nombre chez nos malades (figure 12). Ce résultat serait différent des observations de ROUZIOU [64] selon lesquelles les cellules mémoires sont conservées. Par ailleurs le système immunitaire les protège pour maintenir la mémoire immunitaire. 2- Les lymphocytes TCD8+ Les lymphocytes TCD8+ et TCD8 activés ont été augmentés chez les patients séropositifs en pourcentage et en valeur absolue (figures 13, 14,15, 16). SADOU [65] a fait la même observation avec un nombre de lymphocytes TCD8+ à 1309/mm3 lors de la première numération et à 1328/mm3 lors de la troisième numération. Ces résultats se comprennent aisément car on sait que dès les trois premières semaines de la primoinfection a lieu une hyperlymphocytose portant surtout sur les lymphocytes TCD8+ [66]. 3- les lymphocytes B De nos résultats, nous avons remarqué une chute des cellules B en pourcentage et en valeur absolue (figures 17 et 18). GALANAUD et FRANCOIS [67] ont démontré que le VIH induisait précocement au cours de l’infection une hyperactivation polyclonale B. Dans notre étude la baisse de lymphocytes B pourrait s’expliquer par le fait que les lymphocytes B constitueraient une cible potentielle du VIH [68]. Nous pensons également que la lymphopénie T participerait à inhiber l’activation polyclonale B, en ce sens que les cellules TCD4+ jouent un rôle important dans la production de facteurs de croissance et de différenciation des lymphocytes B. 4- Les cellules NK Pour les cellules NK nous avons constaté une légère augmentation en pourcentage chez les patients infectés par le VIH (figure19). Cependant il n’y avait pas de différences significatives de pourcentage et de valeur absolue entre les deux Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 63 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). groupes notre étude (figure 20). Notre résultat serait différent de celui de SCOTTALGARA. [69] qui a montré que chez certains individus, lors d’une infection par le VIH il y a une expansion de la sous-population NK. Nous pensons que la prolifération des cellules NK pourrait être perturbée par la déplétion de TCD4+ au cours de l’infection par le VIH. Aussi la diminution des cellules NK observée dans notre étude pourrait s’expliquer par la destruction de certaines cellules NK qui exprimeraient les récepteurs d’entrée du virus [70]. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 64 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). V-CONCLUSION Il s’agissait d’une investigation descriptive des sous populations lymphocytaires et des cellules NK s’étendant sur 1 an et portant sur 30 sujets venant des Centres de Santé de Référence des 6 communes de Bamako et du Centre National de Transfusion Sanguine. Notre objectif général était d’étudier la fréquence des sous populations lymphocytaires et cellules NK chez les personnes infectées par le VIH. Au terme de ce travail nous avons pu observer que : La lymphopénie TCD4+ était de règle chez nos malades, avec un taux médian à 17% et une valeur absolue à 392/mm3 contre 43,4% et 955/ mm3 pour les sujets sains. La lymphocytose TCD8+ était évidente avec un taux (52,4%) et une valeur absolue (1290/ mm3) nettement supérieurs à ceux de nos témoins (28,3% et 616/ mm3). La lymphopénie B chez nos malades était significative avec un taux médian à 10% et une valeur absolue à 190/mm3 (contre 13% et 251/ mm3 pour nos témoins). La modification du nombre absolu des cellules NK au cours de l’infection par le VIH était légère (312 cellules NK chez les malades contre 343 chez les personnes indemnes de VIH). Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 65 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). VI- RECOMMANDATIONS Au terme de notre étude et vu nos résultats, nous pouvons formuler les recommandations suivantes : 1- Aux chercheurs Reprendre l’étude sur un échantillon de taille plus grande. 2- A l’Autorité Universitaire Appuyer les chercheurs pour continuer cette recherche. 3- Au Département de la Santé Inscrire dans le schéma de prise en charge le suivi des sous populations lymphocytaires et NK. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 66 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). 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QUESTIONNAIRE TYPE ADMINISTRE AUX DONNEURS DE SANG DU CNTS DE BAMAKO Pour être donneur de sang il faut remplir les conditions ci-après : HOMMES : - Etre âgé au moins de 18 ans ; - Ne pas être âgé de plus de 60 ans ; - Avoir au moins 55 kilogrammes comme poids ; - N’avoir pas effectué de don de sang les 3 derniers mois, ou été hospitalisé ; - Ne pas être sous traitement pour certaines maladies telles que le diabète et l’hypertension, - Accepter l’examen physique avant le don de sang, - Avoir un bon examen clinique après la visite du médecin de collecte ; - Accepter de recevoir les résultats des tests biologiques de validation du don de sang. FEMMES : Pour les femmes en plus des critères ci- dessus cités chez l’homme il faut : - Ne pas être en cycle menstruel ; - Ne pas entrain d’allaiter un enfant ; - Ne pas être enceinte. Ce sont autant de mesures qui visent à réduire la transmission des maladies infectieuses par la transfusion sanguine au CNTS de Bamako. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 76 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). FICHE SIGNALETIQUE Nom : Koné Prénom : Drissa Titre de la thèse : Les sous-populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). Année : 2007 – 2008 Pays : Mali Ville de soutenance : Bamako Lieu de dépôt : Bibliothèque de la Faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odonto – stomatologie Secteur d’intérêt : Immunologie, virologie. RESUME L'infection par le VIH entraine dès les phases initiales de graves perturbations dans les compartiments lymphocytaires et des cellules NK (Natural Killer). C'est dans ce cadre que nous avons entrepris ce travail dont le but est de préciser la proportion des sous populations lymphocytaires et des cellules NK chez les patients infectés par le VIH à Bamako. Cette étude menée de juin 2007 à mai 2008 au Laboratoire de SEREFO a porté sur 30 sujets dont 15 infectés par le VIH et 15 non infectés. L'Immunophénotypage réalisé par cytométrie de flux chez tous les sujets nous a permis de déterminer le pourcentage et la valeur absolue des différentes cellules étudiées. La comparaison des résultats obtenus chez les patients VIH+ et chez les sujets témoins VIH-, nous a permis de montrer que chez les patients VIH+ il y avait des anomalies quantitatives dominées par: - Un déficit profond des lymphocytes TCD4+. - Une diminution significative de la sous population B et légère des cellules NK (Natural Killer). - Une hyperlymphocytose TCD8+. Mots Clés : Sous populations lymphocytaires; NK; VIH; Immunophénoptypage, cytométrie de flux. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 77 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). SHEET Name: Koné First Name: Drissa Thesis title: Sub-lymphocyte populations and NK cells (Natural Killer) among HIVinfected patients in Bamako (Mali). Year: 2007 - 2008 Country: Mali City of oral examination: Bamako Place of deposit: Library of Faculty of Medecine, Pharmacy and Odonto stomatology SUMMARY HIV infection at the first stages causes serious disturbances in the subpopulation of lymphocytes and NK (Natural Killer) cells In this context, we have undertaken this work which aims to clarify the frequency of each subpopulation of cells in HIV infected with HIV in Bamako. This study conducted from June 2007 to May 2008 at the SEREFO‘s Laboratory focused on 30 subjects including 15 HIV-infected persons and 15 uninfected people. We performed flow cytometry with all the blood samples from these 30 people. We could show that there is in HIV infected patients: - A deep deficiency of TCD4+ cells - A significant decrease of B cells - A slightly decrease of NK cells - A very high level of TCD8+ subpopulation. Key words: lymphocytes, subpopulation, NK; HIV, flow cytometry. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 78 Les sous populations lymphocytaires et les cellules NK (Natural Killer) chez les patients infectés par le VIH à Bamako (Mali). SERMENT DE GALIEN Je jure en présence des maîtres de cette Faculté, des conseils de l’ordre des pharmaciens et de mes condisciples : - d’honorer ceux qui m’ont instruit dans les préceptes de mon art et de leur témoigner ma reconnaissance en restant fidèle à leur enseignement ; - d’exercer dans l’intérêt de la santé publique, ma profession avec conscience et de respecter non seulement la législation en vigueur, mais aussi les règles de l’honneur, de la probité et du désintéressement ; - de ne jamais oublier ma responsabilité et mes devoirs envers le malade et sa dignité humaine ; - en aucun cas, je ne consentirai à utiliser mes connaissances et mon état pour corrompre les mœurs et favoriser les actes criminels. Que les hommes m’accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses. Que je sois couvert d’opprobre et méprisée de mes confrères si j’y manque. Thèse de pharmacie, Drissa KONE. 79