synthese et activite antimicrobienne de

Rev. Microbiol. Ind. San et Environn. Vol 6, N°2, p : 147-163 Midassirou et al., 2012
147
RECHERCHE DES BACTERIES LACTIQUES ET ETUDE IN
VITRO DE LEURS PROPRIETES PROBIOTIQUES
B. MIDASSIROU*, A. MAHDHI*, K. CHAIEB, A. BAKHROUF
Laboratoire d’Analyse, Traitement et Valorisation des Polluants de l’Environnement et
des Produits. Faculté de Pharmacie, Monastir, 5000. Tunisie.
Auteur de correspondance: Mahdhi Abdelkarim, Tel: [phone]; Fax: +216 73
46 18 30.
RESUME
Les bactéries majoritairement utilisées comme potentiels probiotiques
appartiennent au groupe des bactéries lactiques. Afin de remplir cette fonction, ces
bactéries doivent répondre à un certain nombre de propriétés (activité antagoniste,
tolérance à l’acidité, tolérance aux acides biliaires, capacité d’adhésion ...). Dans ce
travail, 6 souches ont été isolées et caractérisées. Il s’agit d’Enterococcus faecium,
d’Enterococcus faecalis, de Lactococcus lactis ssp lactis, de Lactobacillus collinoides,
de Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii et de Lactobacillus fermentum. L’étude de
la résistance aux antibiotiques a montré que toutes les souches sont sensibles aux
antibiotiques largement utilisés. Les différentes souches isolées ont une activité
antibactérienne contre des souches pathogènes (Listeria monocytogenes ATCC 19115,
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis CIP 106510,
Enterococcus faecalis ATCC 9212, Micrococcus luteus NCIMB 816, Salmonella
typhimurium NRRLB 4420, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 et Escherichia coli
ATCC 35218), tolèrent la bile Oxgall à 0,3% et un pH de 3. L’étude de l’adhésion au
polystyrène a révélé que les souches testées sont moyennement adhérentes. Les souches
étudiées présentent in vitro des propriétés probiotiques intéressantes (effet inhibiteur,
production d’acides…) indépendamment de leur biotope.
Mots clés: Bactéries lactiques, Lactobacillus, probiotiques, adhésion, acide lactique.

Rev. Microbiol. Ind. San et Environn. Vol 6, N°2, p : 147-163 Midassirou et al., 2012
148
ABSTRACT
The bacteria mainly used as potentials probiotic belong to the group of the lactic
bacteria. In order to fulfill this function, these bacteria must answer a certain number of
properties (antagonistic activity, tolerance to acidity, capacity of adhesion etc). In this
study, 6 strains: Enterococcus faecium, d’Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis ssp
lactis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii and
Lactobacillus fermentum, have been isolated and characterized. Our data revealed that
these strains were susceptible to most used antimicrobial drugs, have an antibacterial
activity against pathogenic strains: (Listeria monocytogenes ATCC 19115,
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis CIP 106510,
Enterococcus faecalis ATCC 9212, Micrococcus luteus NCIMB 816, Salmonella
typhimurium NRRLB 4420, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and Escherichia
coli ATCC 35218). The tested strains showed a aptitude to produce acidity, and
tolerated the bile Oxgall 0,3% and pH 3. Adherence assay to polystyrene revealed that
these strains are fairly adherent. The studied strains present in vitro interesting probiotic
properties (inhibiting effect, production of acids...) independently of their biotope.
Key words: Bacteria lactic, Lactobacillus, probiotic, adhesion, lactic acid.
INTRODUCTION
Les bactéries lactiques sont considérées parmi la flore intestinale normale et ont
toujours montré un effet bénéfique sur la santé et en particulier sur l’équilibre de la flore
intestinale. En effet, l’ingestion des bactéries lactiques, a été pratiqué depuis 1907,
pour réduire les désordres intestinaux et améliorer l’hygiène digestive (Tournier-
Château et al., 1994). L’industrialisation de l’élevage des animaux entreprise depuis
des décennies a entrainé la baisse de leur état général de santé, ce qui oblige à avoir
recours à l’emploi d’additifs alimentaires pour augmenter la production tout en

Rev. Microbiol. Ind. San et Environn. Vol 6, N°2, p : 147-163 Midassirou et al., 2012
149
maintenant un bon état général de santé de ces animaux. Les antibiotiques, ont été
pendant longtemps utilisés avec succès pour améliorer les performances zootechniques
et sanitaires des animaux d’élevage (Gunal et al., 2006). Mais sous la pression des
groupes écologiques et en raison des conséquences liées à l’usage des antibiotiques dont
le principal est l’antibiorésistance des bactéries, la législation est de plus en plus
restrictive quant à leur utilisation comme facteur de croissance. Ceci a conduit à la
recherche des microorganismes ou des substances de remplacement comme alternative à
l’emploi des antibiotiques comme facteurs de croissance. Depuis quelques dizaines
d’années on assiste à l’utilisation des bactéries probiotiques en alimentation humaine et
animale (Saito, 2004; Tang et al., 2007 ; Gaggìa et al., 2010). Aujourd'hui un intérêt
considérable s’est développé autour de l’utilisation des bactéries lactiques ayant des
effets bénéfiques pour la santé ou probiotiques pour des applications alimentaires et
pharmaceutiques (Wunwissa et al., 2003). Les bactéries lactiques probiotiques doivent
répondre à des critères qui ont été définis par Fuller (1989) et Saito (2004) pour être
utilisées. En effet, au cours de leur passage dans le tractus gastro-intestinal, les bactéries
se heurtent aux problèmes de stress causés par le suc gastrique puis le suc biliaire suivi
par la compétition avec les germes pathogènes et autochtones (Bouzaine et al., 2004).
Actuellement, les souches du genre Bifidobacterium et Lactobacillus sont les plus
largement utilisées comme probiotiques dans l’alimentation humaine et animale
(Mountzouris et al., 2007). D’autres microorganismes comme ceux du genre
Enterococcus, Propionibacterium et certaines levures peuvent améliorer la santé en
général (Oyetayo et Osho, 2004). Les propriétés et les effets des bactéries probiotiques
varient d’une espèce à une autre et même en fonction des souches telles que la capacité
de réduire l’adhésion des pathogènes aux surfaces et l’activité antimicrobienne contre
les bactéries potentiellement pathogènes ainsi que viabilité durant le traitement
technologique (Saarela et al., 2000). Il est nécessaire de diversifier les sources

Rev. Microbiol. Ind. San et Environn. Vol 6, N°2, p : 147-163 Midassirou et al., 2012
150
d’approvisionnement afin d’obtenir des bactéries probiotiques plus résistantes aux stress
environnementaux et du transit gastro-intestinal. Le présent travail consiste à isoler les
bactéries lactiques à partir des différents biotopes et à étudier in vitro leurs propriétés
probiotiques.
MATERIEL ET METHODES
1. Recherche des bactéries lactiques
1.1 Biotopes et Isolement
Les souches bactériennes ont été isolées à partir de laits de chèvre, selles de
bébés de 3 mois, les intestins de dindes et de poules.
10g de chaque échantillon ont été homogénéisés dans 90 ml d’eau peptonée tamponnée
puis broyés au stomacher (400 LAB système) et incubés à 37°C pendant 18 à 24 h.
L’isolement des bactéries a été effectué sur un milieu gélose MRS (Man and Rogosa
Sharpe) (Oxoid, England). Après incubation en anaérobiose à 37°C pendant 24 à 48 h,
les colonies isolées ont été repiquées deux fois sur le même milieu.
1.2 Tests d’appartenance au groupe de bactéries lactiques
Différents tests d’appartenance au groupe de bactéries lactiques ont été réalisés
tels que la coloration de Gram et la recherche de la catalase et l’oxydase.
2. Identification biochimique par microgalerie et dénombrement
La galerie Api 20 Strep (Biomérieux, France) a été utilisée pour l’identification
des bactéries de type cocci à Gram positives et catalase négatives. La galerie API 50 CH
pour l’identification des souches de forme bacillaire (bacilles à Gram positives et
catalase négatives). La méthode décrite par Hoben et Somsasegaran (1982) a été utilisée
pour tous les dénombrements effectués au cours de ce travail.

Rev. Microbiol. Ind. San et Environn. Vol 6, N°2, p : 147-163 Midassirou et al., 2012
151
3. Etude des propriétés probiotiques
3.1 Résistance aux antibiotiques
La résistance aux antibiotiques a été étudiée selon la méthode de Zhou et al.
(2000). Les différentes souches sont mises en culture dans un bouillon MRS pendant 24
h à 37°C. 1 ml d’une culture bactérienne de 24 h (107 - 108 UFC /ml) a été additionné à
15 ml du milieu MRS gélosé maintenus en surfusion (45°C). Le mélange est
homogénéisé puis coulé en boites de pétri. Après solidification, les disques
d’antibiotiques (Ampicilline, Erytromicine, Novobiocine, Vancomycine, Acide
naldixique, Chloramphenicol, Rifampicine, Streptomycine, Gentamycine, Néomycine,
Amoxilline) ont été déposés à la surface de la gélose puis l’ensemble est incubé pendant
48 h en anaérobiose à 37°C. Les diamètres des zones d’inhibition de croissance autour
de chaque disque ont été mesurés. Les résultats sont interprétés selon les
recommandations du Comité de la Société Française de l’Antibiogramme, (2007) et du
NCCLS (National comity of Clinical Laboratory Standars). Les résultats sont exprimés
par (S) sensible, (I) intermédiaire et (R) résistant.
3.2 Test d’antagonisme
La méthode de Zhou et al. (2000) avec quelques modifications a été utilisée
pour mettre en évidence l’effet inhibiteur des souches sélectionnées. Au cours de ce test,
8 souches pathogènes ont été utilisées : Listeria monocytogenes ATCC 19115,
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis CIP 106510,
Enterococcus faecalis ATCC 9212, Micrococcus luteus NCIMB 816, Salmonella
typhimurium NRRLB 4420, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 et Escherichia coli
ATCC 35218. Une culture de 24 h en anaérobiose à 37°C en bouillon MRS de chaque
souche a été déposée en spot à raison de 10 µl sur une mince couche du milieu MRS
coulée dans les boites de pétri.