Les transferts d
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UE « Agents infectieux » DFGSM-3, 2ème semestre, année 2016-2017 Plasticité génomique Pr. Vincent Cattoir CHU de Rennes, Service de Bactériologie-Hygiène hospitalière Université de Rennes 1, Faculté de Médecine E-mail : [email protected] Mécanismes de plasticité génomique - Mutation / Restriction-modification - Recombinaison homologue - Recombinaison non-homologue : . Transposition . Recombinaison site-spécifique - Transfert horizontal de gènes : . Transformation . Transduction . Conjugaison Recombinaison non-homologue • Pas de séquenes homologues nécessaires pour la recombinaison (“recombinaison non légitime“) • Transposition - Transfert d‘un élément d‘ADN d‘un site donneur vers une région cible non homologue du génome - Evènement rare, fréquence 10-3–10-8 par génération - Insertion de l‘élément d‘ADN de façon aléatoire ou au niveau hot spots - Duplication possible de la séquence d‘intégration (“direct target repeat“) - Nécessite l‘action d‘une transposase, RecA-indépendante • Site-specific (integrative) recombination - Intégration au niveau d‘un site spécifique : séquence ADN consensus de 15-20 nt nécessaire à la recombinaison - Implique des interactions spécifiques protéines-ADN - Nécessite l‘action d‘une recombinase (résolvase/intégrase), RecAindépendante Eléments transposables Ø Chez les procaryotes, 2 types principaux d’éléments transposables : a. Insertion sequences (IS) b. Transposons (Tn) Séquences d’insertion (IS) Inverted repeats (IR) : similar but not identical nucleotide sequence (imperfect palindrome) for recognition site of the transposase. Caractéristiques d’une IS Transposase . IS simplest transposable elements (760 – 5000 bp) . Inverted repeats (IR): similar but not identical nt sequence (imperfect palindrome), short (9 – 41 bp) IRL IRR 20 families based on combinations of the following criteria: •1) similarities in genetic organisation (arrangement of open reading frames) •2) marked identities or similarities in their transposases (common domains or motifs); DDE Motif conserved •3) similar features of their ends (terminal IRs) •4) fate of the nucleotide sequence of their target sites (generation of a direct target duplication of determined length). Nombre d’IS rapportées 1600 Dec 2006 Nov 2004 : genome analysis 1200 1141 Mai 2005 1100 1000 1040 Jan 2005 914 Sept 2004 1999 : ISFinder: the begining Number of ISs 900 800 700 Mahillon and Chandler 1998 600 500 600 500 Galas and Chandler 1989 400 300 200 100 0 1 1968 20 1983 50 1989 1998 2001 2006 D’après http://www-is.biotoul.fr Nature des transposases d’IS 160 140 120 100 80 60 40 20 0 DDE Siguier (www-­IS.biotoul.fr) Distribution des IS Siguier et al., 2006 Mécanisme de transposition d’une IS • Transposase cuts target DNA (staggered nick), IS integrates, and gaps are filled by DNA polymerase and DNA ligase • Formation of direct repeats (DR) flanking the integrated IS Conséquences d’une insertion d’IS ü Integration of IS elements may: a. Disrupt coding sequences or regulatory regions b. Alter expression of nearby genes by the action of IS element promoters c. Cause deletions and inversions in adjacent DNA d. Serve as a site for crossing-over between duplicated IS elements Transposons • Transposon: mobile (transposable) DNA element that carries additional markers not required for transposition, e.g. antibiotic resistance • Classification - Class I transposons (composite): Flanked by 2 IS (e.g. Tn5). Mechanism: conservative transposition. - Class II transposons (non-composite): Flanked by 2 IR (e.g. Tn3, phage Mu). Mechanism: replicative transposition. Transposons composites ACGGA TGCCT IS ACGGA ACGGA TGCCT TGCCT ATGCA TACGT IS ATGCA TACGT IS ATGCA TACGT Target site Resistance gene IS ACGGA TGCCT Resistance gene DNA fragment : virulence, metabolic and resistance genes • • • • • • • • • Aminoglycosides ß-lactams Trimethoprime Macrolides Cyclines Chloramphenicol Glycopeptides Sulfamides Rifampicine Bacterial species : Gram (+), Gram (-) Formation d’un transposon composite IS ACGGA TGCCT ATGCA TACGT IS ATGCA TACGT ATGCA TACGT IS ATGCA TACGT Target site ACGGA TGCCT IS ACGGA TGCCT Resistance gene ACGGA TGCCT ATGCA TACGT IS ACGGA TGCCT ATGCA TACGT Resistance gene IS Transposons non-composites SRI IR tnpA IR tnpR bla IR : séquence inversée répétée tnpA : gène codant pour la transposase tnpR : gène codant pour la résolvase SRI : site de résolution interne bla : gène de résistance aux ß-lactamines Exemple : Tn1 tnpA res blaTEM-1 Transposition réplicative This type of transposition inserts a copy of the transposon at the target site while another copy remains at the donor site. Eléments intermédiaires = Co-intégrats Shapiro intermediate This structure forms by the fusion of two plasmids, one carrying a transposon, such that both junctions of the original plasmid are spanned by transposons with the same orientation (arrows). Transposons en « cascade » Tn1213 ISPa14 IRL tnpA ISPa12 blaPER-1 tnpR strA strB∆1 ISPa13 gst aphA6 ISPa14 strA strB IRR Qui ckT im e™ et un décompresseur T IFF ( LZW) sont requis pour visi onner cette i mage. Tn5393d IRL merRmerT merP merA orf1 merD orf2 res tnpA IRR tnpR Alcaligenes faecalis, Italy Mantengoli & Rossolini, AAC 2005 Intégrons • • • Integron : integration of DNA (gene cassette) at specific site, requirements: integrase, attI (integration site), promoter to express genes integrated at attI Gene cassette : (resistance) gene usually lacking a promotor and containing a short sequence (59-base or attC element) allowing integration NB : RecA-independant 2 groupes d’intégrons Resistant integrons (RI) (Chromosome, plasmides) intI1 aacA4 dfrVI cmlA2 oxa9 qacED sul integrase 3’-conserved segment 5’-conserved segment Super-integrons (SI) (Chromosome) infC rpmI rplT IF3 L35 L20 intI integrase Intégrons de résistance Five “classes” of RIs • Share between 40-58% amino acid identity • All are associated with mobile DNA elements class 1 class 2 class 3 class 4 class 5 Tn21 family (most ubiquitous) G- : Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Burkholderia, Campylobacter, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Vibrio G+ : C. glutamicum, M. fortuitum Tn7 family G- : Acinetobacter, Shigella, Salmonella self-transmissible plasmid G- (Japan) : P. aeruginosa, A. xylosoxidans, P. putida, K. pneumoniae SXT element (V. cholerae) Compound transposon on a plasmid (V. salmonicida) • Carry at most 8 resistance cassettes (ex. In53) Intégrons de classe 1 Enterobacteriaceae intI1 P. aeruginosa veb1 aadB arr2 cmlA5 oxa10 aadA1 qacED1 sul1 orf5 intI1 IS1999 veb1 aadB arr2 cmlA5 oxa10 aadA1 qacED1 sul1 orf5 qacH aadB aacA1/orfG ÞblaVEB-1 is integron-located ÞIS1999 increases blaVEB-1 expression in P. aeruginosa Super-intégrons intI4 or VchintIA sto i fC n rpmI rplT IF3 L35 L20 integrase n mrhA 126 Kb, 179 cassettes, 3% of genome : VCR 121-123 nt RYYYAAC GTTRRRY inverse core site core site Most are 95% identical There are 3 major differences between MRIs and SIs: • Size (>20 gene cassettes) • The function of most SI cassettes are unknown • High degree og identity (>80%) observed between the SI attC sites (named VCRs) compared to the attC sites of MRIs Mazel, D et al (1998) Science 280:605; Heidelberg, Jet al. (2000) Nature 406:477; Rowe-Magnus et al. (1999) Res Mic 150:641 Gènes cassettes • most contain a single ORF • promoterless • all contain an attC site (59-base element) - integrase target attC site ICS variable region (RYYYAAC) CS (GTTRRRY) • the ICS is always complementary to the CS of the circularized cassette; they form imperfect inverted repeats Intégrons et transposons intI1 qacE D 1 sul1 orf5 Tn21 tnpA tnpR res tnpM urf2 E D A C P T R Les transferts d’information génétique • Transformation – vecteur : ADN – spectre d’hôte : intra- ou interespèce – efficacité : importante – distribution : restreinte • Transduction – vecteur : phage – spectre d’hôte : intra-espèce – efficacité : importante – distribution : ubiquitaire • Conjugaison – vecteur : plasmide – spectre d ’ hôte : intra- ou interespèce – efficacité : variable – distribution : ubiquitaire La transformation Définition : Transfert passif dans une cellule bactérienne d'ADN nu On distingue : - Transformation naturelle : exige état de compétence - Transformation artificielle : traitement chimique et/ou enzymatique de la paroi bactérienne Mise en évidence de la transformation naturelle chez le pneumocoque - 1928 Griffith - 1948 Avery : le principe transformant = l'ADN Expérience de Griffith Septicémie mortelle Pneumocoques du type S3 vivants injection Survie Pneumocoques du type S3 tués Survie Pneumocoques du type R vivants + Pneumocoques du type R vivants Pneumocoques du type S3 tués Septicémie mortelle Expérience de Avery + Pneumocoques du typeS3 tués Pneumocoques du typeR vivants Septicémie mortelle + Pneumocoques du typeR vivants ADN + Pneumocoques du typeR vivants Septicémie mortelle Pneumocoque du typeS3 + ADN Pneumocoque du typeS3 DNase Survie Les bactéries naturellement transformables : état de compétence Etat où la bactérie est capable de recevoir de l'ADN exogène Sous tendu par des mécanismes différents en fonction des espèces N. gonorrhoeae S. pneumoniae B. subtilis DO >40 espèces surtout: Pneumocoque Acinetobacter Neisseria 1 2 3 4 t Les bactéries naturellement transformables : principales étapes a. L'ADN : bicaténaire PM > 106 à 107 MDa origine variable b. 1ère étape :Fixation covalente à un complexe protéique membranaire : le "Transformasome" c. 2ème étape : Fragmentation de l'ADN (nucléases) d. 3ème étape : Entrée de l'ADN simple brin dans la bactérie e. 4ème étape : Devenir de l'ADN simple brin transformant dans la bactérie Devenir de l'information génétique échangée par transformation naturelle Processus de transformation durable : nécessité de larges homologies entre l'ADN exogène et endogène (recombinaison homologue) En règle générale : l'ADN provient de la même espèce bactérienne ou d'une espèce bactérienne proche Sur le plan génétique : la transformation correspond à un remplacement allélique : X X Délétion X X Insertion X X Remplacement Gènes mosaïques - variation antigénique chez le gonocoque - R aux pénicillines et sulfamides chez les Neisseria - résistance aux pénicillines chez le pneumocoque : Gènes mosaïques La transduction et la conversion lysogénique Définition : Transfert d'ADN bactérien d'une bactérie à une autre par l'intermédiaire d'un bactériophage Bactériophages : Transducteurs Particules transductrices : les particules phagiques qui contiennent de l'ADN bactérien Processus essentiellement intra-spécifique Plusieurs types de transductions : 1. 2. 3. 4. La La La La transduction généralisée transduction spécialisée. transduction abortive conversion lysogénique Cycles de multiplication d’un bactériophage Cycle lysogénique Cycle lytique La transduction a un potentiel limité aux espèces très proches, mais c’est un processus très efficace Efficacité : - liée, dans un certain nombre de cas, à la protection du DNA dans les particules virales - système de délivrance très performant - les phages sont très abondants, en milieu aquatique (103-108 phages / ml) => 108 phages / ml ≈ 1/3 population bactérienne sujette à une attaque virale / 24 h Cependant, peu d'évidence quand à l'importance réelle de ce phénomène dans l'acquisition de nouvelles fonctions Toutefois, bon nombre des « ilots de pathogénicité » des bactéries sont en fait hébergés par des prophages intégrés dans les chromosomes bactériens: c’est la conversion lysogénique La Conversion lysogénique Certains bactériophages portent dans leur génome les nouveaux caractères apportés Protéine Gène Bactériophage Gènes de Résistance methicillin-R mecA erythromycin-R erm …. Toxines extracellulaires Diphtérique tox diphteriae Neurotoxin C1 Shiga toxins stx1-stx2 Enterohemolysin hly2 Enterotoxine sea, b,…, m Exfoliative toxine A eta Toxine A, C, I, … speA, C, I Cholérique ctxAB …… Bactérie Staphylococcus spp, S. epidermidis, beta-phage Corynebacterium phage C1 H-19B PhiFC3208 Clostridium botulinum E. coli (EHEC) E. coli (EPEC) Staphylococcus aureus S. aureus Streptococcus pyogenes Vibrio cholerae phiETA CTX-phi Protéines modifiant l’antigénicité Protéines impliquées dans l’adhésion, l’invasion, la survie intracellulaire… La conjugaison Définition : Processus spécialisé qui implique un transfert unidirectionnel d ’ ADN d ’ une cellule donatrice à une cellule réceptrice, par un mécanisme requérant un contact spécifique. Deux classes de véhicules : - plasmides - transposons On observe souvent une synergie entre les véhicules, en particulier des transposons portés par des plasmides. Limites : - pour les plasmides, réplication et expression des fonctions de transfert. - pour les transposons, expression des fonctions de transfert. De façon générale, le transfert et l ’ expression des fonctions de transfert sont très finement régulées, vraisemblablement pour limiter la charge biosynthétique liée à ce processus. Les plasmides Caractéristiques des plasmides ü Molécules d’ADN circulaires ü Extra-chromosomiques ü Réplication autonome (réplicon) ü Transmis de façon stable au cours des divisions cellulaires ü Non indispensables à la bactérie-hôte ü Confèrent à la bactérie-hôte une grande souplesse génétique ü Présents chez la plupart des espèces bactériennes ü Très différents les uns des autres ü Taille variable de 1 à 400 kb Groupes d’incompatibilité des plasmides • Plasmide = réplicon DONC existence d ’ un système autonome de régulation pour son maintien à un niveau constant dans la cellule • Système de régulation à l ’ origine du phénomène d ’ incompatibilité et de contrôle du nombre de copies plasmidiques • Des plasmides incompatibles ne peuvent coexister dans la même cellule car leur réplication est soumise au même système de régulation • DONC plasmides classés en groupes d’incompatibilité (Inc) • Les plasmides du même groupe Inc présentent de fortes homologies ADN/ADN et sont fortement apparentés structuralement Types de plasmides Taille 1-70 kb ; Nbre copies>10 Taille >30 kb ; Nbre copies 1-3 Conjugaison Les transposons conjugatifs Ressemblent aux : ü Transposons car transposition avec intermédiaires circulaires, mais sans DR ü Plasmides car éléments circulaires extrachromosomiques; transfert d’une bactérie à l’autre par conjugaison (gènes tra); mais ne répliquent pas ü Phages car excision-intégration, comme le phage l, mais ne forment pas de particules virales ü Appelés maintenant « ICEs » (Integrative and Conjugative Elements) et font partie des « genomic islands » (ex. PAIs) Structure d’un transposon conjugatif Exemples de transposons conjugatifs Ilôts de résistance ← Contig 42 5’ partial TranspositionFAD-oxido Thioredoxine comM Transposase helper -reductase reductase arsC arsB arsR Arsenic resistance operon arsH arsC uspA merR Heavy metal lspA detoxification protein ← Contig 43 intI Partial intégrase aadB ← Contig 44 recG dhfrI qacED1 sulI cmlA aadB arr-2 cmlA tetR tetA lysR OXA-10 aadA qacED1 Transposase intI Partial intégrase aadB Contig 43 → Transposase strA Contig 44 → TransposaseTransposase intI Partial intégrase aadB qacED1 GCN5 Transposase Contig 45 → IS1999 VEB-1 bla bla Transposase dhfrA10 sulI sulI VEB-1 resistance integron merE merD merA merC Tn501 merP Tn501 merT merR tetR tetA pecM Transposase cat TransposaseTransposase Mercury resistance operon ← Contig 45 TransposaseTransposaseTransposaseTransposase RésolvaseTransposaseTransposase merR Heavy metal lspA detoxification protein Transposase sulI 3’-partial comM kanR Contig 46 → intI Partial intégrase aadB aac3 GCN5 aadA3 strB qacED1 sulI trbI 100 kb resistance island (Fournier et al., PLoS Genetics, 2006) aac6’
