La spectrométrie de masse en tandem appliquée au dépistage
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abc revue générale Ann Biol Clin 2004, 62 : 269-77 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. La spectrométrie de masse en tandem appliquée au dépistage néonatal des maladies héréditaires du métabolisme : le point sur les utilisations actuelles D. S. C. I. C. Cheillan Cognat Vianey-Saban Maire Dorche Service de biochimie pédiatrique, Hôpital Debrousse, Lyon [email protected] Résumé. Les évolutions récentes de la spectrométrie de masse en tandem permettent actuellement le diagnostic de plus de vingt maladies héréditaires du métabolisme, à partir d’une seule tache de sang déposé sur papier. Il est ainsi techniquement possible de réaliser un dépistage néonatal de la plupart des déficits de la b-oxydation mitochondriale des acides gras, de quelques aciduries organiques et des principales amino-acidopathies et déficits du cycle de l’urée. De nombreuses études pilotes prospectives de dépistage néonatal utilisant cette technologie ont été instaurées à travers le monde depuis ces trois dernières années. Devant les enjeux techniques, économiques, médicaux et éthiques que ces applications représentent, cette revue propose de faire un point sur la spectrométrie de masse en tandem ainsi qu’une synthèse des résultats des principales études internationales. Mots clés : maladie héréditaire du métabolisme, dépistage néonatal, spectrométrie de masse en tandem Summary. The recent evolution of tandem mass spectrometry allows to diagnose more than twenty inherited metabolic diseases within a single blood spot. Nowadays, it is technically possible to screen newborns for most of fatty acid oxydation, organic acid and amino acid disorders. An important number of prospective pilot studies, using tandem mass spectrometry, have been done worldwide. However, several technical, economical, medical and ethical problems are raised by these applications. This review is intended to focus on this technology and to resume results from the main international studies. Article reçu le 9 octobre 2003, accepté le 9 décembre 2003 Key words: inherited metabolic disease, neonatal screening, tandem mass spectrometry Le dépistage néonatal des maladies héréditaires du métabolisme a été initié dans le milieu des années 1960 avec les travaux de Robert Guthrie sur la phénylcétonurie [1]. Au-delà de sa technique de mesure de la phénylalanine, le procédé de prélèvement de sang sur papier buvard a permis une application du dépistage au plus grand nombre. Les programmes de dépistage néonatal ont connu un essor considérable à travers le monde tout en diversifiant les pathologies recherchées. Tirés à part : D. Cheillan Ann Biol Clin, vol. 62, n° 3, mai-juin 2004 En France, actuellement, cinq maladies sont recherchées systématiquement à la naissance : la phénylcétonurie, l’hypothyroïdie congénitale, l’hyperplasie congénitale des surrénales, la drépanocytose (dans certaines populations à risque) et la mucoviscidose. Durant ces trente dernières années, le principe de base qui a prévalu dans la mise en place de tout nouveau programme de dépistage a été : une analyse ou un paramètre pour chaque maladie. Les évolutions techniques récentes de la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) vont probablement révolutionner dans le futur le monde du dépistage néonatal. En effet, cette nouvelle technologie permet, à partir d’une seule tache de sang, de mesurer différents métabolites dont les 269 revue générale acylcarnitines et les acides aminés sanguins. Le diagnostic de plus de vingt maladies héréditaires du métabolisme est ainsi possible. Les programmes de dépistage prospectifs intégrant la MS/MS ainsi que de nouveaux développements se multiplient dans de nombreux pays laissant à penser que la MS/MS sera un outil indispensable pour le dépistage néonatal de demain [2, 3]. Parmi les méthodes analytiques, la spectrométrie de masse possède de nombreuses qualités dont sa spécificité, sa grande sensibilité et la grande variété de ses applications. Le principe de base de toutes les techniques de spectrométrie de masse est l’analyse qualitative et quantitative d’un mélange complexe en séparant les molécules (préalablement ionisées) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) [4]. Composition d’un spectromètre de masse en tandem Un spectromètre de masse en tandem est composé d’une source permettant d’ioniser les substances d’intérêt, d’un analyseur comportant trois quadripôles en série et d’un détecteur couplé à un système informatique (figure 1). Les sources d’ionisation Les sources sont destinées à ioniser les substances à analyser par MS/MS. Dans le domaine de la biologie, les sources les plus utilisées sont le FAB (fast atom bombardement), l’ESI (electrospray ionisation) et le MALDI (matrix assisted laser desorption ionisation). Actuellement, le FAB n’est plus très répandu car il ne permet pas l’introduction automatisée d’échantillons. L’ESI est utilisé pour l’étude des petites molécules en milieu liquide et le MALDI pour l’étude des protéines. L’électrospray est produit par application à pression atmosphérique d’un fort champ électrique sur un liquide traversant un tube capillaire avec un faible débit (1 à 10 µL/min). À la sortie du capillaire, il se forme des gouttelettes hautement chargées dont le solvant s’évapore peu à peu. Les gouttelettes subis- Échantillon S Source d'ionisation Q1 Q2 Analyseur Q3 D D Abondance Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. La spectrométrie de masse en tandem m/z Détecteur Figure 1. Schéma d’un spectromètre de masse en tandem. Q1, Q2 et Q3 représentent les trois quadripôles placés en série qui composent l’analyseur. 270 sent alors une cascade de fissions aboutissant à la désorption des ions. Les ions en phase gazeuse sont dirigés dans l’analyseur par une série de lentilles électromagnétiques. Il est possible de produire des ions chargés positivement (ionisation en mode positif) ou des ions chargés négativement (ionisation en mode négatif). Le choix du mode d’ionisation est réalisé en fonction de la structure chimique de la substance d’intérêt : une molécule donnant préférentiellement des ions positifs ou des ions négatifs. Les analyseurs et le détecteur L’analyseur est formé de plusieurs quadripôles placés en série (3 en général). Un quadripôle est constitué de quatre électrodes de section hyperbolique où est appliqué un champ électrique constant et un champ électrique alternatif. Dans ce quadripôle, la stabilité de la trajectoire d’un ion soumis à ces champs électriques va être dépendante de sa masse et de sa charge. Il est ainsi possible de séparer les différents ions d’un mélange complexe en fonction de leur ratio masse/charge (m/z) [4]. Dans un spectromètre de masse en tandem, le premier quadripôle (Q1) isole l’ion parent de la molécule d’intérêt à partir d’un mélange complexe. Cet ion sélectionné est fragmenté dans une cellule de collision (deuxième quadripôle, Q2) pour donner des ions produits et des fragments neutres caractéristiques de la substance d’intérêt. Enfin, un troisième quadripôle (Q3) analyse les ions produits. Les données sont ensuite recueillies par un détecteur (en général un multiplicateur d’électrons) formant un courant électrique amplifié converti par un système informatique en spectres de masse directement exploitables par l’utilisateur. Les différents modes d’utilisation d’un spectromètre de masse L’analyse en MS/MS peut se faire selon quatre modes différents en fonction des molécules à étudier (figure 2). Le balayage des ions fragments (product ion scan) Cette approche consiste à injecter un échantillon, à sélectionner un ion précurseur correspondant à la molécule d’intérêt dans Q1, à le fragmenter en Q2 et à déterminer tous les ions produits en Q3. Ce mode est utilisé pour identifier une substance inconnue dans un mélange complexe. Le balayage des ions parents (precursor ion scan) Ce mode consiste à sélectionner un ion fragment en Q3 et à balayer en Q1 tous les ions parents donnant cet ion fils après fragmentation. Ce mode est utilisé pour identifier une famille de molécules ayant une partie de leur structure similaire (par exemple, obtenir le profil des acylcarnitines). Le balayage en perte neutre (neutral loss scan) Ce mode consiste à choisir un fragment neutre et à détecter toutes les fragmentations provoquant la perte de ce Ann Biol Clin, vol. 62, n° 3, mai-juin 2004 Spectrométrie de masse en tandem fragment. De la même façon que le mode précédent, il est possible d’identifier une famille de molécules partageant une structure chimique similaire. Une des applications de ce mode est le dosage semi-quantitatif des acides aminés. Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Le multi reaction monitoring (MRM) Ce mode permet de trier une ou plusieurs molécules ayant un ion précurseur et un ion fragment spécifique. On obtient ainsi des couples ions parents/ions fils très spécifiques d’une molécule. En utilisant ce mode, il est possible de quantifier simultanément de très nombreux composés ayant des structures chimiques différentes. Les performances de la MS/MS La MS/MS offre la possibilité d’analyser des grandes séries tout en conservant une bonne sensibilité et une grande spécificité rendant possible le dosage de nombreux métabolites sur de faibles quantités de prélèvement. Les appareils ont la capacité de travailler en injection directe ou bien associés à une étape de chromatographie liquide si une séparation est requise [5]. Dans les deux cas de figure, Balayage des ions fragments Sélectionne un ion M+ au niveau de Q1, le fragmente en Q2 et balaye les ions formés F+ au niveau de Q3 S Q1 Q2 Q3 M+ M+ F1+ F2+ Fn+ D D Balayage des ions parents Balaye en Q1 les ions M+ donnant le même ion F+ sélectionné en Q3 après fragmentation dans Q2 S Q1 Q2 Q3 D D M1+ M2+ M+ F+ les temps d’analyse sont extrêmement réduits. Par exemple, le dosage de la phénylalanine sur un échantillon peut prendre 2 heures avec une technique fluorimétrique et moins de 2 minutes par MS/MS. Il reste cependant des limites surtout représentées par les étapes préparatives de l’échantillon qui peuvent être assez longues et fastidieuses (étapes d’extraction, de purification...). La grande complexité de la matrice plasmatique est souvent responsable d’une importante « extinction chimique » diminuant l’ionisation et donc la sensibilité de la technique. Enfin, l’interprétation des données nécessite un personnel qualifié ayant un niveau d’expertise élevé et ce a fortiori dans le domaine des maladies héréditaires du métabolisme. Les applications de la MS/MS au diagnostic des maladies héréditaires du métabolisme Deux applications de la MS/MS ont permis d’améliorer le diagnostic des maladies héréditaires du métabolisme : le profil des acylcarnitines et le dosage semi-quantitatif des acides aminés. La première permet de faire le diagnostic des déficits de l’oxydation mitochondriale des acides gras et de certaines aciduries organiques. La seconde permet pour sa part de diagnostiquer des amino-acidopathies et des déficits du cycle de l’urée. L’apport fondamental de la MS/MS pour ces deux groupes de techniques est la possibilité de les réaliser simultanément en quelques minutes sur de faibles quantités de prélèvement comme une tache de sang déposé sur papier. Le temps d’analyse pour une microplaque de 96 puits est d’environ cinq heures (soit trois minutes par échantillon) auquel il faut ajouter trois heures de préparation préanalytique. Les principales maladies héréditaires du métabolisme pouvant être diagnostiquées par MS/MS sont données dans le tableau I. M + n Balayage des pertes neutres Balaye en Q1 tous les ions M+ perdant une masse donnée (N) après fragmentation en Q2 S Q1 Q2 D D M1+ - N M1+ M2+ Q3 M+ Mn+ M2+ - N Mn+ - N MRM : multi reaction monitoring Sélectionne un ion M+ donnant un ion fragment ou une perte neutre spécifique S Q1 Q2 Q3 M+ M+ F+ D D Figure 2. Principaux modes d’utilisation de la MS/MS. Ann Biol Clin, vol. 62, n° 3, mai-juin 2004 Le profil des acylcarnitines La carnitine est une petite molécule issue de la lysine permettant de détoxifier les acyl-CoA qui s’accumulent dans la mitochondrie sous forme d’acylcarnitines. Dans la plupart des déficits de la b-oxydation mitochondriale des acides gras ainsi que de nombreuses aciduries organiques, ce mécanisme est amplifié car les acyl-CoA ne peuvent plus être métabolisés. Le profil des acylcarnitines et la mesure de la carnitine libre dans un échantillon biologique permettent ainsi le diagnostic de ces déficits [7]. Méthode de détermination du profil des acylcarnitines par MS/MS Le protocole est similaire quels que soient les équipes et les appareils utilisés. Les acylcarnitines sont extraites à partir d’une tache de sang déposé sur papier puis dérivées 271 revue générale Tableau I. Maladies héréditaires du métabolisme pouvant être diagnostiquées par MS/MS sur un prélèvement de sang déposé sur papier. Technique MS/MS Fréquence Amélioration sous traitement Amino-acidopathies Phénylcétonurie Leucinose Homocystinurie Tyrosinémie I, II Hyperglycinémie sans cétose AA PN 102 AA PN 102 AA PN 102 AA PN 102 AA MRM 1/14 000(a) 1/185 000(a) 1/200 000-335 000(a) 1/100 000-120 000(a) 1/200 000(b) Oui Oui Oui Oui Non Déficits du cycle de l’urée Citrullinémie Acidurie argininosuccinique Argininémie AA PN 119 AA MRM AA PN 119 1/57 000(a) 1/70 000(a) 1/363 000(a) Oui Oui +/– AC AC AC AC AC AC AC 1/87 000-137 000(a) ND (> 200 cas(b)) 1/48 000-61 000(b) 1/50 000(b) ND (> 50 cas(b)) ND (> 25 cas(b)) ND (> 50 cas(b)) Oui Oui Oui +/– Oui Oui Oui AC AC AC AC AC AC ND (> 100 cas(b)) ND (> 30 cas(b)) ND (> 200 cas(b)) ND (> 50 cas(b)) ND (> 200 cas(b)) ND (> 200 cas(b)) Oui +/– +/– +/– +/– +/– AC AC AC 1/15 000-100 000(a) ND (> 50 cas(b)) ND (> 200 cas(b)) Oui +/– +/– Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Groupe/maladies Aciduries organiques Acidurie propionique Acidurie isovalérique Acidurie méthylmalonique Acidurie glutarique de type I Déficit en acétoacétyl-CoA thiolase mitochondriale Déficit en 3-méthylcrotonyl-CoA carboxylase Déficit en 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA lyase Déficits de la β-oxydation des acides gras Déficit de transport en carnitine Déficit en carnitine palmitoyl transférase I Déficit en carnitine palmitoyl transférase II Déficit en carnitine-acylcarnitine translocase Déficit en acyl-CoA déshydrogénase des AG à très longue chaîne Déficit en 3-hydroxy acyl-CoA déshydrogénase des AG à chaîne longue ou en protéine trifonctionnelle mitochondriale Déficit en acyl-CoA déshydrogénase des AG à chaîne moyenne Déficit en acyl-CoA déshydrogénase des AG à chaîne courte Déficit multiple en acyl-CoA déshydrogénase AA PN102 : dosage semi-quantitatif des acides aminés en mode perte neutre de 102 Da ; AA PN119 : dosage semi-quantitatif des acides aminés dibasiques en mode perte neutre de 119 Da ; AA MRM : dosage spécifique d’un acide aminé en mode multi reaction monitoring ; AC : profil des acylcarnitines ; AG : acides gras ; +/– : dans l’état actuel de la prise en charge thérapeutique, le traitement apporte un bénéfice réel pour l’enfant mais ne corrige pas complètement tous les symptômes de la maladie ; (a) Les fréquences ont été obtenues dans [6] ; (b) ND : non déterminé, les chiffres représentent la somme des données de la littérature et de notre expérience personnelle. sous forme d’esters butyliques, ce qui augmente la sensibilité. Les échantillons sont ensuite injectés directement dans l’appareil. Toutes les acylcarnitines butylées donnent un ion de masse 85 Da après fragmentation. Le profil est obtenu en sélectionnant tous les ions parents donnant cet ion 85 Da (mode d’analyse en balayage des ions parents). La quantification est obtenue en utilisant comme étalons internes des acylcarnitines marquées par des isotopes stables (2H ou 13C). Chaque pathologie à l’origine d’une accumulation d’acylcarnitines donnera ainsi un profil caractéristique qui permettra d’évoquer un diagnostic [8]. 272 Les déficits de la b-oxydation mitochondriale Le rôle de la b-oxydation mitochondriale des acides gras est de produire de l’énergie sous forme d’acétyl-CoA en relais de la glycolyse dans les épisodes de stress et de jeûne prolongé. Les acides gras proviennent de la lipolyse dans les adipocytes (acides gras à longue chaîne) et de l’alimentation (acides gras à chaîne longue, moyenne et courte). Ils sont captés principalement par les muscles, le foie et le cœur, puis pénètrent dans la mitochondrie pour y être oxydés. Les acides gras à chaîne moyenne et courte entrent directement dans la mitochondrie alors que ceux à chaîne longue entrent sous forme d’acylcarnitines à l’aide Ann Biol Clin, vol. 62, n° 3, mai-juin 2004 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Spectrométrie de masse en tandem d’enzymes de la membrane mitochondriale (carnitine palmitoyl transférase I/II et carnitine-acylcarnitine translocase). Dans la matrice mitochondriale, les acides gras sous forme d’acyl-CoA sont oxydés par des enzymes spécifiques de la taille de leur squelette carboné. Les acétyl-CoA formés pourront alors être directement utilisés par la mitochondrie pour former des corps cétoniques et être exportés pour fournir de l’énergie au cerveau et aux muscles. Dans les déficits de la b-oxydation mitochondriale (défauts de transport membranaire des acylcarnitines ou déficits en enzymes de la b-oxydation), les acyl-CoA s’accumulent dans la mitochondrie et sont éliminés sous forme d’acylcarnitines permettant le diagnostic de ces maladies [9]. L’expression clinique de ces maladies est celle d’un déficit énergétique se révélant soit par une hypoglycémie hypocétotique, soit par une cardiomyopathie hypertrophique, soit par une atteinte musculaire de type faiblesse musculaire ou rhabdomyolyse. Le traitement repose sur l’éviction des périodes de jeûne prolongé associé à une supplémentation en carnitine et en triglycérides à chaîne moyenne pour les déficits de la b-oxydation des acides gras à chaîne longue. Les aciduries organiques La plupart des acides organiques proviennent du catabolisme des acides aminés ramifiés (leucine, isoleucine, valine) produisant de l’acétyl-CoA ou du succinyl-CoA rentrant dans le cycle de Krebs. De nombreuses enzymes peuvent être déficientes et entraîner l’accumulation du précurseur qui s’élimine ensuite sous forme d’acide(s) organique(s) dans le sang puis les urines. Les aciduries organiques les plus fréquemment diagnostiquées sont les aciduries propionique, isovalérique, et méthylmalonique. D’autres aciduries sont retrouvées plus rarement comme le déficit en 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA lyase et le déficit en 3-méthylcrotonyl-CoA carboxylase. Cliniquement, ces maladies se présentent sous trois formes distinctes : néonatale sévère, chronique intermittente et chronique progressive. Les acides organiques accumulés peuvent être éliminés directement ou couplés soit avec de la glycine (sous forme d’acylglycines) soit avec de la carnitine (sous forme d’acylcarnitines) [10]. Outre le catabolisme des acides aminés ramifiés, le catabolisme du tryptophane et de la lysine peut aussi être touché par des déficits enzymatiques conduisant à des atteintes neurologiques sévères dont la plus fréquente est l’acidurie glutarique de type I [11]. Enfin, parmi les troubles de la cétolyse, le déficit en acétoacétyl-CoA thiolase mitochondriale peut être diagnostiqué par MS/MS grâce au profil des acylcarnitines. Pour toutes ces maladies, le principe général du traitement est un régime hypoprotidique afin de limiter l’apport du ou des acides aminés en cause, associé à une complémentaAnn Biol Clin, vol. 62, n° 3, mai-juin 2004 tion en acides aminés essentiels, en vitamines, en minéraux et en oligoéléments. Le dosage semi-quantitatif des acides aminés La plupart des voies métaboliques impliquant des acides aminés sont touchées par des déficits enzymatiques qu’il est possible de diagnostiquer par le dosage des acides aminés plasmatiques. L’approche par MS/MS sans séparation préalable ne permet pas à l’heure actuelle de doser tous les acides aminés. Nous n’envisagerons donc que les déficits qu’il est possible de mettre en évidence avec cette technique sur des prélèvements de sang déposé sur papier. La technique classique de dosage des acides aminés est la chromatographie liquide d’échange d’ions. Le développement actuel des techniques MS/MS permet de doser un certain nombre d’acides aminés. Le principe repose sur la même préparation des échantillons que pour les acylcarnitines : les acides aminés sont extraits à partir d’un tache de sang puis dérivés par butylation avant d’être introduits dans l’appareil. Le mode d’analyse est en revanche différent. Après fragmentation, la majorité des acides aminés donnent un même fragment neutre de masse 102 Da (alanine, sérine, proline, valine, glutamine + acide glutamique, leucine + isoleucine + alloisoleucine, méthionine, histidine, phénylalanine, tyrosine, asparagine + acide aspartique). Les acides aminés basiques (citrulline, lysine, arginine, ornithine) donnent un fragment neutre de masse 119 Da. Le profil des acides aminés est obtenu en sélectionnant tous les ions parents donnant une perte de masse de 102 Da ou de 119 Da après fragmentation (mode d’analyse en balayage des pertes neutres). La glycine et l’acide argininosuccinique sont dosés individuellement en mode MRM. La quantification est obtenue en utilisant comme étalons internes des acides aminés marqués par des isotopes stables (2H ou 13C). Le dosage des acides aminés par cette technique reste cependant semi-quantitatif. En effet, il est impossible de mesurer individuellement les acides aminés isomasse comme la leucine, l’isoleucine et l’alloisoleucine et l’on ne peut mesurer que la somme de ces trois acides aminés. De plus, lors de l’étape de dérivation, la glutamine et l’asparagine se transforment respectivement en acide glutamique et en acide aspartique ne rendant possible que la mesure de la somme acide glutamique + glutamine et la somme acide aspartique + asparagine. Les aminoacidopathies et les déficits du cycle de l’urée Les déficits enzymatiques à l’origine de ces pathologies entraînent une accumulation d’un ou plusieurs métabolites devenant toxiques pour l’organisme. Toutes ces maladies sont traitables par un régime d’exclusion du ou des acides 273 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. revue générale aminés en cause associé à une complémentation en acides aminés essentiels, en vitamines, en minéraux et en oligoéléments. Seule l’hyperglycinémie sans cétose reste difficile à traiter, la plupart des thérapeutiques ayant montré peu d’efficacité. compartiments de l’organisme. La maladie se déclare en période néonatale par une hypotonie sévère avec des anomalies à l’électroencéphalogramme de type suppressionburst. Le diagnostic biologique est posé devant un rapport glycinorachie/glycinémie supérieur à la normale [14]. La phénylcétonurie La maladie se caractérise par un déficit en phénylalanine hydroxylase bloquant le catabolisme de la phénylalanine. L’accumulation de phénylalanine est toxique pour le système nerveux central et entraîne un retard psychomoteur important chez les malades. Cette maladie a été la première à bénéficier d’un dépistage néonatal systématique à la fin des années 1960. Le diagnostic est posé devant une accumulation de phénylalanine dans le sang [1]. Les déficits du cycle de l’urée Seuls les déficits touchant les trois enzymes cytosoliques peuvent être diagnostiqués par MS/MS : la citrullinémie, l’acidurie argininosuccinique et l’argininémie. Ces trois maladies entraînent le blocage du cycle de l’urée et l’accumulation de citrulline, d’acide argininosuccinique ou d’arginine respectivement. L’ammoniaque ne peut plus être éliminé, s’accumule et devient toxique pour le système nerveux central. Les formes classiques de ces maladies se caractérisent par des détresses neurologiques avec coma en période néonatale [15]. La leucinose La leucinose est caractérisée par un déficit de la décarboxylase des acides aminés ramifiés. La maladie se déclare très précocement par un coma néonatal avec hypotonie associé à des mouvements anormaux des membres. L’évolution vers la mort est inéluctable en l’absence de traitement. Le diagnostic est posé devant l’accumulation de leucine, d’isoleucine, de valine et d’alloisoleucine dans le plasma [10]. Les tyrosinémies Dans la tyrosinémie de type I, le déficit se situe sur la voie catabolique de la tyrosine et entraîne l’accumulation de fumaryl- et de maléyl-acétoacétate toxiques pour le foie et le rein. Les malades présentent une insuffisance hépatocellulaire durant les deux premières années de vie pouvant évoluer vers une cirrhose et un carcinome s’associant à une insuffisance rénale progressive [12]. Il faut également souligner l’existence d’une tyrosinémie de type II qui entraîne une pathologie nettement moins sévère (hyperkératose). Au plan biologique, on constate pour le type I, une augmentation de la tyrosine et de la méthionine plasmatique. L’homocystinurie L’homocystinurie est liée au déficit de la cysthationine-bsynthase affectant le catabolisme de la méthionine. La maladie se caractérise par un retard mental, des crises d’épilepsie, une atteinte occulaire (myopie, ectopie cristallinienne), des troubles de la coagulation et des anomalies osseuses (ostéoporose, aspect marfanoïde). Le diagnostic repose sur l’élévation de l’homocystine et de la méthionine. En MS/MS seule l’hyperméthioninémie peut être mise en évidence. Cependant cette augmentation est dépendante du temps et peut être la cause de faux négatifs lorsque le prélèvement est réalisé trop précocement [13]. L’hyperglycinémie sans cétose Le déficit enzymatique se situe sur la voie catabolique de la glycine. La glycine va s’accumuler dans les différents 274 Résultats des études de dépistage néonatal par MS/MS La majorité des méthodes de dosage utilisant la MS/MS dans le diagnostic des maladies héréditaires du métabolisme sont techniquement applicables au dépistage néonatal. De très nombreuses études rétrospectives, des études pilotes et des projets prospectifs ont été réalisés depuis quelques années. Les résultats des principales études prospectives sont réunies dans le tableau II [16-25]. La plupart des auteurs ont utilisé les techniques classiques décrites dans le chapitre précédent : le profil des acylcarnitines et le dosage semi-quantitatif des acides aminés. Les effectifs des études prospectives se situent entre 27 000 et 700 000 nouveau-nés et permettent donc d’obtenir des informations statistiquement significatives. L’incidence globale moyenne, toutes maladies héréditaires du métabolisme confondues, est de l’ordre 1/4 600 (1/1 800 à 1/8 400). L’étude australienne la plus récente [25] décrit un doublement du nombre de cas de maladies héréditaires du métabolisme diagnostiquées grâce à l’apport de la MS/MS (l’incidence passant de 8 cas pour 100 000 naissances à 15,7 cas pour 100 000 naissances). L’analyse plus précise des résultats montre que le déficit en acyl-CoA déshydrogénase des acides gras à chaîne moyenne (MCAD) est le plus fréquemment retrouvé. Les déficits en 3-méthyl-crotonyl-CoA carboxylase et en acyl-CoA déshydrogénase des acides gras à chaîne courte, longtemps considérés comme très rares semblent également être retrouvés avec une fréquence non négligeable. Dans toutes les études, les taux de faux négatifs sont quasiment nuls mais il a souvent été nécessaire de réajuster les valeurs seuils après une période probatoire. Les taux de faux positifs sont très acceptables et sont pour la plupart inférieurs à 0,5 % [24, 25]. Certains paramètres comme la tyrosine Ann Biol Clin, vol. 62, n° 3, mai-juin 2004 Spectrométrie de masse en tandem Tableau II. Principales études prospectives de dépistage néonatal par MS/MS. Pays/année États-Unis 1999 [16] Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. États-Unis 2001 [17] Allemagne 2002 [18] États-Unis 2002 [19] Effectif Analytes testés 700 000 AC AA 163 patients (1/4 300) 86 amino-acidopathies 45 déficits de la β-oxydation des acides gras (36 MCAD) 32 aciduries organiques 160 000 AC AA 42 patients (1/3 800) 22 amino-acidopathies 17 déficits de la β-oxydation des acides gras (10 MCAD) 3 aciduries organiques 503 000 AC AA 179 patients (1/2 800) 95 amino-acidopathies 63 déficits de la β-oxydation des acides gras (53 MCAD) 21 aciduries organiques 320 000 AC AA 77 patients (1/4 200) 23 amino-acidopathies 31 déficits de la β-oxydation des acides gras (24 MCAD) 23 aciduries organiques 74 400 AC AA 19 patients (1/3 900) 8 amino-acidopathies 8 déficits de la β-oxydation des acides gras (5 MCAD) 3 aciduries organiques 26 900 AC AA 15 patients (1/1 800) 8 amino-acidopathies 4 déficits de la β-oxydation des acides gras (3 MCAD) 3 aciduries organiques 60 000 AC AA 18 patients (1/3 300) 9 amino-acidopathies (4 PCU) 3 déficits de la β-oxydation des acides gras 6 aciduries organiques 102 200 AC AA 13 patients (1/7 800) 4 amino-acidopathies 2 déficits de la β-oxydation des acides gras 7 aciduries organiques (5 acidémies propioniques) 250 000 AC AA 106 patients (1/2 400) 65 amino-acidopathies 24 déficits de la β-oxydation des acides gras (16 MCAD) 17 aciduries organiques 362 000 AC AA 57 patients (1/6 350) 15 amino-acidopathies 29 déficits de la β-oxydation des acides gras (17 MCAD) 12 aciduries organiques Australie 2002 [20] Espagne 2002 [21] Belgique 2002 [22] Japon 2002 [23] Allemagne 2003 [24] (a) Australie 2003 [25] Résultats MCAD : déficit en acyl-CoA déshydrogénase des AG à chaîne moyenne ; PCU : phénylcétonurie ; (a) cette étude n’a pas comptabilisé les phénylcétonuries. posent des problèmes en entraînant de nombreux faux positifs pour le diagnostic des tyrosinémies. Enfin, une étude récente a montré que le coût de ces programmes de dépistage néonatal était bien inférieur à celui de l’approche diagnostique classique [26]. Ann Biol Clin, vol. 62, n° 3, mai-juin 2004 Les évolutions futures Un nombre important de travaux utilisant la MS/MS dans le diagnostic des maladies héréditaires du métabolisme a été réalisé ces dernières années. Pour beaucoup, ces 275 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. revue générale techniques sont applicables au dépistage néonatal et sont en cours d’évaluation. Nous pouvons citer le dosage du galactose 1-phosphate pour le dépistage de la galactosémie [27], le dosage des acides gras à très longue chaîne pour le dépistage des maladies peroxysomales [28], le typage de la transferrine pour le dépistage des défauts de glycosylation des protéines [29] ou bien encore le dosage des mucopolysaccharides urinaires [30]. Au-delà des possibilités techniques offertes, il sera nécessaire de suivre à court et long terme tous les enfants dépistés pour étudier leur devenir. Il est clair que le dépistage par MS/MS va faire apparaître de nouvelles formes de maladies héréditaires du métabolisme et notamment des phénotypes moins sévères probablement non diagnostiqués avec les anciennes approches. Par exemple, un génotype particulier de MCAD non décrit auparavant a déjà été rapporté par les différentes équipes ayant lancé des études prospectives. Cette technologie permet également le diagnostic de maladies dont le traitement n’a pas prouvé son efficacité (comme pour l’hyperglycémie sans cétose). Cela soulève une importante question d’éthique : y a-t-il lieu de proposer ce dépistage parce qu’il est réalisable techniquement alors que l’on ne pourra pas guérir l’enfant ? L’éthique est un point de réflexion d’autant plus important que c’est un sujet très peu abordé dans la plupart des études publiées. Les critères qui définissent actuellement les règles du dépistage néonatal excluent les maladies non traitables. Une réflexion devra être engagée par chaque pays afin d’actualiser le cadre éthique du dépistage néonatal devant les nouvelles possibilités offertes par cette technique. Dans cette réflexion, et malgré l’intérêt que certains dépistages peuvent représenter pour le conseil génétique, il ne faudra pas oublier que c’est l’enfant qui doit être au centre du dépistage néonatal. Conclusion La MS/MS est une technologie qui révolutionne le diagnostic et la prise en charge des patients atteints de maladies rares telles que les maladies héréditaires du métabolisme. À partir d’une simple tache de sang déposé sur papier, il est d’ores et déjà possible de réaliser le diagnostic de près de vingt maladies héréditaires du métabolisme et très probablement encore plus dans le futur. Appliquer ces techniques au dépistage néonatal est non seulement possible techniquement mais est aussi un challenge important pour mieux traiter ces malades. Les premières études prospectives montrent une bonne faisabilité technique mais surtout une fréquence de ces maladies beaucoup plus importante que ce qui était ac276 cepté jusqu’à présent. Ainsi, les maladies héréditaires du métabolisme dans leur ensemble représentent une entité aussi importante que des maladies génétiques considérées comme les plus fréquentes en France (par exemple la mucoviscidose, dont la fréquence estimée est de 1/3 000 à 1/3 500). Reste que, malgré l’impulsion sans précédent que cette approche semble donner au dépistage néonatal, il se pose de très nombreux problèmes non seulement techniques (acquisition du matériel, expérience des utilisateurs), mais aussi financiers (coût de l’équipement), médicaux (prise en charge des malades) et éthiques (quelles maladies diagnostiquer ?). Il paraît donc nécessaire d’initier une réflexion, en France, sur l’intérêt de cette approche dans le programme de dépistage néonatal national. Dans ce but, il serait notamment opportun de réfléchir à la mise en place d’études pilotes prospectives dans notre pays. Références 1. Guthrie R, Susi A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large population of newborn infants. Pediatrics 1963 ; 32 : 318-22. 2. Rashed MS, Ozand PT, Bucknall MP, Little D. Diagnosis of inborn errors of metabolism from blood spots by acylcarnitines and amino acids profiling using automated electrospray tandem mass spectrometry. Pediatr Res 1995 ; 38 : 324-31. 3. Johnson AW, Mills K, Clayton PT. The use of automated electrospray ionization tandem MS for the diagnosis of inborn errors of metabolism from dried blood spots. Biochem Soc Trans 1996 ; 24 : 932-8. 4. De Hoffmann E, Charrette J, Stroobant V. Spectrométrie de masse. Paris : Dunod, 1999 : 135-49. 5. 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