Cellules Souches Leucémiques Immunophénotypage et Ciblage
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Cellules Souches Leucémiques Immunophénotypage et Ciblage thérapeuthique François Vergez INSERM, U1037, Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse Laboratoire d’Immunologie, CHU Rangueil, Toulouse 8 avril 2014 Leucémies aiguës myéloïdes • Maladies hétérogènes avec des grandes variations dans les réponses thérapeutiques, la survenue de rechute et la survie globale, selon les facteurs pronostiques tels que l’âge, la cytogénétiques et les anomalies moléculaires. Age Juliusson, Blood 2008 Cytogénétique Mrozek, Hematology, 2006 Mutations Schlenk et al, NEJM 2008 Bases moléculaires des LAM Type II mutations Type I mutations FLT3- ITD FLT3-TKD (Asp835) c-Kit (Exon 8) c-Kit (Asp 816) N-RAS K-Ras c-fms PTPN11 NF1 C-Cbl CBFb-MYH11 AML1-ETO Tel-AML1 PML-RARa NPM1c CEBPA NUP98-HoxA9 PU-1 AML1 AML1-AMP19 Blocage de maturation Autorenouvellement LAM Voies de signalisation PI3K/Akt mTORC1 NF-kB SFKs MAPK Prolifération cellulaire Avantage de survie Cellule Souche Leucémique: le dogme Clevers, Nat Med 2011 CD34+ CD38+ Phénotype « progéniteurs engagés» Souris NOD/SCID CD34+ CD38Phénotype « Cellules souches normales » Bonnet et al, Nat Med 1997 Le dogme des CSL en 1997 CD34+CD38- CD34+CD38• Prise de greffe en NOD/SCID • Reproduit la maladie initiale (prolifération, différenciation) • Est à l’origine de prise de greffe après transplantations sériées (autorenouvellement) • Fréquence variable: 0.2 à 100/106 cellules mononuclées Bonnet et al, Nat Med 1997 CD34+CD38- vs CD34+CD38+ Souris NSG NOD/SCID/IL-2Rγcnull Ishikawa, Nat Biotech, 2007 Les CD34+CD38- se localisent sur la zone endostéale Ishikawa, Nat Biotech, 2007 ….ou elles sont en G0 et protégées de la CTx CD34+CD38- CD34+CD38+ CD34-CD38+ Chimiosensibilité Ishikawa, Nat Biotech, 2007 CD34+38-123+ >15% est corrélé à une mauvaise réponse Age 0.08 NS WBC 0.89 NS Karyotype 0.02 * CD34+ 0.81 NS CD123+ 0.88 NS CD34+38-123+ 0.03 * FLT3-ITD 0.90 NS NPM1c 0.49 NS 100 complete response rate (%) p (Chi square test) 80 60 40 86% 65% < 15% >15% 20 0 CD34+CD38-CD123+ analyse multivariée: CD34+CD38-CD123+>15%: OR: 0.33 (CI, 0.11-0.97) Vergez, Haematologica 2011 CD34+38-123+>1% prédit une mauvaise survie sans maladie p (log rank test) 0.12 NS WBC 0.54 NS Karyotype 0.26 NS CD34+ 0.89 NS CD123+ 0.29 NS <0.0001 *** FLT3-ITD 0.03 * NPM1c 0.95 NS CD34+38-123+ disease free survival (%) Age CD34+CD38-CD123+ < 1% CD34+CD38-CD123+ 1 % 100 80 60 40 p < 0.0001 20 0 1 2 3 time (year) 4 5 analyse multivariée: CD34+CD38-CD123+>1%: RR: 0.27 (CI, 0.13-0.55) Vergez, Haematologica 2011 CD34+38-123+>1% prédit une mauvaise survie globale p (log rank test) 0.009 ** WBC 0.42 NS Karyotype 0.03 * CD34+ 0.91 NS CD123+ 0.16 NS <0.0001 *** FLT3-ITD 0.02 * NPM1c 0.79 NS CD34+38-123+ CD34+CD38-CD123+ 1% 100 overall survival (%) Age CD34+CD38-CD123+ < 1% 80 60 40 p < 0.0001 20 0 1 2 3 time (year) 4 5 analyse multivariée: CD34+CD38-CD123+>1%: RR: 0.24 (CI, 0.12-0.49) caryotype Vergez, Haematologica 2011 Définition • 2 propriétés fondamentales: – Autorenouvellement – Capacité à générer des progéniteurs plus matures hautement proliférant aboutissant à des cellules différenciées constituant le tissu cancéreux hétérogène • Rare au sein du tissu cancéreux • Non engagées • Quiescentes • Capacité proliférative illimitée • Microenvironnement (« niche » tumorale) • Chimiorésistantes Reya et al, Nature 2000 Clarke et al, Cancer Res 2006 Cellule Souche Leucémique: quelle origine? Bonnet et al, Nat Med 1997 MOZ-TIF2 Modèle murin C57BL/6-Ly5.2 5-FU Oncogènes BCR-ABL MOZ-TIF2* * LAM avec inv(8)(p11q13) CSL: lineage, cKithigh, Sca-1-, CD34+, FcRII+ = GMP Huntly et al, Cancer Cell 2004 MOZ-TIF2 Huntly et al, Cancer Cell 2004 MLL-ENL Modèle murin C57BL/6-Ly5.2 pMSCV/IRES-GFP LAM avec t(11;19)(q23;p13.3) Cozzio et al, Genes & Dev, 2003 Remise en cause du phénotype et de l’origine des CSL • Modèles murins – – – MOZ/TIF2 , inv(8)(p11q13), Huntly et al, Cancer Cell 2004 MLL/ENL, t(11;19)(q23;p13.3), Cozzio et al, Genes & Dev, 2003 MLL-AF9, t(9;11) (p22; q23), Krivtsov et al, Nature 2006 – Les CSL peuvent dériver des progéniteurs engagés (CMP, GMP) après acquisition de propriétés d’autorenouvellement NOD/SCID/IL-2Rcnull vs NOD/SCID *No mature T or B cells *Dysfunction of macrophages and dendritic cells *No NK activity *Complement deficiency (C5) *No incidence of lymphoma Long lived Absence of NK activity Shultz et al., J.I. 2005 Xénogreffes de LAM dans les NOD/SCID/IL-2Rcnull CD34+CD38+ Lin- Specimen_AML325.fcsÉQ2: <APC-A>+, <PE-Cy5-5-A>+ Specimen_AML325.fcsÉDAPI- subset 10 3 10 2 80.3 5 104 10 3 10 2 0 0 1.75 0.1 Lin-CD34-CD38- 10 CD123 4 9.45 <PE-Cy5-A> 10 <APC-A> 10 5 0 8.48 2 101 3 10 100 10 10 <PE-Cy5-5-A> 4 10001 10 0 Stem cell-like Lin-CD34+CD38- 5 0 10 2 CMP-like CD45RA- 3 10 10 CD45RA <PE-Cy7-A> 4 10 5 GMP-like CD45RA+ Sarry, JCI 2011 Chaque sous fraction récapitule la diversité du phénotype leucémique Après transplantation SSC SSC Avant transplantation 4.76 95.4 1.4 Lineage 0.19 10 2 <APC-A> 3 82.2 0.96 CD38 10 5 104 <APC-A> CD38 104 10 0 10 3 10 2 0 0 10 2 10 10 CD34 <PE-Cy5-5-A> 3 4 10 5 5 10 4 10 3 10 2 85.8 1.06 16.7 0 0.17 10 2 CD34 3 10 10 <PE-Cy5-5-A> 4 10 5 10 5 10 4 90.1 4.96 10 3 10 2 0 0 0 15 10 <APC-A>: CD38 84.8 Lindim Linneg Specimen_001_SA20 sort325 (4) - BM 2328.fcsÉLin- subset Specimen_001_SA20 sort325 (4) - BM 2328.fcsÉLinlo subset CD38 5 Specimen_AML325.fcsÉLinlo subset <APC-A>: CD38 CD38 10 Lineage Lindim Linneg Specimen_AML325.fcsÉLin- subset 94.8 13 0.14 0 10 2 10 10 CD34 <PE-Cy5-5-A>: CD34 3 4 10 5 4.61 0 0.3 10 2 CD34 3 4 10 10 <PE-Cy5-5-A>: CD34 10 5 Sarry, JCI 2011 Les CSL de LAM dans les NSG adultes • Rares: 1 sur 150.000 à 4 millions • Phénotypiquement hétérogène …..mais toujours enrichies dans les CD34+CD38- • Récapitulent la diversité phénotypique de l’échantillon primaire • Hiérarchie phénotypique ≠ CSH normales • Cellule d’origine? Sarry, JCI 2011 Plusieurs origines pour les CSL Goardon, Cancer Cell 2011 Plusieurs origines pour les CSL Goardon, Cancer Cell 2011 Remise en cause du phénotype et de l’origine des CSL • • Modèles murins – – – MOZ/TIF2 , inv(8)(p11q13), Huntly et al, Cancer Cell 2004 MLL/ENL, t(11;19)(q23;p13.3), Cozzio et al, Genes & Dev, 2003 MLL-AF9, t(9;11) (p22; q23), Krivtsov et al, Nature 2006 – Les CSL peuvent dériver des progéniteurs engagés (CMP, GMP) après acquisition de propriétés d’autorenouvellement Xénogreffes NOD/SCID et NSG – – – Anti-CD38, NPM1c, Taussig et al, Blood 2008; Blood 2010 Goardon et al, Cancer Cell 2011 Souris NSG, Sarry et al, JCI 2011 – Les CSL ne sont pas contenues uniquement dans la sous fraction CD34+ CD38- Les CSL en 2014 Fréquence des CSL CD34+CD38- CD34+/- CD38+ CD34+CD38- CD34+CD38+ MLL-ENL t(11;19)(q23;p13.3) MOZ-TIF2 inv(8)(p11q13) MLL-AF9 t(9;11) (p22; q23) CD34-CD38+ Adapté de Jeffrey M. Rosen, et al, Science, 2009 Cellule Souche Leucémique: d’autres marqueurs? Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL Kikushige, Cell Stem Cell 2010 Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL Jordan, Leukemia 2000 Récepteur de l’IL3 CD123 LAM 18/18 – NBM 0/5 Greffe NOD/SCID CD34+CD123+: 3/3 CD34+CD123-: 0/3 Taussig, Blood 2005 Expression du CD123 sur les CSH CSL Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL CD123 CLL-1 Van Rhenen, Blood 2007 C-type Lectin-Like Molecule-1 LAM 77/89 (87%) Greffe NOD/SCID CD34+CLL-1+: 3/3 CSL Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL CD123 CLL-1 CSL CD96 Hosen, PNAS 2007 Ly T/NK activés LAM 19/29 (66%) – NBM 5% Greffe NOD/SCID CD96+: 4/5 CD96-: 1/5 Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL CD123 CSL Saito, Sci Transl Med 2010 CD32: FCGR2 LAM 21/61 (34%) Greffe NOD/SCID: Het CD32 CD25: IL2RA LAM 15/61 (25%) Greffe NOD/SCID CD34+CD38-CD25+: 4/4 CLL-1 CD25 CD96 Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL CD123 Jan, PNAS 2011 T Cell Immunoglobulin mucin-3 LyT LAM 20/22 (91%) NBM 0/8 Greffe NOD/SCID: CD34+TIM3+: 25/26 CD34+TIM3-: 4/14 CLL-1 TIM-3 CSL CD32 CD25 CD96 Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL Stroopinsky, Cancer Res 2013 MUC-1 LAM CD34+ 20/20 LAM CD34- 6/6 CD227 CD44 Greffe NSG CD34+227+ 4/4 CD34+227- 2/5 CD34-227+ 1/1 CD34-227+ 0/1 Jin, Nat Med 2006 Adhésion cellulaire et transduction des signaux LAM 8/8 Greffe NOD/SCID Inhibée par Ac anti-CD44 CSL Zhi, Cancer Letters 2010 CD325: N-Cadherin CD202b: Tie2 CD325 Augmentation du taux de CD34+CD38-CD123+CD325+ CD34+CD38-CD123+CD202b+ post chimiothérapie CD202b CD184 Fiegl, Blood 2009 CD184: CXCR4 Expression augmente en hypoxie Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL CD91 Majeti, Cell 2009 Ligand SIRPa « ne me mange pas » LAM 6/8 Signal prophagocytaire CD47 LAM 13/13 Greffe NOD/SCID CD34+CD38-CD47+: 3/3 Chao, Sci Transl Med 2010 calréticuline CSL Cellule Souche Leucémique: ciblage thérapeutique Des pistes pour cibler les CSL • Immunothérapie anti-CSL • Quiescence • Inhiber les acteurs de l’hypoxie (HIF1a) Les LSC résident dans la fraction TIM3+ Kikushige, Cell Stem Cell 2010 Kikushige, Cell Stem Cell 2010 Anticorps anti-TIM3: ATIK2 TIM3 (T cell immunoglobulin mucin-3) Anticorps murin IgG2 anti-TIM3 • • • • Induit CDC et ADCC N’affecte pas l’hématopoïèse normale Dépletion des monocytes TIM3+ • Bloque la prise de greffe des LAM en NOD/SCID (NK+) Réduit la masse tumorale et cible les CSL en NRG (NK-) Expression dans l’HP normale – – • (+) Monocytes, sous fraction NK (-) CD34+CD38-, progéniteurs (sauf CFU-M), B, T, neutrophiles Expression dans l’HP leucémique – – – – M0-M7 sauf M3 (+++) CD34+CD38(++) CD34+ CD38+ (+) CD34- • Kikushige, Cell Stem Cell 2010 L’anticorps anti-CD47 induit la phagocytose des cellules leucémiques mais pas des CD34+ normales Majeti, Cell 2009 Activité anti-CSL de l’anticorps anti-CD47 2nd receveur IgG contrôle Anti-CD47 Majeti, Cell 2009 CSL vs CSH: le signal « mange moi » Majeti, Oncogene 2010 Modèle d’immunothérapie anti-CSL Majeti, Oncogene 2010 Parthenolide Ida/Proteasome -i NF-kB/Stress oxydatif Anticorps monoclonaux PI3K-i TORC-i Metformine CD47 TIM3 CD123 CD44 CLL-1 PI3-K/Akt HIF1α SDF1/CXCR4 Echynomycine Plerixafor
