Les endotoxines bactériennes : pourquoi le SIMS

« Endotoxines, Structures et Activités »
Institut de Génétique et Microbiologie – Université de Paris Sud XI Orsay France
La spectrométrie de masse, un outil de choix pour l‘analyse structurale
des endotoxines bactériennes
Martine Caroff
Workshop Equipex Andromède
Institut de Génétique et Microbiologie
le 19 Juin 2013
Structure des LPS, virulence bactérienne et
génétique de la biosynthèse des lipides A
Lipopolysaccharide
n
O-specific
chain
Outer
core
Polysaccharide
Inner
core
Lipid A
LPS
Phospholipid
Lipoprotein
Protein
Periplasm
Peptidoglycan
Rôle protecteur pour la bactérie: barrière de perméabilité,
Activités bénéfiques et délétères pour l’homme
Trimère XXX
Trimère XYZ
AA=1
AA=6
S=176
S=1056
L’aventure de la PDMS
IPN, Orsay
25 ans de collaboration
Premiers spectres LPS, 1990
1991
Lipides A des Bordetelles
HO
O
O
HO P O
OH
O
O
O
OH
O
O
O
Tetra- &
penta-acylated
NH
OH
HO
HO P O
OH O
O
HO
NH
O
O
O
O
O
O P OH
O OH
O
O
NH
HO
HO
O
OH
O
NH
O
O
OH
O
O P OH
O OH
O
O
B. pertussis
C10OH
C10OH
C14OH
C14OH
B. parapertussis
C14OH
C14OH
C14
C14OH
C14
C16
HO
O
O
O
NH
HO
HO
HO P O
OH
O
O
O
O
O
O
Penta- &
hexa-acylated
O
NH
O
HO
O
HO P O
OH O
O
O
O P OH
O OH
O
O
NH
HO
HO
O
O
O
O
O
C14OH
C16
C14
B. bronchiseptica
C14OH
C12OH
O
O P OH
O OH
O
O
OH
C14OH
NH
O
HO
O
O
HO
C14OH
B. hinzii
B. avium
C14OH
B. trematum
C14-2OH C14OH
C12-2OH
C16
Variabilité des Lipid A et endotoxicité des LPS dans 3 souches de
Bordetella pertussis, recherche d’un vaccin entier non-toxique
BP338
BP338
1559
100
GlcN
GlcN
1720
GlcN
1333
BP18-323
HEK-293
transfected
1494
1881
0
BP18-323
1503
1531
BP338
NF-κB
100
GlcN1333
Structure « Classique »
18-323
BP338 GlcN
0
1559
100
1333
0
1300
1500
1700
Mass ( m/z )
1900
B. bronchiseptica souches virulentes et non virulentes
OH
O
HO
NH 2
HO
HO
O
O
O
NH
HO
HO
O P O
OH
O
O
O
O
O
HO
NH
O
O
O
O
O P O
O OH
O
OH
O H
H 2N
O
O
OH
C14OH
1 2 3
4 5 6
7 8 9 10
Basheer et al. 2011
C14OH
C12OH
C14
C16
H+ H- H+ H- H+ H- H+ H1. E. coli
2. B. pertussis
3. B. bronchiseptica 9,73 H+
4.
”
9,73 H5.
”
DANG H+
6.
”
DANG H7.
”
DEL H+
8.
”
DEL H9.
”
ALI H+
10.
”
ALI H-
C14OH
B. bronchiseptica 9,73 H+
OH
HO
HO
O
NH 2
HO
O
O P O
OH
O
O
NH
HO
HO
O
O
OH
O
O
HO
NH
O
O
O
O P O
O OH
O
O
OH
C14OH
C14OH
C14
C14OH
C12OH
B. bronchiseptica 9,73 H-
O
H 2N
OH
O H
Récepteurs Toll
La Drosophile et l’homme utilisent des molécules homologues pour
se défendre contre les infections microbiennes
Hexa-acyl lipid A (agonist)
Park BS et al. Nature 2009
La reconnaissance des lipides A par le récepteur agit comme
une clé qui ouvrirait les vannes de la signalisation cellulaire…
Underacylated lipid A (antagonist)
Origine des modifications
Biosynthèse des LPS et transport à travers la membrane
Camouflage des structures classiques
Extraction des LPS pour l’analyse structurale
Freeze-dried cells
Ammonia 1M / Isobutyric acid
Extraction T° ambiante
Phénol/eau, 65°C
centrifugation
2000g, 15 min
purification
Longue dialyse
LPS
LPS
Extraction, Centrifugation
Dialyse, Lyophilisation
Purification
Hydrolyse
10 jours
LPS
Workshop Equipex Andromède
Extraction
Extraction Directe des LPS
à partir des Bactéries entières
2-3 jours
Analyse, MS, structure
Institut de Génétique et Microbiologie d’Orsay
19 Juin 2013
Analyse des bactéries entières?
Nouvelles approches pour la spectrométrie de masse
LPS= identification bactérienne!
ADN expulsé d’une bactérie
après choc osmotique
Comparaison E. coli sonication et MALDI
n
E. coli Sonication et choc osmotique
E. coli
100
n
0
E. coli surnageant
100
0
E. coli culot
100
0
E. coli LPS
100
0
1500
Lipide A +
cores
DHB
3000
Mass (m/z)
LPS
LPS +
Citric acid
DHB / citric acid
Workshop Equipex Andromède
Institut de Physique Nucléaire d’Orsay
Mardi 27 Nov.2012
Comparaison spectres MALDI LPS vs membrane bactérienne
=intrus!
LP
S
Periplas
m
Phospholi
Lipoprotei
pid
nProtei
n
Peptidogly
can
1300bars
Presse de French
Pourquoi le SIMS?
Premiers résultats sur le lipide A
de E. coli en cluster SIMS
E. coli lipid A
Y1
Counts / Nprojectile [arb.u.]
100
710
4 FA
1361
X1
739
1281
6 FA
1797
1717
Au9, 10 keV
0
650
850
1050
1250
1450
1650
Au5, 10 keV
Au3, 10 keV
1850
Mass ( m/z )
Avantages du SIMS sur le MALDI
Plus quantitatif
Plus informatif au niveau de la fragmentation
Workshop Equipex Andromède
u
10 keV
Institut de Génétique et Microbiologie
19 Juin 2013
Pourquoi Andromède?
Pour garder les avantages du SIMS, avec, en plus:
la possibilité d’aller explorer les couches de l’échantillon
la possibilité d’analyse à l’air sans trop de transformation des échantillons biologiques
La possibilité de combiner ces avantages avec la microscopie et obtenir des informations
topographiques dans la matrice naturelle, comme par exemple, les biofilms…
Workshop Equipex Andromède
Institut de Génétique et Microbiologie
19 Juin 2013
Start-up
www.lpsbiosciences.com
FREDERIC
CAROFF
MARTINE
CAROFF
ASMAA
ELHAMIDI
ALEXEY
NOVIKOV
www.endotox.com/
« Endotoxins: Structures & Activities »
WAHIB
MAHANA
LUIS
AUGUSTO
SAMI
NEHME
STEPHANIE
LEMOULLEC
WEI
ZHANG-SUN