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CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIR E BICÊTRE Génétique bactérienne et implications en bactériologie médicale • Génétique: Etude de l ’hérédité et des variations - Variations phénotypiques (propriétés observables, comportement de la bactérie, réversibles et non transmissibles) - Variations génotypiques (ensemble des déterminants génétiques d ’une cellule, séquence nucléotidique, irréversibles et transmissibles) Première résistance Evolution de la résistance aux antibiotiques Page ‹#› A. baumannii et la médiatisation Décembre 2003 La médiatisation « Evolution » Evolution » bactérienne aux antibiotiques Antibiotiques Mort Survie Mutation Acquisition de gène échange de matériel génétique Page ‹#› Evolution de la résistance acquise aux antibiotiques Modification qualitative du génome bactérien • Mutations Modification quantitative du gènome bactérien • Transfert d ’information génétique Modifications quantitative et qualitative du génome bactérien • Mutation dans un gène transféré Les mutations Définition: C’est un changement, spontané (ou provoqué par un agent mutagène, héréditaire, brusque, rare, indépendant et affecte la séquence nucléotidique (génome bactérien) Caractère des mutations: Spontanéité: lié au hasard, besoin de moyen sélectif Test de fluctuation de Luria et Delbrück, 1943 100ml culture diluée d’E. coli 50ml culture 16h 50 tubes de 1 ml culture 16h 109 bactéries 109 bactéries Gélose contenant de la Streptomycine Nombre constant de colonies Distribution aléatoire Mutation non induite Les mutations Discontinuité: Une seule étape: loi du tout ou rien (parfois il faut plusieurs mutations successives pour voir l’expression phénotypique des mutations. Ex: R aux fluoroquinolones (ciprofloxacine) Stabilité: Transmission à la descendance (possibilité de réversion) Rareté: fréquences faibles 10-6-10-9 Indépendance: un seul caractère affecté (si opéron ou gène régulateur => mutation pléiotrope). La mutation d’un caractère ne modifie pas la probabilité de mutation d’un autre caractère Page ‹#› La mutation à l’échelle moléculaire => Changement de la séquence nucléotidique • Mutations par substitution de base (mutations ponctuelles) - Transition: A-T --> G-C - Inversion: A-T --> T-A - Addition: ATCG --> ATGCG - Délétion: ATGCG--> ATCG Les mutations ponctuelles sont réversibles et peuvent être: - Silencieuses (ex: TCT (ser) --> TCC (ser)) - Létales (ex: TGC (cys) --> TGA (stop)) - Intermédiaires (ex: CTT (leu) --> ATT (ile) •Mutations par cassure des liaisons sucre-phosphate Ce type de mutation affecte une séquence de bases, est souvent létale et non réversible. Délétion (perte de plusieurs bases) Insertions (gain de plusieurs bases) Inversions (rare) La famille des TEMs: TEMs: mutations Bradford, Clin. Microbiol.Rev. 2001, 14; 933-51 Les transferts d’ d’information génétique • Transduction et Conversion vecteur : phage spectre d’hôte : intra-espèce efficacité : importante distribution : ubiquitaire • Transformation vecteur : ADN spectre d’hôte : intra- ou inter-espèce efficacité : importante distribution : restreinte • Conjugaison vecteur : plasmide spectre d’hôte : inter-espèce efficacité : variable distribution : ubiquitaire Page ‹#› La transformation Définition: Transfert passif dans une cellule bactérienne d'ADN nu. On distingue: - Transformation naturelle: exige état de compétence - Transformation artificielle: traitement chimique et/ou enzymatique de la paroi bactérienne Mise en évidence de la transformation naturelle chez le pneumocoque. - 1928 GRIFFITH - 1948 AVERY : le principe transformant = l'ADN. Expérience de Griffith Septicémie mortelle injection Pneumocoques du typeS3 vivants Survie Pneumocoques du typeS3 tués Survie Pneumocoques du typeR vivants + Pneumocoques du typeS3 tués Pneumocoques du typeR vivants Septicémie mortelle Expérience de Avery + Pneumocoques du typeS3 tués Pneumocoques du typeR vivants Septicémie mortelle + ADN Pneumocoques du typeR vivants + Pneumocoques du typeR vivants Septicémie mortelle Pneumocoque du typeS3 + ADN DNase Survie Pneumocoque du typeS3 Page ‹#› Les bactéries naturellement transformables : ETAT DE COMPÉTENCE Etat où la bactérie est capable de recevoir de l'ADN exogène. Sous tendu par des mécanismes différents en fonction des espèces. N. gonorrhoeae S. pneumoniae B. subtilis, S. sanguis H. influenzae DO 44 espèces dont; Streptococcus Enterococcus Staphylococcus Enterobacteriaceae Pseudomonas Acinetobacter Haemophilus Neisseria 1 2 3 4 t Les bactéries naturellement transformables : Principales étapes "Transformasome" a. L'ADN : bicaténaire PM > 106 à 107 Mégadaltons origine variable Binding b. 1ère étape :Fixation covalente à un complexe protéique membranaire : le "Transformasome" c. 2ème étape : Fragmentation de l'ADN (nucléases) Fragmentation Ds cleavage : B. subtilis S. pneumoniae d. 3ème étape : Entrée de l'ADN simple brin dans la bactérie e. 4ème étape : Devenir de l'ADN simple brin transformant dans la bactérie. Uptake 3' : B. subtilis : S. pneumoniae Devenir de l'information génétique échangée par transformation naturelle Processus de transformation durable : nécessité de larges homologies entre l'ADN exogène et endogène En règle générale : l'ADN provient de la même espèce bactérienne ou d'une espèce bactérienne proche Sur le plan génétique : la transformation correspond à un remplacement allélique Le résultat : mutations ponctuelles, délétions, insertions variation antigénique chez le gonocoque résistance aux pénicillines et sulfamides chez les Neisseria résistance aux pénicillines chez le pneumocoque Page ‹#› Délétion X X Insertion X X Remplacement X X Page ‹#› La transformation artificielle Principe : rendre les bactéries compétentes (aptes à recevoir de l'ADN). Importance en génie génétique. Traitement à froid par des solutions contenant des cations divalents (Chlorure de calcium). E. coli est alors transformable. L'ADN rentre sous forme double brin et le reste. Efficace que si l'ADN est capable de réplication autonome (réplicon). La transduction et la conversion lysogénique Définition : Transfert d'ADN bactérien d'une bactérie à une autre par l'intermédiaire d'un bactériophage. Bactériophages : Transducteurs Particules transductrices : les particules phagiques qui contiennent de l'ADN bactérien. Processus essentiellement intra spécifique Plusieurs types de transductions 1. La transduction généralisée 2. La transduction spécialisée. 3. La transduction abortive 4. La conversion lysogénique Cycle de multiplication d'un bactériophage virulent PÉNÉTRATION LIBÉRATION ASSEMBLAGE MULTIPLICATION Page ‹#› La transduction généralisée Transfert qui concerne n'importe quelle partie du génome bactérien Transducteurs : Des phages à ADN T4 et P1 chez E. coli P22 chez Salmonella typhimurium Infection d ’une bactérie A B Mécanisme de la transduction généralisée : * Fragmentation du génome bactérien au cours de la réplication virale (nucléases virales ou non spécifiques). Infection d ’une bactérie a b * 1/100 particules encapside de l'ADN bactérien. * Formation de particules transductrices infectieuses capable d'injecter l'ADN bactérien dans une autre cellule. a c Injection A B * Devenir de l'ADN transduit: remplacement allélique ou transfert de plasmides. Mécanisme de la transduction abortive : Les gènes transférés ne sont pas intégrés dans le chromosome (perte de l ’information génétique au cours des divisions cellulaires) b a b c B c Recombinaison A La transduction spécialisée Transfert qui ne concerne qu'une ou des régions bien particulières du génome bactérien. Repose sur les propriétés d'intégration et d'excision de certains bactériophages tempérés comme λ. Le bactériophage λ ne transfert que : • Les gènes nécessaires à la fermentation du galactose • ou à la synthèse de la biotine. Par excision aberrante deux types de particules transductrices: λgal et λ bio. λgal : perte de l'information génétique nécessaire à la synthèse de la queue + la tête (particule défectueuse). λbio : perte de gènes xis et int, plus de cycle lysogénique mais potentiel infectieux normal. La transduction a un potentiel limité aux espèces très proches, mais c'est un processus extrêmement efficace : Efficacité : - liée, dans un certain nombre de cas, à la protection du DNA dans les particules virales - système de délivrance très performant - les phages sont très abondants, en milieu aquatique on trouve entre 103 et 108 phages / ml. => 108 phages / ml ≈ 1/3 population bactérienne sujette à une attaque virale / 24 h. Cependant, peu d'évidence quand à l'importance réelle de ce phénomène dans l'acquisition de nouvelles fonctions - mécanisme impliqué pour l’acquisition de la toxine erythrogène et la variation antigénique chez les Streptocoques de groupe A Toutefois, bon nombre des «ilots de pathogénicité» des bactéries sont en fait hébergés par des prophages intégrés dans les chromosomes bactériens: c ’est la conversion lysogénique Page ‹#› La Conversion lysogénique Certains bactériophages portent dans leur génome les nouveaux caractères apportés. Protein Gene Bactériophage Gènes de Résistance methicillin-R mecA erythromycin-R erm …. Bactérie Staphylococcus spp, S. epidermidis, Toxines extracellulaires Diphtérique tox Neurotoxin C1 Shiga toxins stx1-stx2 Enterohemolysin hly2 Enterotoxine sea, b,…, m Exfoliative toxine A eta Toxine A, C, I, … speA, C, I Cholérique ctxAB …… Corynebacterium diphteriae Clostridium botulinum Escherichia coli (EHEC) E. coli (EPEC) Staphylococcus aureus S. aureus Streptococcus pyogenes Vibrio cholerae beta-phage phage C1 H-19B PhiFC3208 phiETA CTX-phi Protéines modifiant l ’antigénicité Protéines impliquées dans l ’invasion Protéines impliquées dans l ’adhésion Protéines impliquées dans la survie intracellulaire Etc…. La conjugaison Définition : Processus spécialisé qui implique un transfert unidirectionnel d’ADN d’une cellule donatrice à une cellule réceptrice, par un mécanisme requérant un contact spécifique. Deux classes de véhicules : - plasmides - transposons On observe souvent une synergie entre les véhicules, en particulier des transposons portés par des plasmides. Limites : - pour les plasmides, réplication et expression des fonctions de transfert. - pour les transposons, expression des fonctions de transfert. De façon générale, le transfert et l’expression des fonctions de transfert sont très finement régulées, vraisemblablement pour limiter la charge biosynthétique liée à ce processus. Mise en évidence: évidence: Exp. de Lederberg et Tatum (1946) A B - Traitement à la DNase =>Pas d’effet - Expérience du tube en U T-, L-, M+, B+ T+, L+, M-, B- A B Après quelques heures de contact T+, L+, M+, B+ Filtre en verre poreux Pas de recombinaison = > Besoin de contact Page ‹#› Le plasmide F ADN circulaire double brin Se réplique chez E. coli et Salmonella typhimurium Habituellement en situation extrachromosomique les bactéries males F+ Parfois en situation intrachromosomique les bactéries Hfr Transfert des bactéries F+ : seul F est transféré toutes les bactéries deviennent F+. Transfert bactéries Hfr : transfert de l’ADN chromosomique, le facteur étant transféré en dernier. Donor cell + Recipient cell Nicking and ligation at oriT Pilus binding + + Donor cells Active disaggregation (traS, traT) Recircularization Triggering of conjugal DNA metabolism Pilus retraction Unstable pair mating DNA transfer Donor conjugal DNA synthesis Stabilization ( traG, traN) Stable mating pair Résistance aux antibiotiques et déterminisme génétique Déterminisme génétique Mutation Plasmidique chromosoique + + Page ‹#› Mutation et transfert de plasmides E. coli E. coli CAZ K. pneumoniae CTX-M-18 CTX-M-19 K. pneumoniae pneumoniae-- CTX-M-19 Quinolones R Quinolones CTX-M-19 (Poirel et al., AAC, 2001, 45:3355) Mutation et transfert de plasmides E. coli (CTX-M-18) K. pneumoniae (CTX-M-19) Systèmes de transfert conjugatif à large spectre d'hôte • Gram-négatif – Plasmides IncP (RP4, RK2, etc) • Bacilles et coques à Gram-négatif (Tra+ , Rep+) • Bacilles et coques à Gram-positif bas GC% (Tra+, Rep-) • Sacharomyces cerevisiae (Tra+ , Rep-) – Plasmide IncQ (RSF1010) • Bacilles et coques à Gram-négatif (Mob+, Rep-+) • Bacilles à Gram-positif haut GC% (Mob+, Rep+ ) – Plasmide Ti • Plantes (Tra+ , Int+ ) Page ‹#› Systèmes de transfert conjugatif à large spectre d’ d’hôte • Gram-positif à bas GC% pAMß1/pIP501 (ermB) − Bacilles et coques à Gram-positif (bas GC%) • Tra+, Rep+ − Entérobactéries • Tra+, Rep- Tn916/Tn 1545 (aphA-3, ermB, tetM) − Bacilles et coques à Gram-positif (bas GC%) • Tra+, Int+ − Entérobactéries et Pseudomonas fluorescens • Tra+, Int+ Véhicules du transfert génétique : les plasmides La transposition Classification - Les séquences d'insertion et les transposons composites - La famille Tn3 - Les transposons conjugatifs. Page ‹#› Séquence d'insertion (ISs (ISs)) IRL IRR tnp IS : séquence d'insertion IR : séquence inversée répétée tnp : transposase Eléments transposables les plus simples, très répandus chez les bacéries à Gram négatif et à Gram positif. Plusieurs copies intégrées dans le chromosome ou dans un plasmide. mARN IS ATGCA TACGT Target site Transposase ATGCA TACGT IS ATGCA TACGT gene Genetic support of blaSHV genes (originating from Klebsiella pneumoniae) pneumoniae) Naas et al., al., AAC 1999 Mobilisation of resistance genes: genes: Composite transposons IS ACGGA TGCCT ATGCA TACGT IS ATGCA TACGT ATGCA TACGT IS ATGCA TACGT ATGCA TACGT IS Target site ACGGA TGCCT IS ACGGA TGCCT Resistance gene ACGGA TGCCT ATGCA TACGT IS ACGGA TGCCT Resistance gene Page ‹#› Transposons composites IR IR IS IR IR IS tnp tnp IS IR : séquence d'insertion : séquence inversée répétée tnp : transposase • • • • • • • • • Fragment d'ADN : gènes de virulence, gènes métabolique gènes de résistance Très nombreux chez les bactéries à Gram négatif : . Tn5 (5,7 kb, KmR) . Tn9 (2,6 kb, CmR) . Tn10 (9,3 kb, TcR) Aminoglycosides ß-lactamines Triméthoprime Macrolides Cyclines Chloramphenicol Glycopeptides Sulfamides Rifampicine Bacterial species : Gram (+), Gram (-) Transposons de type Tn3 SRI IR tnpA IR tnpR bla IR : séquence inversée répétée tnpA : gène codant pour la transposase tnpR : gène codant pour la résolvase SRI : site de résolution interne bla : gène de résistance aux ß-lactamines Très nombreux chez les bactéries : - à Gram négatif . Tn3 (4.9 kb, Ap) . Tn4 (20 kb, Ap, Sm, Su) . Tn1721 (10 kb,Tc) - à Gram positif . Tn551 (5.3 kb, Em) . Tn917 (5.2 kb, Em) Les systèmes de capture de gènes: les intégrons (1) P ant intI1 qacE∆ integrase attI sul1 3'- conserved segment attC resistance gene cassette (R gene) Int P ant intI1 attI R gene attC qacE∆ sul1 Page ‹#› Structure of veb1 containing integrons intI1 In55 qacH aadB aacA1/orfG veb1 aadB arr2 cmlA5 oxa10 aadA1 qacH aadB aacA1/orfG veb1 aadB arr2 cmlA5 oxa10 aadA1 qacEΔ1 sul1 IRi P. mirabilis Lil-1 IS26 In53 intI1 IS1999 IS2000 veb1 In50 orf5 IRi intI1 IS1999 veb1 intI1 veb1 aadB qacEΔ1 sul1 qacEΔ1 sul1 orf5 IS26 E. coli MG-1 orf5 P. aeruginosa JES P. aeruginosa pTh2 aadB arr2 cmlA-like aadB qacEΔ1 sul1 orf5 P. aeruginosa Kuwait Intégrons et transposons qacEΔ 1 sul1 orf5 intI1 Tn21 tnpA tnpR res tnpM urf2 E D A C P T R Intégrons, transposons et plasmides Tn2000 In53 IS26 TSD qacH intI1Δ pNLT-1 (160kb) IS26 aadA1 qacEΔ1 sul1 orf5 TSD TraC-2/3/4 Page ‹#› Conjugaison, transposition, capture de gène Gram-positif Gram-négatif Tn Tn Chr (donneur) Chr (réceptrice) Insertion d’un gène cassette Tn pTra Les transposons conjugatifs • Em-Tc DOT − spectre d’hôte étroit : Bacteroides fragilis − confère la résistance à la tétracycline (tetQ) − transfert induit par la tétracycline (X 104) • Tn916 − spectre d’hôte large : Bacilles et cocci à Gram positif − E. coli − P. fluorescens − confère la résistance à la tétracycline (tetM) − existence de variants contenant des marqueurs additionnels (ermB, aphA-3) Conclusions • Bactérie utilise tous les outils génétiques dont elle dispose pour évoluer dans un environnement hostile • « « Superbugs Superbugs » difficiles à éradiquer. Réversibilité ? • Nouveaux mécanismes d ’ accumulation de gènes de résistance (gram-négatifs) : intégrons Page ‹#›
