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Université de Reims Champagne Ardenne EA3801 CHU de Reims Différenciation endothéliale et processus angiogéniques Pr Philippe NGUYEN EA3801 et Laboratoire d’Hématologie Cellule endothéliale 1 à 6 10 13 cellules Poids total : 1 kg Surface : 1 à 7 m2 Cellules aplaties (L:100 µm-l:10 µm Épaisseur :0,3 µm) disposées en mosaïque - Corps de Weibel Palade (ME) Facteur Willebrand PECAM1 (CD31) / VE-Cadhérine (CD144) Synthèse de NO (eNOS) JAMS/Esélectine/VEGFR2 Angiogénèse ANGIOGENESE POST-EMBRYONNAIRE, NON TUMORALE : • angiogénèse : prolifération capillaire, favorisant le flux sanguin • vasculogénèse : à partir de progéniteurs endothéliaux • artériogénèse : développement des réseaux collatéraux (résistance) Différenciation Hypoxie Migration / Prolifération HIF-1a Facteurs de croissance/Cytokines VEGF, FGF, IGF… • Cellule progénitrice endothélial : – endothelial progenitor cell (PEC) – Différenciation et acquisition d’un phénotype endothélial à partir d’une cellule souche hématopoïétique CD34+ [Asahara, 1997] – Circulating bone marrow-derived endothelium progenitor cells (CEPCs) [Rafii, 1998] : • CD34+ • Marqueurs phénotypiques : facteur von Willebrand, Dil-Ac-LDL. Isolement des cellules CD34+ Sang de cordon 1. Isolement des PBMC 2. Élimination des cellules adhérentes 3.Tri immuno-magnétique des cellules CD34 positives 4.Mise en culture dans des « conditions endothéliales » (VEGF …) Modèle de différentiation des cellules CD34+ en progéniteurs endothéliaux (PEC) J0 Cellule souche CD34+ J25-30 Facteurs de croissance (VEGF…) Progéniteurs endothéliaux Analyse de l’expression membranaire et moléculaire à différent temps de la différenciation: VEGF, VEGFR1,VEGFR2,CD144(VE-cadhérine), et FT Caractérisation des PEC • Culture cellulaire – À partir de sang de cordon, de sang périphérique – Support : • gélatine, fibronectine, collagène de type I – Facteurs de croissance : • VEGF, IGF-1, EGF, FGF-B précoces – Temps d’obtention – Aspect des colonies : • Cellules adhérentes « spindle shaped » • Tapis de cellules fusiformes tardives Phénotype des PEC • CD133 (AC133) : – Exprimé par la CSH – Absent de la cellule endothéliale mature et du monocyte – Différenciation endothéliale in vitro • CD34 : – marqueur de cellule souche hématopoïétique – Présent (faible expression) sur la cellule endothéliale mature • VEGF-R2 (KDR) : – Marqueur endothélial Phénotypage des PEC par cytométrie en flux CD34 HUVEC CD34 EPC HUVEC Count Count EPC CD34 VEGFR2 CD34 : PBMC de sang de cordon PEC : en milieu de culture adapté HUVEC : Cellules endothéliales matures EA3801 Origine (multiple) des précurseurs endothéliaux Hémangioblaste HSC Progéniteurs Myéloïdes Progéniteurs Endothéliaux Monocyte Progéniteurs endothéliaux circulants Monocyte CD14+ CD34+ PEC PEC CD14+,CD34low, KDR+ CD34+, CD133+, KDR+ Sous-type myéloïde « True angioblast » Leri, Circ Res 2005 Origine et différenciation des progéniteurs endothéliaux, d’après Dimmeler, 2004. Caractérisation des PEC • • • • • Mesure de la prolifération Expansion Migration cellulaire Formation de tubes : (Matrigel) Activité paracrine : X 40 – synthèse de facteurs de croissance : VEGF, HGF, G-CSF, GM-CSF • Modèles animaux : – Implant de Matrigel – Modèle d’ischémie de la patte (ligature de l’artère fémorale) Rehman, 2003 ; Hur, 2004 Sources possibles de cellules endothéliales – Cellules souches : CSH, cellules souches « cardiaques », cellules souches mésenchymateuses, – Cellules myéloïdes : • CD14+/VEGF-R2+ CD34-/CD133- : • Acquisition de marqueurs endothéliaux phénotypiques • Formation de tubes in vitro – Cellules endothéliales matures : • shedding vasculaire Mobilisation des « PEC » Moelle osseuse Cellules stromales médullaires cKit+ MMP-9 mKitL Hémangioblaste sKitL Barrière endothéliale Sang PEC circulants Précurseur hématopoïétique circulants D’après Hristov, 2003 Mobilisation des PEC • Micro-environnement, « niches » : – Fibroblastes, ostéoblastes, cellules endothéliales • Protéinases : – Élastase, cathepsine G, métalloprotéinases matricielles (MMP) – Clivage de mkitL (kit ligand membranaire) par MMP-9 • Facteurs de croissance – G-CSF, GM-CSF, EPO – SDF-1, VEGF, angiopoïétine Processus de réparation endothéliale par les PEC Cellule endothéliale Circulante (CEC) PEC CD146 + CD31 + vWF+ intégration CE CML Transdifférenciation Matrice extracellulaire D’après Hristov, 2003 Comparaison CEC versus PEC PEC CEC • Cellule mature, provenant de la paroi vasculaire • Témoin d’une lésion vasculaire • Expression de marqueurs endothéliaux : CD146, vWF, CD31… • Pas d’expression des marqueurs CD45/CD133 • Pas de potentiel clonogénique 20 cellules/mL • Progéniteur • Témoin d’une lésion vasculaire ? D’une régénération ? • Faible expression de CD146, CD31 • Faible expression de CD45, expression de CD133 • Potentiel clonogénique Dimmeler, 2004 Différents phénotypes endothéliaux • Cellule « tip » – – – – Leader Filopodes étendus Signaux de direction Migration à travers la matrice extracellulaire • Cellule « stalk » – Prolifération – Vacuoles créant la lumière vasculaire – Produit la matrice • Cellule « phalanx » – – – – Devient quiescent Monocouche Jonctions serrées Contact avec le péricyte Induction et déstabilisation de la paroi capillaire • Induction par hypoxie – HIF : complexe hétérodimérique sensible à l’hypoxie – En hypoxie : dimérisation et activation des gènes cibles (HRE : promoteurs) • Déstabilisation de la paroi capillaire : sortie de la quiescence endothéliale – NO libéré lors de l’hypoxie : favorise la perméabilité induite par le VEGF – VEGF : VEGF-R2 : activité tyrosine kinase (MAPK/PI3K) – Angiopoiétines Facteurs de croissance angiogéniques • VEGF – Effet via les récepteurs VEGF-R1 (flt-1) et VEGF-R2 (flk/KDR) : activité tyrosine kinase – Favorise la migration et la prolifération endothéliale – Augmente la perméabilité vasculaire • Angiopoïétine-1 – – – – – Effet via le récepteur Tie2 (tyrosine kinase) Effet sur l’engagement des précurseurs endothéliaux Effet sur la migration endothéliale Pas d’effet sur la prolifération endothéliale Recrutement des péricytes • Angiopoïétine-2 – Expansion cellulaire • b-FGF – Anti-apoptotique, activation d’Akt Inhibiteurs de l’angiogénèse • Angiostatine – 38 kDa, 3 kringles – Générée par protéolyse du plasminogène par métallo-élastases et MMP – Induit l’apoptose des cellules endothéliales – Inhibe la prolifération endothéliale • Endostatine – 20kDa, fragment du collagène XVIII (cathépsine L, élastase) – Inhibition de la migration endothéliale (dépendant de eNOS) – Pro-apoptotique (réduction de Bcl-2, Bcl-XL) • Thrombospondine-1 – Glycoprotéine haut poids moléculaire – Ligand de CD36 – Pro-apoptotique (p38-MAPK : activation des caspases) Progéniteurs de la cellule endothéliale Source Procédé d’isolement Marqueurs cellulaires Moelle osseuse Microbilles CD133+ CD146-, CD133+, CD31-, vWF-,VEcadhérine - Sang de cordon Microbilles CD34+ CD133+ Sang périphérique Microbilles CD34+ CD133+ ou CD133- Adhésion PBMC CD146 : marqueur de la cellule endothéliale circulante Identification des PEC dans un produit de thérapie cellulaire EA 3801 Identification des PEC dans un produit de thérapie cellulaire EA 3801
