Plateau technique Imagerie cellulaire IFR141 – ITFM
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Plateau technique Imagerie cellulaire IFR141 – ITFM Responsable Scientifique : Pr C. Poüs Responsable du service : Valérie Nicolas « Principe de la microscopie confocale à balayage laser» Formation permanente INSERM 15 au 19 Janvier 2007 Valérie Nicolas IFR141- ITFM Microscope confocal à balayage laser (LSM 510 Zeiss - META) Le plan I- Microscopie confocale à balayage laser : A- Pourquoi confocal B- Résolutions spatiales, rôle du pinhole C- Le principe de la microscopie à balayage laser D- Les coupes optiques II- Du laser à l’image numérique : A- Les lasers B- AOTF / AOBS (Syst. de Sélection / Réglage d’intensité des raies laser) C- La tête confocale D- Les miroirs de balayage E- Le pinhole F- Les photomultiplicateurs G- L’image numérique H- Les règles d’échantillonnage I- Le rapport signal sur bruit I - Microscopie confocale à balayage laser Le principe Microscope à épifluorescence Microscope confocal Cardiomyocyte néonatal de rat Pourquoi Confocal ? Pinhole Illumination Pinhole Détection Echantillon Condenseur Objectif Principe de la microscopie confocale selon Marvin Minsky 1957 Microscopie confocale : Le principe Pinhole 1er mot clé L’élément important : le pinhole (trou d’aiguille) Résolution d’un système optique Conventionnel dxy = 0,61.λem/(n sinα) dxz = 2.nλem/(n sinα)2 Confocal dxy = 0,46.λem/(n sinα) (+1 à 15%) dxz = 1,4.nλem/(n sinα)2 (+30%) François Waharte - IBL/ICF La résolution spatiale • Résolution x, y ( 1 -15% meilleure qu'en fluorescence non confocale ) • Résolution z ( 30 % meilleure qu'en fluorescence non confocale ) rx= 0.46λ ON X,Y Exemple : à 500 nm Objectif 63X, 1.4 ON (immersion oil ) 1 , 4 n λ rz = ON² Résolution X, Y : 160 nm X,Z Résolution X, Z : 500 nm Microscopie confocale Laser continu HeNe 543 nm Double cône de lumière Monophoton Laser Pulsé fs NdYLF 1047 nm Un point focal Deux photons Microscopie confocale : Le principe Pinhole Détecteur de photons Pinhole Miroir dichroïque Source lumineuse Plan focal Double cône de lumière Objectif Détecteur de photons Détecteur de photons Pinhole Miroir dichroïque Source lumineuse Source lumineuse Miroir dichroïque Objectif Objectif Plan focal Plan focal Formation d’une image - Balayage Excitation laser 488nm (bleu) Emission fluorescence verte Y 480 pixels X François Waharte - IBL/ICF 512 pixels Microscopie confocale : Acquisition des images François Waharte - IBL/ICF Microscopie confocale : Acquisition des images Z #1 #2 #3 #4 #5 #6 #1 #2 #3 #4 #5 #6 2ième mot clé Coupes optiques ou Z stack Cellules Wif B Immunomarquage ZO1 (jonctions serrées) DPP IV (pôle apical) Deux canalicules biliaires Doris Cassio – U442 INSERM Wif-B DPP IV ZO-1 Coupes optiques dans l’épaisseur de l ’échantillon 63X /ON 1.4 huile Coupes optiques : 0.8µm Pas : 0.4 µm Wif-B DPP IV Ex : Laser 488nm Em : BP 505-550 nm ZO-1 Ex : Laser 543 nm Em: LP 560 nm 63X /ON 1.4 huile Coupes optiques : 0.8µm Pas : 0.4 µm Projection Visualisation 3D 12 images / sec 4D imaging: 3D + time Axe Z Plan 1 Plan 2 ... Plan 1 Plan 2 ... Plan 1 Plan 2 ... Plan 8 Plan 9 Plan 8 Plan 9 Plan 8 Plan 9 Axe Z Axe Z T=0 T=15 T=30 François Waharte - IBL/ICF LES CELLULES CACO-2 Issues d ’un adénocarcinome colique humain Différenciation spontanée à la confluence phénotype d’entérocyte Expriment la plupart des hydrolases Bon modèle d’étude des modifications fonctionnelles induites par les Rotavirus Unité INSERM 510 / Sandra Martin Vue orthogonale Représentation orthogonale Selon l’Axe 2 Axe 2 Représentation orthogonale Selon l’Axe 1 Axe 1 Cellules épithéliales polarisées (Caco 2) Cellules épithéliales intestinales humaines COUPES XZ (Caco-2) en culture (25 jours après confluence) sur filtre (Transwel). Les cellules sont traitées avec le TNF (10 ng/ml). A- Marquage de l’actine avec la phalloidinerhodamine (en rouge) B- Marquage apical de Pgp (P-glycoprotéine) avec l’utilisation d’un anticorps secondaire conjugué à un AlexaFluor 488 (en vert). C- Superposition des deux marquages. D- Image A en négatif. Il s’agit de coupes xz réalisées dans l’épaisseur de la couche cellulaire grâce à une ligne de scan Ces cellules polarisées ont ici une hauteur de 30 µm. Visualisation : DIC ou Nomarski II- Du laser à l’image numérique Les différents éléments de la microscopie confocale Les Lasers L’AOTF /AOBS La tête confocale Miroirs de balayage Le pinhole Le photomultiplicateur L’image numérique Microscopie confocale : Le principe Mise en place d’une configuration Exemple : FITC Filtre d’émission LP 505 nm Miroir dichroïque Echantillon Laser 488 nm DIC Microscopie confocale : Le principe Les lasers : light amplification by stimulated emission of radiation Amplification de Lumière par Emission Stimulée • Lasers (lumière monochromatique) • • • • • • • Plateau technique IFR141 Argon 25 mW 457nm - 488nm - 514nm Argon 100 mW 351nm - 361nm - 488nm - 514nm HeNe 543 nm HeNe 633 nm Kr/Ar 488 nm - 568 nm - 647 nm He/Cd 422 nm Diodes laser (405, 408, 440, 635, 640, 660, 685, 780, 785,830 nm) Rayonnement cohérent dans l’espace et dans le temps Laser : une longueur d’onde _ Lumière cohérente Les lasers : light amplification by stimulated emission of radiation Amplification de Lumière par Emission Stimulée Tube laser Miroir réfléchissant Miroir semi-transparent Faisceau laser Le principe du laser consiste à exciter les électrons d'un milieu, puis à y déclencher l'émission de photons en cascade, et à accumuler le rayonnement entre deux surfaces réfléchissantes avant de le relâcher sous forme de rayon AOTF Acousto Optical Tunable Filter Rayon ordre 0 Absorbeur acoustique CristalTeO2 Transducteur acoustique Source fréquences Radio variables (150-350MHz) = sélection λ (700nm-400nm) Puissance ( 0.5-3W)= intensité Système de déflection de raies spectrales AOTF Acousto Optical Tunable Filter AOBS Acousto-optical Beam splitter AOBS Acousto-optical Beam splitter Courbes de transmission En Bleu: triple dichroïque, bleu, vert, rouge En Rouge: AOBS® 488, 543, 633 nm Laser Hélium-Néon I Fibre optique Laser Hélium-Néon II Laser Argon Banc laser Tête confocale Fibre optique LSM 510 ZEISS Microscopie confocale : Architecture du LSM 510 • Trajet optique de la tête de balayage PMT Filtre d' émission Pinhole Fibre Optique Beam Splitter Scanners X&Y Microscopie confocale : Architecture du SP2, Leica Trajet optique de la tête de balayage Microscopie confocale : Architecture du SP2, Leica Microscopie confocale : Architecture du SP2, Leica Canal bleu Pinhole Prisme Canal vert Canal rouge Détail : fente variable Détail de la tête confocale Microscopie confocale : Acquisition des images Scanning Laser Scanner Y Scanner X Y X Le zoom électronique Miroirs de balayage Laser Image de 512 X 512 Exemple : Zoom 1 = champ de 146 µm X 146 µm Zoom 2 = champ de 73.1µm X 73.1 µm Microscopie confocale : Le principe Pinhole L’élément important : le pinhole (trou d’épingle) Microscopie confocale : Le principe Photomultiplicateur Détecteur de photons : Photomultiplicateur Photomultiplicateurs sur les microscopes Leica SP2 1000 R6358 Red/White 0.15 first channel R6357 0.4 Cathode radiant sensitivity (mAW) - - - - Quantum efficiency(%) Hamamatsu Photomultipliers 100 10 0.1 100 200 300 400 500 600 700 Wavelength (nm) La sensibilité de l’oeil 800 900 1000 Acquisition des images PMT (photomultiplicateur) D’un photon à une avalanche d’électrons Fluorescence photons e- François Waharte - IBL/ICF Gain (V) Amplification Signal analogique Numérisation (image) Acquisition spectrale Photomultiplicateur Multianodes 32 canaux de détection 10.7 nm X 32 Système META, Zeiss Module META (Détection spectale) Imagerie en multifluorescence - Acquisition de plusieurs signaux simultanément (FPs etc.) jusqu’à 8 marqueurs - Séparation propre de composés fluorescents sans risque de crosstalk - Imagerie Quantitative en fluorescence (colocalisation) - Suivi de modifications de spectres en dynamique (FRET, ion indicators, Kaede) bleu de Nile rouge de nile UMR 8612- Physico-Chimie des systèmes, polyphasés- Mr Ollivon, Hela Gliguem Microscopie confocale : Acquisition des images Signal analogique (U en V) PMT Photons Objectif C.A.N. Signal numérique (NG codé sur 8,12 bit) RAM Ecran, DD. Qu’est-ce qu’une image numérique ? • Un tableau de nombres • Cases = Pixels (Picture Element) ou Voxels en 3D • Valeurs = Niveaux de Gris (NG) = intensité lumineuse Chaque pixel est codé en bit (binary digit) • En général codés sur 8 bits soit 28=256 niveaux de gris allant du noir absolu au blanc parfait. Formation d’une image numérique 0 29 Pixel numerisation Y 480 X François Waharte - IBL/ICF 512 pixel : picture element Règlage de la dynamique Utilisation d’une LUT (Look Up Table) 256 niveaux de gris = Image 8 bit 4096 niveaux de gris = Image 12 bit 65 536 niveaux de gris = Image 16 bit Pixels Bleus = zéro fluorescence Pixels Rouges = saturation Range Indicator Glow scale Rainbow Règlage de la dynamique Utilisation d’une LUT (Look Up Table) Sensibilité du détecteur Gain Saturation de fluorescence Offset Zéro fluorescence Qu’est-ce qu’une image numérique ? Taille (pixels) 512 X 512 1024 X 1024 2048 X 2048 8 bit 8 bit 8 bit Dimension L : 8.67 cm H : 8.67 cm L : 17.34 cm H : 17.34 cm L : 34.68 cm H : 34.68 cm Résolution 150 pixels/pouce 150 pixels/pouce 150 pixels/pouce Taille (octets) 257 Ko 1 Mo 4 Mo Avec Adobe Photoshop, allez dans « image » puis « taille de l’image » 3ième mot clé Régle d’échantillonnage Résolution de l’appareil / Taille du pixel Microscopie confocale : Résolution • Résolution x, y ( meilleure qu'en fluorescence non confocale ) • Résolution z (dépend du carré de l’Ouverture Numérique) rx= 0.46λ ON Exemple : X,Y Objectif 63X, 1.4 ON (immersion oil ) Résolution X, Y : 200 nm 1 , 4 n λ rz = ON² Résolution X, Z : 500 nm X,Z Règle d’échantillonnage bidimensionnelle (x,y) IF Signal analogique de deux points à résoudre 1 NYQUIST 0.5 0 -0.3 Taille r/2.3 Taille r -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 x pixels pixels Dans l ’idéal le pas d ’échantillonnage devrait être r /2.3 Exemple : obj.63X, NA 1.4 Résolution : 160-200 nm Taille du pixel : 80-100 nm Choisir la bonne taille de pixel 800 x 800 nm 200 x 200 nm 400 x 400 nm 100 x 100 nm François Waharte - IBL/ICF Taille du pixel et zoom électronique Résolution xy (µm) Taille du pixel r/2.3 (µm) Zoom optimal Objectifs Longueur d’onde (Émission nm) ON 63 X 500 1.4 0.16 0.07 4X 2X 1X 40 X 500 1.2 0.19 0.08 5.5 X 3X 1.5 X 20 X 500 0.75 0.3 0.13 7X 3X 1.7 X 10 X 500 0.30 0.77 0.33 6X 2.8 X 1.4 X 512X512 1024X1024 2048X2048 Echantillonnage en Z Coupe 1 Coupe 2 Epaisseur de la coupe optique Canal 2 Epaisseur de la coupe optique Canal 1 Pas de l’objectif 0.30 µm Echantillonnage en Z Epaisseur des coupes optiques : 0. 8µ µm Pas : 0.4 µm le diamètre du pinhole déplacement de l’objectif en Z Projection Visualisation 3D 12 images / sec Le rapport signal sur bruit Rapport signal sur bruit Pixel time 1.28s Moyennage 1 Pixel time 3.20 s Moyennage 1 Pixel time 3.20 s Moyennage 4 Rapport signal sur bruit Vitesse de scan Pixel time (s) Moyennage Conclusion - Obtenir des images de la localisation de protéines /autres molécules à l’aide de marqueurs fluorescents, en réalisant des séries de coupes optiques dans l’épaisseur de l’échantillon Multimarquage / Colocalisation - Rôle essentiel du pinhole (diaphragme de détection) Résolution xy : amélioration de 1_15 % /microscopie conventionnelle Résolution en Z : amélioration de 30% / coupes optiques / 3D - Suivi de processus dynamiques : GFP/ lasers / F-techniques … Time lapse 2D +temps; 4D (3D+temps) - Image numérique : Quantification, reconstruction 3D, tracking… FIN Valérie Nicolas IFR141- ITFM
