\ &A F I X A T I O N BIOLOGIQUE DE L' AZOTE L' ORSTOM ET LES RECHERCWES FONDAMENTALES c Microbiologie D,. B o g u s z .C. Franche , Dakar rv .. Y Ce rapport traite uniquement d'une partie des recherches faites au laboratoire de Biologie des Sols O.R.S.T.O.M. de Dakar : il s'agit de recherches en Biologie Mol6culaire sur les symbioses SesbagiaRhizobium et Azolla-Anaba,enaazo,llae. I 11 n'est pas question ici des recherches effectuées sur les symbioses actinorhiziennes ni sur les symbioses avec d'autres LQgumineuses à nodules caulinaires (Aeschynomene) ni sur Les symbioses avec les légumineuses arborescentes. Les recherches sur ces systèmes portent sur la physiologie et l'écologie. 1 Ce rapport a pour but d e ' p r é s e n t e r l e s recherches fondamentales e n t r e p r i s e s dans l e monde e t B 1' ORSTOM s u r l a f i x a t i o n biologique de l ' a z o t e , Nous p r é s e n t e r o n s : - - - une d é f i n i t i o n de l a f i x a t i o n b i o,l o g i en i n t r o d u c t i o n que de l ' a z o t e , a i n s i qu'une l i s t e des d i f f é r e n t s microorganismes f i x a t e u r s d ' a z o t e un h i s t o r i q u e des recherches fondamentales e n t r e p r i s e s dans l e monde s u r l e s principaux systèmes f i x a t e u r s d ' azote un résumé des recherches fondamentales menées p a r l e s chercheurs ORSTOM de l a s e c t i o n microbiologie de Dakar s u r deux systèmes f i x a t e u r s d ' a z o t e : , d ' u n e p a r t l a symbiose Rhizobium- S,e,sbani,a ro st r a t , a d ' a u t r e p a r t l a symbiose A.zolla -Anaba,ena azollae . - ' l e s p e r s p e c t i v e s à lnng terme de c e type de recherche I en conclusion I nous proposerons une r é f l e x i o n s u r l ' e n jeu pour l e s pays en voie de développement de l a b i o l o g i e moléculaire e t du génie génétique , e t sur l e r81e que peut jouer 1'ORSTOM dans ce domaine . I 2 * . 9 F I LA F I X A T I O N BIOLOGIQUE DE L'AZOTE 1 I Définition : L ' a z o t e moldculaire contenu dans l'atmosphère t e r r e s t r e . r e p r é s e n t e u n e r e s e r v e pratiquement i l l i m i t é e d ' e n v i r o n 4.10 1 5 tonnes mais , pour Btre a s s i m i l a b l e p a r l e s végétaux 1' a z o t e d o i t & t r e combiné 21 d ' q u t r e s éléments t e l s que l ' h y d r o gène ou l'oxygène La transformation de l ' a z o t e m o l é c u l a i r e en a z o t e combing e s t appelée f i x a t i o n . d ' a z o t e ; e l l e peut s e f a i r e s e l o n des v o i e s biologiques ou chimiques. . L I Quelques c h i f € r e s : . La f i x a t i o n biologique de L ' a z o t e r e p r é s e n t e environ 180 m i l l i o n s de tonnes d ' a z o t e f i x é p a r an; e l l e e s t r é a l i s é e . uniquement p a r c e r t a i n s microorganismes p r o c a r y o t e s La f i x a t i o n chimique n a t u r e l l e r e p r é s e n t e environ 20.106 tonnes e t l a synthèse chimique d'ammoniaque p a r Le procédé Haber env i r o n 100.10 6 tonnes. L'emploi d ' e n g r a i s r e p r é s e n t e 3 0 pour c e n t de l a "note énerg6tique 'I en a g r i c u l t u r e moderne I1 e x i s t e dans l e monde 600 u s i n e s q u i u t i l i s e n t le proci5dé Haber. Leur consommation en Bnergie-. est considdrabLe.: e l l e &quivaut B environ 2 m i l l i o n s I . Lu-L*I-J_L_ de b a r i l s de p é t r o l e p a r jour. Les microorganismes f i x a t e u r s d ' a z o t e : Les microorganismes f i x a t e u r s d ' a z o t e a p p a r t i e n n e n t à des groupes taxonomiques t r è s d i v e r s regroupant une cinquantaine d' hspèces b a c t d r i e n n e s e t de ndmbreuses cyanobactéries. On p e u t c l a s s e r l e s f i x a t e u r s d ' a z o t e en deux groupes s e l o n l e u r r e l a t i o n avec l e s p l a n t e s : l e groupe des b a c t é r i e s f i x a t r i k e s l i b r e s non a s s o c i é e s . comme Klebsiella pnemon,iae Azospiri1,lum Azotobacter v i n e l a n d i i Clostridium p a s t e u r i a num, Rhodospirillum rubrum e t de nombreuses cyanobactéries; l e groupe des b a c t é r i e s symbiotiques q u i f i x e n t l ' a z o t e en a s s o c i a t i o n avec l a p l a n t e ; c ' e s t l e c a s de Rhiz0bi.w avec l e s légumineuses de c e r t a i n s actinomycètes comme Frankia avec Casuarina e t d'Anaba,ena a z o l l a e q u i f i x e l ' a z o t e l'int é r i e u r de l a fougère Az6ll.a avec une p l a n t e s p e c i f i q u e I I . I . ... . " . . .. I1 ' 3 Le tableau I présente une liste des principaux systèmes fixateurs d'azote Qtudiés dans le monde . I Les systèmes fixateurs dlazote étudiés B 1'ORSTOM : Dans la nature , les systèmes fixateurs d'azote les plus efficaces sont les systèmes symbiotiques En raison de leur intéret pour le maintien de la fertilité des s o l s tropicaux , LIORSTOM a choisi d'étudier 16s symbioses suivantes : - légumineuses- Rhizobium : . L non légumineuse - actinomycète : Casuarina Fran.kia - pteridophyte cyanobactérie.: Azolla- Anabaena azollae - Y - - .. . . . . . . . r , I 1 \ * 1' 4 8 !Tableau I : liste des principaux microorganismes fixateurs d'azote 1 . Klebsiella pneumoniae Fixateurs libres ' 1 i - 1 . Azospirillum . Rhodospirillum rubrum . Azotobacter vinelandii I I l i Cyanobactéries : Gloeothece , Anabaena ,' Nostoc , 1 -.. i Fixat,eurssymbiotiques! j i lj . Rhizobium -symbioses avec les légumineuses: trbfle soja,luzerne,arachide, haricot ,pois,sesbania ,aeschynomene acacia,albizia,leucaena,,... : t i i 1i -symbiose avec l e s non légumineuses: parasponia I - It Actinomycetes : Frankia symbiose avec Casuarina Cyanobactéries : Anabaena azollae symbiose avec Azolla l ._---- ,SUR L E S BACTERIES FIX,ATRICES D'AZOTE Klebsiella pneumoniae : Klebsiella pneumon,iaeest le fixateur libre qui a été le plus utilisé jusqu'en 1980 pour,les analyses géngtiques et biochimiques de la fixation d'azote En effet , cettg bactérie présente des atouts majeurs &ur le travail de Laboratoire : . - c'est une entdrobactérie dont la carte génét$que est très proche de la bactérie modèle Escherichia coli - - elle pousse rapidement et se manipule facilement en' laboratoire ' - il est très facile d'en isoler sur boite de pétri des mutants incapables de fixer l'azote C e s mutants sont des outils indispensables à l'étude des gènes hpliquês dans la fixation d'azote. . A ces propriétés remarquables , les techniques Gr&& d'analyse génétique classique connues chez Esche,richiacoli ont pu etre employées avec Klebsiella pneumoniae C'est ainsi que dès 1971 les gènes nif ( nitrogen fixation ) de,KLebsiella ont été localisés et isolés Le développement des techniques de génie gén6tique a pepis dans les années 1979 une analyse fine du processus biologique de la fixation d' azote chez cette bact6rie"Aujourd'hui , tous les gènes impliqués dans la fixation d'azote sont connus ; le produit de ces gènes est identifié : la fonction de ces produits est pratiquement déterminée Les recherches actuelles portent sur les mécanismes de régulation de l'expression des gènes nif.. . - . . Klebsiella pnemoniae a donc'*.ét6jusqu'en 1980 la bact6rie mod&!le pour les microb idogistes Qtudiant la fixation d' azote Cependant le r81e agronomique de ce fixateur libre est faible . , . . 1 , 6 Les bactéries du genre Rhizobium : En association avec les légumineuses, Rhizobiumiest resLes ponsable de 40 % de la fixation biologique naturelle bactéries du genre Rhizobium infectent les racines des légumineuses oÙ ils induisent la différenciation de structures appeC'est au sein de ces nodules que Rh,izobiun.exlées nodules , prime son activité nitrogénase . . L__._. . Bien que de nombreuses études aient été entreprises sur les reces bactéries en raison Je leur intér@t agronomique En effet une fois cherches fondamentales ont été difficiles isolées des nodules de la plante hBte les bactéries du genre Rhizobium ne poussent plus aux dépens de l'azote moléculaire. 1; est donc impossible d'identifier sur boite de pétri des mutants de Rhi,zobiumincapables de fixer l'azote ; chaque mutant potentiel isolé en laboratoire doit &tre testé sur la plante h8te pour conclure ou non à une mutation dans les gènes de la Ces études sont donc très laborieuses fixation d'azote I . - , I . . Cependant dans les années 1980 la biologie moléculaire a permis une progression notable des études fondamentales chez Rhizobium EA utilisant les connaissances obtenues sur la bactérie modèle Klebsiella pneumoniae ; les chercheurs ont pu Plusieurs g&nes étudier quelques gènesnif de ces Rhizobium bactériens impliqués dans le processus de nodulation sont en cours d'étude . . . Le facteur limitant des recherches fondamentale8 en Rhizobiologie était donc l'impossibilité de cultiver Les bactéries du genre Rhizobium en condition de fixation d'azote . Les cyanobactéries : . . . Les cyanobactéries sont des microorganismes procaryotes La photosynthèse possédant une photosynthgse de type végétale est la transformation de 1'4nergie lumineuse pour la croiskance @'un syst&me biologique Les cyanobactéries se présentent sous des formes très diverses I unicellulaires ou filamenteuses , non fixatrices ou fixatrices d'azote I en symbiose ou 21 1'8tat Dans l e s régions libre I et colonisent des biotopes très variés tropicales I leur r61e dans le maitien du bilan d'azote des spls . . . . assujettis à une culture intensive est important . la purificaC'est vers les années 1970 que l'isolement tion et les milieux de culture des cyanobactdries s o n t m i s au de biochimie et de point Les travaux généraux de physiologie génétique de c e s microorganismes sont donc relativement récents . , . L e s cyanobactéries fixatrices d'azote les plus importantes au niveau écologique sont les formes filamenteuses hétérocystées, L'hétécomme par exemple les cyanobactéries du genre 7 Anabaena . rocyste est une cellule sp6cialisée dans la fixation de l'azote I1 n'existe à l'heure actuelle aucun système d'analyse génétique Dans les années 1980 , la classique de ces microorganismes biologie moléculaire a cependant permis y comme p o u r les bactéries du genre Fhizo.b.ium une étude de quelques g h e s impliqués dans la fixation d'azote , en particulier pour une souche d'An,abaenavivant A l'état libre . . . Les connaissances fondamentales sur la fixation d'azote chez les cyanobactéries sont donc encore plus embryonnaires que pour Rhizobium , et surtout il est très difficile d'isoler des mutants incapables de fixer l'azote . .. . . .. .. 8 &CHERCHES La symbiose Rhizobium FONDAMENTALES EN MICROBIOLOGIE A L'ORSTOM DAKAR - Sesbania - rostrata : La découverte : I \ En 19.19 B.Dreyfus reddcouvre dans le Nord du SBnBgal ) 9 une légumineuse tropicale : Sesbania rostrata. Cette légumineuse i présente l'originalit6 d'une,double nodulation : racinaire et I1 isole de ces nodules une caulinaire ( nodules de tiges ) souche de Rhizobium qu'il appelle ORS 571 En culture pure,'la souche d'ORS 571 présente la proprié\ t6 unique d'utiliser l'azote mol6culaire pour sa croissance Les études en laboratoire sur boite de pétri de la fixation d'azote chez Rhizobium sans passer par l'intermédiaire de la L' ensemble des Rhizobiologistes plante sont donc possibles I B travers le monde avait trouvé sa bactérie modele -' Une autre propriété remarquable de cette symbiose est l'existenke sur la tige de Sesbania de nombreuses Bbauches racinaires qui , a p r h infection par Rhizobium , se transforment en nodules fixateurs d'azote La quantité d'azote fixée par une telle plante est donc beaucoup plus importante que celle , observée pour les légumineuses à nodules exclusivement racinaires ( s o j a luzerne haricot pois , - * . ) \ / i . . ( ( ( La symbiose Rhizobium - Sesbania rostrata presente dona la double caractéristique d'&tre un modèle unique pour les recherches fondamentalesl et un matériel' denchoixpour une utilisation C O ~ Qengrais vert . Les recherches fondamentales ORSTOM : Nous ne parlerons pas ici.volontairement des recherches Nous agronomiques menees par 1'ORSTOM ( engrais vert ) n'aborderons que les recherches fondamentales et distinguerons les recherches effectuees au sein du laboratoire de microbiologie de Dakar et les recherches qui , en l'absence d'un laboratoire de biologie . moléculaire ORSTOM ont du @tre mendes dans d'autres structures . . I 1 I 9 Etudes généti8ques: A 1'ORSTOM Dakar : des bactériophages ( virus des bactéries capables d'infecter Rhizobium ORS 571 ont étés isolés et caractéLe contenu plasmidique ( matériel génétique extrachromorisés somique ) de la souche ORS 571 a été Qtudié . --------- . - . . -en- -collaboration - - - - - - - - -avec - - - -des - - chercheurs - - - - - - - - ORSTOM - . - -: ' Institut Pasteur Paris : des mutants incapables de kixer l'azote önt étés isolés et caractérisés Par les techniques de biologie moléculaire I une anlyse fine de plusieurs de ces g h e s a été entreprise - Université de Gent Belgique :des mutants de la souche ORS 571 affectés dans la fixation d'azote et dans la nodulation de la plante hbte ont étés i s o l é s et caract.érisés I N R A , T O U ~ Q U:S 1'Qtude ~ des gènes de la plante Sesbania rostrata impliqués dans la symbiose est en cours . . . - . Etudes biochimiques : .B -- 1'ORSTOM Dakar : les leghémoglobines ( protéines présente: dans les nodules des légumineuses et indispensables a la fixation purifiées 2i partir des nodules de tige et de d'azote ) ont été racine de Sesbania rostrat2 et partiellement caract6risés a I1 est tres vite apparu que les leghémoglobines de Sesbania rostrata pouvaient servir de modele pour l'étude du fonctionnement let du r8le des leghémoglobines I------- . - . en collaboration - - - -avec des - - -chercheurs - - - - - -ORSTOM - - --: - - - - I . - - - -1 CSIRO Camberra , Australie : la caractérisation biochimique des leghémoglobines a été poursuivie et une étude physiologique est en cours Albert Einstein College , U.'.S.A. : l'affinit6 pour l'oxyghne des leghémoglobines a été mesurée Université de Melbourne M'elbourne I Australie : la séquence en aminoacides des leghhoglobines est en cours I . - . - - . - Université de Californie La Jolla , U.S.A. : la structure fine des leghémoglobines est étudiée en utilisant la résonnance magnétique nucléaire . , I ' , &ABORATOIRES EY'UDIANT RHIZOBIUM L - LA SYMBIOSE SESBANIA ROSTRATA FRANCE : . U n i t é de P h y s i o l o g i e c e l l u l a i r e I n s t i t u t P a s t e u r P a r i s . L a b o r a t o i r e de B i o l o g i e Mol6culaire des r e l a t i o n s h l a n t e s I I microorganismes I INRA / CNRS , Toulouse . L a b o r a t o i r e de Biologie VQgétale , U n i v e r s i t g ETATS I - de N i c e I NICE .i UNIS : . Department of Physiology and medecin I A l b e r t Einstein College of MedechelNew-York Department of Molecular Biology La J o l l a I C a l i f o r n i e . ) . Department Cruz o f Biology Californie , I University of California, U n i v e r s i t y of C a l i f o r n i a I Santa Belgique : Laboratorium voor Genetika e n 'voor H i s t o l o g i e en Genetika, R i jkun i v e r s i t e i t , Gent Allemagne : . Max Plank I n s t i t u t f ü r Zunchtugs forshung ,Cologne H o l 1an de : . Biological laboratory v r i j e U n i v e r s i t e i t Amsterdam Angleterre : School of Chemical Sciences I U n i v e r s i t y of E a s t Norwich Australie : . ) CSIRO Division of P l a n t I n d u s t r y . University of Melbourne , Melbourne Canberra - Anglia I ', I L a symbiose A,nabaena a z o l l a e - Azolla : Présentation : L ' u t i l i s a t i o n des souches de c y a n o b a c t é r i e s l i b r e s f i x a t r i c e : d ' a z o t e comme e n g r a i s v e r t reste d é l i c a t e e t a s s e z i n e f f i c a c e P a r c o n t r e , un e n g r a i s v e r t q u i a f a i t ses preuves depuis des s i h c l e s e n r i z i c u l t u r e e s t l a fougère a q u a t i q u e AzoLla A 1I i n t é r i e u r de c e t t e fougère v i t une c y a n o b a c t é r i e : &abaen,a azollae q u i f o u r n i t t o u t l ' a z o t e nécessaire A l a croissance . . de l a p l a n t e Afin d ' a m é l i o r e r l e s p o t e n t i a l i t é s n a t u r e l l e s de l a sym- I b i o s e Azolla-Anabaena a z o l l a e ( o b t e n t i o n de souches r é s i s t a n t e s aux h a u t e s i n t e n s i t e s lumineuses , de souches hyperf i x a t r i c e s , ) ... il e s t n é c e s s a i r e de b i e n c o n n a i t r e les deux p a r t e n a i r e s : l a . p l a n t e e t l a cyanobactérie O r jusqu'B p r e s e n t , on ne c o n n a i t pas l e m i l i e u de c u l t u r e de l a c y a n o b a c t é r i e 2 il e s t donc impossible de l a c u t i v e r e n dehors de l a fouggre . Etudes g é n é t i q u e s : .L .B -- 1'ORSTOM Dakar : l a démarche e n t r e p r i s e est l a s u i v a n t e : b i e n q u e l ' o n ne p u i s s e pas c u l t i v e r l a c y a n o b a c t é r i e B 1 ' 8 t a t l i b r e , on p e u t l ' i s o l e r à p a r t i r des b r o y a t s de l a p l a n t e , e x t r a i r e l e matsériel g é n é t i q u e ( ou A.D.N. ) c$e l a c y a n o b a c t é r i e , et l'étudier C e s t a i n s i que nous avons pu montrer qu ',A,n.abaen%a a_,zol.l.ae possède de p e t i t s plasmides; ceux-ci p o u r r o n t & t r e u t i l e s pour l a m i s e a u p o i n t de methodes d ' a n a l y s e g é n é t i q u e de l a cyanobactérj .-------e&-- - -- - , P a r i s -: -- - - -- ---- .en c o l l a b o r a t i o n avec l ' I n s t i t u t P a s t e u r .*-------- - I L- L - &--I Nous avons é t u d i é par les techniques de b i o l o g i e m o l é c u l a i r e p l u s i e u r s gènes impliqués dans l a f i x a t i o n d'a z o t e chez Rn.aba,ena azollae C e s o n t l e s premiers r é s u l t a k s obtenus s u r L e s gènes de l a f i x a t i o n d ' a z o t e d ' u n e cyanobact6ri.e symbiotique . -. . . . . . . . .- . . 1 P E R S P E C T I V E S A LONG TERME DE CES RECHERCHES -. -_ . . . .: La finalité de toutes ces recherches fondamentales aur la fixation d'azote menges à travers le monde est la disparition des engrais chimiques azotés par 1' introduction de la capacité de fixer l'azote dans les cellules végétales . Deux approches sont envisageables : - conférer aux végétaux naturellemen't non fixateurs ( le blé , le riz , la canne à sucre ; ) la capacité de former des nodules avec des microorganismes fixateurs d'azote ... - introduire directement dans les cellules des végétaux les gènes responsables de la fixation d'azote . Ces deux approches nécessitent une connaissance parfaite de tous les processus biologiques permettant la fixation d'azote , aussi bien chez la plante hBte que chez les microorUne telle connaissance n'est possible que grace A ganismes l'emploi des techniques de biologie moléculaire et de génie génétique . . II .2 * * - . I CQNCLUS ION C e r a p p o r t s o u l i g n e l ' i n t é r & t des. systèmes b i o l o g i q u e s que l ' o n t r o u v e dans l e s r é g i o n s tropicales e t l ' e x i s t e n c e de recherches d i t e s fondamentales dans l a s e c t i o n m i c r o b i o l o g i e des s o l s de LIORSTOM 11 m e t également en évidence l e s d i f f i c u l t é s r e n c o n t r g e s pour pourkuivre des recherches compétitives . de h a u t niveau dans l e s s t r u c t u r e s a c t u e l l e s de 1'ORSTOM . L a biologie moléculaire e t l e génie génétique nécessitent l ' e m p l o i de p r o d u i t s e t de m a t é r i e l s couteux e t s o p h i s t i q u é s . L a s o l u t i o n adoptée j u s q u ' à p r é s e n t c o n s i s t e pour l e s chercheurs ORSTOM concern& à f a i r e des s t a g e s 'dans des l a b o r a t o i r e s de h a u t niveau Cependant , s i une t e l l e c o l l a b o r a t i o n est p r o f i - . , e l l e conduit souvent B une f u i t e des s u j e t s de recherche ORSTOM dans les l a b o r a t o i r e s des pays i n d u s t r i a l i s é s On p e u t donc s ' i n t e r r o g e r s u r l ' u t i l i s a t i o n du m a t 6 r i e l b i o l o g i q u e en provenance des pays en v o i e de développement e t s u r l a façon dont ces pays p r o f i t e r o n t d e s retombées de ces recherches ;; table s u r l e plan scientifique . J . Dans l e cadre de ces r é f l e x i o n s , nous proposons l a c r é a t i o n d ' u n l a b o r a t o i r e ORSTOM de ' b i o l o g i e m o l é c u l a i r e au s e i n du l a b o r a t o i r e s c i e n c e s de l a v i e de M o n t p e l l i e r Ce laboratoire p o u r r a i t & t r e o u v e r t A t o u t e S . l e s d i s c i p l i n e s ORSTOM . concernées p a r l a b i o l o g i e m o l 6 c u l a i r e ( v i r o l o g i e thologie , ... phytopa- ) e t d e v r a i t se f i x e r un double o b j e c t i f : - mener à b i e n une recherche ORSTOM'compétitive a u niveau international -servir de s t r u c t u r e d ' a c c u e i l pour l a formation e t l a s e n s i b i l i s a t i o n des chercheurs des pays en v o i e de développement .