Projet de fin d`études en vue de l`obtention de la Licence appliquée

« Enquêtes entomologiques dans un foyer de Leishmaniose cutanée zoonotique du centre tunisien » Par Emna Fourati Projet de fin d’études en vue de l’obtention de la Licence appliquée en Protection de l’environnement dans la spécialité «Environnement et sécuritaire» 2010‐2011 Projet de Recherche CRDI n° 104270‐015 Titre du projet CRDI : « Analyse des modalités d’adaptation aux effets sur la santé des Changements Climatiques : Cas de la leishmaniose cutanée zoonotique à leishmania major » Pays : Sidi Bouzid/Tunisie Institution de Recherche : Institut Supérieur des Sciences et Technologies de l’Environnement. Borj Cedria, Tunisie. Equipe de Recherche : M.K.Chahed1, J. Daaboub2, J. Ghrab3. 1. Observatoire National des Maladies Nouvelles et Emergentes et Faculté de Médecine de Tunis.
2. Direction de l’Hygiène du Milieu et de l’Environnement. Ministère de la Santé Publique. Tunisie
3. Institut Supérieur des Sciences et Technologies de l’Environnement. Borj Cedria.Tunisie
Ce rapport est présenté tel qu’il a été reçu du bénéficiaire de la subvention accordée pour le projet. Il n’a pas fait l’objet d’un examen par les pairs ni d’autres formes de révision. Le présent document est utilisé avec la permission de Emna Fourati, J. Ghrab, M.K.Chahed (Noms des titulaires du droit d’auteur) Copyright 2012(année), Emna Fourati, J. Ghrab, M.K.Chahed (nom du titulaire du droit d’auteur) Mots clés – leishmaniose cutanée zoonotique, phlébotomes, sebkha, vecteur REPUBLIQUE TUNISIENNE
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Université de Carthage
Institut Supérieur des Sciences et Technologies de l’Environnement de Borj-Cédria
Projet de Fin d’Etudes
En vue de l’obtention de la Licence Appliquée en Protection de
l’Environnement
dans la spécialité <<Environnement et sécurité sanitaire>>.
Présenté par
Emna FOURATI
Enquêtes Entomologiques dans un foyer de
Leishmaniose cutanée zoonotique du centre
tunisien
Soutenu devant le jury composé de :
Docteur : Ben Slimen Badreddine
Président
Docteur : Ghrab Jamila
d’accueil)
Encadreur (Etablissement
Docteur : Bel Haj Rhouma Rahima
Encadreur (ISSTE)
Année Universitaire: 2010 - 2011
Ce travail a été réalisé dans le cadre du projet
ONMNE / CRDI / ATCT; N°104270-015 :
« Analyse des modalités d’adaptation aux
changements climatiques : cas de la
leishmaniose cutanée zoonotique »
JE DÉDIE CE TRAVAIL :
A MA MÈRE, MON PÈRE
MES FRÈRES
&
ET A NOTRE CHER TAWFIK AYADI
Remerciements
Je tiens à remercier dans un premier temps, toute l’équipe pédagogique de
l’Institut Supérieur des Sciences et Technologie de l’Environnement et les
intervenants professionnels responsables de la formation Protection de
l’environnement, pour avoir assuré la partie théorique de celle –ci.
Je remercie Mme GHRAB Jamila : Maitre assistante à la Faculté des
sciences de Gafsa, et chercheur associée à l’Institut Pasteur de Tunis, pour
m’avoir encadrée et dirigée le long de ce travail. Qu’elle trouve ici
l’expression de ma considération et ma reconnaissance.
Je remercie également Mme Bel Haj RHOUMA-Ben Houria Rahima,
maitre assistante à l’Institut Supérieur des Sciences et Technologie de
l’Environnement de Borj Cédria; pour son aide précieuse et ses conseils.
Un remerciement particulier pour Mr Ben Slimen Badreddine, maître
assistant à l’Institut Supérieur des Sciences et Technologie de
l’Environnement de Borj Cedria, pour l’honneur qu’il me fait en acceptant
de présider le jury.
Je remercie tout particulièrement et témoigne toute ma reconnaissance à
Mesdames Emira Chouihi et Manel Zemzeri, pour l’expérience
enrichissante et pleine d’intérêt qu’elles m’ont fait vivre durant ces trois
mois au sein de l’Institut Pasteur de Tunis.
LISTE DES PRINCIPALES ABREVIATIONS
L : Leishmania
P : Phlebotomus
LV : Leishmaniose viscérale
LC : Leishmaniose cutanée
LCS : Leishmaniose cutanée sporadique
LCZ : Leishmaniose cutané zoonotique
LCC : leishmaniose cutanée chronique
AA : abris d’Animaux
IH : intra habitation
EH : extra habitation
PCR : Réaction en chaîne par polymérase
Chapitre I: Synthèse bibliographique
I-Les phlébotomes
I-1-Taxonomie
I-2-morphologique
I-3-Bio-écologique
I-4-Les phlébotomes en Tunisie
II-Rôle de vecteur des phlébotomes
III- les Leishmanioses
III-1- Définition
III-2 -parasite
II-3-Réservoir
III-4-Répartition géographique
III-4-1-Dans le Monde
III-4-2-En Tunisie
IV-Technique de mise en évidence e Leishmania et son importance
dans le diagnostic et identification du vecteur
IV-1- Examen direct
IV-2-Technique moléculaire
Chapitre II : Matériel et méthodes
I-Zone d’étude
I-1-Description de la zone
I-2- Sites de captures II-Matériel Biologique
1
4
4
4
7
8
9
9
9
11
11
11
12
16
16
17
20
20
20
21
21
21
22
22
22
23
23
23
24
27
27
27
28
28
29
31
32
32
34
34
II-1-Phlébotomes
II-2- La Gamme standard
II-3- Les Contrôle de la PCR
III-Technique
III-1-Technique de capture des phlébotomes
III-2-Dissection et Montage des phlébotomes
III-3- Identification des phlébotomes
III-4-Techniques moléculaire
III-4-1-Extraction
III-4-2-PCR en temp réel
Chapitre III : Résultats et Discussion
I-Inventaire taxonomique
I-1- description des genres et sous genre des phlebotominae
I-1-Identification des genres
I-1-2-Identification des sous-genres du genre Phlebotomus
I-2- Composition du peuplement phl »botomien dans le foyer de l’étude
II-Répartition de P.papatasi selon les biotopes
III-Activité nocturne de P. papatasi
IV-Etude de l’infection chez P. papatasi
IV-1- Sensibilité
IV-2-Précision er reproductibilité
IV-3-Rendement
IV-4- Résultats
Conclusion générale
Bibliographie
Annexe
Introduction générale
Les leishmanioses sont des parasitoses dues à des parasites du genre Leishmania et transmises
par les phlébotomes (Diptera : Psychodidae). Ce sont des maladies émergentes et étroitement liées à
l’état de l’environnement. Le complexe pathogène leishmanien (parasite, vecteur, réservoir), évolue
dans une aire géographique définie par un ensemble de paramètres bioclimatiques. Les modifications
environnementales se répercutent sur le fonctionnement des foyers, leur dynamique et leur extension
territoriale.
La leishmaniose cutanée zoonotique (LCZ) est due à L. major et transmise par Phlebotomus
papatasi à partir d’un rongeur réservoir (Psammomys obesus) inféodé aux zones humides salées
(sebkha). En Tunisie, la LCZ constitue un véritable problème de santé publique. Elle présente,
depuis les années 80, un changement de son profil épidémiologique. Cette situation serait
probablement en rapport avec une pullulation locale du vecteur et/ou du réservoir de cette affection,
suite aux modifications écologiques provoquées par l’aménagement de la biosphère, l’urbanisation et
surtout le vaste programme de mobilisation des ressources hydriques et la création des périmètres
irrigués.
Le développement d’une activité agricole autour d’un point d’eau est souvent accompagné
d’un élevage de bétail et de l’installation de nombreux abris d’animaux aux alentours
de la
population humaine dans ces zones rurales. Ces pratiques d’irrigation et d’élevage pourraient :
-
influencer la distribution et la multiplication de Phlebotomus papatasi, vecteur prouvé de
la LCZ en Tunisie, soit directement par la création des gîtes favorables à cette espèce, soit
indirectement par la création de microclimat favorable à son activité ;
-
renforcer le contact Homme-vecteur. Certains comportements d’agriculteurs, tel que
l’irrigation durant la nuit, l’installation des abris d’animaux contigus à leurs maisons,
l’utilisation du fumier organique,
la construction des maisons dans ces périmètres
irrigués, situées fréquemment sur la bordure des biotopes connus du réservoir de LCZ,
exposent ces agriculteurs aux piqûres des phlébotomes.
Dans le cadre de ce travail, on s’est intéressé à l’étude de l’exposition des agriculteurs au
risque de LCZ dans un foyer au centre tunisien (Hichria, Sidi Bouzid). Cette zone, a connu la
création des périmètres irrigués, situés entre l’agglomération humaine (Hichria village) et Garât
Ennjila, biotope potentiel de réservoir de LCZ.
Notre démarche scientifique a consisté à :
- Identifier les phlébotomes capturés dans le foyer de Hichria afin d’étudier la composition des
peuplements phlebotomiens dans ce foyer et confirmer la présence de P. papatasi, vecteur confirmé
de la LCZ ;
- étudier la répartition de P. papatasi dans différents biotopes (habitations, champs du périmètre
irrigué, terriers des rongeurs) ;
- étudier l’activité journalière de P. papatasi et la confronter à l’activité d’irrigation chez les
agriculteurs ;
- étudier l’infection de P. papatasi par Leishmania major, l’agent causal de la LCZ afin de confirmer
le risque d’exposition des agriculteurs au risque de cette affection lors de leur activité d’irrigation.
Ce document est structuré en quatre chapitres dont le premier « Généralités » présente une synthèse
bibliographique sur les phlébotomes et leur rôle vecteur dans la transmission des leishmanioses en
Tunisie.
Le deuxième chapitre est consacré à la description du matériel et des méthodes adoptées.
Le troisième chapitre traite de l’exposition des résultats de cette étude et leur discussion. Enfin, une
conclusion générale constituant une synthèse de ce travail, permettant de définir les perspectives de
cette étude.
Chapitre I
Synthèse bibliographique
I
- les phlébotomes
I-1-Taxonomie
Il s’agit de Diptères, Nématocères qui constituent à l’intérieur de la famille des
Psychodidae, la sous-famille des Phlebotominae. Les Phlebotominae se distinguent des Trichominae
et des autres Psychodidae par les nervures alaires et par le nombre des segments des palpes
maxillaires.
Les phlébotomes comptent environ 600 espèces réparties en 6 genres (Rodhain et Perez., 1985) :
-
Phlebotomus et Sergentomyia caractéristiques de l’ancien monde
-
Lutzomiya, Brumptomyia, Warileya et Hertigia du nouveau monde
I-2-morphologie
Les phlébotomes présentent un corps grêle et allongé de 1 à 3 mm de taille, de couleur
jaune terne qui vire au noir. Le corps ainsi que les ailes ont un aspect velu. La tête forme un angle de
45° avec le corps donnant à l’insecte une allure bossue.
- La tête est formée par une capsule chitineuse (épicrane), limitée de chaque côté par un grand œil
composé. Sur la région frontale s’insèrent deux antennes formées chacune de 16 segments: deux
segments basaux et 14 segments beaucoup plus longs et minces. L’ensemble des pièces buccales
forme une trompe courte. Seules les femelles portent des mandibules dentelées (Figure 1A).
- Le thorax porte une paire d’ailes et des balanciers qui assurent l’équilibration de l’insecte pendant
le vol. Les ailes sont lancéolées et comprennent sept nervures longitudinales et des nervures
transverses. Sur chacun des trois segments thoraciques fusionnés est insérée une paire de pattes
articulées, longues, fines et couvertes de soies (Figure 2B).
- L’abdomen est composé de dix segments. Les trois derniers sont modifiés pour constituer les
génitalia (Fig 1B) :
¾ Chez le mâle, l’armature génitale (ou génitalia) est externe. Elle est très
développée et se compose de trois paires de prolongements: une paire de coxites sur lesquels
s’articulent les styles ; une paire de pièces médianes, les paramères naissant à la base des coxites ;
une paire de prolongements ventraux appelés lobes latéraux et enfin, soudés à la partie interne de ces
derniers, deux lames membraneuses, les lamelles sous-médianes entre lesquelles s’ouvre l’anus.
Entre les paramères, se situent les valves péniennes soutenant deux filaments génitaux (Figure 1C).
¾ Chez la femelle, l’appareil génital est interne. Il se compose de trois organes
pairs: deux ovaires, deux glandes annexes et deux spermathèques (Fig. 1D). Les spermathéques sont
formées chacune d’une capsule chitineuse, de morphologie variable, suivie d’un conduit plus ou
moins long, qui vient déboucher dans l’atrium génital.
L’armature génitale du mâle, les spermathèques et l’armature buccale de la femelle varient
dans leur morphologie et sont utilisées dans l’identification des espèces des phlébotomes.
3 paires de pates
Pharynx postérieur
1 paire d’ailes
1 paire de balanciers
Œil composé
Palpe
Mentum
Labelles
Style
Soies
Coxite
Tubercule
Pénis
Valve pénienne
Lobes latéral
Pompe génitale
Corps
Conduit
Tète
Atrium génital
Figure 1 : Morphologie d’un phlébotome adulte : (A) Tête (vue ventrale) (B) Thorax et
abdomen (C) Génitalia mâle (D) Spermathèques (Boussa.S, 2008)
I-3- Bio-écologie
Les phlébotomes adultes ont une activité crépusculaire à nocturne (Rioux et Golvan., 1969).
Ils se nourrissent de sucs végétaux. Seules les femelles sont, en outre, hématophages. Elles piquent
divers hôtes mammifères, oiseaux, reptiles ou batraciens pour se procurer des éléments nutritifs
nécessaires pour leur ovogenèse. Le temps entre un repas sanguin et la maturation des œufs est
fonction de l’espèce, de la vitesse de digestion et de la température ambiante. Pour des colonies de
laboratoire, la période varie de 4 à 8 jours (Killick-Kendrick., 1990). L’oviposition est déclenchée
par la maturité ovarienne et par la disponibilité des gîtes propices au développement des stades préimaginaux (Tesh et Guzman., 1996).
Les phlébotomes présentent un cycle de vie holométabole qui comprend l’œuf, quatre stades
larvaires, une nymphe et l’imago (Figure 2). Les femelles gravides déposent leurs œufs (80 à 100
œufs) dans des biotopes qui garantissent les conditions optimales pour les stades pré-imaginaux.
L’éclosion donne naissance à une larve qui passe par 4 stades larvaires séparés par 3 mues, le
quatrième donne naissance à une nymphe. Ces larves sont terricoles, sédentaires et saprophytes. Elles
colonisent des gîtes très variés (fissures du sol, terriers de micromammifères, nids d’oiseaux, creux
d’arbres, termitières, fentes des murs, sols des étables et des chenils) constituant des micro-habitats
stables où règnent des conditions constantes. Il s’agit des lieux sombres, tempérés, protégés des
pluies et des rayons solaires. La larve du 4ème stade subit la nymphose et se transforme en nymphe
qui subira enfin la mue imaginale conduisant à l’adulte.
La durée de développement de ces stades immatures, dès l’éclosion à l’émergence de l’adulte,
est tributaire des facteurs externes particulièrement de la température, de l’humidité et la quantité de
nourriture. La baisse de température lors de la mauvaise saison, couplée à un accroissement de
l’humidité, provoquent la diapause au 4ème stade larvaire (Vattier-Bernard.,1970). L’accouplement se
fait peu de temps après l’émergence des adultes ou/et, chez certaines espèces telles que P. papatasi,
après le repas sanguin (Parrot., 1931). Les mâles de certaines espèces sont attirés vers les hôtes sur
lesquels les femelles s’engorgent où ils vont s’accoupler juste après le repas.
Figure 2. Cycle de vie d’un phlébotome (Boussa, 2008)
Dans les régions tropicales, les phlébotomes adultes sont actifs toute l’année, alors que dans les
régions tempérées, ils disparaissent l’hiver, la pérennité de l’espèce étant assurée par les larves de
stade IV qui entrent en diapause. Leur apparition, leur densité, leur période d’activité et leur
disparition varient suivant la latitude, l’altitude, la saison et l’espèce (Abonnec., 1972).
Etant nocturnes, les phlébotomes adultes séjournent durant la journée dans des endroits retirés
sombres et relativement humides (terriers, étables, clapiers, niches, maisons...); les horaires de sortie
et de rentrée varient suivant l’espèce et les conditions du milieu (étage bioclimatique, période de
l’année..).
I-4- Les Phlébotomes en Tunisie
En Tunisie, seize espèces de phlébotomes ont été répertoriées. Elles se répartissent en deux
genres : Phlebotomus et Sergentomyia et 6 sous-genres (Ghrab, 2009) :
Genre Sergentomyia : Il est représenté par 3 sous-genres et 5 espèces :
Le sous-genre Sergentomyia : représenté par 3 espèces
- S. antennata
- S. fallax
- S minuta parroti
Le sous-genre Sintonus : représenté par une seule espèce
- S. christophersi
Le sous-genre Grassomyia : représenté par une seule espèce
- S. dreyfusi
Genre Phlebotomus : représenté par 3 sous-genres et 11 espèces :
Le sous-genre Phlebotomus : représenté par une espèce unique en Tunisie
-
P. papatasi
Le sous-genre Paraphlebotomus : regroupe 4 espèces
- P. alexandri
- P. chabaudi
- P. sergenti
- P. riouxi
Le sous-genre Larroussius : représenté par 6 espèces
- P. perfiliewi
- P. langeroni
- P. ariasi
- P. longicuspis
- P. perniciosus
- P. chadlii
II- Rôle vecteur des phlébotomes
Etant hématophages, les femelles des phlébotomes interviennent dans la transmission de
plusieurs affections humaines dues à des bactéries et des virus :
-
La bartonellose due à une bactérie Bartonella bacilliformis et transmise par des
phlébotomes du genre Lutzomia du nouveau monde
-
La fièvre de 3 jours (ou fièvre à papataci) causée par des arbovirus
En outre, les phlébotomes sont connus principalement par leur rôle vecteur des leishmanioses
causées par des protozoaires du genre Leishmania. Les espèces des genres Phlebotomus et Lutzomyia
sont les uniques vecteurs démontrés de ces affections respectivement dans l’ancien et le nouveau
monde (Killick-Kendrick, 1990).
III-Les leishmanioses
III-1-Définition
Les leishmanioses sont des parasitoses communes à l’homme et aux animaux. Elles sont
dues à des protozoaires flagellés, du genre
Leishmania, et transmises par des insectes, les
phlébotomes femelles (Léger et al., 1996).
III-2-parasite
Les leishmanies sont des parasites endocellulaires du système cellulaire phagocytaire
mononucluée des vertébrés.
Classification :
Embranchement : Protozoa
Classe : Flagellé
Ordre : Zoomastigophorea
Famille : Trypanosomatidae
Genre : Leishmania
Le parasite est dimorphique (figure 3), amastigote intramacrophagique chez les hôtes vertébrés,
dont l’homme, et promastigote libre dans l’intestin du phlébotome :
- la forme amastigote : est ovoïde ou sphérique, de 2,5 à 5 µm de diamètre avec un noyau sphérique
et un kinétoplaste ébauche de très court flagelle. Cette forme est immobile, aflagellée, parasite du
système réticulo-histiocytaire de l’hôte mammifère ;
- la forme promastigote : est une forme extracellulaire vivant dans le tube digestif du phlébotome et
lui confère une grande mobilité, présente un corps plus ou moins fuselé de 5 à 20 µm de longueur et
de 1 à 4 µm de largeur prolongé par un flagelle qui peut atteindre jusqu’à 20 µm de longueur et qui
émerge de leur pôle antérieur.
a
b
Figure 3: Les deux principaux stades morphologiques de Leishmania :
(a) Promastigote ;(b) amastigote
Cycle de vie
Leishmania a un cycle de vie hétéroxène qui nécessite deux hôtes, l’insecte phlébotomes et un
mammifère qui peut être l’homme ou un autre animal (rongeur, chien,…)
A l’occasion d’un repas sanguin sur un mammifère infecté par la Leishmania, le phlébotome
femelle se contamine par les amastigotes se trouvant au lieu de piqûre.
Ces parasites sont absorbés avec le sang et arrivent dans l’intestin moyen de l’insecte. Ils se
transforment en promastigotes et commencent à se diviser activement. Au bout de 4 à 5 jours, ils
migrent vers la région thoracique de l’insecte. Certains s’attachent, par leurs flagelles, à la cuticule
des cellules de la muqueuse digestive et de la valve stomodéale. D’autres promastigotes deviennent
très allongés se dotent d’une grande mobilité et d’une capacité de multiplication réduite (Killick
kendrik et Molyneux, 1981).
Ces promastigotes pouvaient constituer un bouchon et faciliter ainsi le reflux de promastigotes lors
de pompage du sang (Antoine et al., 1999 ; Volf et al., 2004 ).
Lors d’un autre repas sanguin, les promastigotes régurgités sur l’hôte mammifère, infectent les
cellules macrophagiques et se transforment, après pénétration cellulaire, en amastigotes.
Ces amastigotes se multiplient par division binaire dans le phagolysosome du phagocyte qui est
finalement lysé. Les parasites ainsi libérés sont phagocytés par des cellules avoisinantes où le
processus se poursuit (figure 4).
Figure 4 : Cycle de vie du parasite Leishmania (www.dpd.cdc.gov/dpdx)
III-3-Réservoir
Les réservoirs de leishmanies sont variables selon l’espèce en cause et selon le foyer. On
distingue (Dedet, 2000) :
- Les réservoirs I : Constitués par des animaux sauvages comme les rongeurs, les canidés
sauvages...
- les réservoirs II : constitués par des animaux domestiques comme le chien.
- les réservoirs III : constitués par l’homme.
III-4-Répartition géographique des leishmanioses
III-4-1-Dans le monde
Largement répandues à la surface de la terre, les leishmanioses possèdent une aire de
répartition globalement circumterrestre. Les différentes formes, viscérale, cutanée ou cutanéomuqueuse, ont des territoires dont la délimitation dépend de facteurs intrinsèques liés aux espèces de
parasite, de phlébotomes vecteurs et de mammifères réservoirs, mais également de facteurs
extrinsèques, environnementaux. L'étude de la chorologie et de l'éthologie des différents hôtes
permet de mieux comprendre la répartition des différentes formes et leur écologie.
III-4-2- En Tunisie
En Tunisie, il existe deux formes cliniques principales : la leishmaniose cutanée et la
leishmaniose viscérale.
Ces deux affections sont anciennement connues en Tunisie depuis la description des premiers cas de
leishmanioses cutanée en 1884 à Gafsa, par Deperet et Boniet et la première observation mondiale de
leishmaniose méditerranéenne infantile fut rapportée en 1904, par Laveran et Cathoire dans la
banlieue de Tunis (Laveran et Cathoire, 1904).
- La leishmaniose viscérale (LV)
Il s’agit d’infection grave pouvant entraîner la mort en dehors de traitement spécifique (Dedet
,1999).
La LV sévit en Tunisie de manière sporadique, sous la forme infantile méditerranéenne classique.
Cependant la majorité des cas sont actuellement concentrés au centre du pays (Aoun et al.,2009).
L’agent causal, de LV est Leishmania infantum, Nicolle 1908 ( Aoun et al., 2008).
Le réservoir animal du LV est représenté par le chien, dont le rôle a été clairement établi grâce aux
travaux de Charles Nicolle à Tunis (Nicolle et Comte,1908., Aoun et al .,2003) (figure 5 ).
Le vecteur est un phlébotome du sous–genre Larroussius. L’espèce Phlebotomus perniciosus semble
être le vecteur principal en Tunisie sans négliger le rôle secondaire des autres espèces de ce sous
genre (Killick-Kendrick., 1990 ; Ghrab et al., 2006).
Sous genre Larroussius
Figure 5 : Cycle évolutif de la leishmaniose viscérale à Leishmania infantum
-
La leishmaniose cutanée (LC)
La forme cutanée de leishmaniose sévit en Tunisie sous trois formes noso-
géographiques distinctes : La leishmaniose cutanée zoonotique (LCZ), la leishmaniose cutanée
chronique (LCC) et enfin, la leishmaniose cutanée sporadique du nord (LCS).
•
La leishmaniose cutanée sporadique du nord (LCS)
Cette forme sévit de façon sporadique, dans le Nord du pays. Son aire ne dépasse pas la
Dorsale. L’incidence de la LCZ est de l’ordre de 30 à 50 cas par an (Bouratbine et al.,2003) (Figure
6).
La LCS se présente dans 90% des cas sous la forme de bouton unique de la face (figure 6). Les
lésions sont peu inflammatoires et souvent uniques se situent préférentiellement au visage (Aoun et
al., 2000).
La LCZ est causée par Leishmania infantum. Le caractère sporadique de cette forme implique
l’existence d’un réservoir animal, inconnu à l’heure actuelle mais qui serait très probablement le
chien (Aoun et al., 2003).
Le vecteur de cette forme, appartiendrait au sous-genre Larroussius (Ghrab et al., 2006). Par
analogie avec la situation dans d’autres pays voisins le Phlebotomus perfiliewi serait l’espèce
vectrice de cette forme de leishmaniose (Izri et Belazzoug., 1993).
Figure 6 : forme sporadique
•
La leishmaniose cutanée zoonotique(LCZ)
Cette forme est de loin la plus fréquente et la plus importante sur le plan de la santé publique.
Elle semble avoir toujours été endémique dans le sud tunisien. En 1982, une épidémie de LCZ a
éclaté à proximité du barrage de Sidi Sâad (Gouvernorat de Kairouan). La maladie s’est étendue
depuis, à 9 autres gouvernorats (du sud et du centre) et génère, depuis quelques années, environ 3000
à 4000 cas annuels (Aoun et Bouratbine., 2003).
La LCZ se caractérise par un caractère saisonnier net (automno-estival) à l’apparition des lésions.
Les lésions multiples prédominent au niveau des membres : leur cicatrisation est spontanée. Elles
sont polymorphes et se singularisent par leur grande taille, leur aspect humide et inflammatoire, ainsi
que par la survenue fréquente de surinfections (Bouratbine, 1988).
Le cycle évolutif de la LCZ est bien élucidé. L’agent causal est Leishmania major (Aoun et al.,
2008). Le vecteur de cette forme est identifié, il s’agit de Phlebotomus papatasi (Ben Ismail et al.,
1987 ; Ghrab et al.,2006).
Le réservoir principal de cette forme est un rongeur sauvage, Psammomys obesus, inféodé aux
sebkha et à la végétation halophile (chénopodées) qui constitue son alimentation exclusive (Ben
Ismail et Ben Rachid., 1989). Meriones shawi est également un réservoir de cette forme de
leishmaniose (Figure 7).
P. papatasi
Psammomys obesus
Figure 7: Cycle évolutif de la leishmaniose cutanée zoonotique à Leishmania major
•
La leishmaniose cutanée chronique (LCC)
Depuis sa description, il était connu que cette forme évolue au sein de microfoyers situés
dans le Sud-est, entre Toujène et Tataouine. Jusqu'à la signalisation d’autres cas de la LCC au centre
du pays (Kairouan, Gafsa, Sidi Bouzid) (Bouratbine et al., 2005).
Les lésions de la LCC le plus souvent sont uniques, siègent aussi bien à la face qu’aux membres.
La LCC se caractérise essentiellement par la chronicité des boutons dont la durée d’évolution peut
s’étendre sur plusieurs années. Les lésions sont polymorphes, dominées par les formes ulcérocroûteuse (Chaffaî et al. 1988). L’agent causal de cette forme a été isolé et identifié comme étant
Leishmania tropica MON.8 (Synonyme de L.killicki) (Aoun et al.,2008).
La LCC rencontrée en Tunisie se singularise par rapport aux formes à Leishmania tropica décrites
dans le monde, par la survenue de cas isolés et sporadiques, qui font douter de son caractère et
laissent soupçonner un réservoir zoonotique–anthroponotique (Ben Ismail et Ben Rachid., 1989)
(figure 8).
En ce qui concerne le vecteur, il appartiendrait au sous-genre Paraphlebotomus Phlebotomus
sergenti, fréquent dans les zones de la transmission, constitue le vecteur le plus probable de la LCC
(Ghrab et al., 2006 )
Sous-genre
Paraphlebotomus
Réservoir ?
Figure 8 : cycle évolutif de la leishmaniose cutanée de Leishmania tropica
IV- Techniques de mise en évidence de Leishmania et son
importance dans le diagnostic et l’identification du vecteur
Les leishmanioses se manifestent par des signes cliniques qui diffèrent d’une forme à une
autre et qui peuvent être communes à d’autres affections d’où l’importance et l’apport de l’enquête
entomologique et épidémiologique autour des cas de leishmaniose dans l’orientation du diagnostic et
dans la prophylaxie.
L’enquête entomologique dans un foyer de leishmaniose permet d’une part d’identifier le
vecteur du parasite et d’autre part d’apporter des connaissances sur les lieux et les périodes de
transmission afin de développer des éventuelles mesures de lutte et de prophylaxie.
La confirmation du diagnostic ou du rôle vecteur d’une espèce de phlébotome se fait
principalement par la mise en évidence de leishmanies par les méthodes directes ou moléculaires.
IV-1- Examen direct
Cette méthode repose sur la visualisation du parasite par des prélèvements intéressant les
organes où se trouvent les leishmanies (lésion, moelle osseuse, rate...) (Dedet, 2000).
Chez l’homme, ces prélèvements sont étalés sur une lame porte objet. Après fixation et
coloration au MGG (May-Grunwald-Giemsa), la lecture se fait au microscope optique à l’objectif
x100. Les leishmanies apparaissent sous forme amastigote.
Chez le phlébotome, la femelle est disséquée, sous loupe binoculaire, et le tube digestif
contenant les leishmanies est sorti, écrasé entre lame et lamelle, puis observé au microscope optique
à l’objectif x 40. Les leishmanies apparaissent sous forme promastigote.
IV- 2- Techniques moléculaires
Le développement récent des techniques de biologie moléculaire a apporté de nouvelles
alternatives dans ces domaines. Elles se basent sur la détection et l’analyse des acides nucléiques du
parasite dans les différents prélèvements (Marty et al., 2007). Ces techniques sont également
utilisées pour détecter le parasite chez son vecteur (Myskova et al., 2008).
La PCR est la technique la plus utilisée .Elle consiste en l’amplification des séquences de l’ADN
kinétoplastique (ADNk) et de l’ADN chromosomique spécifique du parasite (Lachaud et al, 2002).
Récemment, des variantes des méthodes de PCR dites quantitatives (ou PCR en temps réel ou
TaqMan) ont été développées afin de déterminer le nombre de copies d’une séquence cible dans
l’échantillon et de quantifier ainsi la parasitémie (Mary et al., 2004). Cette technologie est basée sur
la détection et la quantification d’un reporter fluorescent dont l’émission est directement
proportionnelle à la quantité d’amplicons générés pendant la réaction de PCR (Poitras et Houde
2002) (Figure 9).
La cinétique de la réaction PCR met en jeu trois phases : une phase d’initiation, une phase
exponentielle et une phase plateau. Elle est construite à partir de plusieurs points d’amplification. Un
point d’amplification est un point présentant pour coordonnées le nombre de cycles PCR versus
l’intensité de fluorescence émise.
La ligne de base reflète l’intensité du bruit de fond de fluorescence. La ligne seuil correspond au
seuil de détection optique au-delà duquel la variation en intensité de fluorescence suit une loi
exponentielle. Le point d’intersection de la courbe cinétique PCR avec la ligne seuil définit le cycle
seuil Ct qui est le point de départ de la phase exponentielle et qui se trouve directement lié à la
quantité de cible initialement présente dans l’échantillon (Figure 10).
Figure 9: Processus de déroulement d’une PCR quantitative.
Figure10 : Courbe d’amplification d’une PCR en temps réel
Chapitre II
Matériel et Méthodes
I-Zone d’étude
I-1 - Description de la zone
L’étude entomologique a été menée dans le foyer de Hichria situé dans la délégation de
Souk Jédid, gouvernorat de Sidi Bouzid au centre tunisien. Il s’agit d’un foyer actif de LCZ qui
génère une centaine de cas chaque année. Ce foyer est situé dans l’étage bioclimatique aride, à la
limite d’une Sebkha (Garâat Ennjila), biotope potentiel des rongeurs réservoirs de L. major. Il se
caractérise par un changement environnemental dû au développement agricole qui consiste à la
création de périmètres irrigués situés entre le village et Garâat Ennjila (figure11).L’activité
d’irrigation pourrait consolider le risque à LCZ auquel sont exposés les agriculteurs dans cette
zone.
Figure 11 : le foyer de Hichria
I-2- Sites de captures
Dans la zone de l’étude, plusieurs types de biotopes ont été prospectés à la recherche des
phlébotomes
a- Habitations : ce sont les maisons situées dans le village ou dans de petites agglomérations
humaines limitrophes. Trois types de sites ont été échantillonnés :
‐
Intra‐habitation (IH) : chambre à coucher. ‐
Extra‐habitation (EH) : cour de la maison, où les gens veillent généralement la nuit et y dorment parfois. -
Abri d’animaux (AA) : des abris construits généralement par des troncs d’arbres ou autres
matériaux rudimentaires, Situés toujours adjacents aux maisons.
b- Terriers des rongeurs : terriers de Psammomys obesus et de Meriones shawi réservoirs de
L. major, situés au niveau de Garâat Ennjila.
c- Plein champs : champs d’oliviers et d’arbres fruitiers situé dans le périmètre irrigué.
II- Matériel biologique
II-1- Les phlébotomes
Les phlébotomes utilisés dans cette étude provenaient des captures faites dans les
différents biotopes sélectionnés dans la zone de l’étude. Ces captures ont eu lieu durant une
campagne de 5 jours qui a été menée en Août 2010.
II- 2- La gamme standard
La gamme standard a été mise au point a partir d’un extrait d’ADN d’une souche de
référence provenant d’une culture en masse d’un isolat de L. infantum MON-1 LEM 75. Cette
gamme a été obtenue à partir des dilutions sériées de 10 en 10 de cet extrait allant de 5.103 à 5.10-4
parasites (Aoun et al., 2009) (Tableau 1).
Tableau 1. Résultats de la gamme standard ciblant l’ADNk des parasites issus de la culture
en masse.
Point de la gamme
Nombre de parasites
Cycle seuil
Pt 1
5000
23,31
Pt 2
500
26,77
Pt 3
50
29,65
Pt 4
5
32,16
Pt 5
0,5
35,35
Pt 6
0,05
39,54
Pt 7
0,005
41,71
Pt 8
0,0005
Indéterminé
II- 3- Les contrôles de la réaction PCR
Deux échantillons contrôles ont été utilisés :
-
contrôle négatif : eau
-
contrôle positif : extrait d’ADN d’un isolat de L. major provenant d’une lésion cutanée.
III- Techniques
III-1-techniques de capture des phlébotomes
Les phlébotomes ont été capturés par la technique des pièges lumineux de type « CDC
miniature Light Trap » (Alexander, 2000). Ce type de piège est muni d’une lampe émettant une
lumière de faible intensité qui attire les phlébotomes. Suite à cette attraction, ces derniers sont aspirés
dans une cage en tulle à mailles fines grâce à un ventilateur (Figure12-a). Les pièges ont été mis aux
sites de capture au coucher du soleil et récoltés le lendemain au lever du soleil (Figure 12-b).
Pour étudier l’activité journalière de P. papatasi, un piège CDC modifié, munie d’une
minuterie et de plusieurs cages a permis la ségrégation des collectes de chaque heure, depuis 19h
jusqu’à 6h du matin (Figure 12-b). Ce piège est déposé dans le périmètre irrigué en plein champ.
(a)
(b)
Figure 12 : Pièges lumineux de type CDC (a) simple (b) modifié, munie de minuterie
III-2- Dissection et Montage des phlébotomes
Les phlébotomes conservés dans l’alcool 70° ont été lavés dans 2 bains successifs d’eau
distillée stérile. Chaque spécimen a été disséqué, sous loupe, dans une goutte d’eau distillée. La tête
et les génitalia (4 derniers segments abdominaux chez la femelle) ont été montés entre lame et
lamelle en vue de l’identification morphologique de l’espèce. La partie restante (thorax et abdomen)
a été individuellement conservée à –20°C pour une éventuelle extraction d’ADN.
Le montage se fait dans une goutte de Berlèse (voir annexe). La tête est déposée sur sa face
ventrale, sa face dorsale étant en position supérieure (pour le genre Phlebotomus) afin de rendre plus
aisée l’observation des armatures pharyngiennes. Les génitalia mâles et la partie distale de
l’abdomen des femelles sont déposés sur leurs faces latérales pour mettre en évidence les différents
éléments nécessaires à la diagnose spécifique. La préparation est ensuite recouverte d’une lamelle.
Une légère pression permet de mettre les tissus à observer à plat, position la plus favorable à
l’observation microscopique.
III-3 - Identification des phlébotomes
Les montages ont été examinés en microscope optique (objectifs x10 et x 40) en vue d’une
identification de l’espèce. La diagnose s’est faite selon les clés d’identification connus (Croset et al.,
1978 ; Ghrab., 2009).
III-4 – Techniques moléculaires
III-4-1- Extraction
Après congélation suivi à -80°C de décongélation à Température ambiante, le phlébotome a
été écrasé dans 100µl de Grinding Mix complémenté de 10 µl SDS Mix. Après une incubation d’une
heure à 65°C suivie de refroidissement, 30µl KOAc 8M ont été ajoutés et les tubes ont été incubés
2h dans la glace. Après centrifugation 2 min à 1400 rpm, l’ADN a été précipité par 350µl d’éthanol
absolu une nuit à -20°C. Après centrifugation 10 min à 14000 rpm, le précipité obtenu a été lavé 3
fois avec 500 µl d’éthanol 75°. Enfin, l’élution de l’ADN a été entreprise dans 20 µl TE 1X et
l’ADN a été conservé à -20 °C.
III-4- 2- PCR en temps réel
La PCR en temps réel cible le génome kinétoplastique qui est présent en plusieurs copies (de
100 à 10 000). Elle a utilisé deux amorces et une sonde décrites auparavant par Lachaud et al, en
2002, qui sont spécifiques de l’ADNk (Lachaud et al., 2002) (Tableau 2).
Tableau 2 : Séquences de la sonde et des amorces utilisées pour la PCR en temps réel
Sonde
L.
Séquence cible Taille
24
infantum
ADNk
Séquences 5'-->3'
nucléotides TTTTCGCAGAACGCCCCTACCCGC
22
Amorces
Sens
nucléotides CTTTTCTGGTCCTCCGGGTAGG
24
Anti sens
nucléotides CCACCCGGCCCTATTTTACACCAA
La préparation du mélange (Mix) réactionnel a été faite selon le tableau suivant :
Tableau 3: Concentrations et volumes des composantes du Mix.
Composants par ordre d'addition
1- TaqMan Universal Master Mix 2X
2- Amorce Sens
3- Amorce Anti Sens
4- Sonde TaqMan
5- Eau stérile
Pour 8 réactions
110 µl
5 µl
5 µl
0,5 µl
99,5 µl
Concentration finale
1X
100nM
100nM
50nM
-
Après préparation de Mix, sa répartition se fait sur des plaques PCR (AB gêne, UK) à raison
de 24 µl par puits avant que 1 µl d’extrait d’ADN à tester ne soit ajouté.
L’amplification et la détection de l’ADN parasitaire se fait à l’aide d’un thermocycleur ABI
PRISM 7700 SEQUENCE DETECTOR relié directement à un Macintosh qui illustre tous les
résultats après 40 cycles d’amplification. Ces cycles se déroulent dans des conditions préinstallées
par le manipulateur sur l’appareil suivant la nature du pathogène. Ce programme repose surtout sur
les températures choisies pour chaque cycle, sur le nombre de cycles et sur le volume réactionnel
dans chaque puits de la plaque.
L’amplification le long de notre travail s’était déroulée selon le programme suivant :
Nombre de cycles
1 fois
50 cycles
Durée
et température
2 min à 50°C
10 min à 95°C
15 min à 95°C
1min à 60°C
Nature de l’activité
Incubation de l'Ampérase UNG
Activation de la Taq
Dénaturation
Hybridation et extension des amorces
L’Ampérase UNG (uracyle-N- glycosylase) est une enzyme qui détruit tout acide
nucléique contenant des UTP à 50°C. Ainsi, avant chaque PCR, cette enzyme détruit les
contaminants éventuels provenant de PCR antérieures.
La Taq n’est active qu’à une température correspondant à des conditions d’hybridation des amorces
de forte stringence, évitant ainsi toute amplification non spécifique.
Chapitre III
Résultats et Discussion
I- Inventaire taxinomique
Notre étude se base particulièrement sur l’espèce P. papatasi, seule espèce du sous-genre
Phlebotomus et seul vecteur confirmé de L. major en Tunisie. Son identification et sa discrimination
des autres taxons semblent être un préalable nécessaire pour mener cette enquête entomologique
dans un foyer à LCZ.
Le montage et l’identification de nos échantillons de phlébotomes capturés le long de cette
étude a permis d’identifier 2 genres, Phlebotomus et Sergentomyia et 2 sous-genres Phlebotomus et
Larroussius.
I-1- Description des genres et sous-genres des Phlebotominae
L’identification morphologique des espèces se base particulièrement sur les génitalia externes
chez le mâle et sur l’armature pharyngienne et la spermathèque chez la femelle.
I-1-1- Identification des genres
¾ Le genre Phlebotomus Rondani & Breté, 1840
Ce sont des gros phlébotomes. Les soies des tergites abdominaux II à VI sont uniformément
dressées.
Mâle : le style est dépourvu de soie non caduque et est muni de 4 ou 5 épines insérées à des niveaux
différents.
Femelle : le cibarium est inerme ou rudimentaire. La capsule de la spermathèque est segmentée.
¾ Le genre Sergentomyia Franca & Parrot, 1920
Les soies des tergites abdominaux sont uniformément ou en majorité couchées.
Mâle : le style porte 4 épines fortes sub-terminales, insérées au même niveau et une épine fine, soie
non caduque dont le niveau d’insertion varie selon l’espèce. Les valves péniennes sont courtes et de
forme variable.
Femelle : le cibarium est armé. Les spermathèques peuvent être lisses ou segmentées, tubulaires ou
capsulaires.
I-1-2- Identification des sous-genres du genre
Phlebotomus
¾ Le sous-genre Phlebotomus Rodani, 1843 : Phlebotomus papatasi (Scopoli,
1786)
P. papatasi est facilement reconnaissable en Tunisie. Il s’agit du seul représentant de ce sousgenre.
Mâle : Les génitalia sont très développés. Le style, long et grêle, porte 5 épines courtes et
spatulées dont 3 terminales et 2 sub-terminales. Le paramère est trilobé. Le lobe latéral est muni de 2
épines. Le coxite est muni d’un lobe basal peu développé.
Femelle : La spermathèque est segmentée et composée de 8-10 annulations. Le col de la
spermathèque s’invagine dans le dernier segment, de même taille que les précédents et porte une tête
sessile.
¾ Le sous genre Larroussius Nitzulescu, 1931
Mâle : le style est court et large. Il porte 5 longues épines dont 2 sub-terminales. Le paramère est
simple à apex arrondi. La forme des valves péniennes permet la distinction entre les différentes
espèces de ce sous-genre.
Femelle : la capsule de la spermathèque est segmentée. La tête est portée par un col long. La base
des conduits des spermathèques permet d’identifier les différentes espèces du sous-genre.
I-2- Composition du peuplement phlébotomien dans le foyer de l’étude
Au total, 710 phlébotomes ont été capturés dont 336 mâles et 374 femelles. Ils se répartissent sur 2
genres : Phlebotomus (86.76%) et Sergentomyia (13.24%).
Parmi le genre Phlebotomus, P. papatasi est l’espèce prédominante. Elle représente 73.54% de ce
genre (Tableau 4).
Tableau 4 : Phlébotomes capturés dans le foyer de LCZ de Hichria
Phlebotomus
(P. papatasi)
Larroussius
Genre
Sexe
Mâles
Femelles
Mâles
Femelles
Mâles
Femelles
Nombre
212
241
69
94
55
39
Total
453
Sergentomyia
163
616
94
94
Ces résultats montrent que P. papatasi est l’espèce la plus abondante dans cette zone étudiée. Ceci
est en concordance avec les travaux antérieurs (Helal et al., 1987). En effet, le préférendum
bioclimatique de cette espèce en Tunisie se situe dans l’aride, auquel appartient ce foyer. La
prédominance de cette espèce, vecteur confirmé de L. major, explique en partie la répartition de LCZ
en Tunisie (Ben Ismail et al., 1987 ; Ghrab et al., 2006).
II- Répartition de P. papatasi selon les biotopes
P. papatasi est présent dans tous les biotopes prospectés. Cependant, il est prédominant dans les
terriers de Psammomys (47%) et les abris d’animaux (23%).
Une proportion non négligeable de cette espèce est aussi récoltée dans les maisons, en intrahabitation et en extra-habitation.
Il est important de signaler que 5% de P. papatasi sont récoltés en plein champ, dans le périmètre
irrigué (figure 13). Dans ce biotope, 79,2% des spécimens capturés sont des femelles (Figure 14).
Les femelles sont également prédominantes dans les abris d’animaux (78,1%) et en extra-habitation
(62,9%).
Figure 13 : Distribution des Phlebotomus papatasi (mâle et femelle) en fonction de biotope
P. papatasi M
P. papatasi F
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
EH
IH
s
es
ps
my
am
rion
h
mo
e
c
m
a
in
T. m
Pl e
. Ps
AA
T
Figure 14 : Distribution de P. papatasi selon le sexe dans les différents biotopes.
La prédominance de P. papatasi dans les terriers de rongeurs et dans les abris d’animaux a été
rapportée dans des travaux antérieurs (Helal et al., 1987 ; Maroli et al., 1994 ; Svobodova et al.,
2003).
La prédominance des femelles en plein champ et en extra-habitation laisse supposer que ces biotopes
pourraient constituer le lieu de transmission de L. major.
Les abris d’animaux, qui sont toujours adjacents aux maisons dans ce foyer, constituent alors un
facteur de risque de LCZ. Ils constituent un biotope favorable à P. papatasi.
III- Activité nocturne de P. papatasi
Le suivi de l’activité de P. papatasi a montré que cette espèce est active entre 22-23h et 05-06 h
du matin avec un pic entre 00h et 01h pour l’espèce et entre 00h et 03h du matin pour les femelles.
Le calendrier horaire des programmes d’irrigation a été dressé pour le périmètre irrigué de Hichria en
mois d’Août, en se référant aux documents officiels de réservation des tours d’eau qui nous ont été
fournis par les gestionnaires de l’eau dans ce périmètre. La figure 15 indique une activité d’irrigation
continue de 00h à 19h. La superposition de l’activité d’irrigation des agriculteurs et celle de P.
papatasi montre une coïncidence entre ces cycles qui se situe entre 00h et 05h du matin (Figure 15).
Figure 15 : Suivi de l’activité d’irrigation et P .papatasi le long de la journée
Etant dans leurs champs la nuit, les agriculteurs et leurs compagnons sont donc exposés au risque de
piqûres des femelles de P. papatasi, vecteur de L. major, par le renforcement du contact homme/
vecteur. Ce risque est plus important entre 00h et 04h du matin, période correspondant à l’activité
des femelles de P. papatasi.
Le périmètre irrigué est situé au bord d’un biotope actif du réservoir principal de L. major, à une
distance inférieur à 1km, distance de vol actif de P. papatasi (Doha et al., 1991). Ceci augmente le
risque d’une éventuelle transmission de LCZ.
IV-Etude de l’infestation chez P. papatasi
Afin de confirmer le risque de transmission de L. major dans certains biotopes prospectés, 20
femelles ont fait l’objet d’une extraction d’ADN en vue de la recherche du parasite par la méthode de
PCR quantitative.
Tableau5 : Codes et provenance des échantillons
Code
SB 243
SB248
SB251
SB253
SB19
SB22
SB49
CODE DE PCR
A2
B2
C2
D2
E2
F2
G2
SB50
SB51
SB52
SB53
SB54
SB56
SB57
SB13
SB14
SB17
SB18
SB231
SB232
H2
A3
B3
C3
D3
C4
D4
E3
F3
G3
H3
A4
B4
biotope
Terriers
Psammomys
Plein champ
Intra-habitation
IV-1- Sensibilité
La sensibilité de la PCR quantitative a été évaluée sur des dilutions sériées de l’extrait d’ADN
obtenu à partir d’un culot de 5 106 promastigotes. Le seuil de détection de la PCR quantitative s’est
révélé de 0.005 parasite/tube PCR (tableau1) (Figure16).
A
B
Figure 16 : Représentation de l’amplification en temps réel de l’ADNk pour différentes dilutions de
la gamme standard.
A- Courbe standard : En rose sont représentées les différentes dilutions de la gamme standard
testées en double.
Le coefficient de corrélation est environ égal à 1.
B-Amplification en temps réel (à partir de 5.103 parasites/µl).
L’écart des Ct d’une dilution à l’autre est d’environ 3.1.
Le témoin négatif représenté en marron a un cycle seuil>50.
IV-2- Précision et reproductibilité
La comparaison des résultats de puits dupliqué du témoin positif (L. major), a montré que les
courbes correspondantes étaient superposées ce qui témoigne de la précision et de la reproductibilité
des mesures (Figure 17).
Figure 17: Représentation de l’amplification en temps réel de l’ADNk pour le témoin positif de L
.major testé en double
IV-3- Rendement
Le témoin négatif sans ADN n’a pas montré d’amplification lors de la manipulation ; ce qui
confirme l’absence de contamination (Figure 16 B).
La courbe standard des Ct en fonction du log de la quantité de parasites déposée dans chaque puits a
été linéaire.
Il est à noter que l’écart des Ct d’une dilution à l’autre (au 1/10
éme
) a varié de 2,17 à 4,19 avec une
moyenne de variation de 3.1. Cet écart représente la pente de la courbe Log de X0 en fonction du Ct
selon la formule y= ax+b ; il n’est obtenu théoriquement que si la PCR est efficace à 100%, ce qui
était le cas de notre PCR quantitative. Le coefficient de corrélation de notre réaction a été proche de
1 (figure16 A).
IV-4- Résultats
Les 20 échantillons testés ont été positifs en Leishmania. La quantité d’ADN/phlébotome a varié
de 190,2906 à 3492,520 103.
Selon le biotope cette quantité est variable :
¾ Dans les terriers de Psammomys la quantité d’ADN varie de 1,14118 103 à
190,2906 avec une moyenne de 7255.84 103.
¾ Dans le biotope plein champ la quantité d’ADN varie de 190,2906 à
3492,520 103 avec une moyenne de 1867,1265.
¾ En intra habitation la quantité d’ADN varie de 321,086 à 1515,998 avec une
moyenne de 1081,26.
Tableau 6 : Résultats de la PCR en temps réel
Code PCR
biotope
Ct
29,047
Quantité
Quantité/tube /phlébotome *
73,7052
1,474104 103
A2
1.02449 103
20,4898 103
16,7058
1,74626 105
3492,520 103
D2
18,7029
4,96632 104
993,264 103
E2
28 ,1344
130,943
26,1886 103
F2
29,4537
57,059
1,14118 103
G2
31,2461
18,4587
369,174
29,459
56,8882
1137,764
A3
29,4038
58,8786
1177,572
B3
29,0213
45,2699
905,398
B2
Terries Psammomys 24,867
C2
H3
Plein champ
C3
28,0453
138,495
2769,9
D3
31,4678
16,0543
321,086
C4
26,6329
337,006
6740.12
D4
29,0026
75,7999
1515,998
G3
31,5529
15,2162
304,324
H3
30,8698
23,3936
467,872
A4
27,5974
183,613
3672,26
B4
29,5289
54,4209
1088,418
E3
32,2987
9,51453
190,2906
F3
30,0901
38,2218
764,436
Intra habitation
•
Quantité/ phlébotome= quantité / tube *20 D’après cette étude le taux d’infestation chez P.papatasi est de 100%.
Dans la littérature, le taux n’a jamais dépassé les 50% avec les techniques PCR conventionnelles et
avec la technique de dissection alors qu’il n’a jamais été décrit auparavant par la PCR en temps réel
sur des phlébotomes sauvages. Cependant cette technique de PCR n’a été décrite qu’une seule fois
par Mysokova et collaborateur (2008) sur des phlébotomes expérimentalement infectés.
¾ Dans le biotope terriers Psammomys dont les codes respectifs B2 ,C2 et D2
présentent des P .papatasi fortement chargées en parasite ce qui est explique par le fait que le terrier
Psammomys est le réservoir principal de L. major.
¾ Pour le biotope plein champ on observe la quantité d’ADN /tubes très
importante ; ce qui explique que toutes les femelles de P.papatasi sont infectées par L. major
Ce résultat confirme le risque de transmission de LCZ aux agriculteurs lors de leur activité
d’irrigation.
¾ En intra habitation les femelles capturées sont infectées ce qui explique que la transmission peut également se faire en IH d’ailleurs, P. papatasi est connu pour son caractère
endophiles et la transmission en IH a été décrite dans la littérature (Ben Ismail et Ben Rachid., 1989).
Conclusion générale
Les phlébotomes sont des diptères qui posent un problème de santé humaine et animale. Leur rôle
vecteur a été démontré dans les leishmanioses qui sont des affections parasitaires dont la focalisation
dépend de la distribution de ces insectes (Killick- Kendrick et Ward, 1981). La leishmaniose cutanée
zoonotique due à Leishmania major est la forme la plus importante sur le plan de la santé publique
en Tunisie. En effet, elle est endémo-épidémique et génère depuis quelques années environ 3000 à
4000 cas annuels. Elle touche le centre et le sud du pays. Il s’agit d’une leishmaniose cutanée
épidémique, à caractère saisonnier. Elle a pour réservoir des rongeurs sauvages de l’espèce
Psammomys obesus et Meriones shawi et pour vecteur Phlebotomus papatasi.
Un changement du profil épidémiologique de la LCZ (augmentation du nombre de cas, l’extension
géographique, l’émergence de nouveaux foyers et l’éclosion d’épidémies) est rapporté. Cette
situation serait probablement en rapport avec une pullulation locale de phlébotomes ou de réservoir
suite aux modifications écologiques provoquées par l’aménagement de la biosphère, l’urbanisation et
surtout le vaste programme de mobilisation de ressources hydriques (construction de lacs et barrages
collinaires, puits artésiens, …) entrepris dans tout le pays depuis le siècle dernier. En outre, certaines
activités humaines et particulièrement les activités agricoles, pourraient augmenter le risque
d’exposition de l’homme à la transmission de cette affection.
Dans cette optique, nous avons mené une enquête entomologique dans un foyer de leishmaniose
cutanée zoonotique, le foyer de Hichria, situé au Centre du pays, dans le gouvernorat de Sidi Bouzid.
Nous avons procédé en deux étapes :
- Etape I : inventaire faunistique des espèces de phlébotomes dans la zone d’étude ; et la distribution
de P. papatasi dans différents biotopes ;
- Etape II : étude de l’infection de P. papatasi par L. major par la technique de PCR quantitative.
Le choix du foyer du Hichria comme zone d’étude est fondé essentiellement sur sa position du foyer
actif de leishmaniose cutanée zoonotique, sur sa position limitrophe de d’une Sebkha (Garâat
Ennjila), biotope potentiel du réservoir principal de L. major et sur le développement agricole que
connaît cette région avec la création des vastes périmètres, irrigués entre le village et la sebkha. Les
agriculteurs et leurs compagnons passent une bonne partie de la nuit menant leurs activités agricoles
et particulièrement l’irrigation.
L’inventaire des phlébotomes de ce foyer révèle la prédominance de P. papatasi, vecteur dont le rôle
épidémiologique est bien établi en Tunisie. Cette espèce représente 73,54% du genre Phlebotomus.
Etant ubiquiste, elle est récoltée dans tous les biotopes prospectés. Cependant, P. papatasi a présenté
une légère préférence pour les terriers de Psammomys et les abris d’animaux (respectivement 47% et
23%). Il importe de noter que les 5% de P. papatasi récoltés dans le périmètre irrigué, en plein
champ, sont représentés particulièrement de femelles (79,2%).
La présence de P. papatasi et la prédominance des femelles, vectrice de L. major, dans les champs
des périmètres irrigués indiquent que ces lieux pourraient constituer un lieu de risque à la LCZ.
L’analyse des fluctuations journalières de P. papatasi en plein champ, montre une activité de 23h à
5h du matin. Ces résultats permettent de cerner les périodes à risque augmenté de transmission de L.
major dans le foyer de Hichria.
La superposition des fluctuations journalières du vecteur aux fluctuations de l’activité d’irrigation
des agriculteurs dans le périmètre irrigué de Hichria, a montré une coïncidence d’activité entre 00h et
05h du matin. Ces résultats confirment le renforcement du contact Homme/vecteur en faveur d’un
risque
de
transmission
de
L. major.
Afin de confirmer ce risque, le taux d’infection chez P. papatasi, dans les lieux à risque a été évalué
par une technique moléculaire, utilisée pour la première fois, sur des phlébotomes sauvages. Il s’agit
de
PCR
en
temps
réel.
Les
20
femelles
de
P. papatasi testées ont été positives en leishmanies indiquant un taux d’infection de100%. Ce taux
élevé pourrait être attribué à la sensibilité de cette technique utilisée.
La quantité d’ADN est variable selon le biotope. La quantité moyenne varie de 1081.26 en IH à
755.8 103 dans les terriers de Psammomys, réservoir principal de L. major. Dans le périmètre, en
plein champ, les femelles de P. papatasi sont également fortement chargées en parasites. La quantité
moyenne d’ADN est de 1867.1265 Ces résultats confirment le risque de LCZ au quel sont exposés
les agriculteurs et leurs compagnons lors de leur activité d’irrigation dans ce biotope.
En conclusion, nous signalons un haut risque leishmanien à Hichria (Sidi Bouzid), associé
particulièrement aux changements environnementaux dus au développement agricole dans la région
et liée à l’activité d’irrigation dans ce foyer.
Les résultats obtenus au cours de cette étude nous permettent de proposer des perspectives de
travaux de recherche correspondant à la technique moléculaire, au rôle vecteur et aux mesures
préventives dans la région :
-
Amélioration de la PCR en temps réel dans l’étude de l’infection chez le P. papatasi en
utilisant une gamme standard mise au point à partir d’extrait d’ADN de L. major ;
-
la confirmation de la transmission dans ces différents biotopes par les techniques directes de
mise en évidence du parasite qui doivent compléter les techniques moléculaires car la
présence de l’ADN de Leishmania chez un phlébotome n’implique pas son aptitude à le
transmettre.
-
La connaissance précise des périodes et des lieux de risque de transmission de LCZ nous
permettra de travailler avec la population pour développer des mesures préventives adaptées à
la situation dans ce foyer.
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Les références électroniques
www.dpd.cdc.gov/dpdx
http://scd-theses.u-
strasbg.fr/1494/01/BOUSSAA_Samia_2008.pdf
ANNEXE
10XGrinding Buffer (tampons de Broyage 10X) :
Tris-HCL pH7.5
0.1M
NaCL
0.6M
EDTA
0.1M
Autoclaver et conserver à 4° C
2X SDS Buffer:
Tris-HCL pH9
0.8M
EDTA
0.27
Autoclaver et conserver à 4°C
-
Spermine/spermidine20X
0.1M de chaque produit
Grinding Mix
500µl Grinding Buffer 10X,
2.5ml Sucrose 10% ,
25 µl Spermine/Spermidine 20X,
5ml EBD
SDS mix
1.8 SDS Buffer 2X
2.5 ml Sucrose 10%
60 µl SDS 10%
17 µl DEPC
Resumé
Les phlébotomes sont les seules connus des leishmanioses en Tunisie et en particulier au centre
Tunisie (Hichria, Sidi Bouzid) 0 cette zone connu la création des périmetre irrigués situé entre
l’agglomération humaine (Hichria –village) et Garât Enjila, biotope potentielle de réservoir de
leishmaniose cutané zoonotique.
Nous avons identifié des phlébotomes capturé dans le foyer de Hichria afin d’étudier la comosition
spécifique des peuplements village Hichria on a montré la dominance de Phlebotomus papatasi dans
cette région.l’étude de l’activité journaliére de cette espéce montre qu’elle est active entre 22h et
06h du matin avec un pic entre 00h et 03h du matin pour les femelles. Cette activité ce coincide avec
celle des agriculteurs : ce qui augmente le risque de transmission de la maladie.
L’étude moléculaire de Phlebotomus papatasi, par Leishmania major agent causal de leishmaniose
cutané zoonotique, est effectuée par la technique de la PCR quantitative qui a confirmé l’exposition
des agriculteurs au risque de cette infestation lors de leur activité d’irrigation.
Abstract
Sand flies are the only known vectors of leishmaniasis in Tunisia and especially in the center
(Hichria, Sidi Bouzid). This area has seen the creation of irrigated areas between the human
agglomeration (Hichria-village) and Garât Ennjila, biotope potential of zoonotic cutaneaous
leishmaniasis reservoir.
We identify sand flies to capture in the focus of Hichria o study specific of sand flies in this
confirmed focus and confirm the presence of P. papatasi dominance in the region.
The study of daily activity of P. papatasi shows that it is active from 22h to 06h and higher activity
was noted between 00h and 03h for females. This activity coincides with the activity of farmers
which increases the risk of disease transmission.
The molecular study oh Phlebotomus papatasi, vector leishmania major and the causative agent of
zoonotic cutaneous leishmaniasis, is performed by the technique of quantitative PCR confirmed
farmers exposure to the risk of this transmission during their irrigation activity.
‫ﻣﻠﺨ ﺺ‬
‫ وﻗﺪ ﺷﻬﺪت هﺬﻩ اﻟﻤﻨﻄﻘﺔ إﻧﺸﺎء‬.( ‫ هﺸﺮﻳﺔ‬، ‫ذﺑﺎﺑﺔ اﻟﺮﻣﻞ هﻲ اﻟﻮﺣﻴﺪة اﻟﻤﻌﺮوﻓﺔ ﻟﺪاء ﻟﻠﺸﻤﻨﻴﺎت ﻓﻲ ﺗﻮﻧﺲ ﻋﺎﻣﺔ وﻓﻲ وﺳﻂ اﻟﺒﻼد ) ﺳﻴﺪي ﺑﻮزﻳﺪ‬
‫ اﻟﻤﻨﻄﻘﺔ رﻃﺒﺔ اﻟﺘﻲ ﺗﻌﺪ اﻟﻤﻮﻃﻦ اﻟﺮﺳﻤﻲ ﻟﺨﺰان‬، ‫ﻣﻨﺎﻃﻖ ﺳﻘﻮﻳﺔ ﺗﻤﺮآﺰت ﺧﺎﺻ ًﺔ ﺑﻴﻦ اﻟﺘﺠﻤﻌﺎت اﻟﺒﺸﺮﻳﺔ ) هﺸﺮﻳﺔ اﻟﻘﺮﻳﺔ ( وﻗﺮﻋﺔ اﻟﻨﺠﻴﻠﺔ‬
.(LCZ)‫اﻟﻄﻔﻴﻠﻲ اﻟﻤﺴﺒﺐ ﻟﺪاء اﻟﻠﺸﻤﺎﻧﻴﺎ اﻟﺠﻠﺪﻳﺔ‬
‫ ﺑﺒﺎﺗﺎﺳﻲ اﻟﻨﻮع اﻟﺴﺎﺋﺪ ﻓﻲ‬.‫ﺗﻢ اﻟﺘﻌﺮف ﻋﻠﻰ ﻣﺨﺘﻠﻒ أﻧﻮاع ذﺑﺎﺑﺔ اﻟﺮﻣﻞ اﻟﺘﻲ وﻗﻊ ﺻﻴﺪهﺎ ﻓﻲ اﻟﺒﺆرة اﻟﺘﻲ ﺗﻢ ﻓﻴﻬﺎ اﻟﺪراﺳﺔ واﻟﺘﺤﻘﻖ ﻣﻦ وﺟﻮد ب‬
‫ وﻳﺒﻠﻎ ﻧﺸﻄﺔ هﺬا اﻟﻨﺎﻗﻞ‬. ‫ ﺻﺒﺎﺣًﺎ‬6‫ و اﻟﺴﺎﻋﺔ‬22 ‫ ﺑﺒﺎﺗﺎﺳﻲ ﻋﻠﻰ ﻣﺪي اﻟﻴﻮم ﺣﻴﺚ ﺗﺒﻴﻦ اﻣﺘﺪادﻩ ﺑﻴﻦ اﻟﺴﺎﻋﺔ‬.‫ آﻤﺎ وﻗﻌﺖ دراﺳﺔ ﻧﺸﺎط ب‬. ‫اﻟﻤﻨﻄﻘﺔ‬
‫أوﺟﻬﻪ ﺑﻴﻦ ﻣﻨﺘﺼﻒ اﻟﻠﻴﻞ وﺛﺎﻟﺜﺔ ﺻﺒﺎﺣًﺎ ﺑﺎﻟﻨﺴﺒﺔ ﻟﻸﻧﺜﻰ وﺗﺘﻮاﻓﻖ هﺬﻩ اﻟﻔﺘﺮة ﻣﻊ اﻟﺮي ﺣﻴﺚ ﻳﺘﻮاﺟﺪ اﻟﻔﻼح ﻓﻲ اﻟﺤﻘﻞ ﻣﻤﺎ ﻳﺠﻌﻞ ﻣﻨﻬﺎ ﻓﺘﺮة إﺧﺘﻄﺎر‬
. ‫ﻋﺎﻟﻲ ﺑﺎﻟﻨﺴﺒﺔ ﻟﻠﺸﻤﺎﻧﻴﺎ‬
‫ ﺑﺒﺎﺗﺎﺳﻲ وﻧﺆآﺪ هﺬا أن اﻟﻔﻼح ﻣﻌﺮض ﺣﻘًﺎ ﻟﻠﺨﻄﺮ اﻻﺻﺎﺑﺔ‬.‫ ﻋﻴﻨﺔ ﻣﻦ اﻟﻨﺎﻗﻞ ب‬20 ‫ ﻋﻨﺪ‬major.L ‫هﺬا واﺛﺒﺘﺖ اﻟﺪراﺳﺔ اﻟﺠﺰﺋﻴﺔ ﻟﻮﺟﻮد ﻃﻔﻴﻠﻲ‬
‫ﺑﻴﺪاء ﻟﺸﻤﺎﻧﻴﺎ ﺧﺎﺻ ًﺔ وأن ﺑﻌﺾ هﺬﻩ اﻟﻌﻴﻨﺎت ﺗﻢ ﺻﻴﺪهﺎ ﻓﻲ اﻟﺤﻘﻮل اﻟﻤﺲ‬