Mémoire complet - Thèses et Mémoires

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Université d’ORAN
Faculté des Sciences
Département de Biotechnologie
Mémoire de MAGISTER
en Biotechnologie
Option : Ecosystèmes microbiens complexes
Présenté par
Amaria HARMOUCHE
Intitulé
ETUDE DE L’ANTIBIORESISTANCE CHEZ 83 SOUCHES
AUTOCHTONES DE BACTERIES LACTIQUES
Devant le Jury :
Président :
Pr. ZADI-KARAM Halima
Examinateurs : Dr. DALACHE Fatiha
Dr. DRISSI Mourad
Pr. Baba Ahmed Mohamed Bey
Rapporteur :
Pr. KARAM Nour-Eddine
Soutenue le :
/
Université d’ORAN
Université de MOSTAGANEM
Université de TLEMCEN
Université d’ORAN
Université d’ORAN
/ 2010
REMERCIEMENTS
J'exprime mes profonds remerciements au Pr. Karam Nour-Eddine, Professeur à
l’université d’Oran, qui a dirigé ce projet de recherche : je vous remercie pour votre écoute,
vos idées précieuses, votre disponibilité et, surtout, votre confiance.
Ensuite, je tiens à remercier chaleureusement Pr. ZADI-KARAM Halima, Professeur à
l’université d’Oran, qui a accepté de présider mon jury de soutenance et à qui je suis très
reconnaissante pour sa disponibilité et ses conseils précieux.
Je présente mes sincères remerciements aux Pr. Baba Ahmed Mohamed Bey, Professeur à
l’université d’Oran, Dr. DALACHE Fatiha, Maitre de conférences à l’université de
Mostaganem, et Dr. DRISSI Mourad, Maitre de conférences à l’université de Tlemcen, qui
ont bien accepté d’examiner ce travail. Merci encore au Dr. DALACHE Fatiha pour ses
discussions scientifiques et ses conseils.
J’adresse également mes remerciements :
A mon collègue Mohamed Merzoug pour sa disponibilité et son aide.
A tous les chercheurs et le personnel du Laboratoire de Biologie des Microorganismes et de
Biotechnologies (LBMB).
A tous mes collègues.
Et à toute personne qui a contribué de prés ou de loin à la réalisation de ce projet de
recherche.
Un merci tout spécial à ma famille et mes ami(e)s Assmaa, Wassila, Hayet, Fatima,
Mohamed, Abdeslem, Ali, Yasser, pour leur soutien constant, leur amour et leurs mots
d'encouragement qui m'ont permis de me rendre jusque là.
DÉDICACES
Aux membres de ma famille, qu’ils trouvent dans ce travail
le témoignage de toute ma gratitude et qu’il soit pour eux
le gage de mon amour infini
A tous ceux qui me sont chers, ils se reconnaîtront…….....
Amaria
Sommaire
Pages
SOMMAIRE
Liste des tableaux
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Liste des figures
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1. Introduction
1.1. Les bactéries lactiques
1.1.1. Définition et caractéristiques
1.1.2. Classification
1.2. Les antibiotiques
1.2.1. Modes et modalités d’action des antibiotiques
1.2.1.1. Les inhibiteurs de la synthèse du peptidoglycane
1.2.1.2. Les inhibiteurs de la synthèse protéique
1.2.1.3. Les inhibiteurs de la synthèse des acides nucléiques
1.2.1.4. Les inhibiteurs de la synthèse des folates
1.2.1.5. Les antibiotiques qui provoquent l’altération des membranes
1.2.1.6. Les antibiotiques agissant par inhibition compétitive
1.2.2. Usage des antibiotiques et ses conséquences
1.3. La résistance bactérienne aux antibiotiques
1.3.1. L’antibiorésistance chez les bactéries lactiques
1.3.1.1. Génétique de l’antibiorésistance chez les bactéries lactiques
1.3.1.2. Moyens du transfert des gènes de résistance
1.3.2. Mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries Gram positives
1.3.2.1. Inactivation ou modification de l’antibiotique
1.3.2.2. Modification de la cible
1.3.2.3. Pompes à efflux actif
1.3.3. Les bétalactamases
1.3.3.1. Classification des bétalactamases
1.3.3.2. Les différents types de bétalactamases
1.3.3.3. Les bétalactamases des bactéries à Gram positif
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2. Matériel et Méthodes
2.1. Souches bactériennes
2.2. Confirmation de l’appartenance des souches au groupe lactique et de leur pureté
2.3. Conservation des souches
2.4. Antibiogramme en milieu solide
2.5. Détermination des concentrations minimales d’inhibition des antibiotiques (CMI)
2.6. Recherche d’ADN plasmidique
2.6.1. Extraction d’ADN plasmidique
2.6.2. Electrophorèse sur gel d’agarose
2.7. Purification de l’ADN plasmidique par électroélution
2.8. Transformation de la souche Pediococcus sp. MA1 par électroporation
2.9. Recherche d’activité bétalactamase
2.9.1. Test de synergie
2.9.2. Test 3D
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I
Sommaire
3. Résultats et Discussion
3.1. Confirmation de l’appartenance des souches au groupe lactique et de leur pureté
3.2. Détermination de la sensibilité des souches aux différents antibiotiques testés
3.3. Détermination des concentrations minimales d’inhibition des antibiotiques (CMI)
3.4. Détection des plasmides des bactéries lactiques
3.5. Purification de l’ADN plasmidique
3.6. Transformation de la souche Pediococcus sp. MA1
3.7. Recherche d’activité bétalactamase
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4. Conclusion et perspectives
5. Références bibliographiques
6. Annexe
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II
Pages
Liste des tableaux
Tableau 1 : Quelques résistances naturelles rencontrées chez les bactéries lactiques
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Tableau 2 : Exemples de plasmides portant des gènes de résistances aux antibiotiques
Tableau 3 : Principaux mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries Gram
positives
Tableau 4 : Classification et propriétés des bétalactamases
Tableau 5 : Souches lactiques étudiées
Tableau 6 : Les différents disques d’antibiotiques utilisés
Tableau 7 : Solutions mères d’antibiotiques
Tableau 8 : Profils de résistance des bactéries lactiques étudiées (méthode de diffusion sur milieu
solide)
Tableau 9 : Taux (%) de résistance des bactéries étudiées / antibiotique
Tableau 10 : Concentrations minimales d’inhibition (µg/ml) des antibiotiques testés
Tableau 11 : Sélection des clones transformants
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Pages
Liste des figures
Figure 1 : Résumé des principaux sites d’action des antibiotiques
Figure 2 : Réseau de transfert de résistance aux antibiotiques
Figure 3 : Illustration des mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries Gram
positives
Figure 4 : Structure des systèmes d’efflux actif
Figure 5 : Schéma de la technique de l'électroélution
Figure 6 : Aspect microscopique de quelques souches
Figure 7 : Antibiogramme de la souche Lactobacillus sp. V16
Figure 8 : Antibiogramme de la souche Pediococcus sp. MA1
Figure 9 : Antibiorésistance chez les bactéries lactiques étudiées
Figure 10 : Comparaison des antibiorésistances des souches étudiées, selon leurs origines
Figure 11 : Profil électrophorétique de l’ADN plasmidique des souches étudiées
Figure 12 : ADN plasmidique de la souche Lactobacillus sp. V16 récupéré pour les
expériences d’électroélution
Figure 13 : Image de synergie entre AMC et CTX
Figure 14 : Résultat du test 3D
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Introduction
Les antibiotiques sont d’un grand usage en santé humaine et animale ainsi que dans le
contrôle des phytopathologies, mais leur efficacité est menacée par la capacité des bactéries,
qui sont des organismes très adaptables, à développer une résistance à ces molécules. Par
conséquent, la longue période d’utilisation de ces agents antimicrobiens ainsi que leur
utilisation abusive ont abouti à la sélection de bactéries qui leur sont résistantes. L'ampleur du
problème est sensiblement augmentée par l’aptitude des bactéries à transférer horizontalement
les déterminants de la résistance (Levy, 1992). En effet, il a été démontré que l’exposition de
bactéries hébergeant un gène de résistance à la tétracycline à de faibles concentrations de cet
antibiotique aboutit à une augmentation de 10 à 100 fois de la fréquence du transfert de
l’élément porteur de ce gène et ceci, tant in vitro qu’in vivo dans le tube digestif de souris
gnotobiotiques (Doucet-Populaire et al., 1991). De même, Scott (2002) a conclu que le
transfert de gènes se produit largement in vivo entre les bactéries du tractus gastro-intestinal et
entre ces mêmes bactéries et les bactéries pathogènes du tractus gastro-intestinal, comme des
gènes de résistance identiques sont présents dans diverses espèces bactériennes à partir de
différents hôtes.
Pendant plusieurs décennies, les études sur la sélection et la diffusion de la résistance aux
antibiotiques ont porté principalement sur les espèces à intérêt clinique. Toutefois, de
nombreux chercheurs ont émis l'hypothèse que les bactéries commensales présentes dans les
aliments et dans le tractus gastro-intestinal pourraient servir de réservoirs pour les gènes de
résistance aux antibiotiques et pourraient transférer ces gènes à des bactéries opportunistes et
pathogènes de l’Homme, ce qui nuit à la réussite de l’antibiothérapie (Perreten et al., 1997a;
Mathur et Singh, 2005).
Les bactéries lactiques, qui font partie de la flore commensale et qui bénéficient d’une
longue histoire de sécurité de leur utilisation en industrie agroalimentaire ainsi qu’en tant que
probiotiques (Mathur et Singh, 2005; Ammor et al., 2007), peuvent être l’un de ces réservoirs.
En effet, des gènes conférant la résistance à la tétracycline, l'érythromycine et la vancomycine
ont été détectés et caractérisés chez Lactococcus lactis et des espèces d’entérocoques et de
lactobacilles isolées à partir de produits carnés fermentés et de produits laitiers (Mathur et
Singh, 2005), et la possibilité de leur transfert aux bactéries opportunistes et pathogènes de la
flore digestive de l'Homme est fort envisageable. Toutefois, pour répondre aux
préoccupations de la biosécurité des cultures starters et des probiotiques, un certain nombre
d'initiatives ont été lancé par diverses organisations à travers le monde, tels que l'interdiction
2
Introduction
de l’utilisation des antibiotiques à usage clinique en tant que promoteurs de croissance chez
les animaux d’élevage (déjà appliquée en union européenne) et la limitation des caractères de
résistance que doivent porter les probiotiques à ceux requis pour un but précis seulement
(Mathur et Singh, 2005).
C'est dans le contexte de la résistance bactérienne aux antibiotiques que s'inscrit notre
travail qui a pour objectifs d’étudier le comportement de plusieurs souches de bactéries
lactiques isolées de différents milieux naturels vis-à-vis de divers antibiotiques, et de tenter de
préciser le déterminisme génétique de certaines résistances observées.
3
Introduction
1.1. Les bactéries lactiques :
1.1.1. Définition et caractéristiques :
Les bactéries lactiques constituent un groupe de bactéries Gram positives, taxonomiquement
hétérogène, qui produisent principalement de l’acide lactique par fermentation des sucres en
anaérobiose comme en aérobiose (Axelsson, 2004 ; Atlan et al., 2008). Ce sont des bactéries
asporogènes, de forme coccoide, bacillaire ou coccobacillaire, immobiles, dépourvues de
catalases et de cytochromes (à l’exception de certains genres à pseudocatalase), anaérobies
mais aerotolérantes, et tolérantes à des pH acides (Axelsson, 2004).
Ces bactéries fermentent les sucres selon deux voies : la glycolyse (Embden-MeyerhofParnas), ou fermentation homolactique, qui conduit à la formation d’acide lactique, et la voie
du 6-phosphogluconate / phosphocétolase (fermentation hétérolactique) qui produit, en plus
de l'acide lactique, d’autres métabolites tels que l'éthanol, l'acétate et le CO2 (Axelsson,
2004 ; Atlan et al., 2008).
Ces microorganismes ont une capacité de biosynthèse très faible, ce qui explique leurs
exigences nutritionnelles complexes en acides aminés, peptides, vitamines, sels, acides gras,
glucides fermentescibles et bases puriques et pyrimidiques (Axelsson, 2004 ; Wessels et al.,
2004 ; Atlan et al., 2008). En raison de ces exigences et de leur nature anaérobie
aerotolérante, ces bactéries sont associées à une grande variété de milieux naturels
particulièrement riches tels que les divers produits alimentaires (lait, viande, boissons,
légumes,…). Ces bactéries sont également présentes dans la flore normale de la cavité
buccale, l’intestin et l’appareil génital de l’Homme et des animaux (Stiles et Holzapfel, 1997 ;
Axelsson, 2004 ; Pot et al., 2008).
Les bactéries lactiques bénéficient d’un statut GRAS (Generally Reconized As Safe) et
jouent un rôle très important en industrie agroalimentaire et en santé. De nombreuses espèces
de ces bactéries sont impliquées dans la fabrication et la conservation des aliments à partir de
matières premières agricoles dans lesquelles elles sont présentes comme contaminants ou
ajoutées, volontairement, comme starters pour contrôler les processus de fermentation (Stiles
et Holzapfel, 1997 ; Leroy et de Vuyst, 2004 ; Pot et al., 2008). Ces processus contribuent
aux propriétés organoleptiques, rhéologiques et nutritionnels des aliments fermentés (Leroy et
de Vuyst, 2004) et produisent des acides organiques et d’autres composés antimicrobiens ce
qui a pour conséquence d’inhiber la croissance des bactéries indésirables voire pathogènes
4
Introduction
(Slover, 2008 ; Mäyra-Mäkinen et al., 2004 ). D’autres applications industrielles de ces
bactéries, tels que le traitement des déchets et la production de diverses molécules (enzymes,
métabolites,…), sont connues (De Roissart et Luquet, 1994). D’une autre part, certaines de
ces bactéries, qui sont des hôtes normaux du tube digestif, sont connues d'exercer des effets
bénéfiques pour la santé ; c’est la raison pour laquelle elles sont de plus en plus utilisées sous
forme de probiotiques (Ouwehand et al., 2002).
Il est important de signaler que le caractère pathogène des bactéries lactiques est
extrêmement réduit puisque seules certaines espèces peuvent causer des infections chez
l’Homme, et cela dans des situations particulières tel est le cas avec des malades
immunodéprimés ou ceux recevant une antibiothérapie (Wessels et al., 2004).
1.1.2. Classification :
La classification des bactéries lactiques est basée sur leurs critères morphologiques et
écologiques et sur leurs propriétés physiologiques (croissance à des températures différentes,
capacité de croître à une concentration élevée en sel, mode de fermentation du glucose,…)
(Stiles et Holzapfel, 1997 ; Axelsson, 2004 ; Pot et al., 2008) et moléculaires (Axelsson,
2004).
Ce groupe microbien comprend actuellement environ 20 genres (Pot et al., 2008) dont les
principaux sont : Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,
Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus,
Weissella et Bifidobacterium (Stiles et Holzapfel, 1997 ; Axelsson, 2004 ; Pot et al., 2008).
Les bactéries appartenant à ces genres sont regroupées, selon la composition de leur ADN en
bases nucléotidiques GC, sous deux branches : celle des Actinomycètes qui est représentée
par le genre Bifidobacterium ayant un pourcentage en bases GC supérieur à 55 % et celle des
Clostridies qui regroupe toutes les bactéries à % GC inférieur à 55 % (Axelsson, 2004 ; Pot et
al., 2008 ).
1.1.2.1. Lactococcus : les lactocoques sont des bactéries coccoides. Elles produisent l’acide
lactique de forme L (+) par métabolisme homofermentaire et elles sont couramment présentes
dans les produits fermentés, mais certaines espèces, notamment Lc. lactis, sont souvent
isolées des végétaux (Axelsson, 2004). Parmi les cinq espèces appartenant à ce genre, seule
5
Introduction
les souches de Lc. lactis sont utilisées comme starters dans la fabrication de divers produits
fermentés, notamment les produits laitiers (Floréz et al, 2008).
1.1.2.2. Vagococcus : les espèces de ce genre sont distinguées des lactocoques par leur
composition en acides gras (Axelsson, 2004). Elles sont isolées à partir des excréments des
poulets, des eaux des fleuves et des truites malades (Dellaglio et al., 1995).
1.1.2.3. Streptococcus : ce genre est essentiellement représenté par l’espèce S. thermophilus.
Les bactéries de cette espèce sont des coques lactiques thermophiles isolés à partir des
produits laitiers, mais certaines souches ont été récemment trouvées dans des plantes
(Delorme, 2008). Elles sont largement utilisées comme cultures starter dans la fabrication des
yaourts et de certains fromages (Axelsson, 2004 ; Delorme, 2008). Ainsi, des combinaisons
d’espèces probiotiques contenant S. thermophilus ont été décrites comme ayant des effets
positifs sur la diarrhée chez les jeunes enfants et l'entérocolite chez les nouveaux nés
prématurés (Delorme, 2008).
1.1.2.4. Enterococcus : les entérocoques sont des coques homofermentaires groupés en paires
ou en chaînettes. Les espèces de ce genre occupent une grande variété de niches écologiques
dont les sols, les eaux et les plantes ; elles font également partie de la microflore intestinale de
l’Homme et des animaux, et sont couramment trouvées dans les produits fermentés comme
contaminants ou bien ajoutées en tant que starters (Franz et Holzapfel, 2004). Cependant, ces
espèces ne bénéficient pas du statut GRAS. En effet, la plupart d’entre elles, en particulier En.
faecalis et En. faecium, sont habituellement associées à des infections humaines (Franz et
Holzapfel, 2004 ; Ogier et Serror, 2008).
1.1.2.5. Aerococcus : ce genre est constitué de bactéries coccoides formant des tétrades
(Axelsson, 2004). Ce sont des saprophytes microaérophiles (Dellaglio et al., 1995 ; Axelsson,
2004) groupés en cinq espèces qui n’ont pas de grande importance en technologie alimentaire
(Axelsson, 2004).
1.1.2.6. Pediococcus : les bactéries de ce genre sont des coques formant des tétrades,
acidophiles et homofermentaires. On les trouve dans les végétaux frais ou leurs dérivés
fermentés, dans le fourrage, la peau, les cavités, le tractus ou les sécrétions d’animaux. Parmi
les espèces de ce genre, P. acidilactici et P. pentosaceus sont utilisées comme cultures starter
6
Introduction
pour la fabrication des saucisses, en ensilage et comme agents de maturation des fromages
(Axelsson, 2004).
1.1.2.7. Tetragenococcus : C’est des coques formant des tétrades. Seules deux espèces, T.
halophilus et T. muriaticus, sont actuellement reconnues. Ces bactéries sont extrêmement
tolérantes au sel (> 18% NaCl), cela leur attribue une grande importance en fermentation des
aliments à forte teneur en sel tel que la sauce de soja (Axelsson, 2004).
1.1.2.8. Leuconostoc : Ce genre regroupe des bactéries de forme coccoide ou coccobacillaire,
hétérofermentaires, produisant l'acide D-lactique à partir du glucose et ne produisant pas
l'ammoniac à partir de l'arginine (Axelsson, 2004). Ces bactéries sont habituellement
rencontrées sur les végétaux ainsi que les produits laitiers et carnés. Leur présence intervient
dans le goût et l’arôme des aliments et cela par production de certains composés aromatiques
comme l’acétoïne et le diacétyle ; c’est la raison pour laquelle certaines de ces espèces,
principalement Ln. mesenteroides subsp. cremoris, sont utilisées en industrie laitière. Ces
bactéries sont également importantes dans les fermentations spontanées de légumes
(Axelsson, 2004 ; Ogier et al., 2008). Cependant, certaines espèces peuvent également
provoquer la détérioration des aliments suite à la production de composés indésirables
(amines biogènes et dextrane) (Ogier et al., 2008).
1.1.2.9. Weissella : c’est des bactéries hétérofermentaires incluant des coques et des bacilles.
Elles se distinguent des bactéries du genre Leuconostoc par de nombreuses caractéristiques
telles que leurs modes de fermentation des sucres, la formation de dextrane et la croissance à
différents pH et températures différentes. De nombreuses espèces de ce genre semblent être
associées aux produits carnés (Axelsson, 2004).
1.1.2.10. Oenococcus : les bactéries de ce genre sont des coques lactiques qui se distinguent
des leuconostocs par leur tolérance extrème à l’acide et à l’éthanol (Axelsson, 2004).
1.1.2.11. Lactobacillus : c’est le groupe le plus grand et le plus hétérogène parmi tous les
genres lactiques. Il regroupe des bactéries, en forme de bâtonnets ou de coccobacilles, homo
ou hétérofermentaires qui sont les plus tolérantes à l’acide (Axelsson, 2004). Ces bactéries
sont les plus ubiquitaires, elles sont présentes chez l’Homme, les animaux et les plantes
(Axelsson, 2004 ; Bernardeau et al., 2008). Elles sont ainsi très utilisées en industrie
7
Introduction
alimentaire (ferments lactiques pour produits fermentés) et en tant que probiotiques
(Axelsson, 2004 ; Bernardeau et al., 2008).
1.1.2.12.
Carnobacterium :
ce
sont
des
bacilles
à
métabolisme
principalement
hétérofermentaires. Ils se distinguent des lactobacilles par leur croissance à des pH élevés
(jusqu’à pH 9) et par leur composition en acides gras. Ces bactéries sont typiquement trouvées
dans les viandes et les produits carnés (Axelsson, 2004).
1.2. Les antibiotiques :
Depuis celle donnée par Waksman en 1942, la définition d’un antibiotique a connu plusieurs
évolutions. À l’heure actuelle, le terme antibiotique désigne toute substance naturelle ou
synthétique,
d’origine
microbienne
ou
dérivée
chimiquement,
capable
d'inhiber
spécifiquement la vitalité des micro-organismes (Walsh, 2003 ; Zomahoun, 2005).
Les antibiotiques agissent à faibles doses et doivent présenter certains caractères pour être
actifs sur les micro-organismes : ils doivent pénétrer tout d’abords dans la cellule, ensuite
rencontrer leur cible et perturber la physiologie bactérienne, et ils ne doivent subir aucune
transformation capable de les inactiver au cours de leur contact avec la cellule (Ogawara,
1981 ; Zomahoun, 2005).
Ces molécules peuvent être classées selon différents critères :
L’origine : les antibiotiques sont élaborés par un organisme vivant ou produits par synthèse
(Yala et al., 2001).
La nature chimique : ce critère permet de classer les antibiotiques en différentes familles
(aminosides, macrolides, phénicolés, bétalactamines,…) au sein desquelles peuvent exister
des groupes ou sous-groupes. En général, à une parenté structurale s'associera un même mode
d’action (sur une même cible) et un même mécanisme de résistance (Courvalin, 2008).
Le mode d’action : Les différentes classes d’antibiotiques agissent à différents niveaux chez
la bactérie. Ils agissent notamment au niveau de la biosynthèse de la paroi bactérienne et des
protéines, du métabolisme des acides nucléiques, et au niveau de la membrane cytoplasmique
(Russell, 2002 ; Walsh, 2003).
Les modalités d’action : Les antibiotiques peuvent entraîner la mort des bactéries
(antibiotiques
bactéricides)
ou
seulement
inhiber
leur
croissance
(antibiotiques
bactériostatiques) (Walsh, 2003).
8
Introduction
Le spectre d’activité : c’est la liste des espèces sur lesquelles les antibiotiques
antibiotiques sont actifs
(voir annexe). Il peut être étroit ou large, c’est-à-dire
c’est dire qui englobe une clientèle précise de
bactéries ou une large gamme d’espèces (Bryskier, 1999).
1.2.1. Modes et modalités d’action des antibiotiques :
Comme le montre la figure
igure suivante, les antibiotiques ont divers modes d’action sur leurs
cibles.
Figure 1 : Résumé des principaux sites d’action des antibiotiques (Paquet
Paquet-Bouchard, 2006)
1.2.1.1. Les inhibiteurs de la synthèse du peptidoglycane :
Ces antibiotiques agissent
ssent soit en inhibant la synthèse des précurseurs de la paroi, soit en
inhibant le transfert de ces derniers sur un lipide porteur qui permet leur transport à travers la
membrane plasmique, ou encore en inhibant l'insertion des unités glycaniques précurseurs
précurse
de
la paroi.
•
Les bétalactamines :
Les antibiotiques appartenant à cette famille sont caractérisés par la présence du cycle
bétalactame. Ce sont des acides plus ou moins forts qui traversent difficilement la membrane
9
Introduction
bactérienne (Zomahoun, 2005) et qui ont une action bactéricide (Prescott, 2004). Ces
molécules agissent sur la paroi des bactéries en se fixant aux enzymes indispensables à la
formation du peptidoglycane « PG » (transpeptidases, glycosylases et carboxypeptidases)
appelés PLP ou protéines liant les pénicillines. En fait, ces enzymes lient l’antibiotique au
lieu de lier leurs substrats. Il s’ensuit un affaiblissement du PG et une lyse osmotique qui
mène à la mort bactérienne (Walsh, 2003 ; Mimoz, 2003). D’autre part, les antibiotiques de
cette famille peuvent activer les enzymes responsables de la dégradation naturelle du PG, les
autolysines ou muréine-hydrolases (Charpentier et Novak, 2000 ; Prescott, 2004). Les
bétalactamines n’agissent donc que sur les bactéries en croissance.
•
La fosfomycine :
Cette molécule possède une action bactéricide. Elle pénètre dans la bactérie par le système
de transport actif de l’α-glycerophosphate et du glucose-6-phosphate et agit en inhibant
MurA, la pyruvyl-transférase cytoplasmique qui est responsable de la formation de l’acide NAcétyl Muramique et cela de façon irréversible. Elle inhibe donc le premier stade de la
synthèse du peptidoglycane (El Zoeiby et Sanschagrin, 2003).
•
La bacitracine :
C’est un polypeptide cyclique (Tsuda et Yamashita, 2002), neutre et soluble dans l’eau
(Paquet-Bouchard, 2006). Cette molécule interfère avec les phospholipides de la paroi
bactérienne et perturbe la perméabilité membranaire en empêchant la déphosphorylation du
phospholipide indispensable à la synthèse du peptidoglycane (Ming et Epperson, 2002).
•
Les glycopeptides :
Ces antibiotiques inhibent la 2ème phase de la synthèse de la paroi des bactéries en
croissance, et ce après fixation précoce et irréversible aux parois bactériennes. En effet, ils
recouvrent le D-Ala-D-Ala terminal de l’UDP-N-acetylmuramyl-pentapeptide prêt à être
incorporé dans le peptidoglycane en cours d’élongation. En raison de leur volume, les
glycopeptides vont ainsi empêcher l’action des glycosyltransférases et des transpeptidases et
bloquer l’élongation du peptidoglycane. La grande taille de ces antibiotiques fait, également,
qu'ils ne peuvent pas emprunter les porines et sont donc, de ce fait, inactifs contre les
bactéries à Gram négatif (Mimoz, 2003 ; Zomahoun, 2005).
10
Introduction
1.2.1.2. Les inhibiteurs de la synthèse protéique :
Ces antibiotiques agissent préférentiellement sur la sous-unité 30S et/ou la sous-unité 50S
des ribosomes et cela au niveau de l'une des trois étapes principales de la traduction (Euzéby,
2007).
•
Les aminosides ou aminoglycosides :
Ce sont des antibiotiques bactériostatiques à faibles doses et bactéricides à fortes doses
(Zomahoun, 2005). La cible principale de ces molécules est le ribosome, et en particulier sa
sous-unité 30S. La plupart des aminosides se fixent aussi sur la sous-unité 50S. Cette fixation
sur le ribosome conduit à une altération de la synthèse des protéines (Mimoz, 2003 ;
Zomahoun, 2005). Ces molécules induisent également des erreurs de lecture de l’ARN
messager provoquant ainsi la synthèse de protéines anormales (Zomahoun, 2005).
•
Les tétracyclines :
Ce sont des molécules bactériostatiques ou bactéricides, qui se fixent sur la sous unité 30S
du ribosome et inhibent la fixation de l’aminoacyl-ARNt sur son site ribosomal (Zomahoun,
2005 ; Euzéby, 2007).
.
•
Les phénicolés :
Le chloramphénicol est un antibiotique hydrophile bactériostatique mais qui peut être
bactéricide sur certaines bactéries. Il se fixe à l’ARNr 23S sur la sous unité 50S du ribosome
et inhibe la formation des liaisons peptidiques. Ses antagonistes compétitifs sont les
macrolides et les lincosamides (Zomahoun, 2005).
•
Les macrolides, les lincosamides et les streptogramines (MLS) :
Ces antibiotiques sont bactériostatiques ou bactéricides selon leur concentration. Ils se
fixent sur la sous unité 50S du ribosome et bloquent les réactions de transpeptidation
(streptogramines inhibant la fixation des aminoacyl-ARNt) et/ou de translocation (macrolides
qui se fixent au niveau du site Aminoacyl) (Zomahoun, 2005 ; Philippon, 2006).
•
L’acide fusidique :
De structure stéroïdique, cet antibiotique a un effet bactériostatique. Il inhibe la synthèse des
protéines en agissant sur le facteur d'élongation de la traduction EF-G (substance responsable
11
Introduction
de la translocation de la chaîne des peptides durant la synthèse des protéines) ; ceci entraîne le
blocage de la traduction de l’ARN messager au niveau de la sous unité 50S du ribosome
(Zomahoun, 2005 ; Philippon, 2006).
1.2.1.3. Les inhibiteurs de la synthèse des acides nucléiques :
Les antibiotiques de cette catégorie agissent à différents niveaux du métabolisme des acides
nucléiques.
•
Les quinolones et fluoroquinolones :
Ces molécules ont une action bactéricide. Après leur pénétration dans la membrane externe
des bactéries, elles inhibent la réplication de l’ADN. En effet, les quinolones agissent sur les
topoisomérases (ADN gyrases) qui sont des enzymes régulant les changements de formes
topologiques de l’ADN. Il s’en suit alors la formation d’un complexe ADN gyrase-Quinolone.
C’est ainsi que ces antibiotiques empêchent la réplication, la transcription, la recombinaison
et la réparation au niveau du noyau cellulaire inhibant donc la synthèse de l’ADN (Mimoz,
2003 ; Zomahoun, 2005 ; Euzéby, 2007). Ces molécules sont très utilisées dans le monde
animal notamment chez les volailles et les poissons d’élevage (Courvalin, 2008).
•
Les rifamycines (Ansamycines) :
Ce sont des antibiotiques bactéricides. Ils se fixent sur l’ARN polymérase en formant un
complexe Irréversible ce qui bloque la formation de l’ARN messager (Zomahoun, 2005;
Euzéby, 2007).
•
La mupirocine :
Cet antibiotique inhibe l’isoleucyl-ARN-synthétase qui permet la synthèse de l’ARN de
Transfert (Podie-Magne, 1999).
1.2.1.4. Les inhibiteurs de la synthèse des folates :
•
Les sulfamides et les diaminopyrimidines :
La bactérie édifie l’acide folique à partir de l’acide para-amino-benzoïque, l’acide
glutamique et la ptéridine grâce à la dihydroptéroate synthétase. L’acide folique ainsi secrété
doit être réduit par une dihydrofolate réductase en tétrahydrofolate.
Les sulfamides tel que la sulfadiazine et la Sulfadoxine, qui sont des antibiotiques
bactériostatiques, inhibent compétitivement
la dihydroptéroate synthétase (DHPS) et
12
Introduction
bloquent ainsi la synthèse de l’acide folique. De leur part, le triméthoprime et la
pyriméthamine (diaminopyrimidines) inhibent la dihydrofolate réductase (DHFR) et bloquent
également la synthèse du folate. Ceci explique la synergie d’action entre les sulfamides et les
triméthoprimes (Zomahoun, 2005 ; Euzéby, 2007).
1.2.1.5. Les antibiotiques qui provoquent l’altération des membranes :
•
Les polymyxines :
Elles appartiennent à la classe des polypeptides cycliques. Elles agissent comme des
détergents cationiques : grâce à leur caractère amphipathique, elles pénètrent dans la cellule
bactérienne et s'insèrent parmi les phospholipides des membranes externes et cytoplasmiques,
ce qui entraine la désorganisation de celles-ci et perturbe la perméabilité membranaire
(Zomahoun, 2005).
•
La gramicidine :
Cet antibiotique réagit, également, avec les phospholipides et détruit la membrane
cytoplasmique (Podie-Magne, 1999).
1.2.1.6. Les antibiotiques agissant par inhibition compétitive :
Il existe certains antibiotiques qui agissent par inhibition compétitive (au cours des étapes
du métabolisme intermédiaire), parmi lesquels on cite les sulfamides et l’isoniazide qui sont,
respectivement, des analogues de vitamines et du NAD (Philippon, 2006).
1.2.2. Usage des antibiotiques et ses conséquences:
Les antibiotiques sont utilisés comme phytopharmaceutiques sur des plantes, comme
adjuvants alimentaires pour l’accélération de la croissance et en tant que médicament et
agents prophylactiques chez les animaux d'élevage, et aussi comme agents thérapeutiques
chez l'homme (Wegener, 2003 ; Levy et Marshall, 2004 ; Kastner et al., 2006 ; Flórez et al.,
2008). En Algérie, par exemple, les antibiotiques représentent 38% du marché de
médicaments vétérinaires (Bouguedour, 2008) et ils englobent les pénicillines, les
céphalosporines, les cyclines, les aminosides, les macrolides, les lincosamides, les quinolones
et fluoroquinolones, les furanes, les phénicolés, les polymyxines, les sulfamides, les
imidazolés, le triméthoprime, l’acide fusidique, la bacitracine et d’autres (Zeghilet, 2009). En
13
Introduction
effet, l’antibiotique le plus fréquemment utilisé en thérapeutique vétérinaire est
l’Oxytétracycline (80%) (Akloul, 2008).
Ces modes d'utilisation des antibiotiques influent fortement sur le nombre d'organismes
résistants qui se développent. D'autres
D'a
facteurs contribuent également à cette résistance dont
les
diagnostics
incorrects,
les
prescriptions
abusives
et
l'utilisation
inappropriée
d'antibiotiques par les patients, les cultivateurs ou les éleveurs, par exemple en complément
alimentaire pour une croissance
croissance accélérée des animaux d'élevage (ANMV, 2008). Cette
dernière utilisation a conduit à la sélection de bactéries résistantes aux antibiotiques parmi
celles de la microflore intestinale des animaux traités (Teuber, 2001; Wegener, 2003) avec
possibilité de transmission
ransmission potentielle de la résistance à l'Homme par le biais de la chaîne
alimentaire (Witte, 1997 ; Teuber, 2001; Wegener, 2003).
2003 Cette transmission constitue une
grande menace puisqu’elle peut être à l’origine de l'émergence et la propagation de la
résistance chez les bactéries pathogènes qui deviennent, par conséquent, insensibles aux
traitements par les antibiotiques (Mathur
(
et Singh, 2005).
La figure suivante illustre bien le réseau à travers lequel les gènes de résistance aux
antibiotiques sont disséminés :
Figure 2 : Réseau de transfert de résistance aux antibiotiques (Witte, 2000)
14
Introduction
1.3. La résistance bactérienne aux antibiotiques :
Une souche est dite résistante lorsqu’elle peut croître en présence d’une concentration
d’antibiotique beaucoup plus élevée que celle qui inhibe le développement de la majorité des
autres souches de la même espèce (Zomahoun, 2005).
Il existe deux grands types de résistance aux antibiotiques, la résistance intrinsèque et la
résistance acquise :
- Résistance naturelle ou intrinsèque :
Cette résistance, généralement chromosomique, est présente chez toutes les souches d’une
même espèce ou d’un même genre bactérien. Elle délimite le spectre d’action des
antibiotiques et elle est due soit à une absence de cible pour l’antibiotique soit à une
imperméabilité de la paroi à cet antibiotique (Levy et Marshall, 2004 ; Zomahoun, 2005 ;
Courvalin, 2008). Cette résistance n’est pas transférable horizontalement et elle ne présente
donc aucun risque chez les bactéries pathogènes (Normark et Normark, 2002 ; Levy et
Marshall, 2004 ; Mathur et Singh, 2005).
- Résistance acquise :
Cette résistance ne concerne que quelques souches, d’une même espèce ou d’un même
genre, normalement sensibles à un antibiotique donné (Zomahoun, 2005 ; Mathur et Singh,
2005 ; Courvalin, 2008). Elle est due à des modifications génétiques chromosomiques ou
extrachromosomiques : mutations sur des gènes existants (gènes codant pour des cibles des
antibiotiques, gènes régulateurs…) ou incorporation de nouveaux gènes codant à des
mécanismes de résistances (Levy et Marshall, 2004 ; Zomahoun, 2005 ; Mathur et Singh,
2005). Ces gènes peuvent être originaires des micro-organismes producteurs d’antibiotiques
(Davies, 1997) ou bien des gènes dont les produits originaux jouent un rôle dans le
métabolisme bactérien mais qui ont subi des mutations à plusieurs reprises qui ont changé
leurs substrats de substrats appropriés à des voies de biosynthèse ou biodégradation à des
antibiotiques (Davies, 1994). Cette résistance peut être disséminée par transfert horizontal
entre bactéries (Mathur et Singh, 2005).
Le développement de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries est basé
principalement sur deux facteurs : la présence de gènes de résistance et la pression de
sélection imposée par l'utilisation des antibiotiques (Levy, 1992). Cette pression joue un rôle
clé dans l'émergence de bactéries résistantes : quand une population bactérienne mixte est
15
Introduction
exposée à des antibiotiques, il est probable qu'il y aura des bactéries résistantes à la
concentration appliquée de ces agents. Cependant, sous la pression de sélection, le nombre de
ces bactéries va augmenter et certaines d’elles peuvent transmettre leurs gènes de résistance à
d’autres membres de la population (Aarestrup, 1999).
1.3.1. L’antibiorésistance chez les bactéries lactiques :
Les aliments fermentés ou non, qui ne subissent pas de traitement avant leur consommation,
peuvent constituer un véhicule pour les bactéries résistantes aux antibiotiques en conférant
ainsi un lien direct entre la microflore indigène des animaux et celle du tractus gastrointestinal de l’Homme (Mathur et Singh, 2005). En effet, ces produits contiennent des
bactéries lactiques qui pénètrent en grand nombre dans nos intestins et interagissent avec
notre flore intestinale ; il se peut que certaines de ces bactéries soient porteuses de gènes
d’antibiorésistance potentiellement transmissibles et il est possible que cette résistance soit
transmise à des populations bactériennes humaines, notamment opportunistes et pathogènes, à
travers la chaine alimentaire (Mathur et Singh, 2005 ; Ammor et al., 2007). Ainsi, ces
bactéries occupent, comme a été déjà indiqué, une grande variété d’habitats ce qui augmente
les
possibilités
de leur implication
dans
le phénomène d’antibiorésistance.
De
même, l’introduction commerciale de probiotiques contenant des souches résistantes aux
antibiotiques peut également avoir des conséquences négatives dans le cas ou la résistance est
transférée à des pathogènes intestinaux (Mathur et Singh, 2005).
1.3.1.1. Génétique de l’antibiorésistance chez les bactéries lactiques :
La sensibilité réduite à certains antibiotiques n'est pas une caractéristique inhabituelle des
bactéries lactiques. Plusieurs de ces résistances peuvent être dues à des caractéristiques
intrinsèques complexes tels que les propriétés métaboliques des bactéries (Kastner et al.,
2006), et à la présence d’un grand nombre de ces bactéries dans les produits fermentés et le
tractus gastro-intestinal favorisant ainsi l’apparition de différents mécanismes de résistance
par mutations (Ammor et al., 2007). Les données disponibles sur les résistances intrinsèques
chez les bactéries lactiques sont relativement rares ; le tableau 1 en illustre quelques unes.
Cependant, il existe toujours des différences entre et à l’intérieur des espèces.
Ces bactéries peuvent également, comme a été déjà évoqué, acquérir des gènes de résistance
provenant des autres bactéries de l’écosystème dont elles font partie. Ces gènes peuvent être
portés sur le chromosome principal de la bactérie ou sur des éléments génétiques mobiles
16
Introduction
(plasmides, transposons, intégrons), et ils ont, dans tous les cas, la capacité de se transmettre
entre les bactéries qui, du coup, acquièrent l’élément responsable de leur nouvel état de
résistance face à tel ou tel antibiotique (Davies, 1994 ; Tremblay, 2007).
Tableau 1 : Quelques résistances naturelles rencontrées chez les bactéries lactiques
Espèces
Entérocoques
Lactobacilles
Certains lactobacilles
Pédiocoques
Leuconostocs
Streptocoques
Antibiotiques
céphalosporines, faibles
concentrations d’aminosides
et de clindamycine
vancomycine*
vancomycine*, bacitracine,
céfoxitine et ciprofloxacine,
acide fusidique, kanamycine
et gentamicine,
métronidazole,
nitrofurantoïne,
norfloxacine, streptomycine,
sulfamides
vancomycine*
Références
Knudtson et Hartman, 1993 ;
Teuber et al., 1999
Simpson et al., 1988 ;
Hamilton-Miller et Shah,
1998
Danielsen et Wind, 2003
Simpson et al., 1988 ;
Hamilton-Miller et Shah,
1998
vancomycine*
Simpson et al., 1988 ;
Hamilton-Miller et Shah,
1998
aminoglycosides, péfloxacine Euzéby, 2007
* La résistance élevée des lactobacilles, pédiocoques et Leuconostocs à la vancomycine est considérée
comme un critère d’identification qui leur distingue des autres bactéries Gram positives (Simpson et
al., 1988 ; Hamilton-Miller et Shah, 1998).
-
Le chromosome :
La taille du chromosome des bactéries lactiques avait été estimée entre 1,8 et 3,4 Mb selon
les espèces, et elle peut varier sensiblement au sein d’une même espèce (Davidson et al.,
1996). A titre d’exemple, Lb. plantarum et En. Faecalis possèdent les plus grands
chromosomes avec une taille aux environs de 3,4 Mb (Renault, 2008) et ceux de Lc. lactis
IL1403 et Lb. gasseri ATCC 33323 ont des tailles de 2,42 Mb et 1.96 Mb, respectivement
(Morelli et al., 2004).
17
Introduction
Les gènes portés par les chromosomes de ces bactéries sont généralement ceux
indispensables à la survie de ces dernières (Luquet, 1994). Toutefois, Danielsen (2002) a
démontré que le gène de résistance à la tétracycline tetM détecté chez six différentes souches
de lactobacilles n’est pas porté par des plasmides mais il est probablement situé sur le
chromosome.
-
Les plasmides :
Les plasmides sont des ADN circulaires ou linéaires, de tailles inférieures à 400 kb,
autoréplicatifs, qui peuvent exister séparément du chromosome bactérien ou y être intégrés
(Prescott, 2004 ; Morelli et al., 2004 ; Renault, 2008). Ces ADN, confèrent souvent des
avantages importants à leurs cellules hôtes grâce aux gènes qu’ils peuvent porter et qui codent
pour des propriétés diverses telles que la fermentation des sucres, l'hydrolyse des protéines, la
production d'exopolysaccharides et la résistance aux antibiotiques (Prescott, 2004 ; Morelli et
al., 2004 ; Mathur et Singh, 2005 ; Renault, 2008).
Une souche peut contenir un voire plusieurs plasmides, les lactobacilles par exemple
peuvent contenir de un jusqu’à seize molécules par souche (Mathur et Singh, 2005 ; Renault,
2008). Ainsi, chaque plasmide peut exister en un nombre spécifique de copies allant de une à
deux copies pour les molécules de grandes tailles jusqu’à plusieurs copies pour celles qui sont
petites (Clewell, 2005).
Ces molécules sont divisées en deux catégories : la première regroupe les plasmides
conjugatifs qui portent des gènes qui leur permettent d’engendrer leur propre transfert par
conjugaison (Lanka et Wilkins, 1995) ; ces plasmides sont fréquents chez les entérocoques,
les lactocoques, les leuconostocs, les pédiocoques et certaines souches de lactobacilles
(Davidson et al., 1996). Et la deuxième est celle des plasmides non conjugatifs ou
mobilisables qui ne peuvent être transférés entre les cellules que par des plasmides conjugatifs
(Lanka et Wilkins, 1995), des facteurs chromosomiques F (chromosomally encoded sex-like
factors) (Gasson et al., 1995) ou des bactériophages (Poyart, 2003).
Les plasmides de résistance (plasmides R) peuvent porter de un jusqu'à une dizaine de gènes
de résistance (Prescott, 2004 ; Zomahoun, 2005) et sont en constante évolution et leurs
déterminants de résistance sont souvent modifiés par des transposons, des recombinaisons
18
Introduction
homologues ou des intégrations de cassettes d'intégrons (Prescott, 2004). Des exemples de ces
plasmides sont montrés dans le tableau suivant :
Tableau 2 : Exemples de plasmides portant des gènes de résistances aux antibiotiques
Plasmides
Conjugatifs
pK214
(30 kb)
pRE25
(49 kb)
pAMβ1
(26.5 kb)
Non conjugatifs
pLFE1
(40,31 kb)
pCAT
pMD5057
(10,9 kb)
pLME300
-
Souches hôtes
Résistances
codées
Lactococcus lactis Streptomycine
K214
(str), Tétracycline
(tetS),
Chloramphénicol
(cat), MacrolidesLincosamidesStreptogramines
(mdtA)
Enterococcus
Chloramphénicol
faecalis RE25
(cat), cinq
différents
Macrolides et deux
Lincosamides
(ermB), trois
Aminosides
Enterococcus
Macrolidesfaecalis
LincosamidesStreptogramines
Lactobacillus
Erythromycine
plantarum M345
(erm B)
Lactobacillus
Chloramphénicol
plantarum
(cat)
caTC2R
Références
Perreten et al., 1997a ;
Perreten et al., 2001
Schwarz et al., 2001 ;
Mathur et Singh, 2005
Clewell et al., 1974
Feld et al., 2008
Ahn et al., 1992
Lactobacillus
plantarum 5057
Tétracycline (tetM)
Danielsen, 2002
Lactobacillus
fermentum ROT1
Erythromycine
(erm),
Streptogramine A
Gfeller et al., 2003
Les transposons :
Les transposons sont des séquences d’ADN de taille allant de 16 à 70 kb, ayant comme
caractéristique d’être capables de se déplacer d’une molécule d’ADN (chromosome ou
19
Introduction
plasmide) à une autre ou d’un site à un autre à l’intérieur de la même molécule (Mahillon et
Chandler, 1998 ; Zomahoun, 2005 ; Mathur et Singh, 2005).
Ces éléments peuvent être constitués de séquences simples appelées séquences d'insertion
(IS) dont la taille est généralement inférieure à 2,5 kb. Les IS ne contiennent que les gènes
nécessaires à la transposition, qui sont flanqués par des séquences répétées inversées courtes.
Il existe également des transposons dont la structure est beaucoup plus complexe, ce sont les
transposons composites qui contiennent des gènes supplémentaires flanqués par des
séquences IS (Morelli et al., 2004 ; Renault, 2008).
Les transposons peuvent être conjugatifs en raison de leur structure modulaire qui fait qu’un
antibiotique auquel ils confèrent la résistance peut stimuler spécifiquement leur transfert par
conjugaison d’une bactérie à une autre (Fitzgerald et Gasson, 1988 ; Doucet-Populaire et al.,
1991, Ammor et al., 2007). Ces transposons semblent être un moyen extrêmement important
de dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques puisqu’ils ne se répliquent pas,
affrontés à des problèmes d’exclusion ou d’incompatibilité comme est le cas avec les
plasmides (Ammor et al., 2007).
Chez les bactéries lactiques, les transposons conjugatifs codant des résistances aux
antibiotiques n’ont été rapportés que chez les entérocoques et les streptocoques où ils codent
pour des résistances aux chloramphenicol (cat), tétracycline (tetM), érythromycine (ermAM,
ermB) et kanamycine (aphA-3) (Perreten et al., 1997b ; Huys et al., 2004 ; Mathur et Singh,
2005). Parmi ces transposons on peut citer : Tn916, Tn917, Tn918, Tn920, Tn925 et Tn2702
chez En. faecalis, Tn5233 chez En. faecium, Tn1545 chez En. sp. et Tn93951 chez S.
agalactiae (Mathur et Singh, 2005).
-
Les intégrons :
Les intégrons sont des éléments génétiques contenant un ou plusieurs gènes de résistance
sous forme de cassettes. L’intégron lui-même est une structure immobile, dépourvue de
réplication autonome, portée par des plasmides, des transposons ou plus rarement sur le
chromosome des bactéries. Ce sont les cassettes qui constituent les unités mobiles qui peuvent
être facilement intégrées dans un intégron par un mécanisme de recombinaison à site
spécifique (Ploy et al., 2005 ; Tremblay, 2007 ; Courvalin, 2008).
20
Introduction
Un intégron est constituée d’un gène intI, codant une intégrase chargée d'exciser et
d'intégrer les cassettes, d’un site de recombinaison spécifique nommé attl où l'intégrase va
intégrer préférentiellement les cassettes et d’un promoteur Pc qui permet l’expression des
cassettes. Les cassettes elles-mêmes contiennent un autre élément de recombinaison nommé
attC qui est aussi reconnu par l'intégrase (Ploy et al., 2005 ; Tremblay, 2007).
Ces éléments ont été principalement étudiés chez les bactéries Gram négatives mais ils ont
été également détectés chez certaines bactéries à Gram positif (corynebactéries et
entérocoques) (Ploy et al., 2005 ; Tremblay, 2007). A titre d’exemple, Clark et al. (1999) ont
pu mettre en évidence la cassette aadA1, codant la résistance à la streptomycine et à la
spectinomycine chez En. faecalis mais la structure de l’intégron n’a pas été entièrement
caractérisée.
1.3.1.2. Moyens du transfert des gènes de résistance :
La résistance peut être acquise soit par des mutations dans le génome, on parlera alors de
transmission verticale à la descendance, soit par l’acquisition de nouveaux gènes par transfert
horizontal (Davison, 1999 ; Courvalin, 2008). Les gènes de résistance qui ont pu être tracés
chez les bactéries isolées chez les animaux et celles isolées chez l’Homme sont non
distinguables. Il faut considérer a priori que le transfert horizontal de gènes de résistance
s’opère dans les deux sens entre les animaux et l’Homme (AFSSA, 2006). Ce transfert se fait
principalement selon trois axes qui sont la transformation, la transduction et la conjugaison.
-
La transformation :
La transformation bactérienne survient lorsque de l'ADN étranger présent dans le milieu
extracellulaire est absorbé dans une cellule dite «compétente», elle permet un brassage
génétique entre des bactéries très différentes (Joset et Guespin-Michel, 1993 ; Davison, 1999 ;
Prescott, 2004). La compétence des bactéries est un phénomène lié à la perméabilité de la
membrane, qui peut être induit (via des chocs électriques, thermiques ou des agents
chimiques) ou se retrouver naturellement chez certaines espèces, seulement, comme S.
pneumoniae et Bacillus subtilis. (Joset et Guespin-Michel, 1993 ; Prescott, 2004 ; Mathur et
Singh, 2005).
Ce phénomène naturel n'a été décrit chez les bactéries lactiques que chez Ln. carnosum
(Helmark et al., 2004); Cependant, un système de transformation partiellement opérationnel
21
Introduction
semblable à celui de S. pneumoniae a été identifié chez S. thermophilus (Blomqvist et al.,
2006) de même que des opérons de compétence naturelle chez Lc. lactis IL1403 (Bolotin et
al., 1999). Malgré ces découvertes, le mécanisme de transformation reste toujours mal connu
chez ce groupe bactérien mais il peut être induit artificiellement ; en effet, plusieurs auteurs
ont réussi à transformer des lactocoques (Holo et Nes, 1989), des lactobacilles (Badii et al.,
1989 ; Beasley et al., 2004 ; Ziane, 2008) et des pédiocoques (Caldwell et al., 1996 ; Ziane,
2008) par électroporation.
-
La transduction :
Ce mécanisme se produit lors de l'encapsidation erronée d'ADN génomique bactérien au
cours du cycle de réplication d'un bactériophage, puis de l'infection d'une autre bactérie par ce
phage. Dans le cas des phages tempérés, qui s’intègre dans le génome de l’hôte au cours de
leur cycle, la transduction peut être limitée aux gènes situés à proximité du site d’insertion.
On parle alors de transduction localisée, par opposition à la transduction généralisée au cours
de laquelle n’importe quel fragment de l’ADN de l’hôte est intégré dans les capsides
phagiques. Le matériel génétique ainsi transféré peut alors être intégré à son nouvel hôte par
recombinaison homologue (Joset et Guespin-Michel, 1993 ; Nicklin et al., 2000 ; Renault,
2008).
Ce mode de transmission d'ADN étranger est le premier à être exploité et utilisé pour le
transfert des caractères à intérêt technologique entre les différentes souches lactiques
(Fitzgerald et Gasson, 1988). Cependant, son importance en tant que moyen de diffusion des
gènes d’antibiorésistance est encore discutable en raison de la grande spécificité des phages
(Joset et Guespin-Michel, 1993 ; Morelli et al., 2004 ; Mathur et Singh, 2005 ; Ammor et al.,
2007).
-
La conjugaison :
Il s'agit d'un processus d'échange d'ADN se produisant lors d’un contact entre une cellule
donneuse et une cellule réceptrice (Joset et Guespin-Michel, 1993 ; Davison, 1999 ; Morelli et
al., 2004). La série de gènes nécessaires pour réaliser la conjugaison se retrouve souvent sur
un plasmide conjugatif porté par la cellule donneuse, mais peut également se retrouver au
niveau de son chromosome (Joset et Guespin-Michel, 1993 ; Clewell, 2005 ; Renault, 2008).
Chez les bactéries Gram positives, y compris les bactéries lactiques, le contact est établi
grâce à des mécanismes spécialisés telle que la production d’une protéine de surface par la
cellule donatrice, qui permet l’attachement de celle-ci à la cellule réceptrice. L’expression de
22
Introduction
cette protéine est induite par des phéromones de la cellule réceptrice (Clewell, 1993). Une fois
le contact établi, un plasmide ou une partie du chromosome possédant l'origine de transfert
(oriT) pourra être transmis (Joset et Guespin-Michel, 1993 ; Clewell, 2005).
Ce mécanisme est considéré comme le principal responsable des transferts horizontaux de
gènes de l’antibiorésistance (Teuber et al., 1999 ; Normark et Normark, 2002 ; Clewell,
2005). Les systèmes de conjugaison autochtones sont très communs chez les lactocoques ce
qui reflète l'abondance de plasmides chez ces bactéries (Mathur et Singh, 2005). Ainsi, la
littérature décrit plusieurs travaux qui montre la possibilité de conjugaison entre les autres
espèces de bactéries lactiques (Neve et al., 1984 ; Morelli et al., 1988 ; Dessart and Steenson,
1991 ; Igimi et al., 1996 ; Perreten et al., 1997b ; Teuber et al., 1999 ; Schwarz et al., 2001 ;
Gevers et al., 2003 ; Ouoba et al., 2008).
1.3.2. Mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries Gram positives :
Sur le plan biochimique, les bactéries ont développé de grands mécanismes qui empêchent
l’interaction de l’antibiotique avec sa cible (figure 3, tableau 3). Trois principaux types de
stratégies sont employées par les bactéries à gram positif, y compris les bactéries lactiques,
pour annuler l’effet des antibiotiques sur elles : l’inactivation ou la modification des
antibiotiques, la modification de la cible et l’efflux des antibiotiques à l’extérieur de la cellule
par des pompes énergie dépendantes (Walsh, 2003 ; Tenover, 2006).
Figure 3 : Illustration des mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries Gram
positives (Savard, 2008)
23
Introduction
Tableau 3 : Principaux mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries Gram
positives (Zomahoun, 2005; http://www.microbes-edu.com/index.html)
Mécanismes
de résistance
Antibiotiques
Protéines impliquées
Inactivation/
modification
enzymatique
- Aminosides
- Bétalactamines
- Chloramphénicol
- Macrolides
- Lincosamides
- Streptogramines A, B
- Acétyltransférases (AAC), Nucléotidyltransférases
(ANT), phosphotransférases (APH)
- Bétalactamases
- Acétyltransférases (VatA-E, Cat)
- Estérases, phosphotransférases ((mphA-C)
- Nucléotidyltransférases (LinA, LnuA, LinB....)
- Acétyltransférases, hydrolases
Efflux actif
(systèmes de
transport
membranaire)
Altération de la cible
- Aminosides
- Bétalactamines
- Altération des protéines ribosomales (Protéines L22…)
- Altération ou nouvelle protéine liant la pénicilline
(PLP2a)
- Macrolides, Lincosamides, - Méthylation de l’ARN ribosomal (Méthylases Erm)
Streptogramines
- Quinolones
- Altération de la topo-isomérase II et IV
- Rifampicine
- Altération de l’ARN-polymérase
- Sulfamides
- DHPS (dihydroptéroate synthétase) insensible
- Tétracyclines
- Protection ribosomale Tet(M)-(T)
- Triméthoprime
- DHFR (dihydrofolate réductase) insensible
- Glycopeptides
- Modification de la structure du précurseur du
peptidoglycane
- Bétalactamines
- Mex, Mar, AcrAB-TolC
- Macrolides
- MFS (MdtA), MsrA, ABC
- Lincosamides
- LsA
- Tétracyclines
- Tet(A)-(L)
- Quinolones
1.3.2.1. Inactivation ou modification de l’antibiotique :
Ce mécanisme se produit via la production, par les bactéries, d’enzymes capables de
détruire des liens chimiques nécessaires à l’intégrité fonctionnelle des antibiotiques
(modification ou hydrolyse). Les substrats de ces enzymes sont les bétalactamines, les
aminosides, le chloramphénicol, les macrolides, les lincosamides, les streptogramines et les
tétracyclines (Chopra, 2001 ; Zomahoun, 2005).
24
Introduction
-
Enzymes inactivant les bétalactamines :
La nature de ces enzymes, appelées bétalactamases, leurs différents types ainsi que leur
présence chez les bactéries Gram positives seront présentés en détail dans le chapitre 1.3.3.
-
Enzymes inactivant les aminosides :
Les aminosides peuvent être modifiés par l’ajout de trois types de groupements chimiques
sur leur structure par les enzymes intracellulaires aminosides Phosphotransférases (APH),
aminosides Nucléotidyltransférases (ANT) et aminosides N-Acétyltransférases (AAC) (Poole,
2002 ; Zomahoun, 2005). Ces modifications vont mener à l’acétylation, la phosphorylation et
l’adénylation de ces antibiotiques qui perdront donc la capacité de se fixer sur leur cible,
l’ARN du ribosome (Shaw et al., 1993 ; Zomahoun, 2005). Les gènes codant pour les
enzymes inactivant les aminosides sont, principalement, portés par des plasmides
autotransférables ou des transposons (Zomahoun, 2005), bien que certains semble être situés
sur le chromosome bactérien (Poole, 2002), et ils peuvent également coder pour la résistance
à d'autres antibiotiques (Zomahoun, 2005).
-
Enzymes inactivant les macrolides, lincosamides et streptogramines :
Ces enzymes ont une faible influence sur la fréquence de la résistance aux antibiotiques de
la famille des MLS. Chez les Staphylococcus, des enzymes inactivant l’érythromycine, les
streptogramines A et B ou les lincosamides ont été décrites (Zomahoun, 2005). Des
résistances à d’autres macrolides par inactivation enzymatique sont aussi connues (Poole,
2002).
-
Enzymes inactivant les chloramphénicols :
La résistance aux chloramphénicols résulte, typiquement, de l’action des chloramphénicol
acetyltransférases dont les gènes codant sont portés sur des plasmides présents chez certaines
espèces appartenant au genres Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria et Haemophilus
(Poole, 2002 ; Zomahoun, 2005).
-
Enzymes inactivant la tétracycline :
L’inactivation de cet antibiotique résulte de l’action des produits des gènes tetT et X. Ce
phénomène n’est connu que dans quelques rares cas (Poole, 2002).
25
Introduction
1.3.2.2. Modification de la cible :
-
Modification des sites de fixation sur le peptidoglycane :
Les bactéries peuvent produire de nouvelles PLPs ou y introduire des mutations. Dans les
deux cas, les PLPs auront moins d’affinité pour les bétalactamines (Hakenbeck et al., 1999 ;
Walsh, 2000). Ce mécanisme de résistance est le plus fréquent chez les bactéries à Gram
positif qui ne synthétisent pas ou rarement de bétalactamases (Poole, 2002). A titre
d’exemple, la résistance des entérocoques aux pénicillines peut être en relation avec une
hyperproduction (modification mutationnelle) de PLP d'affinité médiocre telle que les PLP3
(Zomahoun, 2005).
Une résistance au glycopeptides peut, également, résulter de l’altération des sites de fixation
de ces antibiotiques sur le peptidoglycane (Wright, 2003). La résistance à la vancomycine, par
exemple, est due à la synthèse de pentapeptides anormaux possédant à leur extrémité un Dala-D-ser ou D-ala-D-lactate à la place du D-ala-D-ala. Cette synthèse est catalysée par les
produits des gènes van (Cetinkaya et al., 2000) portés par le transposon Tnl546 (Tremblay,
2007).
-
Modification de la cible ribosomale :
Toute modification acquise par mutation de la cible ribosomale diminue l’affinité du site de
fixation de l’antibiotique et rend la bactérie résistante. Ainsi on peut observer des résistances
aux :
Macrolides et lincosamides :
La résistance aux macrolides et lincosamides, la plus fréquemment rencontrée, se manifeste
par la méthylation de l’ARNr 23S par des ARN méthylases (Leclercq et Courvalin, 1991 ;
Schmitz et al., 2000 ; Poole, 2002) dont les gènes codant erm (erythromycin resistance
methylase) sont situés sur des plasmides ou des transposons (Leclercq et Courvalin, 1991).
Tétracyclines :
Les gènes de résistance à la tétracycline tel que tetM et tetL codent pour un mécanisme de
« protection ribosomale », encore mal compris, qui empêche l’association de la tétracycline
avec sa cible ribosomale (Chopra et Roberts, 2001). Ces déterminants peuvent être portés par
le chromosome, des plasmides, des transposons ou des intégrons (Chopra, 2001).
26
Introduction
Aminosides :
La résistance à ces antibiotiques peut résulter de mutations au niveau de leur cible
ribosomale (Poole, 2002). C’est ainsi que les streptomycines deviennent inefficaces à la suite
d’une mutation dans la protéine S12 du ribosome (Hogg, 2005). Ce mécanisme est moins
rarement rencontré par rapport à celui de l’inactivation enzymatique (Zomahoun, 2005).
-
Modification des enzymes intervenant lors de la synthèse des acides nucléiques :
Des mutations dans les gènes gyrA, gyrB (sous-unités A et B de l’ADN gyrase), parC et
parE (sous-unités C et E de la topoisomérase IV) peuvent entraîner la production d’ADN
gyrases et de topoisomérases insensibles à l’action des quinolones et fluoroquinolones. Elles
peuvent également mener à la production d’une transcriptase modifiée qui est à l’origine des
résistances aux rifamycines ((Edgar et Bibi, 1997 ; Zomahoun, 2005), et à la production de
DHPS et DHFR insensibles à l’action des sulfamides et du triméthoprime, respectivement ; la
résistance à ces derniers antibiotiques peut être, également, codée par des plasmides ou des
transposons (Zomahoun, 2005).
1.3.2.3. Pompes à efflux actif :
Il s'agit de transporteurs protéiques transmembranaires qui tirent leur énergie soit de la force
proton-motrice, soit de l’hydrolyse de l’ATP. Leur fonction native est d'éliminer à l'extérieur
de la bactérie des constituants inutiles à celle-ci et présents dans son cytoplasme. Ces pompes
moléculaires permettent une sortie d’antibiotique plus rapide que l’entrée ; ainsi, la
concentration intracellulaire d’antibiotique demeure à un niveau faible et inefficace (Edgar et
Bibi, 1997 ; Walsh, 2000 ; Courvalin, 2008). Ces pompes peuvent contribuer à des résistances
intrinsèques ou acquises (Poole, 2002).
27
Introduction
Figure 4 : Structure des systèmes d’efflux actif (Courvalin, 2008)
Quatre familles de pompes à efflux sont impliquées dans la résistance aux antibiotiques
(figure 4) : la famille ABC (ATP Binding Cassette) qui rassemble des transporteurs primaires
hydrolysant l’ATP, et les familles RND (Resistance Nodulation and cell Division), MSF
(Major Facilitation Superfamily) et SMR (Small Multidrug Resistance) qui correspondent à
des transporteurs secondaires utilisant le gradient de protons (H+) (Tremblay, 2007 ;
Courvalin, 2008).
Ces mécanismes peuvent être très spécifiques (résistance aux tétracyclines) ou d’une
spécificité médiocre et sont, donc, responsables de multirésistance (Courvalin, 2008). Ils
peuvent résulter d’un transfert de plasmides ou de transposons ou bien d’une surexpression,
suite à une mutation ou plus, d’un système résident codé par le chromosome (NorA de
Staphylococcus aureus) (Poole, 2002 ; Courvalin, 2008).
Chez les bactéries à gram positif, les pompes à efflux sont le plus souvent associées au
fluoroquinolones et à la tétracycline ; les pompes transportant ces derniers sont codées par les
gènes tet qui sont, généralement, portés sur un plasmide ou un transposon. Ce mécanisme est
également utilisé pour éliminer les macrolides (gènes mdtA et msrC), le Chloramphenicol
(gène cmlA ) et les bétalactamines (Walsh 2000 ; Poole, 2002).
Chez Lc. lactis K214, un transporteur multidrogues a été décrit. Il s’agit du LmrP,
transporteur proton dépendant, qui confère la résistance
aux macrolides, lincosamides
28
Introduction
streptogramines et tétracyclines, et qui est codé par le gène mdt (A) porté sur le plasmide
pK214 (Perreten et al., 2001). Ce dernier gène a été également détecté chez Lc. garvieae mais
il diffère du gène original de la première souche par deux mutations et par son emplacement
chromosomique (Walther, 2008).
1.3.3. Les bétalactamases :
Le mécanisme majeur de résistance aux bétalactamines, en particulier chez les bactéries à
Gram négatif, est la production de bétalactamases (Poole, 2004 ; Doi et Paterson, 2007),
enzymes qui hydrolysent la liaison amide du noyau bétalactame de ces antibiotiques en les
empêchant ainsi d'aller se lier à leurs cibles qui sont les protéines liant la pénicilline (PLPs)
(Walsh, 2000 ; Poole, 2004 ; Zomahoun, 2005).
Ces enzymes, très nombreuses et variées, sont définies par certains caractères (Zomahoun,
2005) qui sont :
- La localisation : elle est extracellulaire pour les bactéries Gram positives et périplasmique
pour les bactéries Gram négatives.
- La biogenèse : elle est inductible (pénicillinases du Staphylococcus aureus et
céphalosporinases des bactéries Gram négatives) ou constitutive (pénicillinases des bactéries
Gram positives).
- Le déterminisme génétique.
- La sensibilité aux inhibiteurs tels que l’acide clavulanique (les pénicillinases sont inhibées
par cet agent tandis que les céphalosporinases y résistent).
La résistance via la production de bétalactamases résulte soit de la dérépression naturelle ou
mutationnelle des gènes chromosomiques, ou bien de l'acquisition d’éléments génétiques
extrachromosomiques portant des gènes codants à ces enzymes. Les mutations peuvent être
individualisées soit au niveau des gènes de régulation soit au niveau des gènes de structure
codant pour ces enzymes (Poole, 2004 ; Zomahoun, 2005).
1.3.3.1. Classification des bétalactamases :
La classification moléculaire des bétalactamases (Classification d’Ambler) est basée sur la
similitude de leurs séquences nucléotidiques et celles d'acides aminés (Bradford, 2001).
Quatre classes moléculaires de bétalactamases sont connues (tableau 4), dont les
pénicillinases classe A, les métallo-bétalactamases classe B, les céphalosporinases classe C et
29
Introduction
les oxacillinases classe D. Les enzymes de classes A, C, et D ont la serine comme site actif
tandis que les enzymes de classe B ont besoin de l’ion zinc pour effectuer leur activité
catalytique (Poole, 2004 ; Doi et Paterson, 2007).
Tableau 4 : Classification et propriétés des bétalactamases (Poole, 2004)
30
Introduction
1.3.3.2. Les différents types de bétalactamases :
- Les pénicillinases :
Ces enzymes peuvent être produites par les bactéries Gram négatives comme par celle à
Gram positif. Elles ont pour substrat préférentiel les pénicillines (Zomahoun, 2005) et elles
peuvent appartenir aux classes A et D (Poole, 2004).
-
Les bétalactamases à spectre étendu (BLSE) :
Les BLSE sont typiquement codées par les plasmides mais elles sont également présentes
sur les chromosomes, souvent en association avec les intégrons. Elles sont généralement
inhibées par les inhibiteurs de bétalactamases, et sont produites par les bactéries Gram
négatives (Poole, 2004) auxquelles elles confèrent une résistance aux pénicillines,
céphalosporines (première, deuxième et troisième génération) et monobactams (Poole, 2004 ;
Akujobi et al., 2008), tout en conservant leur sensibilité aux céphalosporines de quatrième
génération et aux carbapénèmes (Poole, 2004). Ces enzymes dérivent, principalement, des
bétalactamases de classes A (TEM-1, TEM-2, SHV-1). Des BLSE de classe D (OXA) sont
également connues (Poole, 2004).
-
Les céphalosporinases :
Les céphalosporinases de classe C (AmpC) sont produites par de nombreuses bactéries
Gram négatives. Elles ont un large spectre d’activité contre la plupart des pénicillines et
céphalosporines incluant, dans de nombreux cas, les céphalosporines de quatrième génération
et les monobactams avec des spécificités variées (Poole, 2004 ; Sundin, 2009). Elles sont
inefficaces contre les carbapénèmes et relativement insensibles aux inhibiteurs de
bétalactamases (Poole, 2004).
Les gènes codant les AmpC ont une localisation chromosomique ou plasmidique (Poole,
2004 ; Sundin, 2009), et beaucoup d'entre eux sont associés à des intégrons et des transposons
(Walther-Rasmussen et Hoiby, 2002). Les plasmides codants les AmpC peuvent également
porter des déterminants de résistance à des antibiotiques autres que les bétalactamines
entrainant, ainsi, l’apparition de multirésistance (Poole, 2004).
31
Introduction
-
Les Carbapénémases :
La majorité des carbapénémases appartiennent aux bétalactamases de classes A et B (Poole,
2004). En plus des carbapénèmes, ces enzymes peuvent hydrolyser les pénicillines, les
céphalosporines et l'aztréonam et elles sont inhibées par l’acide clavulanique et le tazobactam
(Moland et al., 2008). Ces enzymes sont portés par les plasmides ou les chromosomes (Poole,
2004).
1.3.3.3. Les bétalactamases des bactéries à Gram positif :
Contrairement aux bactéries à Gram négatif, la résistance des bactéries Gram positives aux
bétalactamines se manifeste, le plus souvent, par l’altération de leurs cibles (Poole, 2004).
Cependant, certaines de ces bactéries sont également productrices de bétalactamases (Poole,
2004 ; Doi et Paterson, 2007).
Des pénicillinases chromosomiques et plasmidiques (ex : Blaz) sont répandues chez les
souches de Staphylococcus aureus (Dyke et Gregory, 1997). Une bétalactamase plasmidique
(Blaz), suggérée être originaire d’un staphylocoque, a été également décrite chez
Enterococcus faecalis (Smith et Murray, 1992). Des études sur Bacillus anthracis ont révélé
la présence de deux gènes chromosomiques bla1et bla2 (Chen et al., 2003) codant,
respectivement, pour une pénicillinase classe A et une métallo-bétalactamase (Materon et al.,
2003), mais elles sont faiblement exprimées (Chen et al., 2003). Il a été également rapporté
que les métallo-bétalactamases chromosomiques sont naturellement présentes chez de
nombreuses espèces de bactéries à Gram positif (Bradford, 2001).
32
Matériel et Méthodes
2.1. Souches bactériennes :
Les 83 souches lactiques utilisées dans cette étude (tableau 5) proviennent du souchier du
laboratoire de Biologie des Microorganismes et de Biotechnologie (LBMB). Elles ont été
isolées à partir de différents écosystèmes et elles appartiennent à divers genres bactériens (37
lactobacilles et 46 coques lactiques).
Tableau 5 : Souches lactiques étudiées
Souche
LVK9, LVK11, LVK12,
LVK13, LVK14, LVK15,
LVK24, LVK27, LVK29,
LVK30, LVK31, LVK32
LVK21
LVK25
CHTD27
BH14
Origine
Lait de vache (El-Kerma)
(Karam, 1995)
Lait de chamelle (Tindouf)
(Belkheir , 2004)
Lait de chamelle (Illizi)
(Bounoua, 2005)
MA1
MA7
GHB8, GHB11, GHB15,
GHB17, GHB24
GHB1, GHB2, GHB3, GHB4,
GHB5, GHB6, GHB7, GHB9,
GHB10, GHB12, GHB13,
GHB14, GHB16, GHB18,
GHB19, GHB20, GHB21,
GHB22, GHB23, GHB25
V1, V2, V3, V6-1, V6-2, V101, V10-2, V11, V13-1, V17,
V19, V24, V26-1, V26-2
V9, V18
V7, V8, V12, V13-2, V14,
V16, V20, V21, V23, V25,
V27
CHM1
CHM5, CHM9, CHM11,
CHM12, CHM16, CHM17,
CHM18, CHM19, CHM20
J3
J4
G6
*: blé fermenté
(pré) Identifiée à
Lactobacillus sp.
Lactococcus sp.
Enterococcus sp.
Lactobacillus brevis
Lactobacillus plantarum
Pediococcus sp.
Machroub* (Rélizane)
(Bouziani et Sabaha, 2006)
Streptococcus thermophilus
Lactococcus sp.
Ghars** (Biskra)
(Benmouna, 2008)
Enterococcus sp.
Lactococcus lactis ssp lactis
Viande bovine fraiche
(Mostaganem) (Benbernou,
2008)
Lactococcus lactis ssp cremoris
Lactobacillus sp.
Enterococcus sp.
Lait de chamelle (Mauritanie)
(Cheikh, 2008)
Jéjunum poulet (Idoui, 2008)
Gésier (Idoui, 2008)
Lactobacillus sp.
Lactobacillus helveticus
Lactobacillus delbrueckii
Lactobacillus helveticus
**: pâte de dattes
34
Matériel et Méthodes
2.2. Confirmation de l’appartenance des souches au groupe lactique et de leur pureté:
L’observation macroscopique des colonies après culture des souches sur milieu MRS (De
Man et al., 1960), la recherche de catalase et l’examen microscopique à l’immersion des
bactéries après coloration de Gram permettent de déterminer l’appartenance de nos souches
au groupe lactique. Le dernier test permet également de vérifier leur pureté.
2.3. Conservation des souches :
Les souches étaient conservées en double exemplaire à +4°C sur milieu gélosé incliné MRS,
ainsi que congelées à -20°C en lait écrémé à 10% ou en milieu MRS additionné de 20% de
glycérol.
2.4. Antibiogramme en milieu solide :
-
Technique :
Tout d’abord, des précultures des souches à étudier étaient préparées en prélevant une
colonie de chaque souche conservée sur gélose inclinée (MRS) et en la mettant dans 5ml de
milieu de culture liquide. Ces précultures étaient incubées à 30°C pendant 18 heures (DO600nm
= 1).
Ensuite, du milieu solide était coulé dans des boites Pétri stériles et il était laissé solidifier.
Un tube contenant 15ml de milieu molle (contenant 50% d’agar) était ensemencé par 1ml de
chaque préculture puis coulé sur la couche de milieu solide contenu dans la boite Pétri.
Une fois le milieu séché, les disques d’antibiotiques (tableau 6) étaient déposés stérilement à
la surface du milieu.
Après incubation à 30°C pendant 24 heures, le diamètre des zones d’inhibition observées
autour des disques était mesuré. Nous avons considéré que pour un diamètre inférieur à 15
mm la souche est résistante -R- à l’antibiotique testé, et pour un diamètre supérieur ou égal à
15 mm, elle est sensible -S- (Karam et Karam, 1994).
35
Matériel et Méthodes
-
Antibiotiques testés :
Tous les disques d’antibiotiques utilisés dans cette étude (tableau 6) proviennent de
Bioanalyse LTD (Turquie) à l’exception de l’oxacilline et l’amikacine qui proviennent des
laboratoires Hi Media (Mumbai).
Tableau 6 : Les différents disques d’antibiotiques utilisés
Antibiotique
Oxacilline (OX)
Pénicilline G (P)
Amoxicilline (AX)
Amoxicilline +
Acide clavulanique
(AMC)
Ampicilline (AM)
Ticarcilline (TIC)
Céfalexine (CL)
Céfazoline (CZ)
Céfoxitine (FOX)
Céfotaxime (CTX)
Ceftazidine (CAZ)
Céfixime (CFM)
Imipéneme (IPM)
Spiramycine (SP)
Erythromycine (E)
Amikacine (AK)
Kanamycine (K)
Gentamycine (CN)
Tobramycine (TOB)
Nitrofurantoïne (F)
Nitroxoline (NTX)
Ofloxacine (OFX)
Charge/disque
5 µg
10 UI
25 µg
20/10 µg
10 µg
75 µg
30 µg
30 µg
30 µg
30 µg
30 µg
5 µg
10 UI
100 µg
15 µg
30 µg
30 µg
10 µg
10 µg
300 µg
30 UI
5 µg
Doxycycline (DO)
30 µg
Tétracycline
30 µg
Rifampicine (RA)
5 µg
Famille
Mécanisme d’action
Bétalactamines
Inhibition de la
synthèse du
peptidoglycane
Macrolides
Aminosides ou
aminoglycosides
Inhibition de la
synthèse des protéines
Nitrofuranes
Fluoroquinolones
Inhibition de la
synthèse de l'ADN
Tétracyclines
Inhibition de la
synthèse des protéines
Rifamycines
(Ansamycines)
Blocage de la synthèse
des ARN messagers
36
Matériel et Méthodes
2.5. Détermination des concentrations minimales d’inhibition des antibiotiques (CMI) :
La détermination des CMI était réalisée en milieu solide en suivant la méthode décrite par
Ziane (2008). Nous avons procédé comme suit :
- Une solution mère de chaque antibiotique (tétracycline, érythromycine, amoxicilline et
pénicilline G) était préparée à une concentration initiale de 5 mg/ml (tableau 7) puis diluée,
dans du milieu MRS en surfusion, à des concentrations finales allant de 0,5 à 400 µg/ml.
Tableau 7 : Solutions mères d’antibiotiques
Formule utilisée pour la préparation des solutions
mères d’antibiotique
Antibiotiques
Solvants
Tétracycline
W = (C x V) / P
W : poids de la poudre d’antibiotique (mg) à dissoudre
dans un volume de solvant (ml).
C : concentration de la solution mère (mg/ml).
P : indice de pureté de l’antibiotique.
Ethanol 95%
Erythromycine
Amoxicilline
Eau distillée
Pénicilline G
- Chaque dilution d’antibiotique était coulée dans une boite Pétri et après séchage du milieu,
les boites étaient ensemencées en surface à l’aide d’un inoculateur multipoint préalablement
trempé dans les puits d’une microplaque contenant les précultures de 18 heures des souches à
étudier. Une boite témoin contenant du milieu sans antibiotique était également ensemencée.
- Après séchage des inoculums, les boites étaient incubées à 30°C pendant 24 à 48 heures et la
lecture des CMI était effectuée à l’œil nu en comparant la croissance des souches par rapport
à la boite témoin. Les CMI correspondaient à la concentration minimale de chaque
antibiotique pour laquelle aucune croissance n’était visible (Phillips et al., 1991).
37
Matériel et Méthodes
2.6. Recherche d’ADN plasmidique :
Les souches sélectionnées pour rechercher leurs plasmides sont : Lactobacillus sp. V16,
Lactococcus lactis ssp lactis V17 et Lactococcus lactis ssp cremoris V18.
2.6.1. Extraction d’ADN plasmidique :
Le principe commun de la plupart des méthodes d’extraction d’ADN plasmidique repose sur
trois grandes phases :
- Lyse alcaline des cellules bactériennes.
- Elimination des contaminants majeurs (ADN chromosomique, protéines, ARN).
- Concentration de l’ADN plasmidique par précipitation alcoolique.
Nous avons utilisé la technique d’O’Sullivan et Klaenhammer (1993) à laquelle nous avons
apporté quelques modifications : cycles de congélation/décongélation pour bien fragiliser les
parois bactériennes, et extractions au phénol seul et au chloroforme seul pour une meilleure
déprotéinisation (Holmes et Quigley, 1981).
Nous avons procédé de la manière suivante :
Culture de 18 heures de la souche dans 5 ml de milieu MRS contenant un disque de 30 µg de tétracycline
Récupération du culot cellulaire par centrifugation (12000 trs/min, +4°C, 15 min)
Lavage du culot cellulaire deux fois dans de l’eau distillée stérile
Resuspension du culot dans 200 µl d’eau distillée stérile
Cycles de congélation/décongélation
Ajout de 200µl d’une solution de saccharose à 25% contenant 30 mg/ml de lysozyme
Incubation 1 heure à 37°C
Ajout de 400 µl d’une solution de NaOH 0,2N contenant 3% SDS (pH 12,4)
Incubation 15 min à température ambiante
Dissolution du culot dans 320 µl d’eau distillée stérile
Ajout d’un même volume de phénol (pH 8), Agitation prolongée par retournement
Centrifugation : 12000 trs/min, + 4°C, 15 min
Récupération de la phase liquide et ajout de 200 µl d’acétate d’ammonium et 350 µl de phénolchloroforme (v/v) ; Agitation prolongée par retournement, Centrifugation : 12000 trs/min, + 4°C, 15 min
Récupération de la phase liquide et ajout d’un volume égal de phénol-chloroforme (v/v)
Agitation prolongée par retournement, Centrifugation : 12000 trs/min, + 4°C, 15 min
Récupération de la phase liquide et ajout d’un volume égal de chloroforme
Agitation prolongée par retournement ; Centrifugation : 12000 trs/min, + 4°C, 15 min
(Cette étape est répétée deux fois pour assurer l’élimination de toute trace de phénol)
Ajout de 1ml d’éthanol absolu froid (-20°C) à la phase aqueuse
Agitation par retournement ; Centrifugation : 12000 trs/min, + 4°C, 15 min
Lavage du culot d’ADN plasmidique avec de l’éthanol 70% suivi de séchage à l’air libre
Dissolution du culot plasmidique dans 40 µl de TE (50 mM Tris-HcL, 5 Mm EDTA, pH 7,5) contenant 0,1
mg/ml d’ARNase ; Incubation 1 heure à 37°C ;
Conservation à 0°C
38
Matériel et Méthodes
2.6.2. Electrophorèse sur gel d’agarose : (Neve et al., 1984 ; Sambrook et Russel, 2001)
Il s’agit d’une électrophorèse horizontale sur gel d’agarose à 0,8%. Un volume de 20 µl de
chaque solution d’ADN additionnée de tampon de charge (5 à 10 µl) était déposé dans les
puits du gel d’agarose. La cuve était remplie de tampon de migration TBE (pH 8) puis la
migration était effectuée sous un voltage constant et elle était stoppée lorsque le tampon de
charge arrivait au front du gel.
Du bromure d’éthidium était ajouté au gel d’agarose, à une concentration finale de 0,5
µg/ml, afin de visualiser l’ADN sous la lumière ultraviolette.
Les plasmides de la souche Escherichia coli V517 (Macrina et al., 1978) étaient utilisés
comme standard de poids moléculaires, dont les tailles sont : 55.5, 7.4, 5.7, 5.3, 4.0, 3.1, 2.8 et
2.2 Kpb.
Solutions pour l’électrophorèse sur gel d’agarose :
Tampon de migration : TBE
89 mM Tris-HCl
2,5 mM EDTA
89 mM acide borique
pH 8
Tampon de charge :
3 ml Glycérol
75 mg Bleu de bromophénol
7 ml Eau distillée
2.7. Purification de l’ADN plasmidique par électroélution :
Nous avons utilisé la technique décrite par Ziane (2008) que la figure 5 illustre :
- Le fragment du gel correspondant à l’ADN plasmidique de la souche Lactobacillus sp. V16
était découpé à l’aide d’une spatule stérile sous lumière ultraviolette. Il était, ensuite, placé sur
un tamis dans une cuve d’électroélution dont les compartiments sont remplis de tampon de
migration TBE.
- Un courant électrique de 100 Volts était appliqué pendant 2 heures, provoquant ainsi
l’élution de l’ADN du gel pour aller dans une couche de 200 µl d’acétate de sodium (3,5 M,
pH 5,2). Le champ électrique était inversé, ensuite, pendant 15 min et le volume d’acétate de
sodium contenant l’ADN plasmidique était récupéré dans un tube Eppendorf.
- Cet ADN était, après, soumis à une extraction phénolique, précipité par l’alcool et le culot
d’ADN plasmidique était, enfin, repris dans 15 µl d’eau distillée après son séchage.
39
Matériel et Méthodes
Figure 5 : Schéma de la technique de l'électroélution
2.8. Transformation de la souche Pediococcus sp. MA1 par électroporation :
- Culture de la souche réceptrice : (Hols et al., 1997 ; Holo et Nes, 1989 ; Badii et al., 1989)
60 ml de milieu MRS contenant 20 mM de D/L thréonine était ensemencé avec un inoculum
issu d’une préculture de 18 heures de la souche réceptrice, puis incubé environ 5 heures à
30°C jusqu’à l’obtention d’une DO600nm de 0,8.
- Préparation des cellules compétentes : (Serror et al., 2002 ; Badii et al., 1989)
Les cellules étaient récoltées par centrifugation (15 min, 8000 trs/min, + 4°C), puis le culot
était lavé deux fois avec 60 ml puis 20 ml de tampon d’électroporation E.B froid (0,4M
saccharose, 1mM MgCl2, 5mM KH2PO4, pH 6) et il était ensuite resuspendu dans 5 ml de
tampon E.B.
40
Matériel et Méthodes
- Électroporation : (Badii et al., 1989)
100 µl de la suspension cellulaire étaient transférés stérilement au fond de la cuvette
d’électroporation préalablement stockée au froid (-20°C), puis 15 µl d’ADN plasmidique
précédemment élué était ajouté à la suspension. Après incubation du mélange dans la glace
pendant 1 à 2 min, la cuvette était placée dans l’électroporateur (Gene Pulser, Bio Rad). Les
paramètres d’électrotransformation utilisés étaient de 25 µF, 800 Ω et 1492 V pour un pulse
de 2,7 ms.
La préparation était, ensuite, diluée au 1/10 dans du milieu MRS froid (4°C) et incubée
pendant 3 heures à 37°C, puis conservée à 0°C.
- Sélection des transformants :
La sélection des clones transformants était réalisée sur milieu MRS contenant la tétracycline
à une concentration supérieure à celle qui a inhibé la souche réceptrice Pediococcus sp. MA1
non transformée : Un inoculum, prélevé à partir de la préparation issue de l’électroporation,
était étalé par inondation sur ce milieu puis incubé à 30°C pendant plus de 48 heures. Une
boite témoin ne contenant pas de tétracycline était également ensemencée. Ainsi, des cultures
témoins de la souche réceptrice et celle donneuse étaient réalisées sur milieu avec et sans
tétracycline.
2.9. Recherche d’activité bétalactamase :
2.9.1. Test de synergie : (Philippon et Arlet, 2006)
Il s’agit d’une démonstration phénotypique de la production d’une bétalactamase à spectre
élargi par la mise en évidence d’une image de synergie entre un disque de céphalosporine
(troisième génération) et un disque d’Amoxicilline /acide clavulanique (AMC).
♦ Souches testées : LVK24, CHM1, MA7, G6, GHB15, GHB21, V3, V7, V13-1, V16,
V17, V18, V19, V26-1.
♦ Technique :
Un disque CTX (céfotaxime) et un disque AMC (amoxicilline + acide clavulanique) étaient
appliqués, à une distance de 1,5 cm, sur un milieu MRS préalablement ensemencé par la
souche à tester.
41
Matériel et Méthodes
♦ Lecture :
Après incubation à 30°C pendant 24 heures, le résultat était considéré positif lorsqu’une
image de synergie entre les deux disques était observée.
2.9.2. Test 3D : (Coudron et al., 2000)
Ce test permet une confirmation phénotypique de la production de bétalactamases de classe
C (AmpC) chez les bactéries résistantes aux bétalactamines.
♦ Souches testées : LVK27, LVK24, CHM1, MA7, G6, GHB15, GHB21, V3, V7, V131, V16, V17, V18, V19, V26-1.
♦ Technique :
- La surface d’un milieu MRS en boite était ensemencée avec une souche indicatrice sensible
au céfoxitine FOX (LVK27).
- Un disque FOX était placé au milieu de la boite.
- Avec une lame stérile, une fissure était crée à quelques millimètres du bord du disque dans
une direction radiale extérieure.
- Un inoculum d’une préculture de 18 heures de la souche à tester, qui est résistante au FOX,
était inoculé dans la fissure.
- Les boites étaient incubées pendant 24 heures, à 30°C.
♦ Lecture :
Une déformation claire de la zone d’inhibition autour du FOX est interprétée comme
résultat positif, la souche testée est donc considérée comme productrice d’AmpC. Si aucune
déformation n’est observée, le résultat est négatif.
42
Résultats et Discussion
3.1. Confirmation de l’appartenance des souches au groupe lactique et de leur pureté :
L’ensemble des bactéries lactiques étudiées ont poussé après 24 à 48 heures d’incubation.
Les colonies observées sont blanchâtres, lisses, rondes, légèrement bombées, à aspect
as
crémeux et à pourtour régulier. Selon les souches, la taille des colonies varient de petite à un
peu plus grande. En général, les colonies des lactobacilles sont plus grandes que celle des
coques (V7
V7 et V27 par rapport aux GHB).
GHB
Elles sont toutes à Gram positif et à catalase négative.
D’après l’examen microscopique, 46 souches sont cocciformes (LVK21, GHB15, V2,
CHM1,…) et les 37 restantes sont des coccobacilles (LVK9, V12, CHM12,…) ou des bacilles
(V7, G6,…) plus au moins allongés (figure 6).
(B)
(A)
(C)
Figure 6 : Aspect microscopique de quelques souches (G x100)
100)
(A): Lactococcus lactis ssp lactis V2 ; (B): Lactobacillus helveticus G6 ;
(C): Enterococcus sp. GHB21
44
Résultats et Discussion
3.2. Détermination de la sensibilité des souches aux différents antibiotiques testés :
Au cours de cette étude, nous avons eu recours à la méthode de l’antibiogramme en milieu
solide (MRS) pour déterminer la sensibilité de 83 bactéries lactiques (appartenant aux genre
Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus et Lactobacillus) à 25 antibiotiques
de différentes familles.
Des exemples de résultats obtenus sont montrés dans les figures 7 et 8 qui représentent des
antibiogrammes des souches Lactobacillus sp. V16 et Pediococcus sp. MA1, respectivement.
TOB
DO
K
TE
SP
RA
OFX
E
NTX
CN
Figure 7 : Antibiogramme de la souche Lactobacillus sp. V16
P
AK
CFM
OX
AM
CAZ
SP
AX
AMC
IPM
Figure 8 : Antibiogramme de la souche Pediococcus sp. MA1
Le tableau 8 rassemble les résultats obtenus par la méthode de l’antibiogramme en milieu
solide. Ceci permet de conclure aux phénotypes et de suggérer des génotypes des bactéries par
rapport aux différents antibiotiques utilisés.
45
Résultats et Discussion
Tableau 8 : Profils de résistance des bactéries lactiques étudiées (méthode de l’antibiogramme en milieu solide)
Origine
Souche
Lactobacillus
sp.
Lait de vache
(El-Kerma)
Lactococcus sp.
Enterococcus
sp.
Lait de
chamelle
(Tindouf)
Lactobacillus
brevis
Lait de
chamelle
(Illizi)
Lactobacillus
plantarum
Code
Profil de résistance
LVK9
LVK11
LVK12
LVK13
LVK14
LVK15
LVK24
LVK27
LVK29
LVK30
LVK31
LVK32
LVK21
OXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
OXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR
OXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
OXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
OXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
OXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
OXR AMCR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR
OXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
OXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
OXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
OXR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
OXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR
OXR CLR FOXR CAZR CFMR CNR TOBR RAR
LVK25
OXR CLR CZR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR
CHTD27
OXR CZR FOXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
BH14
OXR FOXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR
- OX : oxacilline, P : pénicilline G, AX : amoxicilline, AMC : amoxicilline + acide clavulanique, AM : ampicilline, TIC : ticarcilline, CL : céfalexine, CZ :
céfazoline, FOX : céfoxitine, CTX : céfotaxime, CAZ : Ceftazidine, CFM : céfixime, SP : spiramycine, E : érythromycine, AK : amikacine, K :
kanamycine, CN : gentamycine, TOB : tobramycine, F : nitrofurantoïne, NTX : nitroxoline, OFX : ofloxacine, DO : doxycycline, TE : tétracycline, RA :
rifampicine.
- R : Résistant
- Toutes les souches testées ont été sensibles à l’imipéneme (IPM).
46
Résultats et Discussion
Tableau 8 (suite 1): Profils de résistance des bactéries lactiques étudiées (méthode de l’antibiogramme en milieu solide)
Origine
Gésier
Souche
Lactobacillus
helveticus
Code
G6
Profil de résistance
OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER RAR
OXR PR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
OXR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
OXR PR TICR CLR CZR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
OXR PR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR
OXR PR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR
OXR PR AXRTICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR
OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR
RAR
GHB9
OXR PR AMR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
GHB10
OXR PR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
Enterococcus
GHB12
Ghars (Biskra)
OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
sp.
GHB13
OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR
RAR
GHB14
OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR
GHB16
OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
RAR
GHB18
OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR
GHB19
OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
GHB20
OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
GHB21
OXR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
GHB22
OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR
- OX : oxacilline, P : pénicilline G, AX : amoxicilline, AMC : amoxicilline + acide clavulanique, AM : ampicilline, TIC : ticarcilline, CL : céfalexine, CZ :
céfazoline, FOX : céfoxitine, CTX : céfotaxime, CAZ : Ceftazidine, CFM : céfixime, SP : spiramycine, E : érythromycine, AK : amikacine, K :
kanamycine, CN : gentamycine, TOB : tobramycine, F : nitrofurantoïne, NTX : nitroxoline, OFX : ofloxacine, DO : doxycycline, TE : tétracycline, RA :
rifampicine.
- R : Résistant
- Toutes les souches testées ont été sensibles à l’imipéneme (IPM).
GHB1
GHB2
GHB3
GHB4
GHB5
GHB6
GHB7
47
Résultats et Discussion
Tableau 8 (suite 2) : Profils de résistance des bactéries lactiques étudiées (méthode de l’antibiogramme en milieu solide)
Origine
Souche
Enterococcus
sp.
Ghars (Biskra)
Lactococcus sp.
Enterococcus
sp.
Lait de
chamelle
(Mauritanie)
Lactobacillus
sp.
Lactobacillus
helveticus
Jéjunum poulet
Lactobacillus
delbrueckii
Code
Profil de résistance
GHB23
GHB25
OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR
OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR
GHB8
GHB11
GHB15
GHB17
GHB24
CHM1
OXR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR
OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR
RAR
OXR PR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
OXR PR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
CHM5
CHM9
CHM11
CHM12
CHM16
CHM17
CHM18
CHM19
CHM20
J3
OXR AMCR CLR CZR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
OXR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
OXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
OXR AMCR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
OXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR OFXR DOR TER RAR
OXR AMCR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
OXR AMCR CLR CZR FOXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR
OXR AMCR FOXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER
OXR FOXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER
OXR AMCR TICR CLR CZR FOXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR OFXR TER RAR
J4
OXR AMCR TICR CLR CZR FOXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
- OX : oxacilline, P : pénicilline G, AX : amoxicilline, AMC : amoxicilline + acide clavulanique, AM : ampicilline, TIC : ticarcilline, CL : céfalexine, CZ :
céfazoline, FOX : céfoxitine, CTX : céfotaxime, CAZ : Ceftazidine, CFM : céfixime, SP : spiramycine, E : érythromycine, AK : amikacine, K :
kanamycine, CN : gentamycine, TOB : tobramycine, F : nitrofurantoïne, NTX : nitroxoline, OFX : ofloxacine, DO : doxycycline, TE : tétracycline, RA :
rifampicine.
- R : Résistant
- Toutes les souches testées ont été sensibles à l’imipenème (IPM).
48
Résultats et Discussion
Tableau 8 (suite 3) : Profils de résistance des bactéries lactiques étudiées (méthode de l’antibiogramme en milieu solide)
Origine
Machroub
(Rélizane)
Souche
Pediococcus sp.
Streptococcus
thermophilus
Code
Profil de résistance
MA1
OXR CLR CZR FOXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR
MA7
OXR PR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR
OFXR DOR TER RAR
V8
OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
TER RAR
V12
OXR AMCR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR
V13-2
OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR
OFXR DOR TER RAR
V14
OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR
OFXR DOR TER RAR
Viande bovine
V16
Lactobacillus
OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR
fraiche
OFXR DOR TER RAR
sp.
(Mostaganem)
V20
OXR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER RAR
V21
OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER
RAR
V23
OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
DOR TER RAR
V25
OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
TER RAR
V27
OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR TER
RAR
- OX : oxacilline, P : pénicilline G, AX : amoxicilline, AMC : amoxicilline + acide clavulanique, AM : ampicilline, TIC : ticarcilline, CL : céfalexine, CZ :
céfazoline, FOX : céfoxitine, CTX : céfotaxime, CAZ : Ceftazidine, CFM : céfixime, SP : spiramycine, E : érythromycine, AK : amikacine, K :
kanamycine, CN : gentamycine, TOB : tobramycine, F : nitrofurantoin, NTX : nitroxoline, OFX : ofloxacine, DO : doxycycline, TE : tétracycline, RA :
rifampicine.
- R : Résistant
- Toutes les souches testées ont été sensibles à l’imipenème (IPM).
V7
49
Résultats et Discussion
Tableau 8 (suite 4) : Profils de résistance des bactéries lactiques étudiées (méthode de l’antibiogramme en milieu solide)
Origine
Souche
Code
V1
V2
V3
Viande bovine
fraiche
(Mostaganem)
Lactococcus
lactis ssp lactis
V6-1
V6-2
V10-1
V10-2
V11
V13-1
V17
V19
V24
V26-1
V26-2
Lactococcus
lactis ssp
cremoris
V9
V18
Profil de résistance
OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR
TER
OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR
DOR TER RAR
OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR
OFXR DOR TER RAR
OXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER RAR
OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR OFXR DOR TER RAR
OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR OFXR DOR TER RAR
OXR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR OFXR DOR
OXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER RAR
OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR
TER RAR
OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR
OFXR DOR TER RAR
OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR DOR
RAR
OXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR FR OFXR DOR
OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR
OFXR DOR TER RAR
OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR
OFXR DOR TER RAR
OXR AMCR AMR CLR CZR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR OFXR RAR
OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR
DOR TER RAR
- OX : oxacilline, P : pénicilline G, AX : amoxicilline, AMC : amoxicilline + acide clavulanique, AM : ampicilline, TIC : ticarcilline, CL : céfalexine, CZ : céfazoline,
FOX : céfoxitine, CTX : céfotaxime, CAZ : Ceftazidine, CFM : céfixime, SP : spiramycine, E : érythromycine, AK : amikacine, K : kanamycine, CN : gentamycine,
TOB : tobramycine, F : nitrofurantoin, NTX : nitroxoline, OFX : ofloxacine, DO : doxycycline, TE : tétracycline, RA : rifampicine.
- R : Résistant
- Toutes les souches testées ont été sensibles à l’imipenème (IPM).
50
Résultats et Discussion
D’après l’ensemble de ces résultats, nous observons que toutes les souches ont résisté à
l’oxacilline, la ceftazidine et le céfixime mais elles ont été sensibles à l’imipenème. Sachant
que nous avons effectué nos tests sur le milieu MRS, cela nous permet d’infirmer l’hypothèse
suggérant que ce milieu peut inactiver l’imipenème (Ammor et al., 2007).
Pour le reste des antibiotiques, une hétérogénéité de résistance a été remarquée en fonction
des souches, des genres auxquels elles appartiennent et de leurs origines.
Le comportement de l’ensemble de nos souches ainsi que celui de ces dernières selon leur
appartenance, par genre, vis-àà-vis
vis de chaque antibiotique et des familles d’antibiotiques sont
illustrés dans la figure 9 et le tableau 9.
Toutes les souches
Lactococcus
Enterococcus
Lactobacillus
% de souches 100
90
résistantes
80
70
60
50
40
30
20
10
Rifamycines
Tétracyclines
Fluoroquinolones
Nitrofuranes
Aminosides
Macrolides
Bétalactamines
0
Figure 9 : Antibiorésistance chez les bactéries lactiques étudiées
51
Résultats et Discussion
Tableau 9 : Taux de résistance (%) des bactéries étudiées / antibiotique
Antibiotique
OX
P
AX
AMC
AM
TIC
CL
CZ
FOX
CTX
CAZ
CFM
IPM
SP
E
AK
K
CN
TOB
F
NTX
OFX
DO
TE
RA
Toutes les
souches
Lactobacillus
Lactococcus
Enterococcus
100
54,22
15,66
59,04
39,76
65,06
79,52
79,52
79,52
75,90
100
100
0
51,80
63,85
91,56
97,59
98,79
98,79
31,32
86,74
93,97
30,12
32,53
71,08
100
27,02
10,81
54,05
21,62
37,83
54,05
56,76
62,16
48,65
100
100
0
81,08
45,94
97,30
100
100
100
13,51
89,19
94,60
29,73
40,54
51,35
100
63,63
31,81
86,36
77,27
90,90
100
95,45
95,45
95,45
100
100
0
27,27
68,18
95,45
95,45
100
100
50
68,18
95,45
63,63
54,54
86,36
100
86,36
04,54
54,54
31,81
86,36
100
100
90,90
100
100
100
0
27,27
95,45
81,81
100
100
100
45,45
100
95,45
0
0
95,45
D’après ces résultats, nous remarquons que les réponses de l’ensemble de nos souches aux
antibiotiques testés sont variables selon les familles auxquelles appartiennent ces molécules et
ce, même à l’intérieur d’une même famille.
•
Nos souches ont présenté une résistance très élevée aux antibiotiques appartenant
aux familles des aminosides et des fluoroquinolones (représenté par l’ofloxacine)
avec des pourcentages de 96,68% et 93,97%, respectivement. Pour les aminosides,
les taux de résistance des 4 antibiotiques testés ont dépassé les 90%.
52
Résultats et Discussion
•
Un pourcentage élevé de résistance à la rifampicine (71,08%), aux bétalactamines
(65,25%), aux nitrofuranes (59,03%) et aux macrolides (57,82%) a été enregistré.
•
Pour les bétalactamines, toutes les souches testées ont résisté à l’oxacilline, la
ceftazidine et le céfixime. Des pourcentages de résistance dépassant les 75% ont été
constatés pour la céfalexine, la céfazoline, le céfoxitine et le céfotaxime. Pour le
reste des bétalactamines, les taux de résistance ont varié de 15,66% pour
l’amoxicilline à 65,06% pour la ticarcilline. Quant aux nitofuranes, la plupart des
souches ont résisté à la nitroxoline (86,74%) mais seulement 31,32% de ces souches
l’ont fait pour le nitrofurantoïne. En ce qui concerne les macrolides, les taux de
résistance à la spiramycine et l’érythromycine ne différaient pas beaucoup ; ils ont
été de 51,80% et 63,85%, respectivement.
•
La résistance la moins élevée a été observée avec les antibiotiques de la famille des
tétracyclines pour laquelle les pourcentages de résistance ont été de 32,53% pour la
tétracycline et 30,12% pour la doxycycline.
Il est à noter que la différence de sensibilité d’une bactérie aux antibiotiques d’une même
famille a été déjà signalée par Walther et al. (2008), qui ont trouvé qu’une souche de
Lactococcus lactis a résisté à l’amikacine, la kanamycine et la streptomycine grâce au gène de
résistance aux aminosides aac(6`)-Ie-aph(2`)-Ia qu’elle héberge mais elle s’est montrée
sensible à la gentamycine, ainsi que par Schnellmann et al. (2006) et Walther et Perreten
(2007) qui ont détecté également des gènes de résistance aux aminosides chez des
staphylocoques de phénotype sensible.
Comme le montre la figure 9 et le tableau 9, nous pouvons également observer des
différences de taux de résistance en fonction des genres auxquels appartiennent nos bactéries :
-
Lactococcus :
Ces bactéries ont été majoritairement résistantes à l’ofloxacine (95,45%) et aux aminosides
(97,72%). Un grand nombre de ces bactéries a également résisté à la rifampicine (86,36%) et
aux bétalactamines (79,72%). Pour ces derniers, à l’exception de l’amoxicilline auquel
seulement 31,81% des lactocoques ont résisté et de l’imipenème qui était efficace à 100%,
53
Résultats et Discussion
aucun lactocoque ne s’est montré sensible à l’action de l’oxacilline, la céfalexine, la
ceftazidine et le céfixime. Ainsi, plus de 63% de ces bactéries ont résisté à la pénicilline,
l’ampicilline, l’association de l’amoxicilline et l’acide clavulanique, la ticarcilline, la
céfazoline, le céfoxitine et le céfotaxime. Ces résultats concordent avec les données de la
littérature pour l’ofloxacine (Kastner et al., 2006), les aminosides (Temmerman et al., 2002 ;
Herreros et al., 2005 ; Kastner et al., 2006 ; Ziane, 2008), l’oxacilline (Herreros et al., 2005 ;
Kastner et al., 2006), le céfoxitine (Herreros et al., 2005 ; Flórez et al., 2005 ; Alebouyeh, et
al., 2005 ; Ziane, 2008), l’amoxicilline, le céfotaxime et la céfazoline (Ziane, 2008),
l’imipéneme (De Fabrizio et al., 1994 ; Ammor et al., 2007), et la rifampicine (De Fabrizio et
al., 1994 ; Herreros et al., 2005). Ainsi, pour ce dernier antibiotique, 48% de résistance chez
des lactocoques a été enregistré par Ziane (2008). En revanche, la sensibilité de ces bactéries à
la gentamycine (De Fabrizio et al., 1994 ; Walther et al., 2008), l’ampicilline (De Fabrizio et
al., 1994 ; Herreros et al., 2005 ; Ammor et al., 2007 ; Toomey et al., 2010), l’oxacilline (De
Fabrizio et al., 1994), l’amoxicilline, la ticarcilline et la rifampicine (Ammor et al., 2007) et la
pénicilline G (De Fabrizio et al., 1994 ; Ammor et al., 2007 ; Walther et al., 2008) a été déjà
indiquée.
Les taux de résistance des lactocoques aux antibiotiques des familles des nitrofuranes et des
tétracyclines ont été compris entre 50% et 68,18% ; cela était également le cas avec
l’érythromycine. En revanche, seulement 27,27% de ces bactéries ont résisté à la spiramycine.
Ces données sont d’une similarité avec ceux rapportés par différents auteurs concernant le
comportement des lactocoques vis-à-vis des nitrofuranes (Herreros et al., 2005 ; Kastner et
al., 2006 ; Walther et al., 2008), de la tétracycline (Delgado et Mayo, 2004 ; Kastner et al.,
2006 ; Walther et al., 2008 ; Toomey et al., 2010) et de l’érythromycine (Raha et al., 2002 ;
Ziane, 2008 ; Walther et al., 2008). Cependant, d’autres travaux ont montré la susceptibilité
de ces bactéries au deuxième (De Fabrizio et al., 1994 ; Perreten et al., 2001 ; Herreros et al.,
2005 ; Alebouyeh, et al., 2005 ; Ziane, 2008) et au troisième antibiotique (De Fabrizio et al.,
1994 ; Perreten et al., 2001 ; Flórez et al., 2005 ; Hummel et al., 2007).
-
Enterococcus :
Chez ces bactéries, nous avons enregistré 95,45% de résistance à l’ofloxacine, à la
rifampicine et aux aminosides. Cependant, aucune de ces souches n’a résisté à l’action des
tétracyclines testées. Des comportements similaires à ceux montrés par nos souches
d’Enterococcus ont été notés par Belicova et al. (2007), Ziane (2008) qui a constaté 20% de
54
Résultats et Discussion
résistance, et Valenzuela et al. (2009) vis-à-vis de la rifampicine, par Franz et al. (2001),
Lopes et al. (2003) et Ziane (2008) vis-à-vis des aminosides et par Alebouyeh et al. (2005),
Ziane (2008) et Toomey et al. (2010) vis-à-vis de la tétracycline. Par contre, d’autres auteurs
ont enregistré la résistance des entérocoques à ce dernier antibiotique (Butaye et al., 2000 ;
Franz et al., 2001 ; Huys et al., 2004 ; Maïetti et al., 2007 ; Valenzuela et al., 2009) ainsi que
leur sensibilité aux aminosides (Belicova et al., 2007, Maïetti et al., 2007).
Pour les nitrofuranes et les macrolides, nous avons observé une hétérogénéité de résistance
au sein de chaque famille : bien que les entérocoques testés aient majoritairement résisté à la
nitroxoline et l’érythromycine (100% et 95,45%, respectivement), leurs taux de résistance au
nitrofurantoïne et à la spiramycine étaient de 45,45% et 27,27%, respectivement. La
susceptibilité réduite au nitrofurantoïne (Valenzuela et al., 2009) et à l’érythromycine (Franz
et al., 2001 ; Citak et al., 2004 ; Ziane, 2008 ; Valenzuela et al., 2009 ; Toomey et al., 2010) a
été, déja, observée chez des souches d’Enterococcus. Cependant, leur sensibilité au deuxième
antibiotique a été montrée par les résultats de différentes études (Flórez et al., 2005 ; Belicova
et al., 2007, Maïetti et al., 2007).
En ce qui concerne les bétalactamines, tous les entérocoques ont résisté à l’oxacilline, la
céfalexine, le céfotaxime, la ceftazidine et le céfixime, mais ils ont été sensibles à
l’imipéneme. Pour le reste des bétalactamines, à l’exception de l’amoxicilline (31,81% de
résistance), les taux de résistance ont varié de 54,54% pour l’association de l’amoxicilline et
l’acide clavulanique à 90,90% pour le céfoxitine. Ces résultats sont en accord avec ceux
obtenus, chez les entérocoques, pour l’oxacilline (Citak et al., 2004), l’ampicilline et la
pénicilline G (Franz et al., 2001) et pour l’amoxicilline, la céfazoline, la céfalexine, le
céfoxitine et le céfotaxime (Ziane, 2008). D’autres auteurs ont, au contraire, constaté la
susceptibilité élevée des entérocoques à l’ampicilline (Klein et al., 1998 ; Davies et Roberts,
1999 ; Franz et al., 2001 ; Maïetti et al., 2007; Valenzuela et al., 2009 ; Toomey et al., 2010)
et à la pénicilline G (Valenzuela et al., 2009).
-
Lactobacillus :
La plupart des lactobacilles testés ont résisté à l’ofloxacine (94,60%) et aux aminosides
(99,32%). Les taux de résistance de ces souches aux macrolides, bétalactamines, nitrofuranes
et rifampicine ont été compris entre 63,51% et 51,35%. Ceci est en accord avec les résultats
obtenus par Danielsen et Wind (2003), Gevers et al. (2003), Elkins et Mullis (2004), Coppola
55
Résultats et Discussion
et al. (2005), Herreros et al. (2005), Rojo-Bezares et al. (2006), Kastner et al. (2006),
D’Aimmo et al. (2007) et Ziane (2008) pour les aminosides, par Gupta et Mittal (1995),
Danielsen et Wind (2003), Coppola et al. (2005), Kastner et al. (2006), Ouoba et al. (2008)
pour les fluoroquinolones et par Herreros et al. (2005) et Coppola et al. (2005) pour la
rifampicine. Par contre, une sensibilité des lactobacilles à la gentamycine et la kanamycine a
été observée par Swenson et al. (1990). Ainsi, d’autres auteurs (Swenson et al., 1990 ;
Dalache et al., 2003 ; D’Aimmo et al., 2007 ; Ziane, 2008) ont constaté la sensibilité de la
quasi-totalité des lactobacilles qu’ils ont étudié à la rifampicine.
Pour les macrolides et les nitrofuranes, ce sont la nitroxoline et la spiramycine qui ont été
les moins efficaces avec des pourcentages de résistance dépassant les 80%, contrairement au
nitrofurantoïne et l’érythromycine auxquelles les fréquences de résistance des lactobacilles
étaient de 45,94% et 13,51%, respectivement. Plusieurs auteurs ont rapporté la résistance des
lactobacilles au nitrofurantoïne (Danielsen et Wind, 2003 ; Herreros et al., 2005 ; Kastner et
al., 2006) et à l’érythromycine (Cauwerts et al., 2006 ; Toomey et al., 2010) tandis que
d’autres ont constaté des phénotypes de sensibilité à ce dernier antibiotique chez les
lactobacilles qu’ils ont étudiés (Swenson et al., 1990 ; Olukoya et al., 1993 ; Gupta et Mittal,
1995 ; Temmerman et al., 2002 ; Coppola et al., 2005 ; Rojo-Bezares et al., 2006 ; D’Aimmo
et al., 2007 ; Ziane, 2008).
Quant aux bétalactamines, une hétérogénéité de résistance a été constaté : toutes les souches
ont été résistantes à l’oxacilline, la ceftazidine et le céfixime mais sensibles à l’imipéneme.
Les taux de résistance aux autres bétalactamines ont varié de 10,81% pour l’amoxicilline à
62,16% pour le céfoxitine. Ces résultats rejoignent ceux enregistrés par Herreros et al. (2005)
et Coppola et al. (2005) pour le céfoxitine et l’oxacilline, par Kastner et al. (2006) pour ce
dernier antibiotique et pour le céfotaxime et la pénicilline G, par Olukoya et al. (1993) et
Toomey et al. (2010) pour l’ampicilline et la pénicilline G, par Ziane (2008) pour la
céfazoline, la céfalexine, le céfotaxime et le céfoxitine, par Danielsen et Wind (2003) et
Delgado et al. (2005) pour le céfoxitine, et par Gevers et al. (2003) pour la pénicilline G.
Néanmoins, la sensibilité des lactobacilles à l’ampicilline et la pénicilline G a été rapportée
par d’autres auteurs (Gupta et Mittal, 1995 ; Herreros et al., 2005 ; Coppola et al., 2005 ;
D’Aimmo et al., 2007) et (Temmerman et al., 2002), respectivement.
56
Résultats et Discussion
Les tétracyclines étaient d’une efficacité moyenne sur les lactobacilles, comparés aux
lactocoques et aux entérocoques. Les taux de résistance à ces antibiotiques étaient de 40,54%
pour la tétracycline et de 29,73% pour la doxycycline. Ces résultats sont à rapprocher de ceux
qui ont montré la sensibilité de plus de la moitié des lactobacilles étudiés à la doxycycline
(Dalache et al., 2003) et à la tétracycline (Olukoya et al., 1993 ; Gupta et Mittal, 1995 ;
Temmerman et al., 2002 ; Herreros et al., 2005). Cependant, des résistances à ce dernier
antibiotique ont été observées par Kastner et al. (2006) et Toomey et al. (2010).
-
Streptococcus thermophilus :
Cette souche a résisté à tous les aminosides et à la plupart des bétalactamines testées (à
l’exception
de l’imipéneme,
l’amoxicilline et
l’association
amoxicilline + acide
clavulanique) ; cependant, elle s’est montrée sensible à l’ofloxacine, à la rifamycine et à tous
les macrolides et tétracyclines testés. Par ailleurs, en ce qui concerne les nitrofuranes, cette
souche n’a résisté qu’à l’action de la nitroxoline. Ces résultats rejoignent ceux décrits chez
des souches de Streptococcus thermophilus pour les aminosides (Aslim et Beyatli, 2004 ;
D’Aimmo et al., 2007), la pénicilline G (Aslim et Beyatli, 2004), le céfoxitine (Alebouyeh et
al., 2005 ; Ziane, 2008), la céfazoline, la céfalexine, le céfotaxime et l’amoxicilline (Ziane,
2008), la rifampicine (D’Aimmo et al., 2007 ; Ziane, 2008), l’érythromycine (D’Aimmo et
al., 2007 ; Ammor et al., 2007 ; Hummel, 2007 ; Ziane, 2008) et la tétracycline (Aslim et
Beyatli, 2004 ; D’Aimmo et al., 2007 ; Ammor et al., 2007). En revanche, d’autres études ont
montré la résistance des souches de cette espèce à ce dernier antibiotique (Hummel, 2007 ;
Ziane, 2008) ainsi que leur sensibilité à l’ampicilline et à la pénicilline G (D’Aimmo et al.,
2007 ; Ammor et al., 2007).
-
Pediococcus sp. :
La seule souche appartenant à ce genre, qui est Pediococcus sp. MA1, n’a résisté qu’à la
nitroxoline, aux aminosides, et aux bétalactamines suivantes : oxacilline, céfalexine,
céfazoline, céfoxitine, ceftazidine et céfixime. De nombreux auteurs ont obtenus des résultats
semblables aux nôtres pour les aminosides (Swenson et al., 1990 ; Rojo-Bezares et al., 2006 ;
Kastner et al., 2006 ; O’Connor et al., 2007 ; Ammor et al., 2007), l’oxacilline (Kastner et al.,
2006), la céfazoline et le céfoxitine (Ziane, 2008), la céfalexine (O’Connor et al., 2007 ;
Ziane, 2008), la ceftazidine (O’Connor et al., 2007), le céfotaxime (Kastner et al., 2006 ;
O’Connor et al., 2007 ; Ziane, 2008), l’imipéneme et la pénicilline G (Ammor et al., 2007),
l’érythromycine (Swenson et al., 1990 ; Rojo-Bezares et al., 2006 ; Ammor et al., 2007 ;
57
Résultats et Discussion
Toomey et al., 2010), la tétracycline
acycline (Swenson et al., 1990 ; Rojo-Bezares
Bezares et al., 2006 ; Ziane,
2008 ; Toomey et al.,, 2010) et la rifampicine (Swenson et al., 1990 ; Ammor et al., 2007 ;
Ziane, 2008). Au contraire, des résistances au nitrofurantoïne et à l’ofloxacine (Kastner et al.,
2006), à la pénicilline G (O’Connor et al.,, 2007), à l’érythromycine (O’Connor et al., 2007 ;
Ammor et al.,, 2007) ainsi qu’à la tétracycline (Kastner et al., 2006 ; Ammor et al., 2007) ont
été également observées chez des souches de Pediococcus.
La variabilité de la sensibilité des souches étudiées semble dépendre également de leurs
leur
origines (figure 10) :
% de souches
résistantes
100
Souches isolées de la
viande
90
80
Souches isolées du
lait de chamelle de
différentes origines
Souches isolées du
lait de vache
70
60
50
40
Souches isolées du
Ghars
30
20
10
Rifamycines
Tétracyclines
Fluoroquinolones
Nitrofuranes
Aminosides
Macrolides
Bétalactamines
0
Figure 10 : Comparaison des antibiorésistances des souches étudiées, selon leurs origines
Toutes les souches isolées de la viande ont résisté à l’action des aminosides et de
l’ofloxacine. Les taux de résistances de ces souches aux antibiotiques des autres familles ont
varié de 61,10% pour les nitrofuranes à 85,18% pour la rifampicine.
Unee hétérogénéité de résistance a été observée chez les souches isolées du lait de chamelle.
Les antibiotiques les moins efficaces sur ces souches étaient ceux appartenant aux familles
des fluoroquinolones (ofloxacine) et des aminosides (91,66% de résistance pour chaque
famille) ; cependant seulement 25% de ces souches ont résisté aux tétracyclines. Pour les
58
Résultats et Discussion
autres familles d’antibiotiques testés, les taux de résistance étaient de : 66,66% (macrolides),
58,33% (rifamycines), 42,94% (bétalactamines) et 41,66% (nitrofuranes).
En ce qui concerne les souches isolées du lait de vache, elles ont été toutes sensibles à la
doxycycline et la tétracycline, et seulement un faible nombre d’entre elles a résisté à la
rifampicine (14,28%), les bétalactamines (31,31%) et les macrolides (32,14%). La moitié de
ces souches se sont montrées sensibles à l’action des nitrofuranes mais la plupart d’elles ont
résisté à l’ofloxacine (78,57%) et aux aminosides (94,64%).
Pour les souches isolées du Ghars, elles ont toutes résisté à la rifampicine et l’ofloxacine
mais aucune d’entres elles n’a résisté à l’action des tétracyclines. Les antibiotiques des autres
familles ont été moins efficaces sur ces souches avec des taux de résistances qui variaient de
66% pour les macrolides à 96% pour les aminosides.
Pour les souches isolées du Machroub, la souche Streptococcus thermophilus MA7 a résisté
à un nombre d’antibiotique plus élevé que la souche Pediococcus sp. MA1 (tableau 8).
La souche Lactobacillus helveticus G6, isolée du gésier, a résisté à la plupart des
antibiotiques testés à l’exception de l’amoxicilline, l’ampicilline, l’imipéneme, la spiramycine
et le nitrofurantoïne (tableau 8).
Les souches isolées du jéjunum du poulet, Lactobacillus helveticus J3 et Lactobacillus
delbrueckii J4, ont approximativement le même profil de résistance (tableau 8). Ces souches
n’ont été sensibles qu’à la pénicilline, l’amoxicilline, l’ampicilline, le céfotaxime,
l’imipéneme, l’érythromycine, le nitrofurantoïne et la doxycycline. Pour la nitroxoline, la
tétracycline et la rifampicine, seulement l’une des deux souches à résisté à leurs actions.
D’après ces résultats, on peut conclure que les souches les plus résistantes aux
antibiotiques sont celles isolées de produits d’origine animale (viande bovine, lait de
chamelle, gésier, jéjunum poulet). Ceci est assez attendu, vue l’utilisation intensive des
antibiotiques, appartenant à des classes auxquels appartiennent les molécules que nous avons
testées ou bien eux même, en élevage des animaux en Algérie (Bouguedour, 2008 ; Zeghilet,
2009). Il est bien admis que cet usage, à des fins thérapeutiques ou prophylactiques, peut être
à l'origine de l’apparition d’antibiorésistances chez les bactéries de la flore digestive des
59
Résultats et Discussion
animaux et de la présence de résidus d'antibiotiques dans le lait et la chair des animaux, qui
peuvent également conduire à la sélection de bactéries résistantes aux antibiotiques. En effet,
une recherche effectuée par Tarzaali et al. (2008) a mis en évidence la présence de résidus de
tétracyclines et de bétalactamines dans des échantillons de lait cru de vache provenant de
plusieurs régions du centre algérien (89,09% et 65,46% de laits positifs pour les tétracyclines
et les bétalactamines, respectivement) ; de même, Benmohand et Benouadah (2008) ont
détecté des résidus de pénicilline G et d’érythromycine dans des échantillons de poulet de
chair. Cependant, la résistance modérée des souches isolées du lait de vache est probablement
due au fait que les animaux à partir desquels ce lait provient ont été élevés de manière
traditionnelle (alimentation non supplémentée d’antibiotiques, …) ce qui a conduit à une
faible pression de sélection pour les antibiotiques dans cet environnement comparé aux autres
milieux.
D’autre part, la fréquence de résistance très élevée des souches isolées du Ghars aux
différents antibiotiques, exceptés ceux appartenant à la classe des tétracyclines, pourrait
s’expliquer par le fait que les antibiotiques ont été d’un grand usage en tant que
phytosanitaires pour protéger ou traiter les palmiers desquels proviennent les dattes qui ont
servi de matière première pour la production du Ghars. Ainsi, il se peut que des bactéries
résistantes provenant des travailleurs aient contaminé le Ghars au cours de sa production et
ont pu transférer les résistances qu’elles possèdent aux autres bactéries présentes dans ce
produit.
En plus de la variabilité des genres auxquels appartiennent les souches étudiées et des
origines desquelles elles proviennent, l’hétérogénéité des profils de résistance de ces souches
peut être attribuée à d’autres facteurs comme :
- La nature des antibiotiques : les antibiotiques lipophiles comme la doxycycline ont un
accès plus facile à l’intérieur des bactéries que ceux hydrophiles (bétalactamines) vue la
composition de la paroi bactérienne (Zomahoun, 2005).
- L’état physiologique des bactéries : selon Dhar et McKinney (2007), les phases et vitesses
de croissance ainsi que l’âge des cellules peuvent entrainer des variations de résistance aux
60
Résultats et Discussion
antibiotiques. Les bétalactamines, par exemple, ne sont actifs que sur les bactéries en
croissance (Walsh, 2003).
- Les activités physiologiques et biochimiques des bactéries : l’imperméabilité de la paroi
cellulaire semble être l’un des mécanismes de résistance des lactobacilles à des antibiotiques
de la classe des bétalactamines du moment que les espèces de ce genre sont dépourvues de
cytochromes (Condon, 1983). Ainsi, des systèmes autolytiques défectueux de la paroi
cellulaire peuvent être à l’origine des différences de sensibilité aux antibiotiques agissant sur
cette cible (Kim et al., 1982).
- Le profil génétique des bactéries : il se peut que des bactéries parmi celles que nous avons
testé hébergent des gènes de résistance que certaines d’autres en sont dépourvues (Devirgiliis
et al., 2008).
- Le changement de la bactérie pour une forme L : il s’agit d’une résistance non génétique,
donc non transmissible, qui se produit de façon transitoire lorsque une bactérie cesse de
produire la majeure partie de sa paroi ce qui la rend insensible aux agents antimicrobiens qui
agissent sur la synthèse de la paroi. Ce mécanisme est souvent une conséquence du milieu ou
d'un changement brusque dans le métabolisme d'une bactérie (Tremblay, 2007).
- Le milieu de culture : ce facteur peut influencer la susceptibilité des bactéries aux
antibiotiques de même que l’efficacité de ces derniers (Huys et al., 2002 ; Tremblay, 2007 ;
Ammor et al., 2007 ; Devirgiliis et al., 2008). A titre d’exemple, Ammor et al. (2007) ont
rapporté que le milieu MRS peut inactiver certains antibiotiques.
À la lumière des résultats sus cités et du tableau 8, il est bien remarquable que la fréquence
de multirésistances (ou polyrésistances) est très élevée parmi les bactéries sujettes de notre
étude :
•
les souches d’Enterococcus ont montré des résistances à un nombre qui varie de 11 à
20 antibiotiques de 3 à 6 familles différentes, respectivement.
•
les lactocoques ont résisté à un nombre variant de 8 à 24 antibiotiques de 3 à 7
familles différentes, respectivement.
61
Résultats et Discussion
•
les lactobacilles ont présenté des résistances vis-à-vis de 8 à 24 antibiotiques de 2 à 7
familles différentes.
•
Pediococcus sp. MA1 et Streptococcus thermophilus MA7 ont montré des résistances
à 11 antibiotiques de 3 familles différentes et à 16 antibiotiques de 4 familles
différentes, respectivement.
Cela est en concordance avec les différents rapports qui indiquent qu’un nombre croissant
de souches lactiques présentant des résistances à des antibiotiques de familles différentes sont
isolées, et cela quelque soit leurs origines et leur appartenance (Klein et al., 1998 ; Davies et
Roberts, 1999 ; Halami et al., 2000 ; Temmerman et al., 2002 ; Dalache et al., 2003 ; Herreros
et al., 2005; Mathur et Singh, 2005 ; Kastner et al., 2006 ; Ziane, 2008 ; Toomey et al., 2010).
Le phénomène de multirésistance est généralement du soit à une résistance croisée, c'est-àdire résistance de la bactérie à tous les membres d’une classe d’antibiotiques due à un seul
mécanisme de résistance (Chopra and Roberts, 2001 ; Courvalin, 2008) ou à des antibiotiques
de classes différentes ayant la même cible d’action quand cette dernière est modifiée par un
produit de gène de résistance (Roberts et al., 1999 ; Courvalin, 2008), soit à la présence de
plasmides porteurs de plusieurs gènes conférant la résistance à divers familles d’antibiotiques
comme c’est le cas avec le plasmide pK214 qui a été rapporté chez la souche Lactococcus
lactis K214 isolée du fromage à base de lait cru et qui porte des gènes codant la résistance à la
streptomycine, la tétracycline et le chloramphénicol ainsi qu’un gène codant un système
d’efflux (mdtA ) qui confère la résistance à l’érythromycine et la tétracycline (Perreten et al.,
1997a ; Perreten et al., 2001). Un autre transporteur multidrogues (LmrP) a été décrit chez
une autre souche de Lc. lactis, il code la résistance aux macrolides, lincosamides,
streptogramines et à la tétracycline (van Veen et al., 1999).
D’autre part, il est à noter que les taux de résistances très élevés des bactéries testées vis-àvis de certaines familles d’antibiotiques, particulièrement celles des aminosides et des
quinolones, indique fort probablement des résistances intrinsèques à ces molécules comme
cela a été rapporté par Teuber et al. (1999), Danielsen et Wind (2003), Rojo-Bezares et al.
(2006), Euzéby (2007) et Ouoba et Jensen (2008). Elkins et Mullis (2004) ont noté que la
résistance intrinsèque des bactéries lactiques aux aminosides est probablement due à la
structure de leur paroi cellulaire et l’imperméabilité de leur membrane plasmique, qui sont
complémentées dans certains cas par des mécanismes d’efflux actif. De même, Petersen et
62
Résultats et Discussion
Jensen (2004) ont associé la résistance naturelle des bactéries à Gram positif, y compris les
bactéries lactiques, aux quinolones et fluoroquinolones à une substitution dans la séquence
QRDR de la gyrA (sous-unité A de l’ADN gyrase) qui transforme la sérine de la position 83
en une arginine, ou le glutamate de la position 87 en une glycine ou lysine, ou encore la sérine
de la position 80 en une leucine ou isoleucine.
3.3. Détermination des concentrations minimales d’inhibition des antibiotiques (CMI) :
Notre étude a été poursuivie, comme nous l’avons déjà indiqué, par la détermination des
concentrations minimales inhibitrices (CMI) de divers antibiotiques, qui sont la tétracycline,
l’érythromycine, l’amoxicilline et la pénicilline G, chez 16 de nos souches.
Les CMI sont exprimées en mg/ml ou en µg/ml (Mathur et Singh, 2005). Le tableau 10
montre les valeurs de CMI des divers antibiotiques estimées chez l’ensemble des souches
testées : ces valeurs sont de l'ordre de 0,5 à plus de 200 µg/ml pour les deux bétalactamines
(amoxicilline et pénicilline G) et d’à peu près 8 à plus de 200 µg/ml pour la tétracycline et
l'érythromycine. Cela indique que, selon Walsh (2003), les souches testées sont soit
résistantes (CMI ≥ 32 µg/ml) soit sensibles (CMI < 8 µg/ml) ou bien elles ont des résistances
intermédiaires (8 ≤ CMI < 32 µg/ml).
-
CMI de la pénicilline G :
Les souches testées étaient majoritairement sensibles à la pénicilline G. En effet, nous avons
enregistré des CMI qui ne dépassaient pas les 0,5µg/ml pour certaines souches comme
Pediococcus sp. MA1, et des CMI comprises entre 2 et 5µg/ml ou entre 5 et 8µg/ml pour
d’autres telles qu’Enterococcus sp. GHB22 et Lactococcus lactis ssp. lactis V17,
respectivement. Des exceptions ont été observées pour les souches Lactobacillus helveticus
G6, Lactobacillus sp. V7 et Lactobacillus sp. V16 pour lesquelles les valeurs de CMI ont
dépassé 200µg/ml.
Nos observations sont en concordance avec les résultats de différentes études qui rapportent
des valeurs de CMI basses pour la pénicilline G. Ces CMI sont ≤ 2µg/ml chez des
pédiocoques (Halley et Blaszyk, 1998 ; Rojo-Bezares et al., 2006), comprises entre 2 et
8µg/ml chez des lactocoques et des entérocoques (Ziane, 2008), ≤ 4µg/ml chez des
lactobacilles (Halley et Blaszyk, 1998 ; Danielsen et Wind, 2003 ; Rojo-Bezares et al., 2006 ;
D’Aimmo et al., 2007 ; Ouoba et al., 2008 ; Ziane, 2008) et ≤ 2µg/ml chez des souches de
63
Résultats et Discussion
Streptococcus thermophilus (D’Aimmo et al., 2007 ; Ziane, 2008). De même, des valeurs de
CMI élevées ont été constatées par Halley et Blaszyk (1998) et Zarazaga et al. (1999) chez
des lactobacilles.
Tableau 10 : Concentrations minimales d’inhibition (µg/ml) des antibiotiques testés
CMI
tétracycline
CMI
érythromycine
CMI
amoxicilline
CMI
pénicilline G
Pediococcus sp.
MA1
Streptococcus
thermophilus
MA7
>8
15≤
>50
100≤
>2
5≤
<0,5
>5
8≤
>5
8≤
>5
8≤
<0,5
Enterococcus sp.
GHB21
En. sp. GHB22
>5
8≤
>5
8≤
>100
150≤
>100
150≤
>5
8≤
>5
8≤
>2
5≤
>2
5≤
Enterococcus sp.
CHM1
>8
15≤
>100
150≤
>5
8≤
>2
5≤
Enterococcus sp.
LVK25
Lactococcus sp.
GHB15
Lactococcus lactis
ssp. lactis V17
Lactococcus lactis
ssp. cremoris V18
Lactococcus lactis
ssp. lactis V26-1
Lactobacillus
helveticus G6
Lactobacillus sp.
LVK32
>8
15≤
>5
8≤
>200
300≤
> 200
300≤
>200
300≤
>100
150≤
>50
≤100
> 200
300≤
>150
200≤
> 150
200≤
> 150
200≤
>50
100≤
>5
8≤
>15
20≤
>200
300≤
>200
300≤
>200
300≤
> 200
300≤
>2
5≤
>2
5≤
>5
8≤
>5
8≤
>5
8≤
>200
300≤
>40
50≤
>5
8≤
<0,5
<0,5
Lactobacillus sp.
V7
Lactobacillus sp.
V16
Lactobacillus sp.
CHM16
>100
150≤
>100
150≤
>50
100≤
>50
100≤
>200
300≤
>200
300≤
>50
100≤
>20
32≤
>200
300≤
>200
300≤
<0,5
Lactobacillus sp.
CHM19
50>
≤100
20>
32≤
<0,5
<0,5
Souche
Pediococcus
Streptococcus
Enterococcus
Lactococcus
Lactobacillus
<0,5
64
Résultats et Discussion
-
CMI de l’amoxicilline :
Seule la souche Lactococcus sp. GHB15 avait une résistance intermédiaire à l’amoxicilline
(15 < CMI ≤ 20µg/ml). Pour le reste des souches, tous les lactocoques ainsi que Lactobacillus
sp. V7 et V16 et Lactobacillus helveticus G6 ont résisté à des concentrations de cet
antibiotique supérieures à 200µg/ml, alors que les autres lactobacilles, les entérocoques, les
souches Pediococcus sp. MA1 et Streptococcus thermophilus étaient tous sensibles (CMI ≤
8µg/ml).
Il y a relativement très peu d’études qui ont porté sur la détermination des CMI de
l’amoxicilline chez les bactéries lactiques. En effet, Halley et Blaszyk (1998) ont décrit des
CMI ≤ 8µg/ml pour cet antibiotique contre des lactobacilles et des pédiocoques.
-
CMI de la tétracycline :
Une variabilité de sensibilité a été observée pour cet antibiotique : bien que Streptococcus
thermophilus MA7 s’est montrée sensible (5 < CMI ≤ 8µg/ml), Pediococcus sp. MA1 avait
une résistance intermédiaire. Les entérocoques isolés du Ghars étaient sensibles à la
tétracycline, tandis que ceux isolés des laits de vache et de chamelle avaient des résistances
intermédiaires. Quant aux lactobacilles, ils ont été tous résistants à cet antibiotique (40 <
CMI ≤ 150µg/ml) ; c’est le même cas pour les lactocoques isolés de la viande (200 < CMI ≤
300 µg/ml) et cela contrairement à celui de la souche Lactococcus sp. GHB15 isolée du Ghars
dont la CMI était ≤ 8µg/ml.
Plusieurs auteurs ont obtenus des résultats similaires aux nôtres :
•
Chez des lactobacilles, Ziane (2008), Ouoba et al. (2008), Devirgiliis et al. (2008) et
Toomey et al. (2010) ont trouvé des CMI (32, 80 et 256µg/ml) indiquant des
résistances variables à la tétracycline.
•
Chez des lactocoques, des résistances à cet antibiotique (CMI > 32µg/ml) ont été
enregistrées par Walther et al. (2008), de même que des sensibilités ont été notées par
ces mêmes auteurs et par Toomey et al. (2010).
•
Chez des entérocoques, Valenzuela et al. (2009) ont constaté que des bactéries
appartenant à ce genre ont moyennement résisté à la tétracycline (8 ≤
CMI ≤
16µg/ml), tandis que les CMI observées par Toomey et al. (2010) étaient ≤ 2µg/ml.
•
chez Streptococcus thermophilus, D’Aimmo et al. (2007) ont rapporté des CMI de
0,5µg/ml.
65
Résultats et Discussion
Au contraire, certaines de ces études ainsi que d’autres ont également montré la
susceptibilité (0,125 ≤ CMI ≤ 8µg/ml) des pédiocoques (Walther et al., 2008 ; Toomey et al.,
2010) et des lactobacilles (D’Aimmo et al., 2007 ; Ouoba et al., 2008 ; Devirgiliis et al.,
2008 ; Toomey et al., 2010) à la tétracycline, ainsi que la résistance intermédiaires (CMI ≤
16µg/ml) de ces derniers (Halley et Blaszyk, 1998).
-
CMI de l’érythromycine :
La plupart des souches se sont révélées résistantes à l’érythromycine avec des CMI
comprises entre 50 et plus de 200µg/ml. Au contraire, les souches Streptococcus thermophilus
MA7 et Lactobacillus sp. LVK32 étaient sensibles à cet antibiotique, tandis que les deux
lactobacilles isolés du lait de chamelle Lactobacillus sp. CHM16 et CHM19 ont présenté des
résistances intermédiaires (20 < CMI ≤32 µg/ml).
Les seuils de sensibilité de la plupart de nos souches s'avèrent supérieurs à ceux décrits dans
la littérature pour l’érythromycine. Entre autres, divers travaux ont montré la sensibilité et/ou
la résistance intermédiaire des pédiocoques avec des CMI ≤ 1µg/ml (Halley et Blaszyk,
1998 ; Rojo-Bezares et al., 2006 ; Toomey et al., 2010), des entérocoques avec des CMI ≤
16µg/ml (Valenzuela et al., 2009 ; Toomey et al., 2010), des lactocoques avec des CMI avec
des CMI ≤ 16µg/ml ( Walther et al., 2008) et des lactobacilles avec des CMI ≤ 8µg/ml
(Halley et Blaszyk, 1998 ; Rojo-Bezares et al., 2006 ; D’Aimmo et al., 2007 ; Ouoba et al.,
2008 ; Devirgiliis et al., 2008 ; Toomey et al., 2010). Cependant, D’Aimmo et al. (2007) et
Ouoba et al. (2008) ont rapporté quelques résultats comparables aux nôtres pour des souches
de Streptococcus thermophilus (CMI ≤ 0,5µg/ml) et des lactobacilles (CMI ≥ 32µg/ml),
respectivement.
D’après ces résultats, nous déduisons que l’érythromycine était la moins efficace sur les
souches que nous avons testé, contrairement à la pénicilline G dont l’efficacité était aussi
élevée que celle de l’amoxicilline (ces deux antibiotiques appartiennent à la même famille).
3.4. Détection des plasmides des bactéries lactiques :
Nous avons adapté la méthode d’O’Sullivan et Klaenhammer (1993) pour rechercher la
présence de plasmides susceptibles d’être porteurs de gènes de résistance à la tétracycline
chez trois de nos souches Lactobacillus sp. V16, Lactococcus lactis ssp. lactis V17 et
66
Résultats et Discussion
Lactococcus lactis ssp. cremoris V18 qui se sont montrées résistantes à des concentrations
dépassant les 100 µg/ml
g/ml de cet antibiotique. La souche
souc Pediococcus sp. MA1, qui a été
inhibée par des concentrations inférieures à 15 µg/ml, a été utilisée comme témoin.
Les résultats obtenus indiquent la présence d’au moins une bande d’ADN plasmidique chez
chacune des souches résistantes alors qu’aucune bande n’a été révélée chez la souche témoin
(figure 11).
Figure 11 : Profil électrophorétique de l’ADN plasmidique des souches étudiées
(MT : marqueurs de taille en Kpb)
3.5. Purification de l’ADN plasmidique :
L’ADN plasmidique de la souche Lactobacillus sp. V16 était récupéré du gel d’agarose par
électroélution comme a été décrit en chapitre 2.7. Cet ADN (figure 12), nommé pLSV16,
était, ensuite utilisé dans l’expérience d’électrotransformation afin de préciser
préci son rôle dans la
résistance de cette souche à la tétracycline.
67
Résultats et Discussion
Figure 12 : ADN plasmidique de la souche Lactobacillus sp. V16 récupéré pour les
expériences d’électroélution
3.6. Transformation de la souche Pediococcus sp. MA1 :
Nous avons précédemment remarqué que les souches résistantes à la tétracycline
Lactobacillus sp. V16, Lactococcus lactis ssp lactis V17 et Lactococcus lactis ssp cremoris
V18 hébergent de l’ADN plasmidique, alors que la souche Pediococcus sp. MA1 ne semble
pas en contenir (figure 11).
Plusieurs auteurs ont démontré que des gènes de résistance à la tétracycline sont localisés
sur des plasmides chez les bactéries lactiques, notamment les lactobacilles (Vescovo et al.,
1982 ; Gevers et al.,, 2003 ; Danielsen,
Dani
2002 ; Kastner et al., 2006 ; Huys et al.,
al. 2006 ; Ziane,
2008). Ainsi, dans le but de confirmer l’implication des plasmides dans la résistance
bactérienne aux antibiotiques, nous avons tenté de transformer la souche Pediococcus sp.
MA1 (souche réceptrice)
trice) par de l’ADN plasmidique de la souche Lactobacillus sp. V16
(souche donneuse) qu’on a dénommé pLSV16.
Ce plasmide était « introduit » dans la souche réceptrice par électrotransformation et la
sélection des clones transformants était effectuée sur milieu MRS contenant 20 µg/ml de
tétracycline.
68
Résultats et Discussion
Aucun clone transformant n’a poussé dans ces conditions de sélection, après 7 jours
d’incubation (tableau 11).
Tableau 11 : Sélection des clones transformants
Lactobacillus sp. V16
Pediococcus sp. MA1
pLSV16 / MA1
+TE
Croissance après 24h
d’incubation
Absence de croissance même
après 7 jours d’incubation
Absence de croissance même
après 7 jours d’incubation
-TE
Croissance après 24h
d’incubation
Croissance après 24h
d’incubation
Croissance après 24h
d’incubation
L’échec de l’électrotransformation peut être du à divers facteurs :
- Comme le montre la figure 12, la bande correspondante à l’ADN pLSV16 est d’une faible
intensité ce qui reflète que la quantité d’ADN pur récolté par électroélution et donc celle de
l’ADN transformant n’était peut être pas suffisante pour « réussir » la transformation. Il a été
rapporté que l’augmentation de la concentration d’ADN utilisé pour l’électrotransformation
favorise les chances d’obtention de clones transformants et conduit à l’augmentation du
nombre de ces derniers (Rixon et Warner, 2003 ; Rodriguez et al., 2007). Dans ce même
contexte, Serror et al. (2002) ont indiqué que la quantité d’ADN requise pour que la
transformation soit plus efficace est comprise entre 0,3 et 2µg.
- Les paramètres électriques de l’électroporation n’étaient pas optimaux. En effet,
Rodriguez et al. (2007) ont rapporté que la puissance du champ électrique a une influence
positive sur la probabilité d’obtention de clones transformants.
- La grande taille du plasmide. Certains auteurs ont décrit que la fréquence
d’électrotransformation est inversement proportionnelle à la taille de l’ADN transformant
(Gasson et Fitzgerald, 1994 ; Rixon et Warner, 2003 ; Beasley et al., 2004).
- L’instabilité de ce plasmide provenant d’un lactobacille dans l’environnement
« pédiocoque » : il se peut que, même si ce plasmide a pu pénétrer à l’intérieur des cellules
réceptrices, il a été perdu par dilution aux cours des divisions cellulaires pendant la période
d’incubation, ou encore a été dégradé par des enzymes de restriction de la cellule réceptrice.
- Les gènes que porte ce plasmide n’ont pas pu s’exprimer chez un pédiocoque.
- Ces gènes codent pour des fonctions autres que la résistance à la tétracycline.
69
Résultats et Discussion
3.7. Recherche d’activité bétalactamase :
La résistance d’un grand nombre de nos souches à la plupart des bétalactamines testées
(tableau 8) nous a suscité à rechercher la présence d’enzymes dégradant ces molécules, ou
bétalactamases, chez quelques unes de ces souches.
Bien que l’activité bétalactamase représente un sujet très abondant parmi les études portant
sur l’antibiorésistance chez les bactéries à Gram négatif (Yong et al., 2002 ; Lee et al., 2005 ;
Pieboji, 2007 ; Dias et al., 2008 ; Akujobi et al., 2008 ; Drissi, 2008 ; Faure, 2009), il n y a
que très peu de travaux qui l’ont abordé chez les bactéries lactiques (Rojo-Bezares et al.,
2006).
De nombreux tests permettant de rechercher la présence des différents types de
bétalactamases chez les bactéries résistantes sont décrits dans la littérature, parmi lesquels on
cite le test iodométrique (Courvalin et al., 1985), le test de Hodge (Yong et al., 2002) et le test
à l’EDTA (Jesudason et al., 2005). Dans notre étude, nous avons utilisé deux tests qui sont le
test de synergie et le test 3D. Ces tests ont été détaillés dans le chapitre 2.9.
Pour le premier test, l’image de synergie entre les deux disques d’AMC (Amoxicilline
associée à l’acide clavulanique) et de CTX (céfotaxime) n’a été observée que chez les souches
Lactococcus sp. GHB15 et Enterococcus sp. GHB21 (figure 13). Cela pourrait être traduit par
le fait que ces souches sont productrices de bétalactamases à spectre élargi BLSE, bien que la
production de ces enzymes ne soit rapportée, à notre connaissance, que chez des bactéries à
Gram négatif (Garcia-Rodriguez et Jones, 2002 ; Poole, 2004).
Dans le test 3D, aucune déformation de la zone d’inhibition autour du disque de céfoxitine
(FOX) n’a été observée (figure 14), et cela pour toutes les souches testées. Ces souches ne
produisent, donc, pas de céphalosporinases chromosomiques AmpC. Ce résultat concorde
avec les données de la littérature qui indiquent l’absence de ces enzymes chez les bactéries à
Gram positif (Goossens, 2001 ; Poole, 2004 ; Sundin 2009).
70
Résultats et Discussion
GHB21
Figure 13 : Image de synergie entre AMC et CTX
G6
V13-1
V3
V7
Figure 14 : Résultat du test 3D
71
Conclusion et Perspectives
Les bactéries lactiques, comme toute autre bactérie, peuvent être naturellement résistantes à
des antibiotiques ou acquérir cette résistance de leur environnement grâce aux transferts
possibles de gènes codants ces traits - qui auront certainement des conséquences négatives sur
l’état de santé de l’Homme - entre les différentes bactéries. La présence de tels gènes chez une
bactérie lactique lui permet d’annuler l’effet des antibiotiques sur elle par différents
mécanismes dont l’inactivation enzymatique de ces molécules et la modification de leurs
cibles.
Au cours de ce travail, nous avons étudié le comportement de 83 souches autochtones de
bactéries lactiques vis-à-vis de 25 antibiotiques appartenant à 7 familles différentes. A
l’exception de l’oxacilline, la ceftazidine et le céfixime auxquels toutes nos souches ont
résisté et de l’imipéneme qui était efficace sur toutes ces souches, les réponses aux
antibiotiques testés étaient variables selon les classes auxquelles appartiennent ces molécules
et même à l'intérieur d'une même classe. Dans l'ensemble, nos souches ont présenté une
résistance beaucoup plus élevée aux antibiotiques des familles des aminosides et des
fluoroquinolones avec des pourcentages dépassant les 90% et cela par rapport à leur résistance
aux rifamycines (71,08%), bétalactamines (65,25%), macrolides (57,82%) et nitrofuranes
(59,03%) ; la résistance la moins élevée a été observée avec les antibiotiques de la famille des
tétracyclines (31,32%). La variabilité de la sensibilité de nos souches semble dépendre
également du genre auquel elles appartiennent et de leur origine. De plus, nous avons
remarqué une fréquence élevée de multirésistance parmi les souches que nous avons étudiées.
Ce screening a conduit à la détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI)
de divers antibiotiques (pénicilline G, amoxicilline, érythromycine et tétracycline) chez 16 de
nos souches. Les valeurs de CMI estimées étaient de l'ordre de 0,5 à plus de 200µg/ml pour
les deux bétalactamines et d’à peu près 8 à plus de 200µg/ml pour l'érythromycine et la
tétracycline.
La présence de plasmides - susceptibles d'être porteurs de gènes de résistance à la
tétracycline - est montrée chez trois de nos souches résistantes à cet antibiotique avec des
valeurs de CMI dépassant les 100 µg/ml (Lactobacillus sp. V16, Lactococcus lactis ssp. lactis
V17 et Lactococcus lactis ssp. cremoris V18) : ces trois bactéries contiennent, chacune, au
moins une bande d'ADN plasmidique. Après avoir tenté de transformer une souche dépourvue
de plasmides avec l’un des plasmides de la souche Lactobacillus sp. V16 en vue d’affirmer
73
Conclusion et Perspectives
son rôle dans la résistance de cette souche à la tétracycline, nous n’avons obtenu aucun clone
transformant, ce qui ne nous a pas permis de confirmer notre hypothèse. Ce résultat mérite
d’être confirmé par des expériences complémentaires.
Les résultats du screening d’antibiorésistance chez nos souches montrent la résistance d’un
grand nombre de nos souches à la plupart des bétalactamines testées. Cette observation nous a
conduit à rechercher la présence d’enzymes dégradant ces molécules, ou bétalactamases, chez
quelques unes de ces souches. Les tests réalisés pour cet objectif ont montré que les souches
Lactococcus sp. GHB15 et Enterococcus sp. GHB21 produisent des BLSE mais qu’aucune de
ces souches n'est productrice d'AmpC.
Ces résultats suggèrent que les bactéries que nous avons étudiées sont des réservoirs de
gènes de résistance à différents antibiotiques, cela doit amener à penser aux conséquences
négatives que peut avoir la présence de telles bactéries dans les aliments car la possibilité de
transferts géniques entre les bactéries est toujours probable. Comme nous n’avons pas réussi à
confirmer l’implication des plasmides dans les résistances observées et à concrétiser le
concept de la possibilité d’acquisition de tels traits par transfert horizontal de gènes, il serait
très intéressant de continuer à travailler sous cette optique tout en essayant d’optimiser les
protocoles expérimentaux et de mener des études plus approfondies telle est la recherche
directe et la caractérisation des gènes de résistance chez nos bactéries.
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89
Annexe
Annexe : Principales classes d’antibiotiques et leurs spectres d’activité (Zomahoun, 2005 ;
Euzéby, 2007)
Familles ou molécules
non classées
(Modes d'action)
Acide fusidique
(Inhibition de la synthèse
Principaux groupes
ou molécules
Spectre
Étroit (coques et bacilles à
Acide fusidique
des protéines)
Gram positif, coques à Gram
négatif)
Aminosides ou
Amikacine, Apramycine,
aminoglycosides
Gentamicine, Kanamycine,
Large (sauf bactéries
(Inhibition de la synthèse
Néomycine, Streptomycine,
anaérobies).
des protéines)
Tobramycine
Groupe de la pénicilline G :
Pénicilline G, Pénicilline V
Pénicillines antistaphylococciques :
Oxacilline, Cloxacilline,
Dicloxacilline, Méticilline
Aminopénicillines : Amoxicilline,
Ampicilline, Epicilline
Bétalactamines
(Inhibition de la synthèse
du peptidoglycane)
Étroit (coques et bacilles à
Gram positif, coques à Gram
négatif)
Étroit (identique à celui de
la pénicilline G).
Large
Carboxypénicillines :
Carbénicilline, Carfécilline,
Large
Ticarcilline
Uréido-pénicillines : Azlocilline,
Mezlocilline, Pipéracilline
Carbapenems : Imipéneme
Large
Large
Oxapenams : Acide clavulanique
Inhibiteurs de
(associé à l’amoxicilline ou à la
ticarcilline), Tazobactam (associé à la bétalactamases utilisés en
pipéracilline), Sulbactam ( associé à
association avec une autre
l’ampicilline).
bétalactamine).
91
Annexe
Annexe (suite 1) : Principales classes d’antibiotiques et leurs spectres d’activité (Zomahoun,
2005 ; Euzéby, 2007)
Familles ou molécules
non classées
(Modes d'action)
Principaux groupes
ou molécules
Monobactams : Aztréonam
Spectre
Étroit (bacilles à Gram
négatif)
Céphalosporines de 1ère
génération : Céfazoline, Céfalexine,
Large
Céfaloridine, Céfalotine
Céphalosporines de 2ème
Bétalactamines
(Inhibition de la synthèse
du peptidoglycane)
génération : Céfoxitine,
Large
Céfamandole, Céfotétan, Céfuroxime
Céphalosporines de 3ème
génération : Céfotaxime,
Ceftazidime, Ceftizoxime,
Large
Ceftriaxone
Autres céphalosporines : Céfixime,
Céfalonium, Céfopérazone,
Large
Cefsulodine, Cefquinome
Diaminopyrimidines
Baquiloprim, Triméthoprime
Large
Fosfomycine
Large
(Blocage de la synthèse de
l'acide folique)
Fosfomycine
(Inhibition de la synthèse
du peptidoglycane)
Glycopeptides
(Inhibition de la synthèse
du peptidoglycane)
Teicoplanine, Vancomycine
Étroit (bactéries à Gram
positif)
92
Annexe
Annexe (suite 2) : Principales classes d’antibiotiques et leurs spectres d’activité (Zomahoun,
2005 ; Euzéby, 2007)
Familles ou molécules
non classées
(Modes d'action)
Polypeptides
Principaux groupes
ou molécules
Polymyxine B, Colistine
(Action sur la membrane
Spectre
Étroit (bacilles à Gram
négatif)
externe et/ou sur la
membrane cytoplasmique
Bacitracine, Gramicidine, Tyrocidine
des bactéries)
Étroit (bactéries à Gram
positif)
Quinolones de première
génération : Acide nalidixique,
Étroit (bacilles à Gram
Quinolones et
Acide oxolinique, Acide
négatif)
Fluoroquinolones
pipémidique, Fluméquine
(Inhibition de la synthèse
Fluoroquinolones : Norfloxacine,
de l'ADN)
Ofloxacine, Ciprofloxacine,
Énoxacine, Difloxacine,
Large
Enrofloxacine,
Sulfamides
Sulfadiazine, Sulfadimérazine,
(Blocage de la synthèse de Sulfadiméthoxine, Sulfadoxine,
l'acide folique)
Large
Sulfaméthoxazole
Streptogramines ou
synergistines
Pristinamycine, Virginiamycine,
(Inhibition de la synthèse
Synercid
des protéines)
Étroit (coques et bacilles à
Gram positif, coques à Gram
négatif)
Tétracyclines
Tétracycline, Chlortétracycline,
(Inhibition de la synthèse
Oxytétracycline, Doxycycline,
des protéines)
Lymécycline, Minocycline
Rifamycines
(Ansamycines)
(Blocage de la synthèse
des ARN-messagers)
Rifamycine SV, Rifaximine
Étroit
Rifampicine
Large
Large
93
Annexe
Annexe (suite 3) : Principales classes d’antibiotiques et leurs spectres d’activité (Zomahoun,
2005 ; Euzéby, 2007)
Familles ou molécules
non classées
(Modes d'action)
Imidazolés
Principaux groupes
ou molécules
(Coupure des brins d'ADN Métronidazole, Ornidazole
et déroulement de l'ADN)
Clindamycine, Lincomycine
des protéines)
Macrolides
(Inhibition de la synthèse
des protéines)
Nitrofuranes
(Inhibition de la synthèse
de l'ADN)
strictes)
Gram positif, coques à Gram
négatif)
Érythromycine, Spiramycine,
Azithromycine, Clarithromycine,
Josamycine, Midécamycine,
Roxithromycine, Tylosine
Nitrofurantoïne, Nitrofurazone,
Furazolidone, Nifuroxazide
Étroit (coques et bacilles à
Gram positif, coques à Gram
négatif)
Large
Étroit (coques et bacilles à
Novobiocine
(Inhibition de la
Étroit (bactéries anaérobies
Étroit (coques et bacilles à
Lincosamides
(Inhibition de la synthèse
Spectre
Novobiocine
réplication de l'ADN)
Gram positif, coques à Gram
négatif)
Oxazolidinones
(Inhibition de la
synthèse des protéines)
Phénicolés
(Inhibition de la synthèse
des protéines)
Linezolid
Chloramphénicol, Florfénicol,
Thiamphénicol
Large
Large
94
Résumé
Dans le but d’étudier le phénomène d’antibiorésistance chez des bactéries lactiques
autochtones, 83 souches ont été affrontées à 25 antibiotiques de 7 familles différentes puis les
concentrations minimales inhibitrices (CMI) de 4 de ces molécules ont été mesurées chez 16
de ces souches. L’activité bétalactamase et la présence de plasmides susceptibles de porter
des gènes de résistance à la tétracycline ont été recherchées chez les souches résistantes à un
grand nombre de bétalactamines et à la tétracycline, respectivement.
Les résultats obtenus ont montré que ces souches ont des profils d’antibiorésistance variés
qui dépendent principalement des genres auxquels elles appartiennent et de leurs origines, et
qu’un grand nombre d’entres elles présentent des multirésistances ; certaines de ces souches
sont également productrices de bétalactamases. Par ailleurs, les valeurs de CMI estimées
étaient de l'ordre de 0,5 à plus de 200µg/ml pour deux bétalactamines (pénicilline G,
amoxicilline) et d’à peu près 8 à plus de 200µg/ml pour l'érythromycine et la tétracycline.
Parmi les souches résistantes à ce dernier antibiotique, trois hébergent également des
plasmides susceptibles d’être porteurs de gènes de résistance à cette molécule.
Mots clés : antibiorésistance, bactéries lactiques, antibiotiques, CMI, bétalactamases,
plasmides, tétracycline.
Abstract
In order to study the phenomenon of antibiotic resistance in indigenous lactic acid bacteria,
83 strains were tested against 25 antibiotics of 7 different antibiotic families’, then minimal
inhibitory concentrations (MIC) of 4 of these molecules were measured for 16 of these strains.
The betalactamase activity and the presence of plasmids carrying tetracycline resistance genes
were investigated in some strains that were resistant to many betalactams and to tetracycline,
respectively.
The results showed that these strains had different antibiotic resistance profiles relaying
primarily on genus to which they belong and on their origins, and that many of them exhibit
multidrug resistance ; some of these strains are also producers of betalactamases. In addition,
estimated MIC values were in the range of 0.5 to 200µg/ml for two betalactams (penicillin G,
amoxicillin) and about 8 to more than 200µg/ml for erythromycin and tetracycline. Among
strains resistant to the last antibiotic, three host also plasmids that may carry tetracycline
resistance genes.
Key words : antibiotic resistance, lactic acid bacteria, antibiotics, MIC, betalactamases,
plasmids, tetracycline.
‫ملخص‬
‫ مضاد حيوي ينتمون لسبعة‬25 ‫ ساللة ضد‬83 ‫تم تجريب‬،‫من أجل دراسة ظاھرة مقاومة بكتيريا اللبن للمضادات الحيوية‬
‫ تم‬، ‫ بعد ذلك‬.‫ من ھذه السالالت‬16 ‫( لأربعة من ھذه الجزيئات عند‬CMI) ‫عائالت مختلفة ثم تم قياس التركيزات األدنى المثبطة‬
‫ وذلك عند‬tétracycline ‫ و عن وجود البالزميدات التی قد تكون حاملة لجينات مقاومة‬betalactamase‫البحث عن النشاط‬
.‫ على التوالي‬، tétracycline‫ ول‬bétalactamines ‫بعض السالالت التي أظھرت مقاومتھا للكثير من‬
‫النتائج المحصل عليھا بينت بأن أنماط مقاومة ھذه السالالت للمضادات الحيوية كانت متنوعة وذلك أساسا حسب الأجناس التي‬
.betalactamases ‫ و بأن كثيرا منھا أظھرت مقاومات متعددة ؛ بعض ھذه السالالت ھي أيضا منتجة ل‬،‫تنتمي إليھا وأصولھا‬
pénicilline G ) bétalactamines ‫ بالنسبة إلثنين من‬200µg\ml ‫ إلى‬0،5 ‫ في نطاق‬CMI ‫ قدرت قيم‬، ‫باإلضافة إلى ذلك‬
‫ من بين السالالت المقاومة‬.tétracycline ‫ و‬érythromycine‫ ل‬200µg\ml ‫ إلى أكثر من‬8 ‫( وحوالي‬amoxicilline,
.tétracycline ‫ ثالثة تملك بالزميدات قد تكون حاملة لجينات مقاومة‬،‫للمضاد الحيوي األخير‬
، ‫ بالزميدات‬، betalactamases، CMI، ‫ مضادات حيوية‬،‫ بكتيريا اللبن‬،‫ مقاومة المضادات الحيوية‬: ‫الكلمات المفاتيح‬
.tetracyclin
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