Imagerie endoscopique de fluorescence

22/03 BIOPATHOLOGIE TISSULAIRE ET EXPLORATIONS
IMAGERIE DE FLUORESCENCE : QUELQUES APPLICATIONS EN
BIOLOGIE ET MEDECINE
La fluorescence suppose l’absorption et l’émission de photons. C’est donc une technique radioactive.
1. Bases Physiques de la fluorescence
Interaction lumière/ matière :
 Mouvements dans la molécule
 Polarisabilité / polarisation
 Liaison chimique
Lumière = onde électromagnétique associée au photon
 Elle peut donc interagir avec les dipôles stables ou induits, et donc avec la matière
Quand un photon rencontre une molécule, il peut être :
 Réfléchi
 Transmis (il traverse)
 Et surtout absorbé
L’énergie du photon est E=hν.
2. L’absorbance UV-visible :
 Construction du spectre d’absorbance
o On regarde à différentes longueurs d’onde :
Spectre d’absorbance : Courbe des niveaux d’énergie pour lesquels le composé absorbe la lumière en fonction de la
longueur d’onde
C : cellule optique contenant un liquide qui doit être traversé. Caractérisée par une concentration. Une cellule peut y
être assimilée.
L’émission de radiations constitue la fluorescence. En effet une molécule ayant absorbé de l’énergie doit la réémettre.
On s’intéresse donc à ce qui est émis et pas ce qui traverse la cellule (c’est pourquoi le système d’enregistrement ne se
situe pas dans le même plan que le système émetteur).
3. La fluorescence :
Le spectre de fluorescence est équivalent au spectre d’absorption de la substance. La forme du spectre de
fluorescence ne dépend pas de la longueur d’onde d’excitation
Paramètres d’intérêt :
 L’intensité de fluorescence
 La distribution spectrale de la fluorescence
 Les longueurs d’ondes maximales Imax
 Le rendement quantique de fluorescence : phiF
o Phi F est le nombre émis / nombre de photons absorbés
 Multiples processus de « quenching » de ‘énergie de fluorescence (quenching : excitation désactivation /
inhibition)
Pas d’effet

fluorescence d’une molécule non isolée :
Le plus utilisé en biologie cellulaire : FRET
Extinction de fluorescence par FRET :
Le spectre de fluorescence de l’émetteur doit recouvrir partiellement le spectre d’absorption de la molécule réceptrice.
Ce phénomène est d’énergie entre deux dipôles qui ne dépend que de la distance entre les deux.
 multiples processus de « quenching » de l’énergie de fluorescence (= excitation, désactivation, inhibition
c’est un transfert d’excitation entre deux molécules voisines.
Le transfert se fait par un couplage dipôle – dipôle. Il s’agit d’un phenomène qui dépend de la distance entre les deux
fluorophores (l’accepteur et le donneur). On va exciter la molécule M et on observe dans certaines conditions de
concentration l’émission de la molécule Q.
 pas de contact entre M et Q
 dépend de la distance MQ en 1/Ro
 spectres de M et Q inchangés
La distance de Forster (Ro) est la distance pour laquelle l’efficacité de transfert est de 50% (50% de
quenching entre M et Q pour une distance Ro)
les fluorophores biologiques :
a-intrinsèques
On peut éventuellement utiliser le tryptophane et tyrosine, mais il est si peu spécifique qu’on ne l’utilise pas comme
sonde de fluorescence.
On utilise le NADH et NADPH qui sont plus spécifique, ils ont une auto fluorescence, on les utilise par exemple
comme marqueur de l’activité des mitochondries.
L’hème et la GFP( la Green Fluorescent Protein est la plus importante des molécules de fluorescente, on peut réaliser
des phénomènes de fusion entre la GFP et n’importe quelle molécule) sont utilisés comme marqueur. GFP, ECFP et
ECFP : très utilisé en microscopie sur cellules vivantes, survie de molécules uniques = outil fondamental
Toutes les biomolécules ne fluorescent pas à cause d’autres processus de désexcitation compétitifs
b-extrinsèques
Peu de molécules naturelles sont de bons fluorophores  on marque les molécules avec des fluorophores
additionnels :
(fluorophores :)acridine orange  (cible :)Adn et lysosome
4. La microscopie de fluorescence :
 Paramètres déterminant la qualité de l’image
-Source de lumière : laser lampes
-Marqueurs fluorescent : intrinsèque, extrinsèque
-Optique : objectif, lentille
-Détection : œil, caméra
 Propriétés requises pour des fluorophores utilisables comme marqueurs de fluorescence en microscopie
- Coefficient d’extinction molaire élevé
- Rendement quantique
- Brillance

Shift : déplacement en distance de la longueur d’onde
Les marqueurs vitaux :
- Cellules endothéliales pulmonaire bovine incubée simultanément avec Lyso Tracker Red et Mito –tracker
green à 37°C pendant 30 min
- Vague de calcium consécutive à la fécondation d’un ovocyte suivie en calcium green
Le microscope :
 Généralement dans un système afocal (image projetée à l’infini)
L’espace de travail est beaucoup plus important dans un microscope inversé : permet de visualiser un milieu de culture
entier et d’interagir dedans en même temps qu’on observe au microscope
Le microscope inversé : on a une platine et l’objectif sera en dessous, on aura a ce moment un espace de travail
beaucoup plus grand que dans le microscope droit. Ceci sera un très gros avantage.
5. Les différents microscopes :
Obtention d’un objet petit  grossissement
Localisation précise des structures -+ définition précise
Mesurer et localiser la fluorescence  système optique et détection
Microscope droit à épi fluorescence : on a besoin d’un système de filtre de façon à pouvoir visualiser la cellule en
absence de fluorescence et ensuite observer la fluorescence en l’excitant avec une lampe xénon. On a séparé la
lumière d’excitation de l’illumination classique pour observer la fluorescence.
Microscope inversé : la lampe mercure haute pression xénon permet d’exciter la fluorescence. On obtient sur
platine un espace suffisant pour observer la fluorescence.
Bloc de filtre (Ploem block) : on excite l’échantillon, normalement par diffusion on devrait tout recevoir sur l’œil ou
la caméra.
Effet de la diffraction : ceci gène l’observation. On a une diffraction avec interférence lumineuse et diffraction, càd
une image maximale et des rebonds sur les cotés. Il y aura aussi les phénomènes d’interférences classiques. Ceci est
mauvais pour l’image
Il faut atteindre l’intensité du floutage de cette image, on bouge légèrement verticalement le plan image. On utilise
des algorithmes pour éliminer les artefacts liés aux propriétés optiques. On a des algorithmes différents selon la
qualité de l’appareil
Type de fluorophore
Avantages
Inconvénients
Auto fluorescence
Intrinsèques
Non contrôlés
Souvent vue comme un pb in
vivo
Marqueurs fluorescent
Brillants, grande variété
spectrale
Grand décalages des spectres
Petite taille
Prot fluorescentes

Microscopie confocale a balayage
a. But
Effet de la diffraction : but de Microscopie confocale à balayage : amélioration de la définition axiale
 Amélioration du profil …
b. Montage
Effet du trou dépingle (focalisation) : on marque au laser pour obtenir une fluorescence.
On obtiendra un étalement à supprimer, pour ceci on s’arrange avec un diaphragme pour ne récupérer que limage
au plan frontal. On aura à ce moment un plan focal.
La déconvolution : excellente résolution à cout modéré.
Acquisition en empilement en Z (Z-stack)  pilotage précis en Z
Applications :
1- micro injections
Les micromanipulateurs Eppendorf installés sur le microscope à fluorescence inversé LEICA AM 6000 pour micro
injections dans les cellules vivantes en culture.
Métabolisme cellulaire :
Il faut utiliser la fluorescence du NADH, marqueur de l’activité métabolique.
Principe : micro injection d’un substrat du cycle de Krebs provoque la modification du rapport NAD (P)H/ NAD(P) à
niveau intracellulaire (NAD(P)H +NADP) constant.
On peut alors étudier la réponse à une substance exogène.
Forte production de NADH dans les fibroblastes de souris préalablement traités avec du DNP et micro injectés (t=0)
avec du malate, un des substrats clefs du cycle de Krebs
Le DNP-2.4 dinitrophénol – découple la phosphorylation oxydative mitochondriale ce qui conduit à une
augmentation rapide du NADH et de la consommation d’oxygène en parallèle à une faible formation d’ATP
Le DNP est un toxique majeur de l’environnement (gaz de voiture, pesticides) …
2- Le phénomène de FRET
On observe des interactions dans les cellules : substrat – enzyme ou enzyme –activation d’une voie intracellulaire.
La protéine RAC : est une petite protéine a qui on couple un GFP normal, a partir de la on voit comment cette
protéine activée par le GTP se lie a une autre protéine : protéine 21 (une kinase) et le problème c’est qu’on ne peut
pas utiliser cette protéine trop grande, on utilisera a ce moment le domaine de fixation de la protéine qui est très
fluorescent dans le rouge contrairement au GFP qui émet dans le vert. On obtient un phénomène de FRET.
Au niveau cellulaire : on a des fibroblastes
3- le phénomène de FRAP
Vitesse de réapparition de la fluorescence  vitesse de déplacement des fluorochromes
Courte distance, mouvements localisés
Avec l’intensité » laser on va blanchir une partie et on aura un trou de fluorescence. Pour regarder la mobilité de la
membrane on regarde comment les macromolécules vont revenir dans la zone irradiée.
Ex : KRAS (une GTPase).

6. Fluorescence in vivo
Photo diagnostic du cancer en phase précoce fondé sur la spectroscopie tissulaire de fluorescence.
Contexte médical :
Intérêt du diagnostic des lésions précancéreuses et cancéreuses précoces :
- Augmentation des chances de guérison
- Ttt moins agressifs
Technique de diagnostic actuel
- Examen endoscopique en lumière blanche
- Biopsies sur zones suspectes
- Examen microscopique du prélèvement anatomopathologique
Imagerie endoscopique de fluorescence :
Objectif :
- Information contenu dans les spectres sous forme d’une image
- Image de fluorescence de même taille et résolution spatiale que limage endoscopique conventionnelle
Axes de développement :
- Bronches : auto fluorescence NADPH
 Par exemple, facteur important des cycles mitochondriaux, du CytP450
- Vessie : ALA –PPIX
 Protoporphyrine IX
 Acide aminolévulinique
- Voies digestives : œsophage et colon
Etat de l’art :
- Recherche clinique active
- Système commercialement disponible pour les bronches et la vessie
Principe de l’imagerie d’auto fluorescence : fluorescence du NADH, utilisé comme marqueur de l’activité
métabolique
- Augmentation de la concentration globale de NADPH intracellulaire
- Modification du ration NADPH / NADP à niveau intracellulaire constant
- Augmentation de la fluorescence du NADH cohérent avec besoins accrus en énergie des cellules tumorales
remarque : dans une cellule tumorale on a un taux de NADPH qui est en général augmenté
Imagerie de fluorescence avec le 5 – ALA :
Acide alpha – aminolévumique (ou 5-ALA)
- Molécule non fluorescente
- Précurseur de la PPIS dans la synthèse de l’hème
- Pénétration limitée à l’épithélium
Administration de 5-ALA exogène
- Stimulation de la formation de PPIX
- Accumulation préférentielle de PPIX dans les cellules tumorales
Protoporphyrine IX (PPIX) fluorescente
- Absorption dans le violet lambda max = 410 nm
- Fluorescence dans le rouge l max = 365 nm
Application clinique principale : détection des carcinomes uréthéliaux superficiels
Détection des CIS de la vessie par imagerie de fluorescence (ALA)
Carcinome uréthéliaux superficiel