chentouf hanane - Université d`Oran 1 Ahmed Ben Bella

‫اﻟﺠﻤﮭــــﻮرﯾﺔ اﻟﺠﺰاﺋـــﺮﯾﺔ اﻟﺪﯾﻤﻘﺮاطﯿـــــــﺔ اﻟﺸـﻌــﺒــــــﯿـــــــــــﺔ‬
République Algérienne démocratique et populaire
Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique
Université d’Oran Ahmed Ben Bela -1Faculté des sciences
Département de biologie
Thèse de doctorat (LMD)
Spécialité : Microbiologie appliquée
Option : Contrôle microbiologique et hygiène alimentaire
Thème :
Effet des substances antimicrobiennes produites
par Leuconostoc mesenteroides isolées à partir
du lait de chamelle Algérien sur Listeria spp.
dans les produits alimentaires
Présenté par : MIMOUN née CHENTOUF Hanane Fatma
Devant les membres du jury :
Président :
Examinateur :
Examinateur :
Examinateur :
Rapporteur :
Mr KIHAL Mebrouk
Mr ABBOUNI Bouziane
Mr BABA HAMED Mohammed Bey
Mr HADADJI Miloud
Mlle BENMECHERNENE Zineb
2014-2015
Professeur (Université d’Oran)
Professeur (Université de Sidi Bel Abbes)
Professeur (Université d’Oran)
Professeur (Université d’Oran)
M. C. A. (Université d’Oran)
Remerciements
Le premier de mes remerciements ira au bon Dieu miséricorde qui m’a donné la santé,
la volonté et la patience pour réaliser ce modeste travail.
Ce travail n’aurait vu le jour sans la confiance et surtout la patience de ma directrice de
recherche Madame BENMECHERNENE Zineb qui m'a bien accueillie pendant ces années
de thèse. Je tiens à lui exprimer toute ma reconnaissance d'avoir su m'encadrer, me conseiller
et me soutenir tout en me laissant travailler très librement et surtout d’avoir était une bonne
amie.
Mes plus sincères remerciements vont à Monsieur le Professeur KIHAL Mebrouk qui
m'a fait l'honneur d'accepter de juger mon travail et dont l'enseignement et la passion de ce
dernier resteront des exemples pour moi.
Je remercie Messieurs les Professeurs ABBOUNI Bouziane, BABA HAMED
Mohamed Bey et HADADJI Miloud qui ont eu la gentillesse d'accepter de juger mon
travail.
Je tiens à exprimer ma reconnaissance à Melle ZAROUR Kanza qui m'a aidé,
encouragé et soutenue dans mes moments d'enthousiasme étincelant comme dans les
moments de doute inconsolables.
Je tiens à remercier vivement Monsieur BARROS-VELAZQUEZ Jorge qui m’a
accueillie au sein de son laboratoire de microbiologie à l’université de Santiago De
Compostella de Lugo (Espagne), de me faire partie de son équipe et de payer mon stage sans
hésitation et pour m'avoir accordé sa confiance en m'offrant la possibilité de poursuivre ce
travail.
Toutes mes gratitudes vont à Messieurs QUINTELA BALUJA Marcos et El Nakib
Mohamed de leur patience et de m’avoir énormément aidé.
Je remercie tous qui m’ont aidé de près ou de loin afin d’accomplir ce modeste travail.
Dédicace
Je dédie ce modeste travail
A mon très cher père Benali qui m'a toujours soutenu, et a été toujours présent
pour moi.
A la plus chère au monde, ma mère Turkia qui m’a toujours encouragé et me
réconforter durant mes études.
A mon adorable cher mari Djamel Eddine qui m’a supporté et d’avoir été
très compréhensible.
A mon petit bout de chou Mohamed Aymene
A la mémoire de ma sœur Imane (Allah yarhamha)
A mes frères Mohamed Yacine et Sofiane
A ma belle-famille : Fadéla, Houari, Wafaa, Belkhir, Mokhtaria et Tarek
A toute ma famille
A toutes mes amies.
Table des matières
Problématique
‫ﻣﻠﺨﺺ‬
Abstract
Résumé
Liste des abréviations
Liste des figures
Liste des tableaux
Introduction ................................................................................................................................ 1
Synthèse bibliographique
1.
2.
3.
Généralités sur le dromadaire ............................................................................................. 3
1.1.
Origine du dromadaire ................................................................................................ 3
1.2.
Taxonomie et race ....................................................................................................... 3
1.3.
Répartition géographique des dromadaires ................................................................. 4
1.3.1.
Distribution dans le monde ......................................................................................... 4
1.3.2.
Distribution en Afrique ............................................................................................... 5
1.3.3.
Distribution en Algérie ............................................................................................... 6
1.4.
Dromadaire à vocation lait .......................................................................................... 6
1.4.1.
Production laitière mondiale ....................................................................................... 7
1.4.2.
Production laitière en Algérie ..................................................................................... 7
Généralités sur le lait........................................................................................................... 8
2.1.
Lait de chamelle .......................................................................................................... 9
2.1.1.
Caractéristiques organoleptiques et physicochimiques du lait camelin ...................... 9
2.1.2.
Propriétés nutritionnelles du lait camelin.................................................................... 9
2.1.3.
Caractéristiques microbiologiques du lait camelin ................................................... 10
2.1.4.
Système protecteur du lait camelin ........................................................................... 10
Les bactéries lactiques ...................................................................................................... 11
3.1.
Habitat et origine des bactéries lactiques .................................................................. 11
3.2.
Taxonomie des bactéries lactiques ............................................................................ 11
3.3.
Caractéristiques des principaux genres des bactéries lactiques ................................ 13
3.3.1.
Le genre Lactobacillus .............................................................................................. 13
1
4.
5.
3.3.2.
Le genre Lactococcus................................................................................................ 13
3.3.3.
Le genre Streptococcus ............................................................................................. 14
3.3.4.
Le genre Enterococcus .............................................................................................. 14
3.3.5.
Les genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella .................................................. 14
3.3.6.
Les genres Pediococcus et Tetragenococcus ............................................................ 15
3.3.7.
Le genre Bifidobacterium.......................................................................................... 15
3.4.
Les propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques........................................... 16
3.4.1.
Le pH et les acides organiques.................................................................................. 16
3.4.2.
Le peroxyde d’hydrogène ......................................................................................... 17
3.4.3.
Le dioxyde de carbone .............................................................................................. 17
3.4.4.
Le diacétyl ................................................................................................................. 18
3.4.5.
La reutérine ............................................................................................................... 18
3.4.6.
Les bactériocines ....................................................................................................... 18
Le genre Leuconostoc ....................................................................................................... 19
4.1.
Historique .................................................................................................................. 19
4.2.
Habitat ....................................................................................................................... 19
4.3.
Classification............................................................................................................. 21
4.4.
Caractérisation des Leuconostoc ............................................................................... 23
4.5.
Le pouvoir antimicrobien des Leuconostoc .............................................................. 24
4.6.
Résistances aux conditions de stress ......................................................................... 25
4.7.
Utilisation des souches de Leuconostoc dans l’industrie alimentaire ....................... 26
Les bactériocines ............................................................................................................... 26
5.1.
Historique .................................................................................................................. 26
5.2.
Définition .................................................................................................................. 27
5.3.
Classification............................................................................................................. 28
5.3.1.
Classe I : Les lantibiotiques ...................................................................................... 28
5.3.2.
Classe II .................................................................................................................... 28
5.3.3.
Classe III ................................................................................................................... 30
5.3.4.
Classe IV ................................................................................................................... 31
5.4.
La production des bactériocines ................................................................................ 32
5.5.
Le conditionnement des bactériocines ...................................................................... 33
5.6.
L’application des bactériocines et la bactérie productrice dans le secteur alimentaire
33
5.6.1.
Application de la bactériocine dans le secteur alimentaire ....................................... 33
2
6.
7.
8.
5.6.2.
Application de la bactérie productrice de bactériocines dans le secteur alimentaire 34
5.7.
La bioconservation des produits alimentaires ........................................................... 35
5.8.
Utilisation des bactéries lactiques productrices de bactériocine ............................... 37
Les probiotiques ................................................................................................................ 39
6.1.
Définition d’un probiotique ...................................................................................... 39
6.2.
Rôle du probiotique................................................................................................... 39
6.3.
Mécanisme d'action des probiotiques ....................................................................... 40
6.4.
Les principales espèces des bactéries lactiques à potentiel probiotique ................... 41
6.5.
Applications des probiotiques ................................................................................... 42
6.6.
Les probiotiques et leurs effets bénéfiques sur la santé ............................................ 43
6.7.
Les prébiotiques ........................................................................................................ 44
Le genre Listeria ............................................................................................................... 44
7.1.
Historique .................................................................................................................. 44
7.2.
Position taxonomique................................................................................................ 45
7.3.
Habitat ....................................................................................................................... 45
7.4.
Caractères bactériologiques ...................................................................................... 46
7.4.1.
Morphologie et Structures......................................................................................... 46
7.4.2.
Caractères biochimiques, métaboliques et culturaux ................................................ 46
7.5.
La Listériose .............................................................................................................. 47
7.5.1.
L’espèce Listeria monocytogenes ............................................................................. 47
7.5.2.
Aliments associés à la listériose ................................................................................ 47
7.5.3.
Les maladies de l'homme causé par Listeria ............................................................. 48
Identification des bactéries par la biologie moléculaire.................................................... 50
8.1.
Méthodes basées sur la PCR (réaction de polymérisation en chaine)....................... 51
8.1.1.
Champ d'application.................................................................................................. 51
8.1.2. Amplification de régions consensus et séquençage : sous-unité de l’ARN
ribosomique 16S ...................................................................................................................... 51
8.1.2.1. Principe ..................................................................................................................... 51
8.1.2.2. Protocole général....................................................................................................... 51
8.2.
Le spectromètre de masse MALDI-TOF .................................................................. 52
8.2.1.
La spectrométrie de masse ........................................................................................ 52
8.2.2.
La spectrométrie de masse MALDI-TOF ................................................................. 53
8.2.2.1. Principe ..................................................................................................................... 53
8.2.2.2. La matrice ................................................................................................................. 54
3
8.2.2.3. Désorption-Ionisation ............................................................................................... 55
8.2.2.4. La spectrométrie à temps de vol (TOF) ................................................................... 56
8.2.2.5. Le spectre .................................................................................................................. 56
Matériels et méthodes
1.
Lieu du travail ................................................................................................................... 58
2.
Provenance et prélèvement des échantillons ..................................................................... 58
3.
Caractérisation phénotypiques, biochimiques et physiologiques ..................................... 59
4.
3.1. Isolement des souches du genre Leuconostoc ........................................................ 59
3.1.1. Milieux d’isolement ........................................................................................... 59
3.1.2. Préparation des suspensions de dilutions ........................................................... 59
3.2. Caractérisation phénotypique, biochimique et physiologique ............................... 60
3.2.1. Caractérisation phénotypique ............................................................................. 60
3.2.1.1. Purification des isolats ....................................................................................... 60
3.2.1.2. Coloration de Gram ............................................................................................ 60
3.2.2. Caractérisations biochimiques ............................................................................ 60
3.2.2.1. Recherche de la catalase ..................................................................................... 60
3.2.2.2. Hydrolyse de l’arginine ...................................................................................... 61
3.2.2.3. Production de dextrane ....................................................................................... 61
3.2.2.4. Type fermentaire ................................................................................................ 61
3.2.3. Caractérisations physiologiques ........................................................................ 62
3.2.3.1. Tolérance à la salinité ......................................................................................... 62
3.2.3.2. Croissance à différent pH ................................................................................... 62
3.2.3.3. Croissance à différente température et la thermorésistance ............................... 62
3.2.3.4. Étude du profil fermentaire ................................................................................ 62
3.2.3.5. L’utilisation du citrate ........................................................................................ 63
3.2.3.6. La production d’acétoine .................................................................................... 65
3.2.4. Identification par galerie API ............................................................................. 65
Conservation des souches ................................................................................................. 66
5.
4.1. Conservation pour une courte durée ...................................................................... 66
4.2. Conservation pour une longue durée ..................................................................... 66
Caractérisation moléculaire des souches Leuconostoc ..................................................... 66
5.1. Les souches bactériennes et les conditions de culture ........................................... 66
5.2. Identification génétique des souches Leuconostoc par le séquençage du gène 16S
ARNr 67
5.2.1. Extraction d’ADN génomique............................................................................ 67
5.2.2. Purification d’ADN ............................................................................................ 68
5.2.3. Conservation de l’ADN ...................................................................................... 69
5.2.4. Quantification d’ADN purifié ............................................................................ 69
5.2.5. Amplification de l’ARN 16S .............................................................................. 70
4
6.
5.2.6. Détection des produits de PCR........................................................................... 71
5.2.7. Séquençage d’ADN ............................................................................................ 71
5.2.7.1. Principe de la technique Sanger ......................................................................... 71
5.2.8. L'analyse des séquences obtenues ...................................................................... 72
5.3. Identification des souches Leuconostoc par le MALDI-TOF MS ......................... 73
5.3.1. Préparation des extraits pour l’analyse protéomique ......................................... 73
5.3.2. Analyse des spectres obtenus ............................................................................. 73
Caractérisation technologique des souches Leuconostoc.................................................. 76
7.
6.1. Mise en évidence de l’activité antimicrobienne ..................................................... 76
6.1.1. Matériel biologique ............................................................................................ 76
6.1.2. Détection de l’activité antimicrobienne ............................................................. 76
6.1.2.1. Interaction par méthode directe (Spot Agar Test) .............................................. 77
6.1.2.2. Interaction par méthode indirecte (Well Diffusion Assays) ............................... 77
6.1.3. Mise en évidence de la nature de l’agent inhibiteur ........................................... 77
6.1.3.1. Inhibition due à la production d’acides organiques............................................ 78
6.1.3.2. Inhibition due au peroxyde d’hydrogène............................................................ 78
6.1.3.3. Inhibition due aux phages .................................................................................. 78
6.1.4. Recherche de substance inhibitrice de nature protéique .................................... 79
6.1.5. Optimisation de la production de substances antimicrobiennes ......................... 80
6.1.5.1. Effet de la température ....................................................................................... 80
6.1.5.2. Sensibilité au pH ................................................................................................ 80
6.1.5.3. Sensibilité aux solvants organiques.................................................................... 80
6.2. Suivi cinétique d’acidité et de croissance en culture pure et en culture mixte ...... 81
6.2.1. Etude de la cinétique des souches Leuconostoc en culture pure ........................ 81
6.2.1.1. Mesure du pH ..................................................................................................... 81
6.2.1.2. Dosage d’acidité ................................................................................................. 82
6.2.1.3. Mesure de la croissance...................................................................................... 82
6.2.2. Etude de la cinétique des souches Leuconostoc en culture mixte ...................... 83
6.3. Etude probiotique des souches de Leuconostoc ..................................................... 83
6.3.1. Tolérance à l’acidité ........................................................................................... 85
6.3.2. Résistance à la pepsine ....................................................................................... 85
6.3.3. Tolérance et hydrolyse des sels biliaires ............................................................ 86
6.3.3.1. Tolérance aux sels biliaires ................................................................................ 86
6.3.3.2. Hydrolyse des sels biliaires ................................................................................ 86
6.3.4. Activité hémolytique .......................................................................................... 87
6.3.5. Résistance aux antibiotiques .............................................................................. 87
Traitement des données..................................................................................................... 89
7.1. L'analyse statistique de l’activité antimicrobienne et l’étude probiotique ............. 89
7.2. Le suivi cinétique ................................................................................................... 89
7.2.1. Calcule de taux de croissance (µ) ..................................................................... 89
7.2.2. Calcul de temps de génération (G) ..................................................................... 89
7.2.3. Calcul des vitesses maximales ........................................................................... 89
5
Résultas
1.
Échantillonnage ................................................................................................................. 90
2.
Paramètres organoleptiques et physiques des échantillons du lait camelin ...................... 91
3.
Isolements et caractérisation phénotypique, biochimique et physiologique ..................... 92
4.
3.1. Caractérisation phénotypique ................................................................................. 92
3.1.1. Aspect morphologique ....................................................................................... 92
3.1.1.1. Aspect macroscopique........................................................................................ 92
3.1.1.2. Aspect microscopique ........................................................................................ 92
3.2. Caractérisations biochimiques des souches ........................................................... 94
3.2.1. Test de la catalase ............................................................................................... 94
3.2.2. Hydrolyse de l’arginine ...................................................................................... 94
3.2.3. Production de dextrane ....................................................................................... 94
3.2.4. Type fermentaire ................................................................................................ 94
3.3. Caractérisations physiologiques ............................................................................. 96
3.3.1. Tolérance à l’acidité, pH, température et la thermorésistance ........................... 96
3.3.2. Etude du profil fermentaire ................................................................................ 97
3.3.3. L’utilisation du citrate ........................................................................................ 99
3.3.4. La production d’acétoine .................................................................................... 99
Identification par galerie API .......................................................................................... 101
5.
Caractérisation moléculaire des souches Leuconostoc ................................................... 102
6.
5.1. Identification génétique des souches Leuconostoc par le séquençage du gène 16S
ARNr 102
5.1.1. L’analyse génomique ....................................................................................... 102
5.1.2. L'analyse phylogénétique ................................................................................. 106
5.2. Identification des souches Leuconostoc par le MALDI-TOF MS ....................... 108
Caractérisation technologique des souches Leuconostoc................................................ 117
7.
6.1. Mise en évidence des inhibitions inter-bactériennes ........................................... 117
6.1.1. Détection de l’activité antimicrobienne ........................................................... 117
6.1.1.1. Méthode directe ................................................................................................ 117
6.1.1.2. Méthode indirecte ............................................................................................. 119
6.1.2. Mise en évidence de la nature de l’agent inhibiteur ......................................... 121
6.1.2.1. Inhibition due à la production d’acides organique ........................................... 121
6.1.2.2. Inhibition due au peroxyde d’hydrogène.......................................................... 121
6.1.2.3. Inhibition due aux phages ................................................................................ 121
6.1.2.4. Recherche de la substance inhibitrice de nature protéique............................... 121
6.1.3. Optimisation de la production de substances antimicrobiennes ....................... 122
6.1.3.1. Effet de la température ..................................................................................... 122
6.1.3.2. Sensibilité au pH .............................................................................................. 122
6.1.3.3. Sensibilité aux solvants organiques .................................................................. 124
Suivi cinétique d’acidité et de croissance en culture pure et en culture mixte ............... 125
8.
Étude probiotique des souches de Leuconostoc .............................................................. 130
6
8.1.
8.2.
8.3.
8.4.
8.5.
Tolérance à l’acidité ............................................................................................. 130
Résistance aux enzymes ....................................................................................... 130
Hydrolyse et résistance aux sels biliaires ............................................................. 130
Activité hémolytique ............................................................................................ 132
Résistance aux antibiotiques ................................................................................ 132
Discussion .............................................................................................................................. 135
Conclusion .............................................................................................................................. 149
Références bibliographiques .................................................................................................. 151
Annexes
7
‫‪Introduction‬‬
‫ﻣﻠﺧص‬
‫إن ﺑﻛﺗﯾرﯾﺎ اﻟﻠﺑن ھﻲ ﻣﺟﻣوﻋﺔ ﻣن اﻟﺑﻛﺗﯾرﯾﺎ اﻟﻣﻔﯾدة‪ ،‬ﻟﮭﺎ ﻣﻣﯾزات ﻣﺗﺷﺎﺑﮭﺔ ‪.‬ﻣوﺟودة ﻓﻲ ﺑﯾﺋﺎت ﻣﺧﺗﻠﻔﺔ ﻓﻲ اﻟطﺑﯾﻌﺔ‪ ،‬و ﺗوﺟد‬
‫أﯾﺿﺎ ﻓﻲ اﻟﺟﮭﺎز اﻟﮭﺿﻣﻲ ﻟﻺﻧﺳﺎن ‪.‬و ھﻲ أﻧواع ﻣن ﺑﯾﻧﮭﺎ ‪ ، Leuconostoc‬واﻟﺗﻲ ﺗﻠﻌب دورا ھﺎﻣﺎ ﻓﻲ اﻟﻌدﯾد ﻣن اﻟﺗﺧﻣرات‬
‫اﻟﺻﻧﺎﻋﯾﺔ واﻟﻐذاﺋﯾﺔ و ھﻲ ﺗﻧﺗﺞ ﻣواد ذات ﺗﺄﺛﯾر ﻣﺿﺎد ﻟﻠﺟراﺛﯾم‪.‬‬
‫ﺗم ﻋزل ﺛﻼﺛﺔ وﺛﻣﺎﻧﯾن ﺳﻼﻟﺔ‬
‫‪Leuconostoc‬‬
‫‪ mesenteroides‬ﻣن ‪ 12‬ﻋﯾﻧﺔ ﺣﻠﯾب اﻹﺑل اﻟﺧﺎم ﻣن ﻣﻧﺎطق ﺟزاﺋرﯾﺔ ﻣﺧﺗﻠﻔﺔ ‪ .‬ﺑﺎﺳﺗﻌﻣﺎل اﻷﺳﺎﻟﯾب اﻟﺗﻘﻠﯾدﯾﺔ ‪ 42 ،‬ﻣن ھذه‬
‫اﻟﺳﻼﻻت ﺗم اﻟﺗﻌرف ﻋﻠﯾﮭﺎ ﻋﻠﻰ أﻧﮭﺎ‪ . Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides‬و ‪ 37‬ﺳﻼﻟﺔ أﻧﮭﺎ‬
‫‪ Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum‬و ‪ 4‬ﺳﻼﻻت ﻛـ ‪Leuconostoc mesenteroides subsp.‬‬
‫‪ . cremoris‬ﻛﺷﻔت اﻟدراﺳﺔ أن اﻟﺗﻔﺎﻋل ﺑﯾن ﺳﺑﻊ ﻣن ﺳﻼﻻﺗﻧﺎ ﻛﺎﻧت ﻗﺎدرة ﻋﻠﻰ ﻣﻧﻊ ﻧﻣو ‪ Listeria monocytogenes‬و‬
‫‪ Listeria innocua Listeria ivanovii , Staphylococcus aureus , Escherichia coli‬و ‪Lactobacillus‬‬
‫‪ ،plantarum‬ھذ ه اﻟﺳﻼﻻت اﻟﺳﺑﻌﺔ ﺗم اﻟﺗﺄﻛد ﻣن ھوﯾﺗﮭﺎ ﻣرة أﺧرى ﺑﺻﻔﯾﺣﺔ ‪ API‬و اﻻﺳﺎﻟﯾب اﻟﺟزﯾﺋﯾﺔ ﻋن طرﯾق ‪ PCR‬و‬
‫‪.MALDI-TOF MS‬‬
‫ﻣن ﺧﻼل إﺑﻌﺎد ﺗﺄﺛﯾر اﻟﺣﻣوﺿﺔ‪ ،‬و ‪ H2O2‬ﻣن اﻟﻌواﻣل اﻟ ﻣﺿﺎدة ﻟﻠﺑﻛﺗﯾرﯾﺎ و ﺑﺎﺳﺗﺧدام اﻹﻧزﯾﻣﺎت اﻟﻣﺣﻠﻠﺔ ﻟﻠﺑروﺗﯾن ‪ ،‬ﺗم‬
‫ﺗﺣدﯾد ﻋﺎﻣل اﻹﺑﺎدة ﻛﻣﺎدة طﺑﯾﻌﺔ ﺑروﺗﯾﻧﯾﺔ ﺗم اﻟﺗﺣﺻل ﻋﻠﻰ أﻓﺿل إﻧﺗﺎج ﻟﻠﻣﺎدة اﻟﺑروﺗﯾﻧﯾﺔ ﻟﻣﺎ ﻋﺎﻟﺟﻧﺎھﺎ ﺑﻣﺎدة اﻟﺗوﯾن ‪ ،80‬ﻣﻣﺎ أدى‬
‫إﻟﻰ زﯾﺎدة اﻟﻧﺷﺎط ‪ ،‬ﻋﻠﻰ ﻋﻛس اﻟﯾورﯾﺎ اﻟﺗﻲ ﺧﻔﺿت اﻟﻧﺷﺎط‪ .‬إن ﺣرﻛﯾﺔ اﻟﻧﻣو ﻓﻲ اﻟزراﻋﺔ اﻟﻣﺧﺗﻠطﺔ ﺑﯾﻧت ﺑوﺿوح أن ‪Listeria‬‬
‫‪ Listeria ivanovii innocua‬ﺗﺑدي ﺣﺳﺎﺳﯾﺔ ﻛﺑﯾرة ﻟﻌزﻻﺗﻧﺎ ‪.‬ھذه اﻟﺳﻼﻻت أظﮭرت ﺑﯾﺎﻧﺎت ﺑروﺑﯾوﺗﯾﻛﯾﺔ ﺟﯾدة ﻣن ﺧﻼل‬
‫اﺳﺗﻣرارﯾﮭﺎ ﻓﻲ اﻟﺣﯾﺎة ﻓﻲ درﺟﺔ ﺣﻣوﺿﺔ ‪ , 2.0‬وﺟود اﻷﻣﻼح اﻟﺻﻔراوﯾﺔ و اﻟﺑﯾﺑﺳﯾن ‪ .‬ھذه اﻟﺳﻼﻻت ﻟﯾس ﻟﮭﺎ ﻗﺎﺑﻠﯾﺔ ﻟﺗﻔﻛﯾك‬
‫اﻷﻣﻼح اﻟﺻﻔراوﯾﺔ و ﻟﯾس ﻟﮭﺎ ﺗﺄﺛﯾر ﺳﻠﺑﻲ ﻋﻠﻰ اﻟﻛرﯾﺎت اﻟدﻣوﯾﺔ‪ ،‬وﻟﻛﻧﮭﺎ أظﮭرت ﻣﻘﺎوﻣﺔ ﺟﯾدة ﺿد اﻟﻣﺿﺎد اﻟﺣﯾوي اﻟﻣﺳﺗﻌﻣل‬
‫طﺑﯾﺎ‪.‬‬
‫اﻟﻛﻠﻣﺎت اﻟﻣﻔﺗﺎﺣﯾﺔ ‪:‬‬
‫‪ ، Leuconostoc mesenteroides‬ﺣﻠﯾب اﻟﻧﺎﻗﺔ‪ ،‬ﻣواد ﻣﺿﺎدة ﻟﻠﺑﻛﺗﯾرﯾﺎ‪ ،Listeria ،‬ﻣﻧﻊ اﻟﻧﻣو‪ ،‬ﺑروﺑﯾوﺗﯾك‪.‬‬
‫‪8‬‬
Introduction
Abstract
Lactic acid bacteria are a group of beneficial bacteria, whose virtues are similar.
They are ubiquitous in nature, and are also found in the human digestive system. Among
them, the genus Leuconostoc, which plays an important role in many industrial and food
fermentations which produces substances with a bactericidal effect. Eighty-three strains of
Leuconostoc mesenteroides were isolated from 12 samples of raw camel milk from
different Algerian areas. With conventional methods, 42 of the strains identified as Ln.
mesenteroides subsp. mesenteroides, 37 as strains of Ln mesenteroides subsp. dextranicum
and 4 as strains of Ln. mesenteroides subsp. cremoris. Interaction studies revealed that
seven strains were able to inhibit the growth of L. monocytogenes and L. innocua, L.
ivanovii, St. aureus, E. coli and L. plantarum. These seven strains were identified by API
gallery and molecular identification by PCR and MALDI-TOF MS. By eliminating the
effect of pH, H2O2 from the antimicrobial factors and using proteolytic enzymes, the
inhibiting agent was determined as a substance of proteinous nature. Optimizing the
production of these substances by treating the supernatant by the Tween 80, which
increased the inhibitory activity but it was affected by adding the urea. Growth kinetics in
mixed culture clearly showed that L. innocua and L. ivanovii are sensitive to our isolates.
These strains of Ln. mesenteroides have remarkable probiotics profiles, be able to survive
at pH 2.0 and in the presence of bile salts and pepsin. These strains do not have evaluated a
bile salt hydrolase or haemolytic activity, but they showed good resistance to antimicrobial
agents clinically relevant.
Keywords:
Leuconostoc mesenteroides, camel milk, antimicrobial substances, probiotic, Listeria
spp., inhibition growth.
9
Introduction
Résumé
Les bactéries lactiques appartiennent à un groupe de bactéries bénéfiques, dont les
vertus se ressemblent. Elles sont omniprésentes dans la nature, et se trouvent aussi dans le
système digestif de l’homme. Parmi elles, Le genre Leuconostoc qui joue un rôle important
dans plusieurs fermentations industrielles et alimentaires dont il produit des substances à
effet bactéricide. Quatre-vingt-trois souches de Leuconostoc mesenteroides ont été isolées
à partir de 12 échantillons de lait cru de chamelle provenant de différentes zones
algériennes. Avec des méthodes classiques, 42 souches ont été identifié comme étant des
Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides, 37 souches comme des Ln. mesenteroides subsp.
dextranicum et 4 souches comme des Ln. mesenteroides subsp. cremoris. L'étude des
interactions révèle que sept souches étaient capables d'inhiber la croissance de L.
monocytogenes ainsi L. innocua, L. ivanovii, St. aureus, E. coli et L. plantarum. Ces
souches productrices de substances antimicrobiennes ont été ré-identifié par l’utilisation
des galeries API et les techniques moléculaires par PCR et MALDI-TOF MS. En éliminant
l'effet du pH, du H2O2 des facteurs antimicrobiens et en utilisant des enzymes
protéolytiques, l'agent inhibiteur a été déterminé comme substance de nature protéique.
L’optimisation de la production a été effectuée en traitant le surnageant par la Tween 80
qui a augmenté l'activité d'inhibition, contrairement à l'urée qui l’a diminué. La cinétique
de croissance en culture mixte a clairement montré que L. innocua et L. ivanovii sont
sensibles devant nos souches isolées. Ces souches de Ln. mesenteroides présentent des
profils probiotiques remarquables, être capable de survivre à un pH de 2.0 et à la présence
de sels biliaires et de la pepsine. Ces souches évaluées ne présentent pas une hydrolase des
sels biliaires ou une activité hémolytique, mais ont montré de bonne résistance aux agents
antimicrobiens cliniquement pertinents.
Mots clés :
Leuconostoc mesenteroides, lait de chamelle, substances antimicrobiennes, probiotique,
Listeria spp., inhibition de croissance.
10
Introduction
Liste des abréviations
% : pour cent
FDA : Food and Drug Administration
°C : Degré Celsius
fru : fructose
°D : Degré dornic
g : gramme
µ : micron
G : temps de génération
µg : microgramme
G+C: Guanine + Cytosine
µl: Microlitre
G-6 -PDH: Glucose 6 Phosphate
µm: Micromètre
déshydrogénase
µmax : Le taux de croissance maximum
gal : galactose
ACN : acétonitrile
glu : glucose
ADH : arginine dihydrolase
Gr : grossissement
ADN : Acide Désoxyribonucléique
GRAS : generally recognized as safe
ADNr : ADN ribosomal
h: heur
ADP: adenosine 5’-diphosphate
H2O2 : eau oxygénée
amd : amidon
HCl : Chlorure d’hydrogène
ara : arabinose
HMRUO : hôpital militaire régional
ARNr : Acide Ribonucléique Ribosomique
universitaire d’ORAN
ATCC: American Type Culture Collection
i.e. : c'est-à-dire
’
ATP: adenosine 5 -triphosphate
IFN : interferon
Aw: activité de l’eau
Il : interleukine
BCP: bromocresol pourpre
kDa: kilodalton
BHI : Brain Heart Infusion
L. : Listeria
BL: bactéries lactiques
lac : lactose
BN : Bouillon nutritif
Lb. : Lactobacillus
cm : centimètre
Lc. : Lactococcus
CO2 :Dioxyde de carbone
LDH : le lactate dehydrogénase
Da: Dalton
LMA : laboratoire de microbiologie
DO : densité optique
appliquée
Ech. : Échantillon
LMG : collection type des cultures de
EMP: Embden- Meyerhof-Parnas
l’université de Ghent (Belgique).
EPS: Exopolysaccharides
Ln. : Leuconostoc
FAO : organisation mondiale pour
m : masse
l’alimentation et l’agriculture
11
Introduction
M.E.T: Microscope électronique à
PCR : polymérase chain réaction
transmission
pH : Potentiel d’Hydrogène
mal : maltose
PM : poids moléculaire
MALDI : Matrix-Assisted Laser
pmol : picomol (10-12mol)
Desorption/Ionisation (source d'ionisation
ppm : partie par million
laser assistée par une matrice)
QPS : présomption de sécurité qualifiée
mg : milligramme
raf : raffinose
min : minute
rha : rhamnose
ml : millilitre
s : seconde
mM : milli-molaire
S. : Staphylococcus
mnt : mannitol
sac : saccharose
MPa: mégapascal
sor : sorbitol
MRS : milieu de Man-Rogosa et Sharp
sp : Espèce non précisée
MRS-BCP : milieu MRS additionnée de
ssp : Sous espèce
pourpre de Bromocrésol
St : Streptococcus
MRSBCP-EV : MRS sans extrait de viande,
subsp : Sous sous espèce
additionnée de BCP
T ° : température
MS : mass spectrometry (spectrometrie de
TFA : acide trifluoroacétique
masse)
TOF : time-of-flight mass spectrometry
MSE : milieu de mayeux, sandine et Elliker
(analyseur à temps de vol)
N : Normalité
tpm : tours par minute
NaCl: Chlorure de sodium
tr : tour
+
NAD : nicotinamide adenine dinucléotide
tris : trishydroxyméthylaminométhane
NADH: nicotinamide adenine dinucléotide
UFC: unité formant colonies
NaOH : hydroxyde de sodium
UHT : ultra haute température
ND : n’est pas déterminé
UI : unité internationale
ng : nanogramme
UV : ultrat-violet
nm : nanomètre
V : vitesse
O2 : oxygène
Vol : volume
OMS : organisation mondiale de la santé
VP : Voges-Proskaeur
p : page
xyl : xylose
P: phosphate
α-CHCA : α-cyano-4-hydroxycinnamique
pb : paire de base
l'acide
Pb: pair de base
σ : l’incertitude de mesure
12
Introduction
Liste des figures
Figure 1: L’espèce Camelus dromedarius ................................................................................ 3
Figure 2: Répartition des principales races de dromadaires en Afrique du Nord (Vroum,
2007)........................................................................................................................................... 4
Figure 3: production du lait de chamelle dans le monde (FAO, 2009). .................................... 5
Figure 4: distribution des dromadaires en Afrique (Ould Ahmed, 2009). ................................ 5
Figure 5: Répartition géographique des chamelles laitières en Algérie (Anonyme, 2013) ...... 7
Figure 6: Les étapes successives de la listériose. Les organes touchés par l'infection, les
symptômes et les barrières épithéliales traversées par L. monocytogenes. .............................. 49
Figure 7: Principe d'ionisation par la technique MALDI. ....................................................... 55
Figure 8: Technique Time of flight (TOF) .............................................................................. 57
Figure 9: Spectre MALDI-TOF .............................................................................................. 57
Figure 10: prélèvement d’un échantillon de lait de chamelle ................................................. 58
Figure 11: schéma représentant l’utilisation de la plaque d’Elisa pour effectuer le profil
fermentaire des souches............................................................................................................ 64
Figure 12: schéma présentant la démarche dichotomique pour l’identification présomptive
des espèces de Leuconostoc (Carr et al., 2002)........................................................................ 64
Figure 13: Protocole d'extraction de l'ADN ............................................................................ 68
Figure 14: schéma explicatif de la quantification d’ADN purifié ........................................... 70
Figure 15: schéma général du travail pour l'identification des souches bactériennes par
MALDI-TOF MS ..................................................................................................................... 75
Figure 16 : schéma explicatif pour l’étude de la cinétique des souches Leuconostoc en culture
mixte ......................................................................................................................................... 84
Figure 17: les chamelles dont on a prélevé le lait ................................................................... 90
Figure 18: aspect macroscopique de Leuconostoc .................................................................. 92
Figure 19: observation microscopique des souches. Grx100x10x1.25 ................................... 93
Figure 20: Aspect des colonies de Leuconostoc sur milieu M16BCP .................................... 95
Figure 21: aspect des souches LnH13, LnC1, LnC11 productrices de Dextrane sur milieu
MSE .......................................................................................................................................... 95
Figure 22: la production du CO2 à partir du glucose .............................................................. 95
Figure 23: l’utilisation du citrate par l’apparition des colonies de contours bleuâtres sur KMK
des souches LnH1, LnH26, LnCH1, LnC42 ............................................................................. 99
Figure 24: la production d’acétoine par quelques souches isolées ......................................... 99
Figure 25: identification des souches de Leuconostoc mesenteroides LnC12, LnC21, LnC23,
LnC26, LnC28, LnC29, LnC33 par galerie API 20STREP .................................................... 101
Figure 26: photographie par le ChemiDoc™ MP Imaging System du gel d’agarose des
souches des Leuconostoc mesenteroides réalisé par électrophorèse. ..................................... 102
Figure 27: extrait du chromatogramme correspondant au spectre de la souche
L.MESEN_Ln_C21, vu dans Chromas Lite programme 2.0. ................................................ 104
Figure 28: Exemple d'un examen manuel de la séquence appartenant à L.MESEN_Ln_C21.
................................................................................................................................................ 104
13
Introduction
Figure 29: Identification de l’échantillon de L.MESEN_Ln_C21 en utilisant l'outil BLAST..
................................................................................................................................................ 105
Figure 30: l’arbre phylogénétique des souches de Leuconostoc mesenteroides sur la base de
la séquence de l'ARNr 16S. .................................................................................................... 107
Figure 31: l’arbre phyloproteomique des souches Leuconostoc spp. basé sur le profil des
protéines obtenu par le MALDI-TOF MS............................................................................. 110
Figure 32: caractéristiques des pics de masse de la souche LnC12. .................................... 111
Figure 33: caractéristiques des pics de masse de la souche LnC21. .................................... 111
Figure 34: caractéristiques des pics de masse de la souche LnC23. .................................... 112
Figure 35: caractéristiques des pics de masse de la souche LnC26. .................................... 112
Figure 36: caractéristiques des pics de masse de la souche LnC28. .................................... 113
Figure 37: caractéristiques des pics de masse de la souche LnC29. .................................... 114
Figure 38: caractéristiques des pics de masse de la souche LnC33. ................................... 114
Figure 39: spectres de références correspondant aux espèces L. carnosum, L. mesenteroides
et L. pseudomesenteroide.. ..................................................................................................... 115
Figure 40: Interaction bactérienne par la méthode directe entre les souches LnC12, LnC21,
LnC23, LnC26, LnC28, LnC29, LnC33 et les souches pathogènes. ...................................... 118
Figure 41: Interaction bactérienne par la méthode des puits entre les souches LnC12, LnC21,
LnC23, LnC26, LnC28, LnC29, LnC33 et les souches pathogènes. ...................................... 120
Figure 42: Effet des enzymes protéolytiques sur le surnageant des souches ...................... 122
Figure 43: Effet des solvants sur le surnageant des souches ................................................. 124
Figure 44: L’évolution du pH en fonction du temps lors de la croissance en culture pure et
mixte de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides C12 et Listeria innocua ........... 127
Figure 45: L’évolution du pH en fonction du temps lors de la croissance en culture pure et
mixte de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides C12 et Listeria ivanovii ........... 127
Figure 46: L’évolution de l’acidité en fonction du temps lors de la croissance en culture
pure et mixte de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides C12 et Listeria innocua 128
Figure 47: L’évolution de l’acidité en fonction du temps lors de la croissance en culture
pure et mixte de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides C12 et Listeria ivanovii 128
Figure 48: la cinétique de croissance de la souche Leuconostoc mesenteroides subsp.
mesenteroides C12 en culture pure et mixte avec Listeria innocua ....................................... 129
Figure 49: la cinétique de croissance de la souche Leuconostoc mesenteroides subsp.
mesenteroides C12 en culture pure et mixte avec Listeria ivanovii ....................................... 129
Figure 50: la non-hémolyse des souches de Leuconostoc mesenteroides sur milieu Columbia
Agar contenant 5% du sang humain sur milieu frais (a) et cuit (b)........................................ 133
Figure 51: antibiogramme d’une souche Leuconostoc mesenteroides ................................. 133
14
Introduction
Liste des tableaux
Tableau 1: nombre de têtes de dromadaire par Wilaya d’Algérie (Anonyme, 2013). .............. 6
Tableau 2: Exemples de races camelines laitières (Wardeh, 2004). ......................................... 6
Tableau 3: la production laitière cameline par Wilaya d’Algérie en 2013 ............................... 8
Tableau 4: les différents environnements qu’occupe le genre Leuconostoc (Hemme et
Foucaud- Scheunemann, 2004) ................................................................................................ 20
Tableau 5: Les espèces incluent dans le genre Leuconostoc (Hemme et FoucaudScheunemann, 2004) ................................................................................................................ 22
Tableau 6: Les caractères distinctifs des espèces du genre Leuconostoc (Garvie, 1986). ...... 24
Tableau 7: Séquences de quelques bactériocines de classe II (Dortu et Thonart, 2009). ....... 30
Tableau 8: Les bactériocines des bactéries lactiques (Stiles et Hastings, 1991 ; modifié) ..... 31
Tableau 9: Exemples d’applications des bactériocines comme des conservateurs alimentaires
(Benmechernene et al., 2013)................................................................................................... 36
Tableau 10: Microorganismes considérés comme probiotiques (Holzapfel et al., 1998)....... 41
Tableau 11: Les principaux effets bénéfiques attribués aux probiotiques (Salminen et al.,
2004 ; Patterson, 2008)............................................................................................................. 43
Tableau 12: Différenciation des espèces de Listeria.(Rocourt et Jacquet,2000, Azizi,2010). 49
Tableau 13: Caractéristiques des chamelles dont on a prélevé le lait. .................................... 59
Tableau 14: les souches de référence utilisées dans l’identification phylogénétique et
protéomique .............................................................................................................................. 67
Tableau 15: préparation des eppendorfs pour la quantification de l’ADN purifié ................. 69
Tableau 16: les souches indicatrices utilisées ......................................................................... 76
Tableau 17: les différents antibiotiques à utiliser,leurs symboles et leurs charges de disque. 88
Tableau 18: Paramètres physiques des échantillons du lait camelin frais .............................. 91
Tableau 19: Caractères biochimiques et physiologiques des isolats ...................................... 96
Tableau 20: les résultats du profil fermentaire des souches isolées ........................................ 97
Tableau 21: la liste des pics de masse des espèces spécifiques de L. carnosum, L.
pseudomesenteroides et L. mesenteroides .............................................................................. 116
Tableau 22: diamètre des zones d’inhibition des souches testées par la méthode directe. ... 117
Tableau 23: diamètres des zones d’inhibition des surnageant des souches testées par la
méthode des puits. .................................................................................................................. 119
Tableau 24: influence de la température, le pH et les protéases .......................................... 123
Tableau 25: sensibilité aux solvants organiques ................................................................... 124
Tableau 26: effet du pH acide sur la viabilité des souches de Leuconostoc mesenteroides
isolées ..................................................................................................................................... 131
Tableau 27: Effet de la pepsine à différents pH sur la viabilité des souches de Leuconostoc
mesenteroides isolées ............................................................................................................. 131
Tableau 28: Effet des différentes concentrations des sels biliaires sur les souches de
Leuconostoc mesenteroides isolées ........................................................................................ 131
Tableau 29: résistance aux antibiotiques des souches Leuconostoc mesenteroides (mm) ... 134
15
Introduction
Introduction
Le lait de chamelle est un aliment hautement nutritif par sa richesse en glucides,
lipides, vitamines et sels minéraux (Katinan et al., 2012), en
raison
de
sa
valeur
nutritionnelle élevée, il connait un regain d'intérêt ces dernières années. Bien que
pendant ces dernières décennies, il a fait l'objet de multiples travaux par le monde entier,
mais peu d'investigations sur le lait produit dans notre pays ont été envisagées.
Le lait de chamelle possède un effet antimicrobien contre les bactéries pathogènes,
parmi elles, on trouve Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Staphylococcus aureus et
Salmonella typhimurium. Cette activité antimicrobienne est attribuée à la présence dans le
lait de chamelle de substances antimicrobiennes telles que le lysozyme,
le
peroxyde
d’hydrogène, la lactoferrine, la lactoperoxydase et les immunoglobulines (Souid, 2011)
Cette activité ainsi que la production de substances antimicrobiennes des bactéries lactiques
du lait de chamelle sont peu étudiée.
Les microorganismes bioprotecteurs ont déjà montré leurs potentiels d’application
dans divers aliments (Vermeiren et al., 2004). Ces bactéries constituent un groupe diversifié
de microorganismes associés aux plantes, à la viande, au lait cru et les produits laitiers
(Azadnia et al., 2011). Les bactéries lactiques sont plus connues pour leur utilisation comme
ferments lactiques dans la fabrication de produits laitiers et leurs effets bénéfiques dans
l'industrie alimentaire (Hugenholtz et Kleerebezem, 1999). Ce qui a conduit à la
reconnaissance de leur statut GRAS (Generally Recognized As Safe) (Klaenhammer et al.,
1994).
Actuellement, les bactéries lactiques comprennent treize genres bactériens différents:
Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus,
Bifidobacterium, Carnobacterium, Oenococcus, Weissella, Aerococcus, Tetragenococcus et
Vagococcus (Dortu et Thonart, 2009). Parmi eux, le genre Leuconostoc qui est présent dans
de nombreux environnements (Hemme et Foucaud-Scheunemann, 2004)
Fait intéressant, le genre comprend un bon antagoniste. L'action antimicrobienne de
Leuconostoc contre les microorganismes pathogènes a été attribué à différents mécanismes, y
compris les acides organiques (Alakomi et al., 2000), le peroxyde d'hydrogène (Condon,
1987) et les bactériocines (Ennahar et al., 2000).
1
Introduction
La demande croissante de tous les produits alimentaires a conduit à une augmentation
de leurs quantités et leurs variétés qui sont offertes aux consommateurs; des maladies graves
et même fatales dues à la consommation d'aliments contaminés par des agents pathogènes
qui ont un impact économique, mais surtout sur la santé publique (Francis et al., 1999).
Au cours de la dernière décennie, de nombreuses communications ont été publiées sur
l'utilisation de la biopréservation incluant l'examen de la production et la caractérisation de
différentes bactériocines de bactéries lactiques qui a montré que cette bactériocine produite
réduit le nombre ou inhibe la croissance des pathogènes dans les produits alimentaires
(Gravessen et al., 2004).
Puisque ces bactéries sont destinées à être utilisées sous forme de cultures de protection,
le motif d'inhibition, la sécurité et les propriétés fonctionnelles et technologiques de ces
bactéries devraient être examinés.
Objectifs de la thèse
Le but de cette thèse de doctorat est de contribuer à la compréhension du phénomène
impliqué dans la production des bactériocines produites par Leuconostoc mesenteroides
pour diminuer la contamination des produits alimentaires tant que le lait par les espèces de
Listeria.
Nos principaux objectifs résident dans :
1-
La sélection des souches de Leuconostoc mesenteroides qui produisent des
substances antimicrobiennes ayant un effet inhibiteur sur Listeria spp.
2-
L’optimisation de la production de ces substances.
3-
L’évaluation de l’activité anti-listerial et leur potentiel d’utilisation dans les
produits alimentaires par la représentation complète de la caractérisation de leurs profils
génétiques, technologiques et probiotiques.
2
Synthèse bibliographique
1. Généralités sur le dromadaire
Le dromadaire occupe une place de choix dans les zones arides et semi-arides, en raison
de son excellente adaptation aux mauvaises conditions de vie, tels que le manque d'eau et de
pâturage; mais malgré tout cela, il est apte à produire un lait de bonne qualité (Mahboub et al.,
2010).
1.1.
Origine du dromadaire
Le nom « dromadaire » dérive du terme grec « dromados » qui veut dire course. Il
existe deux espèces: la première est Camelus dromedarius: elle est donnée à l’espèce de
chameau à une seule bosse, appartenant au genre Camelus de la famille des Camelidae et dont
le nom scientifique est Camelus dromedarius; la deuxième est camelus bactrianus (deux
bosses).
Le dromadaire vit dans les régions chaudes, arides et semi-arides de la planète.
Il est le plus ancien fossile de Camelidae (Dick et al., 2011).
1.2.
Taxonomie et race
La taxonomie du dromadaire selon Wilson (1984) est la suivante:
Règne :
Animalia
Embranchement :
Chordata
Classe :
Mammalia
Ordre :
Artiodactyla
Sous ordre :
Tylopoda
Famille :
Camelidae
Sous famille :
Camelinae
Genre :
Camelus
Espèce :
dromedarius
Figure 1: L’espèce Camelus dromedarius
L’espèce Camelus dromedarius, communément appelé dromadaire ou chameau à une
bosse se distingue par son aire de répartition géographique. Les différentes races de
dromadaire se présentent sur la carte illustrée dans la Figure 2.
3
Synthèse bibliographique
Figure 2: Répartition des principales races de dromadaires en Afrique du Nord (Vroum,
2007)
1.3.
Répartition géographique des dromadaires
1.3.1. Distribution dans le monde
Il est difficile de connaitre avec exactitude la population caméline mondiale, cela est lié
à plusieurs facteurs comme l’absence de vaccination obligatoire pour cette espèce et la nature
même des écosystèmes dans lesquels elle évolue, ce qui rend difficile le recensement de ces
effectifs. Les chiffres proposés par la FAO s’appuient sur des estimations qu’un recensement
exhaustif.
La répartition mondiale de l’espèce caméline est fortement inégale, et elle est confinée
dans la ceinture des zones tropicales et subtropicales sèches de l’Afrique, de l’Ouest du
continent asiatique et du Nord-Ouest de l’Inde (Figure 3). Une implantation massive de
dromadaires a été faite au siècle dernier en Australie, des introductions très ponctuelles ont
également été réalisées aux États-Unis, en Amérique Centrale, en Afrique du Sud et en
Europe (Wilson et al., 1990).
4
Synthèse bibliographique
Figure 3: production du lait de chamelle dans le monde (FAO, 2009).
1.3.2. Distribution en Afrique
Près de 80% de la population de dromadaire se situe en Afrique. Les pays de la Corne
de l’Afrique (Somalie, Soudan, Éthiopie, Kenya, Djibouti) abritent seuls 60% du cheptel
camelin mondial. La Somalie contient environ 6,5 millions de dromadaires, ce qui est proche
de 50% du cheptel africain (Faye, 1997). La carte de la Figure 4 présente plus de détails.
Figure 4: distribution des dromadaires en Afrique (Ould Ahmed, 2009).
5
Synthèse bibliographique
1.3.3. Distribution en Algérie
Selon les derniers recensements effectués en 2013 par le ministère Algérien de
l’agriculture et du développement rural, l’espèce cameline se situe fortement au sud du Sahara
Algérien (Anonyme, 2013) (Tableau 1).
Tableau 1: nombre de têtes de dromadaire par Wilaya d’Algérie (Anonyme, 2013).
Wilaya
Tête
Wilaya
Tête
Wilaya
Tête
ADRAR
46 998
DJELFA
6 440
ILLIZI
31 182
CHLEF
0
JIJEL
0
B.B.ARRERIDJ
0
LAGHOUAT
1 950
SETIF
0
BOUMERDES
0
O.E.BOUAGHI
0
SAIDA
0
EL TAREF
0
BATNA
43
SKIKDA
0
TINDOUF
51 342
BEJAIA
0
S.B.ABBES
0
TISSEMSILT
0
BISKRA
3 025
ANNABA
0
EL OUED
36 700
BECHAR
24 320
GUELMA
0
KHENCHLA
0
BLIDA
0
CONSTANTINE 0
SOUK AHRAS
0
BOUIRA
0
MEDEA
0
TIPAZA
0
TAMENRASSET 85 745
MOSTAGANEM 0
MILA
0
TBESSA
410
MSILA
1 620
AIN DEFLA
0
TLEMCEN
0
MASCARA
0
NAAMA
1 013
TIARET
230
OUARGLA
31 787
A.TEMOUCHENT 0
TIZI OUZOU
0
ORAN
0
GHARDAIA
11 150
ALGER
0
EL BAYADH
10 060
RELIZANE
0
1.4.
Dromadaire à vocation lait
Les chamelles laitières sont caractérisées généralement, par une production laitière
supérieure à 2500 litres/lactation. Le Tableau 2 résume des caractéristiques de quelques races
laitières.
Tableau 2: Exemples de races camelines laitières (Wardeh, 2004).
Race
Challageea
Fakhreya
Hoor
Ouled sidi cheikh
Rachaida
Sirtawi
Pays d’élevage
Soudan
Libye
Somalie
Algérie, Maroc, Mauritanie
soudan
Libye
6
Production (kg)
2000-3000 par lactation
3500 par lactation
800–2800 par lactation
2000-3500 par 305 jrs
2000-3000 par lactation
3000-4000 par 305 jrs
Synthèse bibliographique
Dans notre pays, l’Algérie, le nombre de tête des chamelles laitières sont en
augmentation chaque année, d’un total de 150 960 têtes en 2003 à 197 830 têtes en 2013. La
réparation géographique des chamelles laitières est présentée dans la Figure 5.
Figure 5: Répartition géographique des chamelles laitières en Algérie (Anonyme, 2013)
1.4.1. Production laitière mondiale
La population mondiale des dromadaires est estimée à 20 millions de têtes dont
les femelles laitières représentent 18 % avec une production moyenne de 1500 litres par an, la
production mondiale en lait de chamelle serait de l'ordre de 5.4 millions de tonnes dont 55 %
environ sont prélevées par les chamelons, les productions individuelles varient entre
1000 et 2700 litres par lactation en Afrique, mais peuvent atteindre 7 000 à 12 000
litres selon certaines sources en Asie du Sud (Faye, 2003).
1.4.2. Production laitière en Algérie
La production laitière cameline en Algérie est estimée à 43 725 litres en 2013
(Anonyme, 2013) comparés à 39 668 litres en 2003, le tableau suivant représente en détail la
production laitière des chamelles par Wilaya.
7
Synthèse bibliographique
Tableau 3: la production laitière cameline par Wilaya d’Algérie en 2013
Wilaya
Productio
Wilaya
Productio
Wilaya
n lait
n lait
ADRAR
7 759
DJELFA
1 035
ILLIZI
CHLEF
JIJEL
B.B.ARRERIDJ
LAGHOUAT
4 212
SETIF
BOUMERDES
O.E.BOUAGHI SAIDA
EL TAREF
BATNA
SKIKDA
TINDOUF
BEJAIA
S.B.ABBES
TISSEMSILT
BISKRA
1 440
ANNABA
EL OUED
BECHAR
5 113
GUELMA
KHENCHLA
BLIDA
CONSTANTIN SOUK AHRAS
E
BOUIRA
MEDEA
TIPAZA
TAMENRASSE 14 782
MOSTAGANE MILA
T
M
TBESSA
MSILA
AIN DEFLA
TLEMCEN
MASCARA
NAAMA
TIARET
OUARGLA
3 996
A.TEMOUCHEN
T
TIZI OUZOU
ORAN
GHARDAIA
ALGER
EL BAYADH
160
RELIZANE
Productio
n lait
5 111
11 480
927
528
2 108
-
2. Généralités sur le lait
Le lait est un produit naturel sécrété par les mammifères. À la fois aliment et boisson, il
est donc d’un grand intérêt nutritionnel et se prête à de nombreuses applications culinaires,
industrielles et technologiques. (Fredot, 2009).
C'est en 1909 que le Congrès international de la Répression des Fraudes a défini ainsi le
lait: "Le lait est le produit intégral de la traite totale, il est ininterrompu d'une femelle laitière
bien portante, bien nourrie et non surmenée. Il doit être recueilli proprement et ne pas contenir
de colostrum".
Le lait destiné à la consommation ne pourra être mis en vente que s'il provient
de femelles laitières en parfait état sanitaire. Cela signifie que le lait provenant d'animaux non
reconnus ne peut être considéré comme propre à la consommation humaine en nature (Fall,
1997).
8
Synthèse bibliographique
2.1.
Lait de chamelle
2.1.1. Caractéristiques organoleptiques et physicochimiques du lait
camelin
Le lait est un liquide blanc mat en raison notamment de la structure et de la
composition de sa matière grasse, relativement pauvre en β-carotène, légèrement visqueux. Il
a un gout assez doux, légèrement sucré, avec un goût acide, parfois même salé (Abdel-Rahim,
1987) et/ou amer (Ramet, 2003). Cette variabilité dans le goût est liée au type de fourrage
ingéré ainsi qu'à la disponibilité en eau (Wangoh et al, 1998). À la traite et lors des
transvasements, il forme une mousse abondante. Comparé au lait de vache, le lait de chamelle
s’acidifie très peu. Il peut être conservé longtemps sans réfrigération (3 jours à 30°C et 2
semaines à 7°C) (Senoussi, 2011).
Sa composition et ses caractéristiques physicochimiques varient sensiblement au cours
de la période de lactation, de la traite ou de l'allaitement de la chamelle. Elles sont aussi
tributaires de la nature de l’alimentation (Ouadghiri, 2009).
Le pH du lait camelin se situe autour de 6,6 et l’acidité est de l’ordre de 15°Dornic. Sa
densité oscille entre 0,99 et 1,034 avec une viscosité moyenne de 2,2 centipoises (Siboukeur,
2007).
2.1.2. Propriétés nutritionnelles du lait camelin
Le lait de chamelle présente des teneurs importantes et équilibrées en nutriments de
base. Ce lait présente des taux de protéines variant de 2,5 à 4,5%. Les teneurs en
matière grasse dans ce lait sont estimées en moyenne à 3,15%. La matière grasse cameline est
caractérisée par la richesse en acide gras mono-insaturé à longue chaine (acide stéarique et
oléique). Le lactose constitue le sucre principal dans le lait. Sa concentration dans le
lait camelin varie de 2,8 à 5,8%. Par ailleurs, les grandes concentrations en vitamine et
en minéraux font de ce lait un véritable aliment à finalité diététique. À ce propos le
lait de chamelle présente de faibles teneurs en vitamine A et B2 par rapport au lait de
vache et de fortes teneurs en vitamine E et B1 dans le colostrum tandis qu’il présente un
apport important en vitamine C (Siboukeur, 2012).
9
Synthèse bibliographique
2.1.3. Caractéristiques microbiologiques du lait camelin
Le lait d'un animal est parfaitement saint quand il est trait aseptiquement, il est
normalement dépourvu de microorganismes. À la sortie de la mamelle le nombre de germes
est très faible généralement inférieur à 5000 germes/ml (Anonyme, 1993).
À la sortie de la mamelle, le lait est à la température de l'animal (37 °C). Malgré cette
condition favorable à la multiplication de nombreux germes, celle-ci est inexistante pendant
les quelques heures qui suivent la traite, en raison du pouvoir bactériostatique du lait frais.
Dans la mesure où l'on dispose des moyens nécessaires, il est hautement
souhaitable de profiter de cette période pour refroidir le lait afin de ralentir la
prolifération des microorganismes dès la phase bactériostatique passée (Anonyme, 1993).
Pour certaines espèces microbiennes, le lait de chamelle constitue un bon milieu de
culture, ce qui leur permet de s'y développer. Parmi les genres appartenant qui y vive, on cite
les
Streptococcus
(ou
Lactococcus),
les
Lactobacillus, les
Leuconostocs
et
les
Bifidobacteriums.
2.1.4. Système protecteur du lait camelin
Le lait de chamelle possède un effet antimicrobien contre les bactéries GRAM
positif et GRAM négatifs, parmi ces bactéries on trouve Escherichia coli, Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus et Salmonella typhimurium. Cette activité est
attribuée à la présence dans le lait de chamelle de substances antimicrobiennes telles que le
lysozyme,
le
peroxyde
d’hydrogène,
la
lactoferrine,
la lactoperoxydase
et
les
immunoglobulines. L’activité antimicrobienne du lait de chamelle est en moyenne supérieure
à celle du lait de la vache. La quantité de lysozyme, lactoferrine et immunoglobulines dans ce
lait est supérieure à celle de lait bovin (Souid, 2011).
10
Synthèse bibliographique
3. Les bactéries lactiques
Décrites pour la première fois par Orla-Jensen au début du XXe siècle, les
bactéries lactiques (LAB) constituent un groupe hétérogène, qui n’est pas clairement
défini du point de vue taxonomique.
Les LAB rassemblent en effet un certain nombre de genres qui se caractérisent par la
production, liée à un métabolisme exclusivement fermentaire, de quantités importantes
d’acide lactique à partir des sucres. La fermentation est dite : homolactique si l’acide
lactique est pratiquement le seul produit formé et hétérolactique si d’autres composés sont
aussi présents (acide acétique, éthanol, CO 2 …etc.) (Leveau et Bouix, 1993 ; Pilet et al.,
2005).
Elles sont Gram positif, généralement immobiles, asporulées, catalase négative,
oxydase négative
généralement
nitrate
réductase
négative, ce
sont
des
bactéries
anaérobies facultatives. Elles ont des exigences nutritionnelles complexes pour les acides
aminés, les peptides, les vitamines, les sels, les acides gras et les glucides fermentescibles
(Dellaglio et al., 1994 ; Hogg, 2005).
3.1.
Habitat et origine des bactéries lactiques
Les bactéries lactiques sont très fréquentes dans la nature. Elles se trouvent
généralement associées à des aliments riches en sucres simples. Elles peuvent être isolées du
lait, du fromage, de la viande, des végétaux. Elles se développent avec la levure dans le vin, la
bière et le pain. Quelques espèces colonisent le tube digestif de l’homme et des animaux
(Hassan et Frank, 2001).
3.2.
Taxonomie des bactéries lactiques
Depuis la description du Bacterium lactis (actuellement Lactococcus lactis), la
taxonomie des bactéries lactiques est en évolution permanente. Le nombre de nouvelles
espèces a augmenté énormément au cours de ces dix dernières années. Les réorganisations
effectuées ont contribué à fusionner des espèces en une seule, ou identifier une espèce
comme un nouveau genre (Pot, 2008).
11
Synthèse bibliographique
La
classification des bactéries lactiques peut se faire
selon des critères
phylogénétiques par l’utilisation des méthodes moléculaires. Cependant, la caractérisation
phénotypique /biochimique classique demeure pratique dans l’identification préliminaire
des
microorganismes.
Certaines caractéristiques
phénotypiques
sont
utilisées
pour
identifier les espèces à l'intérieur des genres comme la capacité à : fermenter les hydrates
de carbone, tolérer différentes concentrations en bile, produire
des
polysaccharides
extracellulaires, exiger des facteurs de croissance, produire de l’acétoïne et synthétiser
certaines enzymes. La composition en G+C de l’ADN, la composition en acides gras, la
mobilité électrophorétique de la lactate déshydrogénase sont également d'autres critères
qui peuvent être étudiés pour l'identification des espèces lactiques (Vandamme, 1996).
La morphologie est considérée comme la caractéristique clé pour décrire et classifier les
genres des bactéries lactiques. De ce fait, les bactéries lactiques peuvent être divisées
arbitrairement en bacilles (Lactobacillus et Carnobacterium) et coques (tous les autres
genres). Le genre Weissella, récemment décrit, est le seul genre qui comporte à la fois des
bacilles et des coques (Collins et al., 1993).
À
ce
groupe
de
bactéries
lactiques,
Aerococcus, Atopobium, Carnobacterium,
Leuconostoc,
appartient
Enterococcus,
plusieurs
genres
Lactobacillus,
comme
Lactococcus,
Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et
Weissella. (Stiles et Holzapfel, 1997 ; Pot, 2008). Des genres nouveaux, par exemple
Alloiococcus,
Dolosicoccus,
Dolosigranulum, Eremococcus, Facklamia, Globicatella,
Helococcus, Ignavigranum et Lactosphaera, ont également été décrits, comportant des
souches qui montrent des liens physiologiques et phylogénétiques avec les groupes des
bactéries lactiques (Broadbent, 2001 ; Axelsson, 2004).
Le genre Bifidobacterium est actuellement considéré par plusieurs auteurs comme
genre de bactéries lactiques, bien qu’il se distingue par un pourcentage en G+C de 55%,
largement supérieur à celui des autres genres et par une voie métabolique de fermentation des
sucres particulière. Les études phylogénétiques basées sur l’analyse des séquences des
ARN ribosomiques ont confirmé l’appartenance de ces différents genres à un même
groupe qui inclut également Clostridium, Bacillus et Propionibacterium (Pilet et al., 2005).
12
Synthèse bibliographique
3.3.
Caractéristiques des principaux genres des bactéries lactiques
3.3.1. Le genre Lactobacillus
Lactobacillus est le genre principal de la famille des Lactobacillaceae, il contient de
nombreuses espèces qui sont des agents de fermentation lactique intervenant dans de
nombreuses industries ou qui sont rencontrées comme contaminants. Il s’agit de bacilles
longs et fins (parfois incurvés) souvent groupés en chaines, immobiles, asporulés, catalase
négative, se développent à un optimum de température situé entre 30 et 40°C. Les
lactobacilles ont des exigences nutritionnelles très complexes en acides aminés, en
vitamines, en acides gras, en nucléotides, en glucides et en minéraux (Khalid et Marth,
1990 ; Leclerc et al., 1994).
3.3.2. Le genre Lactococcus
Le genre Lactococcus (streptocoque du groupe N) représente les streptocoques dits
«lactiques», car ils sont associés à de nombreuses fermentations alimentaires et ne
possèdent aucun caractère pathogène. Les produits végétaux constituent leur réservoir
principal, mais ils sont largement présents dans le lait et les produits laitiers (Pilet et al.,
2005).
Les lactocoques se présentent sous forme de coques en paire ou en chaines de longueur
variable. Ce sont des bactéries anaérobies facultatives homofermentaires ne produisant que de
l’acide lactique L(+), seul Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis produit le
diacétyle. Leur température optimale de croissance est proche de 30°C, capable de se
développer à 10°C, mais pas à 45°C.
Quelques espèces produisent des exopolysaccharides et des bactériocines. Elles sont
capables de se développer à 3% de bleu de méthylène et d’hydrolyser l’arginine (Tamime,
2002).
Actuellement, le genre Lactococcus comprend cinq espèces, Lactococcus lactis est
l’espèce la plus connue avec ses trois sous-espèces : Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp.
cremoris et Lc. lactis subsp. hordniae (Pot et al., 1996 ; Pot, 2008).
13
Synthèse bibliographique
3.3.3. Le genre Streptococcus
Le genre Streptococcus est toujours large et la classification est très mouvementée.
Ce genre est généralement divisé en trois groupes : pyogène (la plupart des espèces
pathogènes et hémolytiques), oral (tel que St. salivarius, St. bovis) et les autres streptocoques
(Scheilfer, 1987).
La seule espèce de streptocoques qui soit utilisée en technologie alimentaire est
Streptococcus thermophilus qui a été incluse dans le groupe des «autres streptocoques», mais
ensuite transféré au groupe des streptocoques oraux à cause de leur degré d’homologie avec
l’ADN de Streptococcus salivarius (Stiles et Holzapfel, 1997).
Streptococcus thermophilus se différencie par son habitat (lait et produits laitiers) et son
caractère non pathogène. La résistance à la température, la capacité de croitre à 52°C et le
nombre limité des hydrates de carbone permettent de distinguer les St. thermophilus de la
plupart des autres streptocoques (Pilet et al., 2005).
3.3.4. Le genre Enterococcus
Ce genre regroupe les streptocoques fécaux qui représentent une hémolyse de type
λ et β et qui appartiennent au groupe D. Ce sont des commensaux de l’intestin. Les
espèces rencontrées dans l’alimentation sont essentiellement En. faecalis et les espèces
proches. Les entérocoques sont des coques qui peuvent être mobiles, homofermentaires,
généralement différenciés par la fermentation de l’arabinose et le sorbitol, ils croissent entre
10°C et 45°C (Tamime, 2002).
3.3.5. Les genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella
Ils ressemblent les coques lenticulaires en paires ou en chainettes mésophiles, qui
possèdent un caractère hétérofermentaire marqué, avec production d’acide lactique
(isomère D), de CO2 et d’éthanol. Les caractéristiques telles que l’hydrolyse de
l’esculine, la formation de dextrane, les conditions de croissance, la capacité à croitre
à différents pH et température, l’assimilation de citrate et/ou malate permettent la
différenciation entre les genres Leuconostoc et Weissella (Ho et al., 2007).
14
Synthèse bibliographique
Actuellement, le genre Leuconostoc comprend quatorze espèces, ils sont également
anaérobies facultatifs et exigeants au point de vue nutritionnel et leur croissance est
toujours lente. Le développement des Leuconostoc entraine souvent l’apparition d’une
viscosité dans le milieu grâce à la production des exopolysaccharides. Les Leuconostocs
principalement Ln. mesenteroides ssp.cremoris et Ln. lactis sont utilisés en association avec
les lactocoques dans l’industrie laitière pour produire en plus de l’acide lactique et le CO2,
des substances aromatiques telles que le diacétyle et l’acétoïne à partir des citrates du lait
(Ogier et al., 2008).
Récemment, l’espèce Leuconostoc oenos isolée de vins a été classée dans un
nouveau genre, Oenococcus oeni et certaines espèces de lactobacilles hétérofermentaires
ont été groupées avec Leuconostoc paramesenteroides dans le nouveau genre Weissella
(Stiles et Holzapfel, 1997).
3.3.6. Les genres Pediococcus et Tetragenococcus
Les Pediococcus sont des coques homofermentaires dont la particularité est le
regroupement en tétrade. Ils sont mésophiles, le plus souvent incapables d’utiliser le
lactose, et leur développement nécessite la présence de divers facteurs de croissance.
Certaines espèces se distinguent par leur capacité à se développer à des teneurs en sels
très
élevées, comme Pediococcus halophilus, renommé Tetragenococcus halophilus et
Tetragenococcus muriaticus qui tolère jusqu’à 18% de NaCl (Pilet et al., 2005).
Les espèces de Tetragenococcus ont un rôle crucial dans la fabrication des produits
alimentaires à concentration élevée en sel comme les sauces de soja, alors que les
pediocoques sont parfois utilisés comme levains lactiques pour les charcuteries
(Tosukhowong et al., 2005).
3.3.7. Le genre Bifidobacterium
Le genre Bifidobacterium est considéré comme faisant partie du groupe des
bactéries lactiques grâce à la similarité de ses propriétés physiologiques et biochimiques et à
sa présence dans le même habitat écologique, tel que le tube gastro-intestinal. Ces
microorganismes sont phylogénétiquement sans rapport
avec ces dernières.
Ils
sont
davantage liés au phylum Actinobacteria (anciennement Actinomycètes) des bactéries
Gram positif dont l’ADN est à haut pourcentage de G +C. Les bifidobactéries se
15
Synthèse bibliographique
caractérisent par leur forme très irrégulière souvent en forme V, mais pouvant être coccoïdes,
la présence d'une enzyme, la fructose-6-phosphate phosphocétolase, celle-ci leur permet de
fermenter les hexoses en produisant de l'acide acétique et de l'acide lactique. Leur température
de croissance varie de 36°C à 43°C (Axelsson et al., 2004).
3.4.
Les propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques
Les propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques peuvent être associées à
de nombreux éléments. Elles résultent de l’effet combiné de différents facteurs
biologiques provenant de leurs activités métaboliques.
3.4.1. Le pH et les acides organiques
Les produits principaux du métabolisme des bactéries lactiques sont les acides
organiques qui sont produits soit par la voie homofermentaire, soit par la voie
hétérofermentaire. Le métabolisme du pyruvate conduit à la formation uniquement
d’acide lactique chez les homofermentaires tandis qu’il conduit à la formation d’acide
lactique, acétique et formique, d’éthanol et de dioxyde de carbone chez les hétérofermentaires
(Liu, 2003).
Grâce à cette production d’acides organiques, les bactéries lactiques diminuent le pH du
milieu dans lequel elles se multiplient en inhibant une partie de la flore qui s’y développe.
Les acides organiques sont un des agents classiques de préservation des aliments (Brul
et al.,1999) et sont reconnus comme des additifs alimentaires. Les acides couramment utilisés
sont les acides benzoïque, sorbique, acétique, fumarique, propionique et lactique. Ils
sont utilisés pour prévenir ou retarder la croissance des bactéries dégradant la nourriture
(Hsiao et al., 1999). Le principal problème consécutif à leur utilisation est la haute
concentration nécessaire pour inhiber les bactéries pathogènes ou indésirables et qui est
parfois inacceptable pour le consommateur (Kobilinsky et al., 2007).
La concentration inhibitrice minimale, qui est la plus petite quantité d’acide qui peut
empêcher la croissance d’un microorganisme, de chacun de ces acides doit être
déterminée dans des conditions précises de pH, mais aussi d’activité d’eau, de
température…(Hsiao et al., 1999). Elle varie avec chaque microorganisme à inhiber.
16
Synthèse bibliographique
Hsiao et al. (1999) ont montré qu’une concentration en acide acétique de 0,105 g/l inhibe la
croissance de Bacillus subtilis à un pH de 5,3 alors qu’il faut une concentration de
27,5 g/l pour inhiber Lactobacillus plantarum et une concentration de 1,6 g.l-1 pour
inhiber Escherichia coli dans les mêmes conditions. Listeria monocytogenes est inhibé par
de l’acide lactique à 9,0 g/l et un pH de 3,7 tandis qu’il l’est à un pH de 3,4 par l’acide
chlorhydrique à la même concentration (Gravesen et al., 2004).
Les bactéries pathogènes peuvent développer certains mécanismes de résistance
appelés « acid tolerance response » vis-à-vis de l’exposition à des pH acides. Ceux-ci leur
sont également utiles pour survivre au transit intestinal. L. monocytogenes par exemple
peut survivre à une exposition de 60 minutes à un pH de 3 (Brul et Coote, 1999; Cotter et al.,
2003).
3.4.2. Le peroxyde d’hydrogène
Les bactéries lactiques ne possèdent pas de catalase typique contenant un noyau hème
pour dégrader le peroxyde d’hydrogène en oxygène et en eau. Il peut s’accumuler et
être inhibiteur de différents microorganismes par l’oxydation des lipides membranaires
et la destruction des structures des protéines cellulaires (Zalan et al., 2005). Certaines
bactéries lactiques peuvent néanmoins se protéger contre le peroxyde d’hydrogène qu’elles
produisent par la synthèse de catalase hexamérique ou tétramérique contenant du manganèse
et qui est parfois décrit comme étant des pseudocatalases (Strus et al., 2006). La
concentration de peroxyde d’hydrogène produite par des Lactobacilli varie entre 0,001 et 8
mM, en fonction de l’espèce, de la souche et des conditions de cultures (Sakamoto
et
al.,1998; Strus et al., 2006). Son action se manifestera aussi bien sur les germes
indésirables que sur ceux qui sont indispensables
au bon déroulement de la
fermentation. Il est donc rarement utilisé pour son activité inhibitrice. D’autre part, son action
oxydante peut avoir un effet néfaste sur la santé humaine (Zalan et al., 2005).
3.4.3. Le dioxyde de carbone
Celui-ci
est
formé
pendant
la
fermentation
hétérolactique
et
crée
un
environnement anaérobie qui inhibe les microorganismes aérobies. L’accumulation de
dioxyde de carbone dans la bicouche lipidique peut causer un dysfonctionnement de la
perméabilité (Ammor et al., 2006).
17
Synthèse bibliographique
3.4.4. Le diacétyl
Il est synthétisé par différents genres de bactéries lactiques comme Lactococcus
sp., Leuconostoc sp., Lactobacillus sp. et Pediococcus sp. Le diacétyl (C4H6O2) est un
des composants aromatiques essentiels du beurre. Il a des propriétés antimicrobiennes
qui sont dirigées contre les levures, les bactéries Gram négatif et les bactéries Gram
positif non lactique, ces dernières y sont néanmoins moins sensibles (El Ziney et al.,
1998). Les concentrations nécessaires à l’obtention d’une inhibition sont de l’ordre de 100
ppm, et sont supérieures à celles présentes dans le beurre et susceptibles de provoquer son
arôme (2 à 7 ppm) (Caplice et al., 1999).
3.4.5. La reutérine
La reutérine (ou 3-hydroxypropionaldehyde) est une substance antimicrobienne qui est
produite comme métabolite intermédiaire pendant la fermentation anaérobique du glycérol par
certaines espèces de Lactobacillus (El-Ziney et al., 1998). La fermentation du glycérol se
déroule en deux étapes. Le glycérol sera tout d’abord déshydraté par une «glycerol
deshydratase» pour former de la reutérine qui sera ensuite réduite en 1,3-propanediol par une
oxydoréductase. Cette deuxième étape est inhibée en l’absence de glucose. La reutérine
s’accumule alors dans le microorganisme producteur. À haute concentration, elle est
excrétée dans le milieu. Sa toxicité contre la cellule productrice limite sa
production,
certaines espèces comme Lactobacillus reuteri y sont plus résistantes (Vollenweider,
2004).
3.4.6. Les bactériocines
Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont des substances
antimicrobiennes de poids moléculaire variable. Elles ont une activité inhibitrice dirigée
contre les bactéries proches de la souche productrice et leur spectre d’action est
généralement étroit. Les plus connues sont : la nisine, la diplococcine, l’acidophiline et la
bulgaricane (Dortu et Thonart, 2009). La plupart
des bactériocines produites par
les
bactéries lactiques partagent le même mode d’action, basé sur la formation de pores dans la
membrane de la bactérie cible (De Vuyst et Leroy, 2007 ; Kumari et al., 2009).
18
Synthèse bibliographique
4. Le genre Leuconostoc
Le genre Leuconostoc a été défini en 1878 par Vanthieghem. Le terme Leuconostoc
vient du mot Leucos qui veut dire blanc, claire, lumière et Nostoc qui est une algue bleue
mucilagineuse (cyanobactérie) ; le tout fera des algues incolores (Ogier et al., 2007).
4.1.
Historique
Les premières souches ont été isolées à partir d’accidents apparus dans les sucreries. Or
les Leuconostocs responsables de ces accidents produisent des dextranes et en milieu
saccharose, les chaines de coccis sont entourées d’une gaine bien distincte à l’examen
microscopique. Les travaux d’Orla-Jensen (1919) basé sur le type de l’acide lactique produit,
l’utilisation de l’arabinose et du caractère hétérofermentaire par Evans (1918), confirmés par
Garvie (1984) ont conduit à la séparation du genre Leuconostoc du genre Streptococcus.
4.2.
Habitat
Les souches de Leuconostoc sont présentes dans de nombreux environnements tels que
la végétation verte et les racines qui constituent leur niche écologique naturelle (Mundt,
1970). La présence des espèces, Ln mesenteroides, Ln lactis et Ln dextranicum, a été signalée
dans le lait de chamelle (Zarour et al., 2012 ; Chentouf et al., 2014 ; Benmechernene et al.,
2014). Ils peuvent facilement se propager dans diverses autres niches, tels que des légumes et
de l'ensilage (Ennahar et al., 2003) et dans les produits alimentaires fermentés (Tableau 7).
19
Synthèse bibliographique
Tableau 4: les différents environnements qu’occupe le genre Leuconostoc (Hemme et
Foucaud- Scheunemann, 2004)
Products
Dairy
Meat
Fish
Cereal
Foodstuff
Butter and cream cheese
cheeses
Raw material
Milk
Milk
Fermented
milk
(amasi, Milk
maziwa, lala, laban, filmjolk,
kefir, pindidam, smetanka,
etc)
Sausages
Meat
LAB,
mould
Malt, maize, corn,
rice, millet
international
LAB,
mould
Maize,
rice,
sorghum, tef
Europe
Africa
Southeast
Asia
Southeast
Asia
International
International
LAB, yeasts
Africa
LAB
Salami
Sauce
foods
(belacham,
chinchaluk, pekasam, somfak, etc)
Beverages
(beer,
boza,
bushera, idli, dadih, jangsu,
ogi, pozol, sobia, etc)
Dough
and
starchy
accompaniments (breas, flour,
mawe, puto, trahanas, etc)
Meat
Fish, schrimp
Sauce foods (tsauco, etc)
Rice, soybeans
cabbage
Olives, beetroot,
cabbage,
carrot,
cucumber, sweet
pepper
Dough
and
starchy Cassava, taro
accompaniments (agbelima,
flour, fufu, sapal, etc)
Cocoa
Coffee
Juices
Tempoyak
Kocho
Europe
Africa
Asia
Microorganisms
LAB
LAB,
yeasts,
mould
LAB, yeasts
Europe
Southeast
Asia
Europe
Southeast
Asia
Vegetables sauerkraut
Pickles, kimshi, sayur-asin
Fruit
Country
International
International
Durian fruit
Ensete ventricosa
20
yeasts,
LAB
LAB
yeasts,
LAB
LAB
LAB
New Guinea Yeasts, acetic acid
Central
bacteria, LAB
Africa
South
America
Central
LAB,
yeasts,
Africa
Enterobacteriaceae
South
America
South
LAB
America
International
South East LAB
Asia
LAB
Africa
Synthèse bibliographique
4.3.
Classification
Aujourd'hui, les caractères moléculaires, particulièrement ceux basés sur des analyses
d'acide nucléique, sont considérés de plus en plus dans la classification et l'identification. Les
nouveaux outils moléculaires ont mené à des changements cruciaux pour le genre
Leuconostoc. Seulement quatre espèces de Leuconostoc sont incluses dans le Manuel de
Bergey de Bactériologie systématique (Garvie, 1986). Récemment, l’espèce Leuconostoc
oenos isolée du vin a été classé dans un nouveau genre, Oenococcus oeni et certaines espèces
de lactobacilles hétérofermentaires ont été groupées avec Leuconostoc paramesenteroides
dans le nouveau genre Weissella (Stiles et Holzapfel, 1997).
Plusieurs changements dans la classification et la taxonomie des espèces de genre
Leuconostoc ont été faits dans les dix dernières années, et de nouvelles espèces ont été
décrites.
Le genre Leuconostoc comprend Ln. mesenteroides (avec les trois sous-espèces,
mesenteroides, dextranicum et cremoris) et 13 autres espèces (Tableau 8), Ln. citreum, Ln.
carnosum, Ln. durionis, Ln. fallax, Ln. ficulneum, Ln. pseudoficulneum, Ln. fructosum, Ln.
gasicomitatum, Ln. gelidum, Ln. inhae, Ln. kimchii, Ln. lactis, Ln. pseudomesenteroides (Kim
et al., 2003).
21
Synthèse bibliographique
Tableau 5: Les espèces incluent dans le genre Leuconostoc (Hemme et FoucaudScheunemann, 2004)
Espèces de Leuconostoc
Précédente nomenclature
Références
Garvie (1986)
Ln. mesenteroides
subsp. cremoris
subsp. dextranicum
subsp. mesenteroides
Ln. lactis
Garvie (1986)
Ln. pseudomesenteroides
Farrow et al. (1989)
Ln. carnosum
Shaw et Harding(1989)
Ln. gelidum
Shaw et Harding(1989)
Ln. fallax
Martinez et Collins (1991)
Ln. citreum
Ln. amelibiosum
Takahashi, et al. (1992)
Ln. argentinum
Dicks, et al. (1993)
Ln. pseudoficulneum
Euzeby (1997)
Ln. gasicomitatum
Bjorkroth et al. (2000)
Ln. kimchi
Kim, et al. (2000)
Ln. ficulneum
Antunes et al. (2002)
Ln. fructosum
Lactobacillus fructosus
Antunes et al. (2002)
Kim, et al. (2003)
Ln. inhae
22
Synthèse bibliographique
4.4.
Caractérisation des Leuconostoc
Les corps cellulaires des Leuconostoc peuvent être sphériques, mais souvent
lenticulaires, surtout lorsqu’ils sont cultivés sur milieu gélosé. Ils sont Gram positifs, non
mobiles, non sporulées et sont anaérobies facultatifs; leur optimum de température de
croissance se situe entre 20 et 30°C. Ils sont chimio-organotrophes, nécessitant pour se
développer des milieux riches comportant des facteurs de croissance complexes et des acides
animés; pour se développer, toutes les espèces de Leuconostoc ont besoins de l’ensemble de:
acide nicotinique, thiamine, biotine, acide pantothénique (ou l’un de ces dérivés) (Garvie,
1986). La croissance ne se fait qu’en présence d’un sucre fermentescible.
Les souches de Leuconostoc ne possèdent ni catalase ni cytochromes. Ils ne produisent
pas de NH3 à partir de l’arginine. Le lait n’est en général ni acidifié ni coagulé. Ces germes
sont non protéolytiques, ne produisent pas d’indole et ne réduisent pas les nitrates. Ils sont
non hémolytiques et non pathogènes pour les végétaux et les mammifères (Holzapfel et
Schillinger, 1992).
Leur taille est approximativement 0,5–0,7 x 0,7–1,2 µm. Les cellules sont arrangées en
paires ou en chaines. Dans les milieux de culture pendant la phase active de croissance, elles
sont souvent en chaines courtes, tandis que dans leur environnement naturel et en conditions
plus stressantes les chaines sont plus longues. La plupart de ces bactéries se développent entre
20°C et 30°C, c’est l’intervalle optimum de la température. Le pH initial du milieu de
croissance est de 6,5 et chute à 4,4–5,0 pendant la culture due à la production d'acide.
L'espèce acidophile Oenococcus oeni se développe mieux dans un milieu à pH de départ de
4,8 (Damelin et al., 1995).
Les espèces de Leuconostoc participent dans la fermentation et l’amélioration de
l’aliment par la saveur et la texture par la production des composés aromatiques, production
de dextrane (Hemme, et Foucaud-Scheunemann, 2004).
23
Synthèse bibliographique
Tableau 6: Les caractères distinctifs des espèces du genre Leuconostoc (Garvie, 1986).
Caractères
D-xylose
Arabinose
Cellulose
Fructose
Lactose
Saccharose
Tréhalose
Hydrolyse de l’esculine
Formation de dextrane
Croissance à pH 4,8
Croissance éthanol 10 %
Acetoine (Citrate)
GC %
G-6 PDH (NAD)
Besoin TJF
(1)
+
+
v
+
v
+
+
v
+
39
+
-
(2)
v
v
+
v
+
+
+
+
37
+
-
(3)
v
+
38
+
-
(4)
v
v
v
+
v
+
+
v
v
39
+
-
(5)
+
v
+
44
+
-
(6)
v
v
+
+
+
+
+
39
+
Leuconoctoc mesenteroïdes subsp mesenteroïdes ; (2) Leuconoctoc mesenteroïdes subsp.
dextranicum, (3) Leuconoctoc mesenteroïdes subsp cremoris ; (4) Leuconoctoc paramesenteroïdes ;
(5) Leuconoctoc lactis ; (6) Leuconostoc oenos ; (v) Caractère variable ; (+) Caractère positif ; (-)
Caractère négatif ; G-6 -PDH = Glucose 6 Phosphate déhydrogénase ; TJF = Tomato juice factor
(Glucopanthoténate).
4.5.
Le pouvoir antimicrobien des Leuconostoc
L’effet antimicrobien dû aux bactériocines produites par Leuconostoc sp. a été observé
pour la première fois dans les années 90 (Ahn et Stiles, 1990). Plus tard, différentes
bactériocines produites par Leuconostoc sp. ont été isolées, parmi lesquelles quelques-unes
ont été caractérisées. Parmi ces bactériocines, la leucocine A-UAL 187, produite par Ln.
gelidum A-UAL 187 (Hastings et al., 1991), la leucocine B-Ta11a produite par Ln. carnosum
Ta11a, la mésentéricine Y105 produite par Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides Y105
(Héchard et al., 1992),…. Depuis, de nouvelles bactériocines ont été et sont toujours en
découvertes (Sawa et al., 2010).
24
Synthèse bibliographique
La détermination des séquences peptidiques des bactériocines produites par
Leuconostoc sp. a permis de montrer qu’elles faisaient partie de la classe II et présentaient,
par conséquent, une activité antimicrobienne dirigée contre des bactéries pathogènes incluant
en particulier Listeria sp. (Stiles, 1994). Ceci pourrait peut-être aussi être le cas de
bactériocines isolées de bactéries du genre Leuconostoc, mais pas encore caractérisées comme
la kimchicine par exemple (Chang et al., 2007).
Les bactéries du genre Leuconostoc renfermaient un ou plusieurs plasmides de
différentes tailles. Ces plasmides portent différents systèmes génétiques parmi lesquels celui
impliqué dans la biosynthèse des bactériocines (Dessart et Steenson, 1995, Fremaux et al.,
1995).
4.6.
Résistances aux conditions de stress
Leuconostoc sp. sont capables de survivre pour une longue durée dans des
environnements défavorables aussi divers que le sucre, l’huile ou les industries laitière
industries. Les conditions ambiantes hostiles favorisent les phénomènes d'interaction à travers
la formation de boue ou de glycocalyx en présence de saccharose et d'oligoéléments, ce qui
entraine un biofilm, qui protège les cellules contre les agents nuisibles (Kim, Thomas, et
Scott- Fogler, 2000).
L’homéostasie du pH interne est essentielle pour la croissance et la survie de tous les
microorganismes y compris les Leuconostoc mais la croissance bactérienne est un processus
d’auto-inhibition par l’acidification du milieu externe et l’accumulation d’acide (Cogan et
Jordan, 1994 ; Konings, 2002).
Les technologies de conservation, tels que la haute pression, qui combinent une
réduction efficace de germe avec une rétention maximale des propriétés chimiques et
physicochimiques
des
produits,
sont
actuellement
à
l'étude.
Les
traitements
d'homogénéisation à haute pression à 25°C pendant 15 min et une pression comprise entre
100 et 300 MPa ont montré que les bactéries à Gram positif, y compris Ln. mesenteroides sont
plus résistantes que les bactéries Gram négatifs ; c’est la structure du peptidoglycane qui
contribue probablement à sa résistance (Wuytack, Diels, et Michiels 2002).
25
Synthèse bibliographique
4.7.
Utilisation des souches de Leuconostoc dans l’industrie alimentaire
Parmi les bactéries lactiques les plus utilisées en industrie laitière figure le genre
Leuconostoc. Leur application est remarquée dans la production du beurre et des crèmes et
plusieurs autres produits laitiers (Vedamuthu, 1994). Leurs présence est régulièrement
rencontrer plusieurs variétés de fromage d’après Cogan et al. (1997). Une étude consacrer sur
la flore lactique de 35 fromages européens différents comprenant 14 fromages artisanaux a
révélé que parmi 4379, 10% de souche étaient des Leuconostoc, ce taux a été comparé aux
taux des lactobacilles (mésophile, 12% et thermophile, 14%). Et les entérocoques 17%. Ces
résultats confirment des données précédentes indiquant la présence du Leuconostoc dans la
majorité des fromages de lait cru (Devoyod et Poullain, 1998). Leuconostoc est présent dans
une grande variété de lait fermenté. Ces bactéries sont également parmi les composants du
grain de kéfir ; légèrement comparés aux levures, intervenant dans la production de l’éthanol
et de l’acétate (Robinson et al., 2002).
Les Leuconostoc jouent un rôle important dans la fermentation des produits alimentaires
varies. Pendant la fermentation, les produits finaux du métabolisme d’hydrate de carbone
contribuent non seulement à l’acidification, mais également à la saveur et à la texture du
produit. La fermentation peut également augmenter la qualité alimentaire du produit en
augmentant sa digestibilité, comme dans la fermentation du lait en fromage, ou en réduisant
sa toxicité (Gueguen et al., 1997).
5. Les bactériocines
5.1.
Historique
L'histoire de bactériocines s'étend au début des années 1920. Bien que leur activité
antimicrobienne ait été découverte en 1928, les bactériocines n'ont pas été utilisées dans les
produits alimentaires jusqu'en 1951. Dans les années 1960, la première bactériocine, appelée
nisine, qui est produite par Lactococcus lactis subsp. lactis, a été purifié et reconnu comme
agent de conservation alimentaire par la FAO / OMS en 1969. En 1988, la FDA a approuvé
l'utilisation de la nisine comme additif dans les produits en conserve aux États-Unis pour
inhiber la croissance de C. botulinum. En outre, les résultats d'études de recherche indiquent
que la résistance de L. monocytogenes à la nisine ne semble pas être stable (Benmechernene et
al., 2013).
26
Synthèse bibliographique
5.2.
Définition
Les bactériocines sont des substances antimicrobiennes de nature protéique dont
l'activité inhibitrice est dirigée contre des espèces taxonomiquement proches du
micro-organisme producteur (Tagg et al., 1976). La détection des bactériocines remonte à
1925 par André Gratia qui a observé que la croissance de certaines souches d'Escherichia coli
a été inhibée en présence d'un composé antibactérien, dont il a donné le nom de colicin V. La
colicin V a été caractérisée comme composé peptidique thermostable. Tagg et al., (1976)
suggéraient qu'un composé antimicrobien doit être considéré comme une bactériocine que
lorsqu'il satisfait aux critères suivants:
- L'activité des bactériocines doit disparaitre sous l'action des protéases.
- Un spectre d'inhibition étroit dirigé contre les espèces apparentées à la souche
productrice.
- La présence d'une fraction protéique biologiquement active.
- Un mode d'action bactéricide.
- Un site d'attachement (récepteurs) spécifique sur les cellules sensibles.
- La bactérie productrice synthétise une molécule qui la protège contre sa propre
bactériocine.
Les bactériocines sont codées par des plasmides.
Comme cette définition est restrictive et plusieurs substances inhibitrices ne peuvent
réunir tous ces critères, les mêmes auteurs ont proposé que les bactériocines produites par les
bactéries à Gram positif doivent être au moins des protéines biologiquement actives ayant une
action bactéricide contre les microorganismes qui leur sont sensibles.
Cette définition risque de changer puisqu'il est aujourd'hui admis que les bactériocines
peuvent avoir un spectre plus large incluant des espèces qui ne sont pas proches sur le plan
taxonomique du microorganisme producteur (Kim et al., 2003). Les bactériocines sont
produites par une vaste gamme d'espèces bactériennes et forment un groupe hétérogène de
souches productrices, à leurs spectres d'action antimicrobiens, leurs modes d'action et leurs
propriétés physicochimiques.
27
Synthèse bibliographique
5.3.
Classification
Les bactériocines des bactéries lactiques font l'objet d'une attention toute particulière
depuis une dizaine d'années en raison de l'intérêt tant fondamental qu'appliqué qu'elles
suscitent. D'après (Klaenhammer, 1993),
5.3.1. Classe I : Les lantibiotiques
Ce sont des peptides de taille inférieure à 5 kDa, stables à la chaleur et qui contiennent
des acides aminés inhabituels soufrés formés post-traductionnellement, comme la lanthionine,
la β-méthyl lanthionine, la déhydrobutyrine et la déhydroalanine. Les lantibiotiques
peuvent être divisés en deux types : la classe Ia qui comprend des peptides cationiques
hydrophobes allongés contenant jusqu'à 34 acides aminés et la classe Ib qui comprend les
peptides globulaires chargés négativement ou sans charge nette et contenant jusqu'à 19 acides
aminés (Twomey et al., 2002). Certains lantibiotiques sont par ailleurs constitués de
deux peptides agissant ensemble pour avoir une activité comme la lacticin 3147.
Les lantibiotiques interagissent avec la membrane cellulaire par des interactions
électrostatiques ou par la liaison à des récepteurs spécifiques telle que le lipide II
(undecaprenylpyrophosphoryl-MurNAc-pentapeptides-GlcNAc),
un
précurseur
du
peptidoglycane. Suite à cette liaison, les lantibiotiques peuvent former des pores larges et non
spécifiques dans la membrane cytoplasmique, ce qui va causer l'efflux rapide des petits
composés cytoplasmiques tels que les ions,
les
acides
aminés,
l'ATP,
etc.
Cette
augmentation de la perméabilité membranaire va conduire à la mort de la cellule (Twomey
et al.,2002 ; Bauer et al., 2005).
5.3.2. Classe II
Ce sont des peptides de taille inférieure à 10 kDa, stables à la chaleur, ne contenant pas
d'acides aminés modifiés. Leur point isoélectrique varie entre 8 et 10. Le tableau 4, présente
les séquences de quelques bactériocines appartenant à cette classe. Cette dernière est
subdivisée en trois sous-classes.
28
Synthèse bibliographique
- La sous-classe IIa. Ces bactériocines contiennent entre 27 et 48 acides aminés et
ont toute une partie N-terminale hydrophobe contenant la séquence consensus YGNGV ainsi
qu'un pont disulfure et une partie C-terminale moins conservée, hydrophobe ou
amphiphile qui détermine la spécificité d'action (Fimland et al., 2000). Elles ont toutes une
activité contre
Listeria
monocytogenes. Certaines bactériocines de cette sous-classe
contiennent également un deuxième pont disulfure dans leur domaine C-terminale qui semble
être important dans la stabilisation de la structure tertiaire. Il semble par ailleurs qu'il
leur confèrerait une meilleure activité antimicrobienne, une meilleure résistance à
l'exposition à des hautes températures et un spectre d'action plus large (Fimland et al., 2000
; Drider et al., 2006).
- La sous-classe IIb. Elle comprend les bactériocines ayant besoin de deux peptides
pour avoir une activité. Deux types de bactériocines de classe IIb peuvent être distingués : le
type E (Enhancing) où la fonction d'un des deux peptides est d'augmenter l'activité de l'autre
et le type S (Synergy) où les deux peptides sont complémentaires.
- La sous-classe IIc. Toutes les autres bactériocines de classe II ne pouvant pas
être classées dans les sous-classes a et b.
Le mécanisme d'action supposé des bactériocines de classe IIa est l'interaction de
la bactériocine avec la membrane ou un récepteur spécifique, la « mannose perméase »,
pour ensuite former un pore dans la membrane de la cellule, ce qui induit la perméabilité de
la membrane et par conséquent, la mort de la cellule (Dalet et al., 2000 ; Bauer et
Dicks., 2005). Le mécanisme de formation des pores n'est pas bien connu, même si
l'hypothèse la plus courante est l'association de différentes molécules de la bactériocine
(Diep et al., 2007). Les bactériocines de classe IIb ont en général un spectre d'action
inhibant une large gamme de bactéries Gram +. Elles forment des pores et rendent la
membrane perméable à différentes petites molécules à savoir les cations et les anions
(Oppegard et al., 2007).
29
Synthèse bibliographique
Tableau 7: Séquences de quelques bactériocines de classe II (Dortu et Thonart, 2009).
Class IIa : Pediocin-like bacteriocin
MTNMKSVEAYQQDNQNLKKVVGGKYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGINRLANGGNGFW
Mésenterocine Y105
………...…MEKFIELSLKEVTAITGGKYYGNGVHCGKHSCTVDWGTAIGNIGNNAAANWATGWNAGG
Sakacine P
………..MNNVKELSMTELQTITGGARSYGNGVYCNNKKCWVNRGEATQSIIGGMISGWASGLAGM
Curvacine A
……...…MKTVKELSVKEMQLTTGGKYYGNGVSCNNKNGCTVDWSKAIGIIGNNAAANLTGGAAGWNKG
Piscicoline126
……....MKSVKELNKKEMWWINGGAISYGNGVYCNKEKCWVNKAENKQAITGIVIGGWASSLAGMGH
Carnobactériocine
Bm1
...................MKKIEKTEKEMANIIIGGKYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC
Pédiocine PA-1
….MKHLKILSIKETWLIYGGTTHSGKYYGNGVYCTKNKCTVDWAKATTCIAGMSIGGFLGGAIPAKC
Entérocine A
. …….……MKNTRSLTIQEIKSITGGKYYGNGVSCNSHGCSVMWGQAWTCGVNHLANGGHGGVC
Sakacine G
Class IIb : Two-peptides bacteriocin
ABP-118
α KRGPNCVGNFLGGLFAGAAAGVPLGPAGIVGGANLGMVGGALTCL
Lactocine 705
Lactococcine
Plantaricine
Class IIc
Plantaracine A
Lactococcine A
Lactococcine 972
β
α
β
M
N
E
F
KNGYGGSGMRWVHCGAGIVGGALIGAIGGPWSAVAGGISGGFTSCR
MDNLNKFKKLSDNKLQATIGG
MESNKLEKFANISNKDLNKITGG
IRGTGKGLAAAMVSGAAMGGAIGAFGGPVGAIMGAWGGAAVGGAMKYSI
GSIWGAIAGGAVKGAIAASWTGMPVGIGMSALGGAVLGGVTYARPPVH
FNRGGYNFGKSVRHVVDAIGSVAGIRGILKSIR
VFHAYSARGVRMNYKSAVGPADWVISSAVRGFIHG
MKIKIKGMKQLSNKEMOKIVGGKSSAYSLQMGATAIKQVKKLFKKWGW
MKNQLNFNIVSDEELSEANGGKLTFIQSTAAGDLYYNTNTHKYYVYQQTQNAFGAAANTI
VMNGWMGGAAGGFGLHH
MKTKSLVLALSAVTLFSAGGIVAQAEGTWQHIYGVSSAYSNYHHGSKTHSATVVNNMTGR
QCKDTQRAGVWAKATGVRNLTEKASFYYNFW
5.3.3. Classe III
Ce sont des protéines de taille supérieure à 30 kDa et sensibles à la chaleur. La structure
et le mode d'action de ces bactériocines diffèrent complètement des autres bactériocines
produites par les bactéries lactiques. Cette classe ne contient que quatre bactériocines :
l'helveticin J produite par Lactobacillus helveticus A, l'enterolysin A produite par
Enterococcus
faecium,
la zoocin A produite par Spreptococcus zooepidemicus et la
millericin B produite par Streptococcus milleri (Papagianni, 2003). Le mode d'action de ces
bactériocines
diffère
complètement
des
bactériocines
des
autres classes. En effet,
l'enterolysin A, la zoocin A et la millericin B agissent par l'hydrolyse des liens peptidiques du
peptidoglycane des cellules sensibles. La zoocin A a un spectre d'action étroit alors que
l'enterolysin A et la millericin B ont un spectre d'action large. L'helveticin J a un mode
d'action bactéricide.
30
Synthèse bibliographique
5.3.4. Classe IV
Ce sont des peptides requérant une partie carbohydratée ou lipidique pour avoir une
activité.
Les bactériocines actuellement reconnues, produites par les bactéries lactiques, sont
mentionnées dans le tableau 5.
Tableau 8: Les bactériocines des bactéries lactiques (Stiles et Hastings, 1991 ; modifié)
Organisme producteur
Lactococcus lactis
L. lactis subsp. lactis
L. lactis subsp. lactis
L. lactis subsp. cremoris
L. lactis subsp. lactis
L. lactis subsp. diacétilactis
Lactobacillus
L. fermenti 466
L. helveticus 27
L. helveticus
L. aciduphilus
L. aciduphilus
L. plantarum
L. sake Lb 706
L.sake L 45
L. casei
Pediococcus
P. acidilactici H
P. acidilactici PAC 1.0
P. pentosaceus FBB61
Carnobacterium
Leuconostoc
Ln. geldium
Ln. mesenteroides subsp mesenteroides
Ln. carnosum
Ln. paramesenteroides
ND : non déterminé
Bactériocine
Nisine
Lacticine 481
Diplococcine
Lactostrepcins
Bacteriocine S50
ND
Lactocine 27
Helveticine J
Lacatcine B
Lactacine F
Plantaricine A
Sakacine A
Lactocine S
Caseicine 80
Pediocine
Pediocine PA-1
Pediocine A
Substances inhibitrices non dénomées
Leucocine A-VAL 187
Mesenterocine Y105
Carnosin 44A
Leucocin S
31
Synthèse bibliographique
5.4.
La production des bactériocines
Les bactériocines sont généralement produites à la fin de la phase exponentielle et au
début de la phase stationnaire de croissance. Elles peuvent ensuite être dégradées par
les protéases produites par la bactérie productrice (Savijoki et al., 2006) ou être adsorbées à
sa surface, ce qui mène à sa baisse de concentration de bactériocines dans le milieu de
culture. Les facteurs influençant la production de bactériocines sont principalement la
souche productrice, la température, le pH, la composition du milieu et la technologie de
fermentation employée.
Comme l'ont montré Moretro et al. (2000) pour la production de sakacin P par L.
sakei, une même bactériocine peut être produite par des souches ou espèces différentes dont la
capacité de production peut être variable. Les conditions de culture influencent fortement la
production de bactériocines. En effet, l'optimisation de la croissance ne résulte pas
nécessairement de l'optimisation de la production de bactériocines (Parente et al.,1999). Il a
même été suggéré que des conditions de croissance défavorables permettent de stimuler leur
production (Verluyten et al., 2004). Les températures et pH optimaux de production sont
souvent inférieurs à ceux de la croissance.
La composition du milieu, tout particulièrement les concentrations des sources de
carbone et d’azote, affecte fortement la production de bactériocines. Les bactéries lactiques
productrices requièrent de nombreux nutriments pour leur croissance et des milieux
riches contenant de l'extrait de viande, de levure et des hydrolysats de protéines sont
nécessaires. Il a déjà été montré que l'augmentation des concentrations en extrait de
levure, extrait de viande ou peptone peut permettre une augmentation de la production
de bactériocines (Verluyten et al.,2004). D'autre part, quelques études ont montré que la
source de carbone utilisée et sa concentration est un facteur important dans l'optimisation de
la production de bactériocines (Chen et al.,2007).
32
Synthèse bibliographique
5.5.
Le conditionnement des bactériocines
Il est très difficile de conditionner les bactériocines sous une forme purifiée. La
purification des bactériocines est une procédure longue et couteuse qui nécessite la
mise en œuvre de nombreuses techniques, à savoir une précipitation des protéines au
sulfate d'ammonium, différentes combinaisons de chromatographies sur colonne telles que
des échanges d'ions
ou
des
interactions
hydrophobes
et
une
étape
finale
de
chromatographie liquide à haute performance en phase inverse. Ces traitements ne sont pas
applicables à l'échelle industrielle. La stratégie souvent mise en œuvre est la semi purification. Les bactériocines semi-purifiées peuvent alors être conditionnées sous forme
sèche par atomisation ou lyophilisation (Parente et al., 1999). La nisine, la seule bactériocine
légalement approuvée comme additif alimentaire, est commercialisée sous une forme semipurifiée.
5.6.
L’application des bactériocines et la bactérie productrice dans le
secteur alimentaire
Les bactériocines peuvent être appliquées sous une forme purifiée, semi-purifiée ou
sous la forme d'un concentré obtenu après fermentation d'un substrat alimentaire. Les
bactéries productrices peuvent également être appliquées dans les produits alimentaires,
la bactériocine sera alors produite in situ.
5.6.1. Application de la bactériocine dans le secteur alimentaire
Les bactériocines purifiées ou semi-purifiées sont appliquées après leur production
en fermenteur. D'un point de vue législatif, une telle préparation est considérée comme un
additif alimentaire. Jusqu'à présent, seule la nisine, un lantibiotique, est acceptée
comme
additif alimentaire (E234) (Guinane et al., 2005). Les bactériocines peuvent
également être appliquées sous la forme d'un concentré obtenu après fermentation par la
souche productrice. Cette préparation sera considérée comme un ingrédient fermenté. Elle
contiendra la bactériocine, mais également d'autres métabolites microbiens tels que l'acide
lactique. La pédiocine, une bactériocine de classe IIa, est commercialisée sous cette
forme sous le nom ALTA 2341. Des essais ont été récemment fait avec la lacticine
3147, un lantibiotique (Deegan et al., 2006).
33
Synthèse bibliographique
Un autre mode d'application des bactériocines consiste en l’immobilisation sur
des cellules productrices dans des gels ou des films tels que l'alginate de calcium, la
gélatine, la cellulose, les protéines de soja, des films de polysaccharides, etc. La
bactériocine sera alors libérée dans le produit au cours de sa conservation. Depuis peu, des
emballages en polyéthylène ou d'autres films plastiques contenant des bactériocines ont
été développés. Ces emballages permettent de réduire la croissance des microorganismes
pathogènes ou indésirables pouvant se développer en surface durant la conservation du
produit (Deegan et al., 2006).
5.6.2. Application de la bactérie productrice de bactériocines dans le
secteur alimentaire
Les bactéries productrices de bactériocines peuvent être ajoutées comme starter dans
des produits fermentés ou comme culture protectrice. Elles doivent être capables de
croitre et de produire des bactériocines dans l'aliment à conserver. La composition du
produit (nutriments accessibles, pH, additifs alimentaires, etc.) et les conditions de
stockage (température, atmosphère, activité d'eau, etc.) doivent donc permettre la
croissance et la production de bactériocines. Si les bactéries sont ajoutées en tant que starter
dans des produits fermentés, elles doivent pouvoir conférer au produit les propriétés
organoleptiques désirables tout en produisant des bactériocines. Les bactéries productrices de
bactériocines peuvent être également ajoutées en combinaison avec un autre starter qui
confèrera les propriétés organoleptiques désirables. Dans ce cas, la bactérie productrice de
bactériocines ne doit pas détériorer les qualités organoleptiques de l'aliment fermenté et la
bactériocine produite ne doit pas avoir d'activité contre le starter (Deegan et al., 2006).
Si la bactérie est appliquée en tant que culture protectrice, elle doit être capable
de produire sa bactériocine sans modifier les propriétés organoleptiques (Rodgers,
2001). La concentration cellulaire maximale atteinte dans le produit doit par ailleurs
être inférieure à la limite de 106 cfu/g généralement admise pour les produits non fermentés.
34
Synthèse bibliographique
5.7.
La bioconservation des produits alimentaires
La bioconservation des aliments fait l’objet depuis 40 ans de nombreuses études. Elle
consiste en une augmentation de la durée de vie et une amélioration de la sécurité sanitaire
des produits alimentaires, en utilisant des microorganismes et/ ou leurs métabolites (Stiles,
1997).
L’HACCP (Hazard Analysis et Critical Control Points), ‘analyse des dangers et
des points critiques pour leur maitrise’, est un système de gestion qui identifie, évalue et
maitrise les dangers significatifs au regard de la sécurité des aliments. Malgré la mise
en œuvre de technologies modernes et de concepts de sécurité sanitaires, l’HACCP
n’est toujours pas arrivée à contrôler l’émergence de nouveaux pathogènes colonisant
les denrées. Dans ce contexte, les bactéries lactiques et/ ou leurs métabolites utilisés depuis
des millénaires d’une façon empirique par de nombreuses populations, peuvent contribuer
à la conservation des aliments (Ross et al., 2002) (Tableau 6). C’est grâce aux
propriétés antimicrobiennes de métabolites qu’ils synthétisent, tels que l’éthanol, le
peroxyde d’hydrogène, le diacétyle (Atrih et Foster, 2001a),les composés antifongiques
(Corsetti et al., 1998), les acides phényl-lactiques (Lavermicocca et al., 2000), les
antibiotiques comme la reutéricycline (Höltzel et al., 2000) et les bactériocines, que les
bactéries lactiques sont reconnues comme de bons agents de conservation des produits
alimentaires (Abee et al., 1995). Afin de diminuer l’utilisation des additifs chimiques
dans l’alimentation et d’obtenir des aliments prêts à la consommation et respectant les règles
de la sécurité sanitaire, l’industrie agroalimentaire en Europe s’intéresse à l’utilisation
des bactériocines comme des bio-conservateurs (Makhloufi, 2011).
L’absence de toxicité pour les cellules eucaryotes et la perte d’activité en présence des
protéases présentes dans le tube digestif présentent des propriétés qui pourraient placer
les bactériocines parmi les substances sans danger pour l’homme. Elles doivent cependant,
pour le moment, être considérées comme un moyen de conservation complémentaire à ceux
déjà existants (Deegan et al., 2006). Pour améliorer leur conservation, les aliments sont
soit supplémentés en bactéries productrices, la bactériocine étant produite in situ, soit en
bactériocine ex situ.
35
Synthèse bibliographique
Tableau 9: Exemples d’applications des bactériocines comme des conservateurs
alimentaires (Benmechernene et al., 2013).
Company
Country
Danisco A/S
Denmark
Kerry Biosciences
Ireland
Chr.
Hansen Denmark
A/S
Holland
Handary
Bacteriocin
produced
Nisin A
produced by
Lactococcus
lactis
Sakacin G
produced by
Lactobacillus
sakei
Pediocin PA-1
produced by
Pediococcus
acidilactici
Pediocin
Sakacin A
Nisin Z
Nisin A
Pediocin A
Pediocin P
36
Target bacteria
Applications
Listeria spp
Bacillus spp
Clostridium spp
LAB
Dairy products
Bakery
Beverages
Delicatessen
Fresh and
cooked meat
products
Listeria
monocytogenes
Listeria
monocytogenes
Meat products
Starter culture
for sausage
Dairy products
Listeria spp
Bakery
Clostridium spp Beverages
B. cerus
Delicatessen
Other
Gram Meat
positive bacteria
Nutraceuticals
Bakery
Beverages
Dairy products
Meat
Synthèse bibliographique
5.8.
Utilisation des bactéries lactiques productrices de bactériocine
C’est durant le XIXe siècle, au Danemark, que la première boisson fermentée
fabriquée à partir d’un mélange de souches bactériennes isolées à partir de lait cru a
été commercialisée. Le concept de ferment a ensuite évolué au début du XXe siècle
après l’identification de quelques souches impliquées dans la fermentation.
Grâce à leurs propriétés d’acidification et de production de polysaccharides, les
bactéries lactiques ont souvent été utilisées en co-cultures pour initier et/ ou améliorer la
fermentation de nombreux aliments comme la choucroute, les saucisses ou les olives
vertes
(Settanni
et Corsetti, 2008). Cependant, une des caractéristiques des bactéries
lactiques qui leur permet de se placer comme bioconservateur est leur production de
molécules antimicrobiennes (Settanni et Corsetti, 2008). La production de bactériocine
in situ offre de nombreux avantages comparés à la production de bactériocine ex situ,
comme le coût ou l’augmentation de la compétition avec la microflore résidente augmentant
ainsi l’inhibition de croissance des bactéries pathogènes. La diminution du coût de
préparation pourrait généraliser la pratique permettant aux pays en voie de développement
où la sécurité alimentaire est le plus souvent compromise de bénéficier de ces applications
(Holzapfel, 2002). D’autres qualités ont depuis été associées aux bactéries lactiques
lorsqu’elles sont associées aux produits alimentaires comme l’augmentation des valeurs
nutritionnelles des aliments, la réduction de la formation de produits toxiques et la propriété
de probiotique. En plus de la propriété de bioconservation, plusieurs propriétés ont été
attribuées aux bactéries productrices de bactériocines telles que la diminution des gaz dus à la
fermentation ainsi qu’à l’amélioration du goût et de la qualité du produit fini.
Grâce à leur activité protéolytique et leur acidification importante du milieu, les
bactéries productrices de bactériocines sont utilisées soit pour initier la fermentation soit pour
jouer le rôle d’adjuvant en présence d’une bactérie initiatrice de fermentation (Gálvez et al.,
2011). Aussi, la croissance de la co-culture ne doit avoir aucun effet sur les
propriétés physicochimiques et organoleptiques du produit fini ni interférer avec celles-ci. De
plus, la bactérie productrice doit être prédominante et capable de produire sa bactériocine à
n’importe quelle température, pendant la réfrigération ou à température ambiante, afin
d’empêcher la croissance et la prolifération des bactéries pathogènes dans les aliments
(Holzapfel et al., 1995).
37
Synthèse bibliographique
Les bactéries productrices sont aussi utilisées comme cultures bioprotectrices dans les
aliments non fermentés dans la mesure où elles ne présentent aucun effet négatif sur le produit
fini.
De
nombreuses
souches
bactériennes
productrices
de
bactériocines
sont
actuellement utilisées dans les produits alimentaires fermentés, tels que les produits laitiers,
les viandes, les poissons ou les légumes. Les souches bactériennes du genre Lactococcus
sont les bactéries productrices de bactériocines les plus utilisées. La souche bactérienne
productrice de la nisine, Lc. lactis, est souvent utilisée lors de la fermentation de fromages
comme le Manchego ou le Camembert en raison de ses propriétés antibactériennes dirigées
contre L. Monocytogenes et Staphylococcus aureus (St. aureus) (Gálvez et al., 2008). Les
souches productrices de nisine Z sont aussi utilisées pour limiter les gaz produits lors de
la fermentation, qui sont le plus souvent dus à une surcroissance de spores de
Clostridium et en particulier de Cl. tyrobutyricum. La souche productrice de lacticine 3147
est aussi utilisée pour le contrôle de la prolifération de L. Monocytogenes dans les aliments
tels que les fromages fabriqués
à partir du lait écrémé (O'Sullivan et al., 2006).
L’optimisation de l’arôme du fromage pourrait être réalisée par l’utilisation des souches
productrice de lacticine 3147 en combinaison avec des cultures bactériennes productrices
d’amino-transférases et de décarboxylases (Makhloufi, 2011)
Du fait de leur robustesse, leur présence naturelle dans différents produits alimentaires
et leur production de nombreuses bactériocines, Enterococcus faecalis (En. faecalis) et
En. faecium productrices de bactériocines sont largement utilisées comme adjuvants (Franz et
al., 2007). Les bactéries appartenant au genre Pediococcus productrices de bactériocines ne
sont pas adaptées à la fabrication des produits laitiers fermentés de par leur manque ou leur
lenteur de fermentation du lactose (Papagianni et Anastasiadou, 2009). En revanche, la
souche Pediococcus acidilactici productrice de pédiocine PA-1/ AcH s’est révélée être
responsable de la bonne conservation de la viande en diminuant les populations de L.
Monocytogenes et de Clostridium perfringens (Rodríguez et al., 2002).
Les bactéries lactiques sont, de loin, la catégorie de microorganismes la plus utilisée
dans la production de produits alimentaires contribuant ainsi à la texture et au goût
des produits fermentés. Par ailleurs, la production par ces bactéries de métabolites tels
que les peptides antimicrobiens et l’acide lactique permet d’inhiber la prolifération des
microorganismes pathogènes et d’assurer ainsi une bonne conservation des aliments
(Pot, 2008).
38
Synthèse bibliographique
6. Les probiotiques
6.1.
Définition d’un probiotique
Le terme probiotique a bénéficié de plusieurs définitions qui ont évolué dans le temps
en fonction des connaissances scientifiques et des avancées technologiques. La notion de
probiotique a été développée principalement grâce aux travaux de Metchnikoff ayant
suggéré que l’ingestion de bactéries lactiques vivantes accroit la longévité en réduisant
dans le tube digestif la population de bactéries putréfiantes ou produisant des toxines
(Metchnikoff, 1907). Une des premières définitions des probiotiques comme « facteurs
promoteurs de croissance produits par des microorganismes » a été proposée par Lilly et
Stillwell en 1965. Ensuite, Parker élargit cette définition à des « organismes et substances
qui contribuent à l’équilibre de la flore » (Parker, 1974). Cette définition inclut
potentiellement des produits métaboliques microbiens y compris les antibiotiques. Plus
tard, Fuller propose une définition très proche du sens actuel : « supplément alimentaire
microbien vivant qui affecte de façon bénéfique l’hôte en améliorant l’équilibre de sa
flore intestinale » (Fuller, 1989).
Par opposition aux précédentes définitions, la définition suivante introduit la
notion de souche définie bien caractérisée d’un point de vue taxonomique ainsi que la notion
de quantité à l’homme. La FAO (Food and Agriculture Organization) et l’OMS
(Organisation mondiale de la santé) ont établi récemment des lignes directrices pour
l’utilisation du terme « probiotiques » dans les aliments (FAO/OMS, 2002) et formulent
la définition suivante : « microorganismes vivants qui lorsqu’ils sont administrés en
quantités adéquates, exercent une action bénéfique sur la santé de l’hôte qui les ingère».
6.2.
Rôle du probiotique
Pour être considéré comme probiotique, un microorganisme ne doit présenter ni
toxicité ni pathogénie. Les probiotiques doivent être capables de moduler la réponse
immunitaire (Schiffrin et al., 1997) et/ou produire des substances antimicrobiennes. Ils
doivent être aussi capables de survivre et de proliférer dans les milieux naturels occupés par
des bactéries pathogènes. Plusieurs études ont attribué de nombreuses propriétés aux
probiotiques dans lesquels ils participent à l’activation de l’immunité et à la réduction
d’allergies chez les sujets à risque (Gourbeyre et al., 2001).
39
Synthèse bibliographique
La résistance à l’acide gastrique et à la bile permet aux probiotiques de survivre dans le
tube digestif où réside une partie de l’immunité (Grangette et al., 2002, Klaenhammer et
Kullen, 1999). Les lymphocytes sont présents à l’état isolé au niveau de l’épithélium et dans
la lamina propria, mais ils sont aussi regroupés dans la sous-muqueuse dans des structures
spécialisées appelées les plaques de Peyer.
À chaque site de l’intestin, de l’épithélium, de la lamina propria et de la plaque de
Peyer, les types et fonctions des lymphocytes diffèrent. Dans l’épithélium, il s’agit
majoritairement de lymphocytes T CD8 et dans la lamina propria et à l’état isolé, il s’agit de
populations mélangées comprenant des lymphocytes T CD4 et des lymphocytes B. Les
plaques de Peyer contiennent un cœur de lymphocytes B et un petit nombre de lymphocytes T
CD4. Aussi, les probiotiques participent au développement du système immunitaire chez le
nourrisson et l’améliorent chez la personne âgée en augmentant le nombre de phagocytes et
de lymphocytes natural killer, premières défense contre un agent exogène (Donnet-Hughes et
al., 1999, Haller et al., 2002).
Ils agissent également sur l’immunité en colonisant le tractus intestinal, réalisant ainsi
«un effet barrière» (Logan et Katzman, 2005, Penner et Fedorak, 2005b). L’«effet barrière»,
empêche d’une part la colonisation de l’épithélium par des pathogènes et renforce d’autre
part l’immunité au niveau des muqueuses intestinales en augmentant la production
d’IgA et de mucus donc des défenses locales au niveau des muqueuses (Kaila et al., 1992).
6.3.
Mécanisme d'action des probiotiques
Les probiotiques peuvent être considérés comme un moyen de véhiculer les
principes
actifs
qu'ils contiennent
(enzymes,
composants
de
paroi,
substances
antimicrobiennes) jusqu'à leurs cibles d'action dans le tractus digestif.
Les mécanismes d'action des probiotiques sur l'hôte sont complexes, souvent multiples
et dépendent de la souche bactérienne considérée ; ils agissent en particulier en
inhibant les bactéries indésirables, en neutralisant les produits toxiques, en améliorant la
digestibilité alimentaire et en stimulant l'immunité, ceci suggère qu'il faut un contact direct
de ces probiotiques avec les différents constituants de la barrière intestinale, tels que la
microflore endogène, le mucus intestinal, les cellules épithéliales. Ils sont également une
source de vitamines (essentiellement du groupe B), et de sels minéraux assimilables
(Robin et Rouchy, 2001 ; Ait-Belgnaoui et al., 2005).
40
Synthèse bibliographique
6.4.
Les principales espèces des bactéries lactiques à potentiel
probiotique
Les microorganismes considérés comme probiotiques sont des souches bactériennes
ainsi que les levures. Les bactéries probiotiques sont principalement des bactéries lactiques et
des bifidobactéries (Tableau 10).
Tableau 10: Microorganismes considérés comme probiotiques (Holzapfel et al., 1998)
Lactobacillus
L.
acidophilus
L. amylovirus
L. brevis
L. casei
L. cellobius
L. crispatus
L. curvatus
L. delbrueckii
L. farciminis
L. fermentum
L. gallinarum
L. gasseri
L. johnsonii
L. paracasei
L. plantarum
L. reuteri
L. rhamnosus
Bifidobacterium
B. adolescentis
B. animalis
B. bifidum
B. breve
B. infantis
B.thermophilum
Autres LAB
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Lactococcus lactis
Leuconostoc
mesenteroides
Pediococcus acidilactici
Sporolactobacillus
inulinus
Streptococcus
thermophilus
Streptococcus
diacetylactis
Streptococcus
intermedius
41
Autres microorganismes
Bacillus spp.
Escherichia coli strain Nissle
Propionibacterium
freudenereichii
Saccharomyces cerevisae
Saccharomyces bourlardii
Synthèse bibliographique
6.5.
Applications des probiotiques
Grâce à leurs propriétés nutritionnelles et thérapeutiques utilisées par les
industries agroalimentaires et pharmaceutiques, les probiotiques sont parfois utilisés
comme compléments dans des produits comme les yaourts ou bien dans des
préparations pharmaceutiques
bactériennes
ont
sous
montré leurs
forme
de
gélules.
bénéfices
sur
la
santé
De
nombreuses
humaine
et
souches
sont
déjà
commercialisées par Danone telles que Bifidobacterium lactis (bifidus actif) utilisé dans la
production des yaourts Activia (Picard et al., 2005) ou Lb. Caseire trouvé dans Actimel.
En Europe, toute nouvelle souche introduite dans l’alimentation doit faire l’objet d’une
évaluation selon le système QPS (Qualified Presumption of Safety, présomption de sécurité
qualifiée) depuis novembre 2007. Le système européen QPS, est un outil d’évaluation de la
sécurité des cultures de microorganismes utilisées par l’EFSA (European Food safety
Authority) pour lesquelles une demande d’autorisation de mise sur le marché est nécessaire.
Ce système s’appuie sur 4 piliers: l’identité précise de la souche (criblage), l’état
des connaissances, le type d’application (matrice) et le rapport innocuité/ pathogénie
(EFFCA, 2011).
Les probiotiques ne sont pas seulement utilisés comme additifs alimentaires, mais aussi
en association avec des traitements médicaux conventionnels dans quelques préparations
pharmaceutiques du fait de leur reconnaissance en tant que GRAS aux États-Unis (Saarela et
al., 2000, Salminen et al., 1998). L’agence Américaine du Médicament (Food and Drug
Agency, FDA), estime que les produits contenant des probiotiques ne font pas objet
des mêmes recommandations que les médicaments. En revanche, l’Agence Européenne
des Médicaments (European Medicines Evaluation Agency, EMEA) n’a toujours pas
autorisé cette utilisation.
42
Synthèse bibliographique
6.6.
Les probiotiques et leurs effets bénéfiques sur la santé
Plusieurs effets bénéfiques sur la santé ont été associés à la consommation des
probiotiques. Le tableau 03 illustre la diversité des effets bénéfiques sur la santé
documentés et rapportés dans la littérature.
Tableau 11: Les principaux effets bénéfiques attribués aux probiotiques (Salminen et
al., 2004 ; Patterson, 2008).
Effets intestinaux
Effets sur le système
Autres effets
Immunitaire
Contrôle
des
troubles - Modulation immunitaire
Réduction du risque de :
suivants :
- Répression des réactions
- Certains cancers
- Mauvaise digestion du
allergiques par réduction
(colorectal, vessie, col utérin,
lactose
de l’inflammation
sein)
- Diarrhée due aux rotavirus
- Réduction des risques
- Coronaropathie
et diarrhée-associée aux
d’infection par des agents
- Maladie des voies urinaires
antibiotiques
pathogènes courants
- Infection des voies
- Syndrome du côlon
(Salmonella, Shigella)
respiratoires supérieures et
irritable
infections connexes
- Constipation
Réduction du cholestérol
- Infection par Helicobacter
sérique et de la pression
pylori
artérielle
- Prolifération bactérienne
dans l’intestin grêle
- Maladies inflammatoires
chroniques de l’intestin
Prévention de l’entérocolite
nécrosante du nouveau-né
43
Synthèse bibliographique
6.7.
Les prébiotiques
Le terme de prébiotique a été récemment introduit par Gibson et Roberfroid en
1995 (Gibson, 1995). Il désigne un ingrédient alimentaire non digestible par l’hôte, mais
stimulant sélectivement la croissance et / ou l’activité de certaines bactéries du côlon comme
par exemple les bifidobactéries.
Pour qu’un ingrédient alimentaire soit classé comme prébiotique, il doit :
- ni être hydrolysé ni être absorbé dans la partie haute du tube digestif
- être un substrat sélectif d’une ou plusieurs bactéries bénéfiques, commensales du
côlon, dont la croissance est alors stimulée et / ou le métabolisme activé
- en conséquence, induire une composition plus saine de la flore colique
Les prébiotiques peuvent être des sucres non digestibles, des peptides ou des protéines
et même des lipides qui, en raison de leur structure ne sont pas absorbés dans l’intestin grêle.
7. Le genre Listeria
7.1.
Historique
C’est en Angleterre, à Cambridge, en 1926, Murray, Webb et Swann isolèrent un petit
bacille à Gram positif du sang de lapins atteints d’une mononucléose sanguine qu’ils
nommèrent "Bacterium monocytogenes" (Kaismoune, 2009).
En outre, le germe a été isolé par Pirie à partir de gerbille sauvage infecté. Pirie a
proposé le nom de Listerella pour le genre en honneur au chirurgien “Lord Lister”.
Murray et Pirie réalisèrent qu’ils ont procédé à l’isolement de la même espèce
bactérienne et ainsi ils combinèrent les noms pour former Listerella monocytogenes qui sera
changé pour des raisons de taxonomie en Listeria monocytogenes (Pirie, 1940).
En 1961, Prévot proposa l'appellation de Listeria denitrificans pour une unique souche
bactérienne isolée en 1948 par Sohier, Benazet et Piéchaud à partir de sang de bœuf chauffé.
Ultérieurement, ont été décrites les espèces Listeria grayi et Listeria murrayi. Ces
quatre espèces ont été retenues dans les Approved Lists of Bacterial Names, mais, depuis la
parution de ces listes, la systématique du genre Listeria a été profondément modifiée (Azizi,
2010).
44
Synthèse bibliographique
7.2.
Position taxonomique
Le genre Listeria appartient à la branche phylogénétique des Clostridium, avec
Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Brochothrix et Bacillus. (Bergey’s, 1994).
Les Listeria font partie des Listeriaceae. Cette position, au sein des bactéries à Gram
positif est devenue évidente avec les résultats de la Taxonomie numérique, puis s’est imposée
sans ambigüité avec ceux du séquençage de l’ARN ribosomique16S (Larpent, 2000). Depuis,
d’autres espèces de Listeria ont été décrites et, notamment grâce aux méthodes d’analyses
génétiques, la systématique du genre Listeria a été affinée.
En effet, le genre Listeria regroupe six espèces : monocytogenes, innocua, ivanovii,
welshimeri, seeligerri, grayi avec deux sous-espèces L. ivanovii subsp. ivanovii, L. ivanovii
subsp. londoniensis (Farber et Peterkin, 1991) dont les espèces non pathogènes sont L.
innocua, L. seeligeri, L. welshimeri et L. grayi. (Glaser et al., 2001; Hain et al., 2006).
7.3.
Habitat
Elles sont peu exigeantes et capables de croitre dans des conditions défavorables.
Elles sont ubiquitaire, très répandue dans l’environnement et peuvent survivent de
longue durée dans les sols, les fruits et les légumes, les viandes, les saucisses, le lait et
les produits laitiers, les fèces, la paille… Elles peuvent être isolées de diverses niches
écologiques et de nombreuses espèces animales, peuvent être également trouvées au
niveau de l’intestin (des ovins, caprins…) ainsi que l’homme (Farber et Peterkin, 1991 ;
Guerini et al., 2007).
45
Synthèse bibliographique
7.4.
Caractères bactériologiques
7.4.1. Morphologie et Structures
Listeria sp. sont des bacilles à Gram positif. Se présentent sous forme de bâtonnets
courts et réguliers de 0,4 à 0,5 μm de diamètre sur 0,5 à 2 μm de long, aux extrémités
arrondies; certaines cellules pouvant toutefois être incurvées. Elles se présentent de manière
isolée ou groupée en V ou en L, en palissade ou en courte chainette.
Les Listeria sont des bactéries non acido-alcoolo-résistantes, non capsulées, non
sporulées, non pigmentées et sans structure extracellulaire telle que les fimbriae.
Lorsque la culture est réalisée à 20-25°C, elles sont mobiles grâce à quelques flagelles
de type péritriches, mais sont immobiles ou faiblement mobiles à 37°C en raison du manque
d'expression flagelline à cette température (Way et al., 2004) . Leur ADN est caractérisé par
une faible teneur en G + C (36-42%).
7.4.2. Caractères biochimiques, métaboliques et culturaux
Listeria est une bactérie aéro-anaérobie facultative. Sur gélose nutritive, elle forme en
24-48 h à 37°C des colonies de 0,5 à 1,5 mm de diamètre, translucides, à reflets bleutés en
lumière oblique. Sur gélose au sang de mouton ou de cheval, elle donne des colonies
β-hémolytiques. L. monocytogenes se développe bien sur les milieux empiriques riches
(milieu cœur cervelle, milieu à la peptone de caséine et de soja additionné d'extrait de levure).
En milieux synthétiques, ses exigences de base concernent certains amino-acides, des
vitamines, mais pas de bases nucléiques (Premaratne et al., 1991).
Sur le milieu synthétique de Welshimer (1968), sa croissance est stimulée par l'addition
de fer (Fe3+) et cet effet stimulant est proportionnel à la concentration de fer ajouté (Sword,
1966). L'apport d'esculine et de citrate stimule aussi sa croissance.
Les espèces de Listeria peuvent être différenciées sur la base de plusieurs caractères. Le
Tableau 12 résume cette distinction.
46
Synthèse bibliographique
7.5.
La Listériose
Listeria monocytogenes est l’agent étiologique de la listériose, infection d’origine
alimentaire rare, mais associée à une mortalité élevée d’environ 20 à 30 % pour les
formes les plus graves. La listériose humaine évolue essentiellement sous forme de cas
sporadiques et plus rarement sous forme de cas groupés causés par l’ingestion
d’aliments contaminés (Farber et Peterkin, 1991; Berche et al, 2000).
7.5.1. L’espèce Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes est un pathogène intracellulaire facultatif. Il a évolué d'une
panoplie de facteurs de virulence, qui exploitent d'importants processus cellulaires au cours de
l'infection (Cossart et al., 2003). Elle est apparue comme un outil manipulable génétiquement
pour répondre aux principaux processus de la biologie cellulaire, comme la phagocytose, la
motilité à base d'actine et de la signalisation par les récepteurs du facteur de croissance
(Martin et Stanly, 2006).
L'utilisation combinée de la génétique, la biologie cellulaire, la génomique fonctionnelle
et les études post-séquençage a conduit à une compréhension précise des infections L.
monocytogenes. La génomique comparative de L. monocytogenes avec les espèces non
pathogènes L. innocua, et d'autres espèces de Listeria peuvent désormais être pleinement
exploitées pour l'étude de la virulence, la régulation et la biodiversité de Listeria (Martin et
Stanly, 2006).
7.5.2. Aliments associés à la listériose
Des poussées ayant la même origine ont été associées ou liées sur le plan
épidémiologique à la consommation de fromages frais, à pâte molle, demi-molle et
à moisissures, de hot-dogs, de langue de porc en gelée, de viandes transformées, de
pâté, saucissons, lait pasteurisé arôme chocolat, lait pasteurisé, lait non pasteurisé,
beurre, crevettes cuites, moules fumées, poisson fumé, salade de pommes de terre,
légumes crus et salade de chou.
47
Synthèse bibliographique
Des cas sporadiques ont été associés à la consommation de lait cru, crèmes
glacées non pasteurisées, fromage ricotta, fromages de chèvre, de brebis et de feta, fromages
à pâte molle, demi-molle et à moisissures, fromage de type hispanique, saucissons, hotdogs, champignons salés, œufs de morue fumée, moules fumées, poisson insuffisamment
cuit, picholines, légumes crus et salade de chou.
En général, les concentrations de L. monocytogenes dans les aliments étudiés ont
dépassé 103 UFC/g (EC, 1999; FDA/FSIS, 2001), mais il y a eu des exemples où elles ont
été beaucoup plus faibles. Toutefois, une grande incertitude demeure concernant ces
estimations, car la concentration réelle du pathogène dans la portion d’aliment consommé
par un individu infecté aurait pu varier considérablement par rapport à celle observée
dans d’autres portions de l’aliment durant une étude postérieure.
7.5.3. Les maladies de l'homme causé par Listeria
Listeria monocytogenes cause des infections gastro-entérite, la méningite, la neuroencéphalite, chorioamniotite, les avortements, les infections néonatales. La listériose est
associée à un taux élevé de mortalité, particulièrement chez les individus immunodéprimés
(Schlech, 2000).
Listeria monocytogenes infecte l'homme par ingestion de produits alimentaires
contaminés. Les bactéries peuvent traverser la barrière intestinale et de diffuser à partir des
ganglions mésentériques à la rate et le foie, d'où ils peuvent atteindre le cerveau ou le
placenta, ce qui entraine une méningite ou une encéphalite chez les patients immunodéprimés,
d'avortements chez les femmes enceintes, ou d'infections généralisées chez les nouveau-nés
infectés (Figure 6).
48
Synthèse bibliographique
Tableau 12: Différenciation des espèces de Listeria. (Rocourt et Jacquet, 2000, Azizi,
2010).
CAMP
CAMP
D-
L-
D-
test S.
test R.
xylose
rhamnose
mannoside
Ribose
Mannitol
aureus
equi
+
+
-
-
+
+
-
-
+
-
-
+
-
-
+
-
+
-
+
+
-
d
-
-
L. innocua
-
-
-
-
d
+
-
-
L. welshimeri
-
-
-
+
d
+
-
-
L. seeligeri
+
+
+
+
-
-
-
-
L.grayi
-
-
-
-
-
ND
-
+
hémolyse
L.
monocytogenes
L. ivanovii
(subsp.
Ivanovii)
L.ivanovii
(subsp.
Iondoni)
(+) : positif, (-) : négatif, (d) : différencié, ND : non défini.
Figure 6: Les étapes successives de la listériose. Les organes touchés par l'infection, les
symptômes et les barrières épithéliales traversées par L. monocytogenes.
49
Synthèse bibliographique
8. Identification des bactéries par la biologie moléculaire
L'identification des bactéries, isolées à partir de prélèvements biologiques, pendant des années,
a été basée uniquement sur des critères morphologiques et biochimiques. Le développement des
techniques de biologie moléculaire à partir des années 1990 a permis d'introduire ces approches au
sein des laboratoires d'analyse biologique. Leur intérêt dans 'identification des bactéries s'est accru au
fil des années. Elles permettent d'obtenir un résultat en quelques heures dans les situations d'urgence
(identification et typage du germe, et détection des résistances antibiotiques) ou d'identifier un
microorganisme si les systèmes utilisés en routine (approche biochimique) sont pris en défaut. De
plus, dans des prélèvements biologiques, elles rendent possible la caractérisation des bactéries si la
culture est restée négative, si les bactéries recherchées sont des bactéries intracellulaires strictes (pour
lesquelles la culture est réservée à des laboratoires spécialisés) ou des bactéries encore incultivables à
ce jour.
Le gène ciblé est en fonction des informations disponibles sur l'isolat bactérien. Le gène codant
l'acide ribonucléique ribosomique (ARNr) 16S est l'outil de choix si les tests précédemment réalisés
n'ont pas permis de définir le genre ou l'espèce auxquels appartient l'isolat bactérien. Un système
d'identification mettant en jeu un gène plus variable est préférable si des critères d'orientation sont
disponibles (Roux et Rolain, 2014).
La plupart des techniques mises en œuvre sont basées sur l'utilisation de l'amplification génique
(polymerase chain reaction [PCR]) couplée à une réaction de séquençage du fragment obtenu par la
technique de Sanger ou de la PCR en temps réel. Pour cette dernière méthode, la spécificité et la
sensibilité sont meilleures, la durée de réalisation de l'analyse est plus courte et c'est le germe
recherché ou le groupe de bactéries à caractériser qui commandent le système utilisé.
Dans les années à venir, le développement des techniques de séquençage des génomes entiers va
ouvrir des possibilités considérables en ce qui concerne l'identification des bactéries, leur
épidémiologie, l'étude de leur sensibilité aux molécules antibiotiques et la caractérisation de leurs
facteurs de virulence (Roux et Rolain, 2014).
50
Synthèse bibliographique
8.1.
Méthodes basées sur la PCR (réaction de polymérisation en
chaine)
8.1.1. Champ d'application
Identification au niveau de l'espèce de bactéries lactiques préalablement
isolées de moûts et vins par culture sur plaque. La méthode PCR peut être
adaptée à plusieurs niveaux d'identification (genre, espèce ou souche) en fonction
du choix des amorces(courte séquence oligonucléotidique). Le principe est le
suivant : l'amorce recherche la région complémentaire pour s’apparier sur la
matrice d'ADN qui est analysé. C’est à partir de l’extrémité de l’amorce que la
polymérisation s’opère en recopiant le brin d’ADN matrice un très grand nombre de fois
ce qui conduit à l’amplifiant (Castellucci, 2012).
8.1.2. Amplification de régions consensus et séquençage : sous-unité de
l’ARN ribosomique 16S
8.1.2.1. Principe
Le séquençage de l’amplifiant du gène codant pour l’ARNr 16S constitue
la méthode de base. Cette approche s'appuie sur la présence obligatoire de l’ARNr
dans les bactéries. La séquence nucléotidique de ce gène permet la classification
phylogénétique et l'identification d'isolats inconnus, car la base de données
existante pour ce gène est la plus étendue des gènes bactériens. La séquence
nucléotidique de la région entre les gènes codant pour les ARNr 16S et 23S,
appelée ITS, peut être utilisée pour l'identification, mais sa séquence est moins
conservée. Dans ce cas, la PCR utilise des amorces correspondantes aux régions
conservées universelles dans les gènes codant l’ARNr 16S et 23S, de part et d’autre de
l’ITS (Castellucci, 2012).
8.1.2.2. Protocole général
Cette méthode nécessite l'extraction de l'ADN de la culture pure à
identifier. L’ADN extrait sert de matrice dans la réaction de PCR. Après séparation par
électrophorèse, les amplifiants sont purifiés avec les kits appropriés, puis ils sont
séquencés.
Les
séquences obtenues des gènes codant l’ARNr 16S ou rpoB sont
comparées à celles figurant dans les bases de données disponibles.
51
Synthèse bibliographique
8.2.
Le spectromètre de masse MALDI-TOF
La spectrométrie de masse MALDI-TOF est une nouvelle technologie apparue ces
dernières années en microbiologie. Si les techniques conventionnelles d’identification
des différents germes se basent sur leurs aspects phénotypiques, il est possible aujourd’hui
d’identifier les microorganismes en analysant directement leurs protéines (Cariello, 2012).
En microbiologie, l’identification traditionnelle des bactéries se fait principalement en
étudiant leurs
aspects
morphologiques
(macro-
ou
microscopiquement)
et
leurs
caractères biochimiques. Ces tests requièrent la croissance des bactéries dans des galeries de
tests biochimiques et nécessitent une incubation allant de 4 à 18 heures.
Une nouvelle méthode basée sur la spectrométrie de masse peut être utile au laboratoire
de bactériologie pour l’identification rapide des différents pathogènes. Contrairement
aux méthodes classiques, la spectrométrie de masse analyse directement les macromolécules
des différents germes, notamment les protéines, permettant ainsi d’obtenir des résultats plus
rapidement (Cariello, 2012).
8.2.1. La spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse consiste à séparer et identifier des molécules selon leur
masse et leur charge. Les applications de la spectrométrie de masse sont nombreuses
et touchent divers domaines: en biotechnologies pour l’analyse des peptides ou
oligonucléotides, en pharmacologie pour le dosage de médicaments, dans le domaine
de l’environnement pour l’analyse de l’eau, en clinique pour la recherche de drogues, etc.
Il existe plusieurs types de spectromètres de masse pouvant séparer des molécules plus
ou moins grandes et leurs méthodes ont toutes en commun les étapes suivantes ( Sellier et
Morin, 2002 ) :
·
Préparation et introduction de l’échantillon
·
Ionisation des molécules d’intérêt
·
Séparation des ions en fonction de leur rapport masse/charge
·
Détection et amplification du signal
·
Analyse des données et identifications de l’échantillon
52
Synthèse bibliographique
Les premiers spectromètres de masse datent du début du 20e siècle et ont servi
en physique à rechercher les différents isotopes d’un élément chimique. C’est Francis
William Aston qui conçut le premier spectromètre de masse en 1922. Il a réussi à
démontrer l’existence des isotopes en les séparant selon leur masse et leur charge.
Au cours du 20ème siècle, la spectrométrie de masse prend de plus en plus d’ampleur
et de nombreuses nouvelles techniques d’ionisation et de séparation des ions ont été
mises en place.
Le développement de la méthode MALDI-TOF se fait dans les années 80. À cette
période, l’ionisation se faisait sur des molécules ayant une taille d’environ 1000
Daltons et il était impensable d’ioniser des molécules excédant 10 000 Daltons car trop
fragiles. En 1985, Koichi Tanaka, chimiste japonais ayant reçu un Prix Nobel en 2002,
constate que des macromolécules peuvent être séparées en mélangeant l’échantillon
avec une solution contenant de la poudre métallique ultrafine et du glycérol. Il réussit à
ioniser la molécule de lysozyme
d’une taille de 14 300 Daltons. Durant la même
période, Michael Karas et Franz Hillenkamp réussissent à ioniser l’albumine possédant une
taille de 66 600 Daltons (Tonella et Petrini, 2011).
Les différentes recherches menées pas les équipes de K. Tanaka et Karas/Hillenkampf
ont permis de mettre au point la technique de spectrométrie de masse MALDI-TOF utile dans
l’analyse des biomolécules.
8.2.2. La spectrométrie de masse MALDI-TOF
8.2.2.1. Principe
Le spectromètre de masse MALDI-TOF est un spectromètre utilisant une source
d’ionisation laser assistée par une matrice (MALDI
=
Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionisation) et un analyseur à temps de vol (TOF = Time-Of-Flight).
La séparation des molécules par cette technique est plus douce qu’avec les autres
méthodes. Elle permet d’ioniser des molécules de grande taille, peu volatiles et sensibles à
la chaleur sans les dégrader (Young, 2004). La méthode MALDI-TOF s’applique aux
biomolécules plus fragiles comme les peptides, les protéines, les glycoprotéines et les
oligonucléotides (Ashcroft, 2012.).
L’échantillon est mélangé à la matrice et placé sur une lame. Le dépôt (ou spot)
formé est appelé cible. Une source laser est dirigée sur la cible afin d’ioniser les
53
Synthèse bibliographique
molécules de l’échantillon. Les ions sont ensuite détectés en mesurant le temps que mettent
les différentes particules à atteindre le détecteur. La vitesse de chaque particule dépend
du rapport masse/charge. Les molécules plus grandes mettront plus de temps à atteindre le
détecteur, tandis que les molécules plus petites arriveront plus vite. Une fois l’ion arrivé au
détecteur, le signal est amplifié et envoyé à un ordinateur qui traite les données et donne les
résultats sous forme de spectre (Tonella et Petrini, 2011).
8.2.2.2. La matrice
La matrice est constituée de molécules cristallisées dont les plus utilisées sont l’acide
2,5 dihydroxybenzoïque
(DHB),
l’acide
sinapinique
et
l’acide
α-cyano-4-
hydroxycinnamique (CHCA). Ces molécules sont ajoutées à un solvant (acétonitrile,
éthanol ou acide trifluoroacétique). Le DHB convient pour l’analyse des échantillons
organiques hydrophobes ou des polymères aromatiques, tandis que l’acide sinapinique
et l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique sont destinés pour l’analyse des protéines.
Un solvant composé d’eau et d’acétonitrile est ajouté à la matrice afin de permettre aux
substances de l’échantillon de se dissoudre dans le mélange : les substances hydrophobes de
l’échantillon auront une affinité pour l’acétonitrile et les substances hydrophiles auront une
affinité pour l’eau (Cariello, 2012).
Après avoir mélangé la matrice à l’échantillon, le spot est séché à l’air. Le solvant va
ainsi s’évaporer et il ne restera plus que la matrice cristallisée et l’analyte à l’intérieur.
Les composants de la matrice doivent avoir plusieurs caractéristiques :
·
ils doivent pouvoir se mélanger avec les solvants organiques et l’eau
·
ils doivent être assez grands afin de ne pas s’évaporer lors de la
préparation
de l’échantillon ou lorsque celui-ci est introduit dans le
spectromètre
·
ils doivent être assez petits afin d’avoir une bonne volatilité et se
vaporiser sous l’action du rayon laser
·
ils doivent être acides afin de transmettre des protons à l’analyte et ainsi
l’ioniser
·
ils doivent pouvoir absorber fortement et rapidement les rayons ultraviolets du laser
54
Synthèse bibliographique
8.2.2.3. Désorption-Ionisation
Un laser UV (337 nm de longueur d’onde) d’azote (N2) est pulsé en direction de la
cible. La matrice ayant une grande réactivité pour l’absorption de la lumière UV absorbe
l’énergie du laser protégeant ainsi les molécules protéiniques de la dégradation.
L’énergie du laser produit deux phénomènes : tout d’abord, la matrice se vaporise
libérant les peptides (désorption), ensuite, elle transfère ses protons à l’analyte qui s’ionise
(Figure 7).
Figure 7: Principe d'ionisation par la technique MALDI.
L’analyte (en vert) est cristallisé dans la matrice (en violet).
Les ions peuvent être chargés positivement ou négativement selon leur nature.
Les protéines et peptides ont des groupements accepteurs de protons et sont ionisés
positivement. Les oligonucléotides et les saccharides ont des groupements qui perdent un
proton et sont ionisés négativement.
Peptides :
R-NH2 + H+→ R-NH3+
(ionisation positive)
Saccharides : Acides carboxyliques R-CO2H → R-CO2Fonction alcoolique R-OH → R-O-
55
(ionisation négative)
(ionisation négative)
Synthèse bibliographique
8.2.2.4. La spectrométrie à temps de vol (TOF)
La spectrométrie à temps de vol est une technique séparant les substances
ionisées en fonction de leur charge et de leur poids moléculaire. La séparation se fait entre
une anode et une cathode dirigeant ainsi les molécules ionisées vers l’électrode portant la
charge inverse des ions à analyser (Figure 8). Les ions passent ensuite à travers un
champ électrique de force connue accélérant leur progression (Tonella et Petrini, 2011). Le
spectromètre mesure le temps que mettent les différents ions à atteindre le détecteur. Les
grosses molécules mettent plus de temps à atteindre le détecteur que les petites
molécules. Elles sont ainsi séparées en fonction de leur rapport masse/charge.
Le détecteur envoie ensuite les informations enregistrées à l’analyseur qui va
traiter les données et les présenter sous forme de spectre.
8.2.2.5. Le spectre
Les données enregistrées sont calculées afin de transposer les résultats dans un
spectre où chaque pic correspond à un type de molécule. L’axe des ordonnées représente
l’intensité relative du signal et l’axe des abscisses indique la taille de la molécule en Daltons.
L’appareil intègre les différents pics enregistrés et recherche dans la base de
données l’identification du germe correspondant (Cariello, 2012).
56
Synthèse bibliographique
Figure 8: Technique Time of flight (TOF)
Figure 9: Spectre MALDI-TOF
57
Matériels et méthodes
1. Lieu du travail
Ce présent travail a été élaboré au niveau de trois laboratoires ;
Le laboratoire de microbiologie appliquée (LMA) du département de biologie de la
faculté des sciences de l’université d’Oran.
Le laboratoire de microbiologie de l’hôpital militaire régional universitaire d’ORAN
(HMRUO) «Dr Amir Mohamed BENAISSA».
Le laboratoire de microbiologie du département de chimie analytique, nutrition et
science de l’alimentation, école vétérinaire, sciences/ collège de biotechnologie de l’université
de Santiago De Compostella de Lugo (Espagne).
2. Provenance et prélèvement des échantillons
Les échantillons du lait cru de chamelle prélevés provient du sud-ouest d’Algérie de
différentes régions : Abadala et Zouzfana de la wilaya de Bechar, Sidi Makhlouf de Laghouat,
Wadi Chergui d’El Bayed et des nomades dans la wilaya de Tindouf. Le Tableau13 représente
les caractéristiques des chamelles dont on a prélevé le lait.
Figure 10: prélèvement d’un échantillon de lait de chamelle
Le prélèvement a été effectué tout en respectant les conditions d’asepsie. Le lait est
traité manuellement après lavage des mamelles (pis), directement dans des flacons stériles.
Les échantillons ont été transportés dans une boite isotherme et conservés à 4°C jusqu’à leurs
utilisation qui a eu lieu dans les 30h qui suivent.
58
Matériels et méthodes
Tableau 13: Caractéristiques des chamelles dont on a prélevé le lait.
Région, Wilaya
Couleur
Âge
(ans)
5
9
10
Race
Heure de
prélèvement
19h :30
19h :30
7h :40
Production
journalière(L)
6–9
6–9
5 – 10
14h :00
6h :00
6h :20
6–9
6–9
4–7
Ech. 1
Ech. 2
Ech. 3
Abadla, Bechar
Abadla, Bechar
Sidi Makhlouf, Laghouat
Marron
Marron
Marron
Ech. 4
Ech. 5
Ech. 6
Zouzfana, Bechar
Zouzfana, Bechar
Wadi Chergui, El Bayed
Jaunâtre
Marron
Jaunâtre
9
5
7
Reguibi
Reguibi
Ouled Sidi
Cheikh
Reguibi
Reguibi
Berberi
Ech. 7
Jaunâtre
4
Reguibi
17h :00
5–8
Ech. 8
Beni mellal, Abadla,
Bechar
Les nomades, laghouat
jaunâtre
8
/
5–8
Ech. 9
Les nomades, laghouat
marron
7
/
5–8
Ech. 10
Ech. 11
Ech. 12
El mora, abadla, Bechar
Les nomades, Tindouf
Les nomades, Tindouf
marron
Marron
Jaunâtre
8
5
6
Ouled Sidi
Cheikh
Ouled Sidi
Cheikh
Reguibi
Targui
Targui
19h :30
18h :15
18h :15
6–9
6–9
6–9
3. Caractérisation phénotypiques, biochimiques et physiologiques
3.1. Isolement des souches du genre Leuconostoc
3.1.1. Milieux d’isolement
Afin d’isoler des souches du genre Leuconostoc, deux milieux de cultures sélectifs ont
été utilisés lors du travail dans le but de favoriser la prolifération du germe désiré et éliminer
et/ou retarder la croissance des autres bactéries lactiques;
Le milieu MRS (Man, Rogosa et Sharpe, 1960) a été additionnée d’un antibiotique, la
vancomycine qui joue le rôle d’un agent sélectif des Leuconostocs à raison de 30 µg/ml
(Mathot et al., 1994).
Le milieu MSE (Mayeux, Sandine et Elliker, 1962) a été utilisé comme milieu sélectif
pour les bactéries lactiques qui produisent du dextrane.
3.1.2. Préparation des suspensions de dilutions
1 ml d’échantillon du lait cru de chamelle a été pipeté aseptiquement dans 9 ml d’eau
physiologique. Des dilutions décimale de 10 -1 jusqu’à 10-8 ont été réalisées, 1 ml des 4
dernières dilutions ont été ensemencées en profondeur dans les milieux MRS et MSE
additionnées de Vancomycine (30µg/ml) (Mathot et al., 1994).
Les boites ont été incubées à 30°C pendant 24 à 72h
59
Matériels et méthodes
3.2. Caractérisation phénotypique, biochimique et physiologique
3.2.1. Caractérisation phénotypique
Les colonies typiques qui présentent des aspects morphologiques identiques au genre
Leuconostoc (forme, taille, élévation, pigmentation, contour, viscosité) (Mair et al., 1986) ont
été isolées à partir des boites incubées ainsi repiquées dans du bouillon MRS suivi par une
incubation à 30°C.
3.2.1.1. Purification des isolats
La purification des souches isolées a été réalisée par subculture des isolats dans du
bouillon MRS et puis ensemencer en surface par stries dans du MRS gélosé (Kihal, 1996) ;
Les colonies obtenues doivent être bien isolées et homogènes.
3.2.1.2. Coloration de Gram
La réalisation de la coloration différentielle de Gram (Larpent et Larpent, 1990 ; Heleni
et al., 2006), suivi par une observation microscopique au grossissement (G x100) permet de
classer les bactéries selon le Gram, la morphologie cellulaire et le mode d’association (Joffin
et Leyral, 1996).
3.2.2. Caractérisations biochimiques
3.2.2.1.
Recherche de la catalase
La recherche de l’enzyme catalase est le deuxième test de pré-identification. Cette
enzyme respiratoire permet la dégradation du peroxyde d’hydrogène en eau et dioxygène
selon la réaction suivante :
H2O2
catalase
H2O +1/2O2
Elle a été mise en évidence par contact de la colonie avec une solution fraiche d’eau
oxygénée à 10 volumes, un dégagement gazeux abondant (du dioxygène) sous forme de
mousse traduit la présence de la catalase.
60
Matériels et méthodes
3.2.2.2. Hydrolyse de l’arginine
La recherche de l’arginine dihydrolase (ADH) est intéressante pour la caractérisation
des bactéries lactiques. Cette enzyme libère l’ammoniac et la citruline à partir de l’arginine,
elle a été étudiée sur le milieu gélosé M16 BCP (Thomas, 1973) qui contenait du Lactose
(2 mg/ml), l’arginine (4 mg/ml) et le pourpre de bromocrésol (0,05 mg/ml) comme indicateur
de pH.
Les bactéries lactiques qui utilisent le lactose acidifient le milieu en donnant ainsi une
coloration jaunâtre sur la gélose. D’autres bactéries lactiques sont capables d’utiliser
l’arginine et ré-alcalinisent le milieu, leurs colonies apparaissent blanchâtres. La couleur de
l’indicateur de pH demeure inchangée.
3.2.2.3. Production de dextrane
Le dextrane est un exopolysaccahride produits par quelques espèces du genre
Leuconostoc ainsi que d’autres genres bactériens.
La production du dextrane a été mise en évidence par l’ensemencement des souches sur
le milieu gélosé MSE (Mayeux et al., 1962) et une incubation à 30 °C pendant 24 à 48h. Une
production de dextrane apparait sous forme de colonies larges, gluantes et visqueuses.
3.2.2.4.
Type fermentaire
Ce test a permis de savoir le type du métabolisme de la bactérie, si elle est
homofermentaire ou hétérofermentaire.
Il a été réalisé par inoculation de la souche dans un bouillon MRSg (glucose au lieu du
lactose) contenant une cloche de Durham avec une incubation à 30°C pendant 24 à 48h.
L’apparition d’un trouble dans le milieu de culture avec la présence du gaz dans la
cloche indique un métabolisme hétérofermentaire (Hariri et al., 2009).
61
Matériels et méthodes
3.2.3. Caractérisations physiologiques
3.2.3.1.
Tolérance à la salinité
La croissance en présence de différentes concentrations de chlorure de sodium (NaCl)
donne des renseignements précieux pour l’identification. Un ensemencement des souches
d’une culture jeune de 18h dans deux tubes du bouillon MRS contenant 3% et 6,5% de NaCl
ont été incubés à 30°C pendant 5 jours avec un témoin (un bouillon MRS sans NaCl)
(Guessas et Kihal, 2004).
3.2.3.2. Croissance à différent pH
Ce test a permis de différencier entre les souches qui croissent dans un milieu acide ou
neutre. On a préparé un bouillon MRS avec différent pH, le premier a été à 4.6 et l’autre à 6.5.
On a introduit une préculture des souches dans les bouillons préparés puis on a incubé à 30°C
pendant 72 heures (Carr et al., 2002).
3.2.3.3. Croissance à différente température et la thermorésistance
La croissance à différent température a permis une différenciation entre les bactéries
thermophiles ou psychrophiles. Des cultures jeunes ont été ensemencées dans le bouillon
MRS en les incubant pendant 5 jours à différents températures : 4°C, 15°C, 30°C, 37°C et
45°C (Guessas et Kihal, 2004).
Le test de la thermorésistance a été effectué au bain marie après l’inoculation des
souches à 63.5°C pendant 30 minutes et 55°C pendant 15 minutes (Guiraud, 1998).
3.2.3.4. Étude du profil fermentaire
La dégradation des sucres permet de différencier entre les espèces de Leuconostoc et les
sous espèces de Leuconostoc mesenteroides. La fermentation des sucres a été concrétisée sur
bouillon MRS sans extrait de viande ni sucres ajouté, additionné de pourpre de Bromocrésol
(MRSBCP-EV).
La source de carbone a été représentée par l’un des sucres suivant : l’arabinose, maltose,
saccharose, rhamnose, raffinose, mannitol, sorbitol, galactose, lactose, fructose, glucose,
xylose et l’amidon.
62
Matériels et méthodes
Les solutions sucres ont été préparées à 3% et stérilisés au bain-marie à 110°C pendant
10 min. 1ml de la solution stérile a été ajouté à 10 ml de MRS BCP.
La plaque d’Elisa a été utilisée pour ce test (Figure 11). Une solution bactérienne
servant à ensemencer les puits contenant les différentes sources de carbone a été préparée.
Une culture de 18 heures de la souche appropriée a été centrifugée à 5000 tr/mn pendant 15
min. Le culot récupéré a été additionné à 2 ml de tampon phosphate puis re-centrifugé aux
mêmes conditions pour le débarrasser des restes du milieu de culture et obtenir un culot
cellulaire pur. 5 ml de milieu MRSBCP-EV a été additionné pour former la solution cellulaire
servant à ensemencer les puits contenant différentes source de carbone ; 100 μl de cette
solution bactérienne a été déposée dans chaque puit. La lecture des résultats a été faite après
24 et 48 heures d’incubation (Guessas, 2006).
L’identification de nos souches bactériennes a été achevée selon le schéma de
systématique selon Bjorkroth et al. (2006) qui est illustré dans la Figure 12.
3.2.3.5. L’utilisation du citrate
La dégradation du citrate se fait grâce à la citratase, une enzyme existe dans certaines
espèces de Leuconostoc.
L’utilisation du citrate a été étudiée sur milieu gélosé Kempler et Mc Kay (1980) (Kihal
et al., 1996 ; Moulay, 2006). Ce milieu contient une solution de ferricyanide de potassium et
une solution de citrate ferrique. La présence du citrate dans le milieu inhibe la réaction entre
l’ion ferrique et le potassium ferricyanide. Les colonies qui fermentent le citrate lancent la
réaction entre ces ions il en résulte la formation de colonies bleues ou ayant un centre bleu
(après 18 h-72 h d’incubation). Les colonies incapables de fermenter le citrate restent
blanches.
63
Matériels et méthodes
Sucres utilisés
Souches
Figure 11: schéma représentant l’utilisation de la plaque d’Elisa pour effectuer le profil
fermentaire des souches.
Figure 12: schéma présentant la démarche dichotomique pour l’identification
présomptive des espèces de Leuconostoc (Carr et al., 2002)
64
Matériels et méthodes
3.2.3.6.
La production d’acétoine
La production d’acétoine (acétylméthylcarbinol) a été testé sur milieu Clark et Lubs
(Guiraud, 1998). Les souches ont été incubées 24 h à 30°C. Après cette période, on test par la
réaction de Voges-Proskaeur dite réaction VP (Avril et al., 1992).
Dans un tube, 2 ml de la culture a été transvasée avec 0.5 ml de réactif α-naphtol à 6%
dans l’alcool absolu (VP1) et 0.5 ml d’une solution de soude (NaOH) à 16% dans l’eau
distillée (VP2), pour assurer la réaction de VP, on a agité soigneusement les tubes et on les a
laissé en contact direct avec l’air libre pendant 5 à 10 min à température ambiante. La
production d’acétoine se traduit par l’apparition d’un anneau rose à la surface du milieu.
Un VP positif signifie que la souche possède une voie métabolique particulière pour la
fermentation des hexoses, la voie butylèneglycolique (Guessas, 2006).
3.2.4. Identification par galerie API
Pour la détermination de l’espèce, des galeries API (bioMerieux, France) ont été
utilisées pour la mise en évidence de l’activité enzymatique et le profil de fermentation des
hydrates de carbone. Les seules souches productrices de substances antimicrobiennes ont été
identifiées en utilisant des galeries API® 20 STREP (bioMerieux, France). Les bactéries à
tester ont été inoculée dans chaque tube de la galerie contenant un substrat différent sur lequel
elle allait réagir. Pendant l’incubation, le catabolisme des glucides conduit à la production
d’acides organiques qui provoquent le virage de l’indicateur de pH, ce qui donne une
coloration différente à chaque cupule.
Les souches Leuconostoc mesenteroides ont été isolées depuis une boite MRS et
cultivée pendant une nuit à 30°C. Des colonies ont été prélevées et inoculées dans 2 ml de
suspension medium d’API 20 STREP afin d’obtenir une suspension dense. Cette préparation
était égale à une opacité supérieure à 4 Mc Farland. La solution doit être utilisée
extemporanément. Après homogénéisation, la suspension medium ainsi inoculé a été réparti
dans des microtubes qui contiennent des substrats déshydratés. Les tests ont été recouverts
d’huile de paraffine pour éviter un éventuel dégagement gazeux. La galerie a été incubée
à 30°C pendant 48 h. La lecture du profil biochimique a été faite à l’aide d’un tableau de
lecture et l’identification a été obtenue à l’aide du catalogue analytique ou du logiciel
d’identification.
65
Matériels et méthodes
4. Conservation des souches
4.1. Conservation pour une courte durée
La conservation à court terme des souches pures a été effectuée sur milieu solide MRS
incliné. Après croissance à la température appropriée (30°C), les cultures ont été maintenues à
4°C et un repiquage a été faite toutes les 3 semaines pour les maintenir en vie (Saidi et al.,
2002).
4.2. Conservation pour une longue durée
À partir des cultures jeunes de 18h incubées dans un milieu liquide, les cellules ont été
récupérées par centrifugation à 5000 tours par minute pendant 10 min. Une fois le surnageant
était éliminé, on a ajouté le milieu de conservation sur le culot.
Ce milieu contenait du lait écrémé et 30% de glycérol. Les cultures ont été conservées
en suspension dense dans des eppendorfs à -20°C. En cas de besoin, les souches sont
repiquées dans du lait écrémé enrichie par 0.5 % d’extrait de levure, deux fois avant
l’utilisation (Saidi et al., 2002 ; Badis et al., 2005).
5. Caractérisation moléculaire des souches Leuconostoc
5.1. Les souches bactériennes et les conditions de culture
Les souches purifiées de Leuconostoc qui ont été maintenues à -20°C dans le lait
écrémé avec du glycérol seront par la suite repiquées et enrichies dans un bouillon MRS
pendant 6h à 37°C.
Les souches de références utilisées pour identifier génétiquement nos souches
Leuconostoc mesenteroides sont de différentes sources (Tableau 14); d’une collection type
des cultures espagnoles et d’une collection type des cultures de l’université de Ghent
(Belgique). Les souches de références sont montées dans le Tableau 14.
66
Matériels et méthodes
Tableau 14: les souches de référence utilisées dans l’identification phylogénétique et
protéomique
Souches
Source
Origine
Leuconostoc mesenteroides
CECT 219
Olive fermenté
Leuconostoc mesenteroides
LMG 6908
ND
Leuconostoc pseudomesenteroides
CECT 4027
Jus
Leuconostoc pseudomesenteroides
LMG 11482
ND
Leuconostoc carnosum
CECT 4024
Viande de bœuf
Lactococcus lactis
CECT 4432
Lait de vache
Lactococcus lactis
LMG 1363
Lait de vache
CECT : collection type des cultures espagnoles.
LMG : collection type des cultures de l’université de Ghent (Belgique).
ND : n’est pas déterminé.
5.2. Identification génétique des souches Leuconostoc par le séquençage
du gène 16S ARNr
5.2.1. Extraction d’ADN génomique
L’extraction d’ADN a été réalisée en utilisant le Kit DNeasy (Invitrogene). Après avoir
cultivé la souche Leuconostoc mesenteroides dans 10 ml de bouillon MRS pendant 24h, on a
rempli les eppendorfs par 2 ml de cette culture. Une centrifugation a été effectué à 7500 tpm
pendant 10 min en se débarrassant du surnageant. On a resuspendu le culot bactérien dans 180
µl de tampon de lyse enzymatique puis on a incubé à 37°C pendant 1 heure. On a ajouté 25 µl
de Protéinase K et 200 µl de tampon AL ensuite on a bien mélangé avec le vortex. On a
effectué une dernière incubation à 70°C pendant 30 min.
67
Matériels et méthodes
5.2.2. Purification d’ADN
La purification d’ADN a été réalisée par l’ajout de 200 µl d’éthanol (96-100%) sur
l’ADN extrait puis on a mélangé à l’aide du vortex. On a déposé le mélange dans le DNeasy
Mini spin déjà placé dans un tube de collecte de 2 ml puis on a centrifugé pendant 1 min à
8000 tpm. On s’est débarrassé du filtrat ainsi que le tube de collecte. Après l’emplacement de
la colonne du DNeasy Mini spin dans un nouveau tube de collecte de 2 ml, on a rajouté 500 µl
du tampon AW1 puis on a centrifugé pendant 1 min à 8000 tpm. On s’est débarrassé de
nouveau du filtrat et le tube de collecte. On a replacé la colonne du DNeasy Mini spin dans
un nouveau tube de collecte de 2 ml et ajouté 500 µl du tampon AW2 ensuite on a centrifugé
pendant 3min à 13000 tpm pour sécher la membrane du DNeasy. Se débarrasser pour une
autre fois du filtrat et le tube de collecte. Pour maximisé le rendement de l’ADN, ces étapes
sont répétés deux fois. On a placé la colonne du DNeasy Mini spin dans un nouveau tube de
collecte de 2 ml et on a rajouté 100 µl du tampon AE directement sur la membrane du
DNeasy sans la toucher. On a incubé à température ambiante pendant 1 min. Ultérieurement,
on a centrifugé pendant 1 min à 8000 tpm et on n’a pas jeté le filtrat.
Figure 13: Protocole d'extraction de l'ADN
68
Matériels et méthodes
5.2.3. Conservation de l’ADN
·
L’ADN extrait peut être conservé au réfrigérateur pour 1 semaine au maximum
·
L’ADN extrait peut être congelé pour une longue période qui peut durer des
mois.
5.2.4. Quantification d’ADN purifié
Les concentrations d’ADN purifié seront mesurées en utilisant Qubit TM floumeter
(Invitrogen) après l’utilisation des réactifs de Quant-IT TM Kit Q (invitrogen).
On a commencé le protocole par faire sortir les réactifs qu’ils doivent avoir une
température ambiante puis on a placé les eppendorfs (2 pour les standards et un pour chaque
échantillon) ensuite on a préparé la solution du travail du Quant-iTTM par la dilution du réactif
du Quant-iTTM 1 :200 dans le tampon du Quant-iTTM. On a préparé les eppendorfs selon le
Tableau 15. On a mélangé pendant 2-3 secondes et incubé les pendant 2 min à température
ambiante.
On a lu les eppendorfs dans le Quant-iTTM fluorimètre (Figure 14) puis on a choisi
l’option ‘calculer la concentration’ ; les résultats de la lecture ont été en µg/ml (=ng/µl)
Les volumes de la PCR ont été calculés selon l’équation suivante :
VPCR = 100 ng / CDO (ng/µl)
Tableau 15: préparation des eppendorfs pour la quantification de l’ADN purifié
Les standards
Les
échantillons
Le volume à ajouter de la solution du travail
190 µl
180-199 µl
Le volume à ajouter du Standard (depuis le Kit)
10 µl
-
-
1-20 µl
200 µl
200 µl
Le volume à ajouter de l’échantillon
d’utilisateur
Le volume final de chaque eppendorfs
69
Matériels et méthodes
Figure 14: schéma explicatif de la quantification d’ADN purifié
5.2.5. Amplification de l’ARN 16S
L’amplification d’un fragment de 700 pb de l’ARN 16S du gène bactérien a été réalisée
avec des oligonucléotides universelles p8FPL/p806R dans un volume total de réaction de
50µl.
On a mis les échantillons d’ADN extrait, les oligonucléotides, le BIOMIX (BioMix,
Bioline, London, UK) et le H2O à température ambiante puis on les a mélangé bien. On a
préparé les eppendorfs spéciaux pour PCR qui contient un volume approprié d'échantillons
d'ADN génomique, 25 µl de biomix, 5 µl de chaque amorce (primers et revers) et de l’eau
distillée stérile afin de compléter le volume final.
Les oligonucléotides universelles p8FPL/p806R utilisés sont :
p8FPL (Forward)
5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
p806R (Reverse)
5′-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3′
On a mis les eppendorfs dans le thermocycleur (BioRad Laboratories, Hercules, USA)
et on l’a programmé ; la matrice d'ADN a été initialement dénaturée à 94 °C pendant 2 min.
Par la suite, un total de 35 cycles d'amplification a été réalisé dans un cycleur thermique
programmable. Chaque cycle consiste à une dénaturation pendant 20s à 94 °C, l'hybridation
des amorces pendant 20s à 55 °C et l'extension de 30s à 72 °C. Le dernier cycle a été suivi
d’une extension finale à 72 °C pour 15 min.
70
Matériels et méthodes
5.2.6. Détection des produits de PCR
Pour détecter la présence d'ADN, on a effectué une électrophorèse sur gel d'agarose
horizontal (2,5%) contenant à 0,5 µg/ml SYBR Safe (Invitrogen, Espagne) en tampon TAE
1X et 100V.
Les produits récoltés de la PCR ont été détectés par électrophorèse sur gel d'agarose à
2.5 %, la coloration a été faite au bromure d'éthidium. La visualisation a été effectuée sous
lumière UV et la photographie du gel a été prise par le ChemiDoc™ MP Imaging System
(Bio-Rad).
5.2.7. Séquençage d’ADN
5.2.7.1. Principe de la technique Sanger
La réaction de séquence que l’on a utilisée repose sur la méthode de SANGER. Le
principe de cette dernière consiste à initier la polymérisation de l’ADN à l'aide d'un petit
oligonucléotide (amorce) complémentaire à une partie du fragment d’ADN à séquencer.
L’élongation de l’amorce a été réalisée par le fragment de Klenow (une ADN polymérase I
dépourvue d’activité exonucléase 5’→3’) et maintenue par des ADN polymérases
thermostables, celles qui ont été utilisées pour la PCR. Les quatre désoxyribonucléotides
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) ont été ajoutés, ainsi qu’une faible concentration de l'un des
quatre didésoxyribonucléotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP). Ces derniers agissent
comme des terminateurs de chaîne : une fois incorporés dans le nouveau brin synthétisé, ils
empêchent la poursuite de l’élongation. Cette terminaison se fait spécifiquement au niveau
des nucléotides correspondant au didésoxyribonucléotide incorporé dans la réaction. Pour le
séquençage complet d'un même fragment d'ADN, on répète cette réaction quatre fois en
parallèle, avec les quatre didésoxyribonucléotides différents.
Avant le séquençage, les amplicons de PCR ont été purifiés avec le kit "ExoSAP-IT"
(GE Healthcare, Uppsala, Suède). Le séquençage direct a été réalisé avec le «Big Dye
Terminator v 3.1" (Applied Biosystems, Foster City, CA) .Les mêmes amorces utilisées pour
la PCR ont été également utilisés pour le séquençage des deux brins des produits de PCR.
71
Matériels et méthodes
5.2.8. L'analyse des séquences obtenues
Les réactions de séquençage ont été analysés dans un système de séquençage
automatique (ABI 3730XL ADN de l'analyseur, Applied Biosystems) avec le système POP-7.
Les séquences du gène d'ARNr ont été analysés avec le logiciel Chromas (Université Griffith,
Queensland, Australie) et alignées en utilisant Clustal Xsoftware (Saitou et al., 1987,
Thompson et al., 1997). Après l'alignement, ces séquences ont été identifiées par la recherche
de l'homologie de séquence entre les séquences de référence publiés en utilisant l'outil web
pour
BLAST
(National
Center
for
Biotechnology
Information
(NCBI),
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) (Altschul et al., 1990). Les homologies supérieures à 99% par
rapport à notre type de souche ont été considérées comme de bonnes identifications.
Les analyses phylogénétiques et moléculaires ont été réalisées avec le logiciel MEGA
5.0 (Kumar et al., 2008). Le regroupement phylogénétique et la construction d'un arbre à base
de la phylogénie ont été réalisées en utilisant la méthode de neighbor-joining (Saitou et al.,
1987) en se servant de la «méthode Bootstrap" comme un test de la phylogénie ainsi que le
« model à 2 paramètres de Kimura » pour calculer les distances évolutives (Kimura, 1980 ;
Tamura et al., 2011). L'arbre de consensus bootstrap déduit à partir de 1000 répétitions qui
ont été pris pour représenter l'histoire évolutive des taxons analysés (Felsenstein, 1985).
Pendant ce temps, les estimations de divergence et de la diversité des valeurs évolutives pour
les séquences du gène l'ARNr 16S ont été réalisées avec le logiciel MEGA 5.0 en utilisant le
«modèle du maximum composite de vrai semblance» (Tamura et al., 2011).
72
Matériels et méthodes
5.3. Identification des souches Leuconostoc par le MALDI-TOF MS
5.3.1. Préparation des extraits pour l’analyse protéomique
Une masse microbienne de chaque culture bactérienne a été prélevé et placé dans 100
µl d'une solution constituée de 50% d'acétonitrile (ACN) (Merck, Armstadt, Allemagne) et
1% d'acide trifluoroacétique aqueux (TFA) (Acros Organics, Morris Plains, NJ). Le culot
bactérien a été bien agité avec le vortex jusqu'à ce que le culot ait complètement remis en
suspension. L'homogénéisation complète du mélange était nécessaire pour obtenir de bons
profils spectraux. Après une centrifugation à 8000 tpm pendant 10 min, les surnageants ont
été transférés dans de nouveaux tubes et stockés à 20°C. Une aliquote de 1 µl de solution de
chaque échantillon a été mélangé avec 10µl d'une solution de matrice constituée de 10 mg de
α-cyano-4-hydroxycinnamique l'acide (α-CHCA) dans 1 ml de 50% d'ACN et 2,5% de TFA
aqueux.
A partir de cette solution finale de l'échantillon et de la matrice, 1 µl de l’aliquote a été
déposé manuellement sur une plaque d'acier inoxydable du MALDI et on l’a laissé sécher à la
température ambiante. Une fois les échantillons ont été séchés, la plaque a été introduite dans
le spectrophotomètre de masse et les spectres ont été obtenus.
5.3.2. Analyse des spectres obtenus
Les spectres de masse ont été obtenus en utilisant un spectromètre de masse "DE STR
MALDI-TOF" (Applied Biosystems, Foster City, CA) fonctionnant en mode linéaire et
l'extraction des ions positifs a été effectuée avec une tension d'accélération de 25 000 V et le
temps de retard à 350 ns. Le fil de tension du réseau et le guide ont été fixés à 95% et 0,05%,
respectivement. Chaque spectre a été accumulé par un total minime de 1 000 clichés laser, qui
ont été obtenus à partir de 10 positions différentes et elles ont été choisies manuellement à
partir du même point de l'échantillon dans une gamme de 1500-15000 Da. Pour chaque
souche, deux extractions ont été réalisées et les deux extraits ont été mesurés en double
exemplaire, donc un total de quatre spectres pour chaque souche bactérienne. Les spectres de
masse ont été calibrés à l'extérieur en utilisant un mélange de 1 pmol/µl d’oxydée de l'insuline
B-chain et 1 pmol/µl d'insuline bovine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) qui ont été analysées
avec le logiciel Data Explorer (version 4.0) (Applied Biosystems) pour la correction de base
et le filtrage de bruit.
73
Matériels et méthodes
Les listes de données contiennent des valeurs m/z qui ont été extraites à partir des
données de spectrométrie de masse, y compris les signaux avec des intensités relatives
supérieures à 2%. Les listes de pics de masse obtenues ont été analysées et comparées en
utilisant des pics qui s’étendaient de 2000 à 10000 Da de masse à cause de la reproductibilité
du profil spectral dans cette gamme de masse.
Les listes de masse ont été traitées ultérieurement avec une application gratuite sur le
Web, le SPECLUST, qui est disponible sur http://bioinfo.thep.lu.se/speclust.html (Alm et al.,
2006). L’option « les pics en commun » dans cette interface web a calculé la différence des
masses entre les quatre pics qui ont été pris de différentes listes de pics et a déterminé si deux
sommets sont identiques en tenant de compte l’incertitude de mesure (σ) et la valeur
homologue des pics (‫)ݏ‬. La valeur homologue des pics représente la probabilité que deux pics
avec leurs masses mesurées ݉ et ݉’ ont une différence de masse égal ou supérieur à |݉ – ݉’|,
a donné que la différence de masse était seulement due à des erreurs de mesure. Parce que
chaque souche bactérienne a été cultivée en double exemplaires et chaque culture a été
analysés en double exemplaires, cet outil a été utilisé pour examiner les quatre spectres de
chaque échantillon. Les pics communs représentatifs qui ont été présents dans les quatre
spectres ont été extraits par cette application web avec une partie de la valeur homologue des
pics qui était supérieur à 0,7 (ce qui correspond à une erreur de mesure de ± 5 Da) pour
obtenir des marqueurs biologiques spécifique à l’espèce et spécifique au genre. Un pic a été
considéré comme commun à quatre spectres si la valeur homologue des pics était plus grande
que 0.7, ce qui correspond à une gamme de 10 Da. Selon ces spécifications, les listes de
masse ont été créées pour chaque souche bactérienne (y compris les 5-35 masses de pics), qui
représente les empreintes digitales bactériennes reproductibles.
Les listes de masse de toutes les souches Leuconostoc ont été regroupées en utilisant
l'option de «Clustering» qui est également disponible dans le SPECLUST de l'interface Web.
La méthode de classification ascendante a créé un groupe pour chaque liste de pics ainsi que
les distances calculées entre les groupes. Les deux groupes avec la plus petite distance par
paire (de liaison complète) ont été ensuite fusionnés en un nouveau groupe et les distances ont
été calculées à nouveau en ajoutant tous les scores de similarité individuels pour chaque paire
de deux listes de pics. Ce processus a été répété jusqu'à ce qu'un seul cluster soit resté. Tous
les scores de similarité individuels de chaque paire des deux listes de pics ont été additionnés
pour calculer la distance entre les deux listes de pics. La largeur dans la valeur homologue des
pics a été fixée à 10 Da.
74
Matériels et méthodes
Enfin, le regroupement phyloprotéomique a été confirmé par l'analyse des listes de
masse en utilisant le logiciel Statgraphics Plus (version 5.1). Le tableau de la liste de masse a
été transformé en une table binaire, qui a été suivie par le regroupement en utilisant le centre
de gravité et les méthodes analytiques moyennes des groupes ainsi qu’à l'aide de la distance
métrique des blocs de population et les options des variables de groupes.
2. Préparation de l’échantillon
1.Microorganisme inconnu
5.Identification
3.Aquisition du spectre MALDI-TOF
MS
4.Analyse des listes de masses consensus
Figure 15: schéma général du travail pour l'identification des souches bactériennes par
MALDI-TOF MS
75
Matériels et méthodes
6. Caractérisation technologique des souches Leuconostoc mesenteroides
6.1. Mise en évidence de l’activité antimicrobienne
6.1.1. Matériel biologique
Les souches indicatrices utilisées lors des tests antibactériens sont répertorié dans le
Tableau16. Ce matériel bactérien a été utilisé dans les activités antagonistes de nos souches
obtenues de Leuconostoc mesenteroides.
Tableau 16: les souches indicatrices utilisées
Souches indicatrices
Provenance
Code
Listeria monocytogenes
Espagne
(LIHCA)
Espagne
(LIHCA)
Espagne
(LIHCA)
LMA
LMA
LMA
ATCC 4032
Conditions de
culture
BHIB/37°C
ATCC33090
BHIB/37°C
ATCC19119
BHIB/37°C
ATCC43300
ATCC25922
58
BN/37°C
BN/37°C
BN/37°C
Listeria innocua
Listeria ivanovii
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Lactobacillus
plantarum
LMA : laboratoire de microbiologie appliquée
LIHCA : laboratory of hygiene, inspection and food safety
6.1.2. Détection de l’activité antimicrobienne
Afin de détecter si nos souches ont la capacité de produire des substances
antimicrobiennes, la méthode de Fleming et al. (1975) a été adoptée. Cette recherche a été
réalisée selon deux méthodes, directe et indirecte.
L'activité antibactérienne a été estimée par la mesure du diamètre de la zone d'inhibition
observée autour des puits (double de la distance en mm allant du bord du puit jusqu'au point
où se termine l'inhibition de la croissance (fin de la zone d'éclaircissement)).
76
Matériels et méthodes
6.1.2.1. Interaction par méthode directe (Spot Agar Test)
L’activité antimicrobienne des isolats a été évaluée sur milieu solide selon la méthode
de Barefoot et Klaenhammer (1983). Le milieu MRS gélosé a été ensemencé par touche
(Spot) par nos souches en phase exponentielle et incubées à 30°C. Après la croissance des
souches, la deuxième couche a été coulée en dessus qui contenait 10 ml du milieu MH semisolide en ajoutant 100 µl d’une culture jeune de la souche indicatrice dont la charge
microbienne est ajustée au préalable à une A 625 nm se trouvant dans l'intervalle 0.08-0.1
(Anonyme, 2011). On a laissé le milieu se solidifie puis on les a ré-incubé à 37°C pendant
24h.
Les résultats positifs se manifestent par l’apparition d’une zone claire autour des
souches
Leuconostoc
qui
sont
considérées
comme
productrices
de
substances
antimicrobiennes.
6.1.2.2. Interaction par méthode indirecte (Well Diffusion Assays)
Afin de déterminer la nature de la substance inhibitrice produite par Leuconostoc
mesenteroides, on a réalisé les tests d’une méthode dites indirecte qui permet de mettre le
surnageant des souches Leuconostoc productrices de substances antimicrobiennes en contact
avec les souches indicatrices.
Les souches ont été cultivées dans un bouillon MRS et incubées pendant 6 à 8 heures
(Lacroix et al., 2011). Après l’incubation, la culture a été centrifugée à 6000 tpm pendant
30min à 4 °C ainsi le surnagent a été conservé. Dans des boites de pétri (9 mm) contenant du
MRS gélosé et ensemencés par les souches indicatrices (107 UFC/ml, approximativement),
des puits sont formés avec un emporte-pièce de 5 mm de diamètre et celées par 10 µl de
gélose MRS. Les puits recevront 100µl de surnageant de la souche à tester et les boites sont
incubée pendant 24 à 48 heures.
Les puits entourés par une zone claire et ayant un diamètre supérieur ou égale à 2 mm
seront considérées comme positives.
6.1.3. Mise en évidence de la nature de l’agent inhibiteur
77
Matériels et méthodes
Les inhibitions de la croissance de la souche indicatrice peuvent être dues à
l’acidification du milieu, à la production de peroxyde d’hydrogène, à la présence de phages ou
à la production de bactériocines (Meziani et al., 2009).
6.1.3.1. Inhibition due à la production d’acides organiques
L’étude de l’effet de l’abaissement du pH du milieu sur l’inhibition des souches
indicatrices a été réalisée selon Fleming et al. (1975) en milieu MRS tamponné à pH 7 à
l’aide d’un tampon phosphate (0.1M). Ce dernier, a été préparé selon les indications de
Benhamouche (2005).
Après incubation, la lecture des résultats a été faite en comparaison avec un milieu
témoin (non tamponné).
6.1.3.2. Inhibition due au peroxyde d’hydrogène
La croissance de certaines bactéries lactiques entraine la production de peroxyde
d’hydrogène (H2O2) qui est considéré comme un inhibiteur de la croissance bactérienne
(Cogan et al., 1981). Cet agent peut être dégradé par une enzyme, la catalase, présente chez
certaines espèces bactériennes telles que Staphylococcus aureus, Listeria innocua et Listeria
ivanovii.
6.1.3.3. Inhibition due aux phages
Nous avons effectué ce test pour écarter la supposition d’une inhibition causée par les
phages bactériens.
-
Technique 1
La technique a été réalisée par la découpe d’un fragment de la gélose où il y a eu une
zone d’inhibition. Ce fragment a été suspendu dans 1 ml de tampon phosphate stérile
contenant 50 µl de chloroforme. Après agitation, on a laissé décanter pendant 5 min, puis on a
prélevé 300 µl du milieu que l’on ajoute à 7.5 ml de gélose molle contenant la souche
indicatrice à 0.1 ml. Le mélange a été coulé aseptiquement dans une boite de Pétri et incubé
48 h à 28°C.
La présence de plage de lyse indique la présence des phages.
78
Matériels et méthodes
-
Technique 2
La souche productrice a été cultivée sur milieu gélosé et après incubation le milieu est
complètement délogé à l’aide d’une spatule stérile et déposé dans une autre boite de Petri
stérile en sens inverse (culture au-dessous). Une surcouche de gélose moelle ensemencée par
la souche indicatrice est coulée sur le premier milieu.
Après incubation, la production de bactériocine se traduit par l’apparition d’un halo
claire sur la surcouche contenant la souche indicatrice.
6.1.4. Recherche de substance inhibitrice de nature protéique
Afin de rechercher la production des substances antimicrobiennes comme les
bactériocines par nos souches Leuconostoc sélectionnées lors du criblage, la méthode des
puits a été réalisée.
Pour confirmer la nature protéique des substances inhibitrices, on a traité le filtrat d’une
culture de Leuconostoc productrice par différents enzymes protéolytiques dissoute dans du
phosphate de sodium (0.1M, pH7).
Selon les conditions décrites par Lacroix et al. (2011), à partir d’une culture jeune, 2 ml
a été prélevé et centrifugé à 8500 tpm pendant 10 min. 1ml du filtrat de cette culture a été
additionné d’ 1 mg/ml de trypsine et 1 mg/ml d’α-chymotrypsine, séparément. Le mélange a
été incubé à 37°C pendant 1h. On a stérilisé le tout par filtration à l’aide d’un filtre millipore
de 45 µm de diamètre. Les réactions enzymatiques ont été désactivées par une incubation à
65°C pendant 10 min (Trias et al., 2008). L’action de ce filtrat a été testée par la méthode des
puits sur milieu Muller-Hinton préalablement ensemencé par les souches indicatrices (DO 625
nm = 0.08-0.1) suivi par une incubation à 37 °C pendant 24 à 48h.
79
Matériels et méthodes
6.1.5. Optimisation de la production de substances antimicrobiennes
6.1.5.1. Effet de la température
Les substances antimicrobiennes ont été testées pour leur thermostabilité et la
conservation de leurs activités vis-à-vis des souches indicatrices. Le filtrat des cultures de
Leuconostoc productrice de substances antimicrobiennes a été exposé à différentes
températures pendant différentes durée (50°C pendant 60min, 60 °C pendant 30min, 100°C
pendant 15min, 100°C pendant 30min, 100°C pendant 60min et 121°C pendant15 min) puis
on a testé de nouveaux leur activité antimicrobienne.
6.1.5.2. Sensibilité au pH
L’effet du pH sur l’activité antimicrobienne des surnageants des souches productrices a
été observé par l’ajustement du pH de ces derniers de 2 à 10 suivit d’une incubation de 2
heures puis on a testé de nouveaux leur activité antimicrobienne.
6.1.5.3. Sensibilité aux solvants organiques
La sensibilité des substances antimicrobiennes aux différents détergents a été testé par
l’incubation du surnageant neutralisé en présence de 1% de Tween-80 et 1% d’urée pendant
2h à 37°C, puis une ré-incubation de ces derniers à 37 °C. Ensuite on a testé de nouveau leur
activité antimicrobiennes.
80
Matériels et méthodes
6.2. Suivi cinétique d’acidité et de croissance en culture pure et en
culture mixte
Le genre Leuconostoc joue un rôle important dans la technologie des produits
laitiers, en particulier à travers la production de gaz et des acides lactiques ainsi que les
produits aromatiques; la production de l’acide lactique indique leur croissance et provoque la
diminution du pH.
On a choisis l’isolat Ln C12 pour effectuer cette expérience, les souches indicatrices
utilisées (Listeria innocua et Listeria ivanovii) ont été ensemencées par stries sur leurs
milieux spécifiques et incubées à 37°C pendant 18h et la souche Leuconostoc mesenteroides
Ln C12 a été ensemencée sur MRS et incubée à 30°C. Après leur croissance, une colonie de
chaque a été inoculée dans son bouillon approprié et incubée pendant 18h. Un volume de 3
ml de chaque souche (107 UFC/ml approximativement) a été introduit dans 10 ml du lait
écrémé additionné de 0.3% d’extrait de levure et incubée à 30°C pendant 18h. 9ml de cette
préculture a été additionnée à une fiole contenant 300 ml du lait écrémé à 0.3% d’extrait de
levure. Le contenu des flacons a été répartit dans des tubes stériles à raison de 10 ml par tube,
le tout a été incubé à 30°C (Figure 16).
Un intervalle de trois heures, des échantillons ont été prélevés de façon aseptique pour
déterminer le pH, l'acidité Dornic, et le taux de croissance (Guessas et al., 2005 ; kihal et al.,
2009).
6.2.1. Etude de la cinétique des souches Leuconostoc en culture pure
6.2.1.1. Mesure du pH
Le pH a été mesuré à 25°C à l’aide d’un pH-mètre (OHAUS®). Le principe repose sur la
mesure directe du pH à l'aide d'une électrode plongée dans un bécher contenant les 10 ml du
lait écrémé.
81
Matériels et méthodes
6.2.1.2. Dosage d’acidité
L’acidité est dosée par titration avec une solution de NaOH (N/9) et exprimée en degré
Dornic (1°D correspond à 0,1 g d’acide lactique par litre de lait) (SBOUI et al., 2009). Le
degré Dornic correspondant au nombre de 1/10 de ml de soude Dornic N/9 nécessaire pour
assurer le virage de la phénolphtaléine (Guiraud, 1998).
L’acidité est déterminée par la formule : Acidité (°D) = VNaOH . 10
VNaOH: Volume de NaOH utilisé pour titrer l’acide lactique contenu dans les 10 ml de
lait.
Pour cela, 5 gouttes de solution phénophtaléine à 1% a été ajoutées dans 10 ml du lait
et on a ajouté une solution de soude 1/9N goûte à goûte à l’aide d’une burette jusqu'à
l’obtention de la couleur rose pale, le volume de la soude ajouter a été noté (Accolas et al.,
1977).
6.2.1.3. Mesure de la croissance
On a utilisé la méthode de numérotation sur milieu solide qui prend en compte que les
cellules vivantes (contrairement à la mesure par le spectrophotomètre qui détecte toutes les
cellules).
Après agitation à l’aide d’un vortex, les prélèvements ont été traités par dilution
décimale dans l’eau physiologique. Les dilutions adéquates ont été ensemencées en
profondeur dans le milieu MRS.
Après incubation, on a dénombré seules les boites contenant entre 25 et 250 colonies
(Kihal et al., 2007).
Les résultats sont exprimés selon la relation (Joffin et Leyral, 2006).
ൌ
ᎂ
ሺͳ ൅ Ͳǡͳʹሻ†
N : nombre de colonies en UFC/ml
∑C : la somme des colonies comptées sur les boites.
n1 : le nombre de boites comptées à la dilution la plus faible.
n2 : le nombre de boites comptées à la dilution la plus élevée.
d : est la valeur correspondant à la dilution à partir de laquelle les premiers
dénombrements ont été retenus.
82
Matériels et méthodes
6.2.2. Etude de la cinétique des souches Leuconostoc en culture mixte
La même technique a été utilisée (dans la section matériels et méthodes 6.2.), sauf que
le volume inoculé de la préculture a été 1.5 ml (10 7 UFC/ml approximativement) de notre
souche Leuconostoc mesenteroides (Ln C12) et 1.5ml (107 UFC/ml approximativement)
d’une pré-culture de la souche test (Listeria innocua et Listeria ivanovii). Les mêmes
précédentes étapes ont été suivies (Figure 16).
6.3. Etude probiotique des souches Leuconostoc mesenteroides
Les probiotiques présentent des propriétés qui sont variables selon l’espèce ou la
souche microbienne. Il est nécessaire de connaître le genre et l’espèce de la souche utilisée car
les effets probiotiques sont spécifiques à la souche microbienne.
La non pathogénicité (innocuité) des souches est un critère très important, les
souches ayant le statut GRAS (Generally Regarded As Safe) sont d'ailleurs à favoriser.
Toutefois, le critère de viabilité ou de survie demeure essentiel dans la sélection des
probiotiques qui doivent parvenir vivantes au site de leur action, à savoir l’intestin, et
donc
résister
aux
différents
mécanismes
de défense de l’hôte. Les bactéries étant
administrées par voie orale, il faut qu’elles franchissent les obstacles majeurs du transit
digestif : le pH acide, les sels biliaires, les enzymes pancréatiques…etc (Millette et al., 2008).
83
Matériels et méthodes
Figure 16 : schéma explicatif pour l’étude de la cinétique des souches Leuconostoc en
culture mixte
84
Matériels et méthodes
6.3.1. Tolérance à l’acidité
L’acidité de l’estomac est la première barrière à la survie des microorganismes.
Toutefois, certains peuvent survivre durant la traversée de l’estomac, grâce à une capacité
intrinsèque de résistance à l’acidité, ou à la faveur d’une baisse de la sécrétion acide de l’hôte,
ou bien à la protection conférée par certains aliments à pouvoir tampon élevé (Marteau,
2000).
L’acidité stomacale varie de pH=1,5 à pH=6 après la prise alimentaire. Pour l’heure, il
n’y a pas de véritable consensus sur le niveau de pH et la composition exacte du milieu.
Les cellules bactériennes de la souche Leuconostoc mesenteroides d’une culture jeune
(108 UFC/ml approximativement) ont été récupérées par centrifugation (4000 tpm pendant 10
min), le culot a été rincé par le PBS (phosphate buffer saline) [PBS par litre: K2HPO4
(Merck) : 1.41 g; KH2PO4 (Merck) : 0.26 g; NaCl (Merck) : 8.0g] stérile de pH 7. La
procédure centrifugation/rinçage a été répétée trois fois. Les cellules ont été remises en
suspension dans du PBS stérile ajusté à différents pH : 2.0, 3.0 et 4.0, les tubes ont été incubés
à 37°C pendant 3heures.
Les cellules bactériennes viables ont été déterminées sur milieu MRS par décomptage
des colonies.
6.3.2. Résistance à la pepsine
L’action antimicrobienne de la pepsine qui est une enzyme sécrété par l’estomac,
constitue la deuxième barrière biologique contre les éléments intrus ainsi qu’à la survie des
bactéries dans le tractus intestinal.
Les cellules bactériennes de la souche Leuconostoc mesenteroides d’une culture jeune
(108 UFC/ml approximativement) ont été récupérées par centrifugation (4000 tpm pendant 10
min), le culot a été rincé par du PBS [PBS par litre: K2HPO4 (Merck) : 1.41 g; KH2PO4
(Merck) : 0.26 g; NaCl (Merck) : 8.0g] à pH8. Après une autre centrifugation, les cellules
bactériennes ont été mises dans du PBS à pH2 et pH3 additionné de 3 mg/ml de pepsine
(Sigma) (Hosseini et al., 2009).
La résistance des souches Leuconostoc a été évaluée par la détermination du comptage
des cellules initiales puis après 3 heures d’incubations à 37°C.
85
Matériels et méthodes
6.3.3. Tolérance et hydrolyse des sels biliaires
Les sels biliaires sont formés par des dérivés du cholestérol et par des stéroïdes acides
secrétés par le foie et se trouvant principalement dans la bile. Ils permettent la fragmentation
des gros globules de lipides alimentaires qui facilite alors la digestion des lipides par la lipase
pancréatique.
Leur deuxième rôle est d'inhiber (par effet antibiotique) la prolifération des bactéries de
la flore intestinale dans la partie haute de l'appareil digestif. Certaines bactéries pathogènes
(tel que Salmonella enterica) ont développé des résistances aux sels biliaires.
Ces tests nous ont permis de collecter des souches Leuconostoc mesenteroides qui sont
résistantes aux sels biliaires.
6.3.3.1. Tolérance aux sels biliaires
Les cellules bactériennes de la souche Leuconostoc mesenteroides d’une culture jeune
(108 UFC/ml approximativement) ont été récupérées par centrifugation (4000 tpm pendant 10
min), le culot a été rincé par du PBS pH8, une autre centrifugation a été faite puis on a ajouté
du PBS pH8 additionnée de 0.5%, 1% et 2% d’oxgall (Sigma). Les tubes ont été incubés 4
heures à 37°C après une agitation vigoureuse (Hosseini et al., 2009).
Les cellules bactériennes viables ont été déterminées sur milieu MRS par décomptage
des colonies.
6.3.3.2. Hydrolyse des sels biliaires
Depuis une culture jeune de la souche Leuconostoc mesenteroides (108 UFC/ml
approximativement), un ensemencement a été réalisé sur milieu MRS additionné de 0.5%
d’oxgall (Sigma). Les boites ont été incubés 24 et 48 heures à 37°C (Hosseini et al., 2009).
L’hydrolyse bactérienne des sels biliaires a été visualisée comme une altération dans la
morphologie des colonies en comparant avec les cellules ensemencées sur les boites MRS
control (sans oxgall) ainsi par visualisation d’une zone de précipitation au contour des
colonies.
86
Matériels et méthodes
6.3.4. Activité hémolytique
L’hémolyse ou la lyse des hématies est due à la rupture de leur membrane plasmique,
souvent sous l’action de phosphatidyl-choline estérase des bactéries et sous l’action de
molécules provoquant la formation de pores membranaires. Ce phénomène libère
l’hémoglobine qui est ensuite plus ou moins digéré. Si la digestion est totale, la couleur rouge
disparait et on observe une zone éclaircie (hémolyse partielle), ou incolore (hémolyse
complète) autour de la colonie. On parle alors d’hémolyse β. La digestion peut être
incomplète et il se forme des produits verdâtres ou marrons et on parle de l’hémolyse α.
Depuis une culture jeune des souches de Leuconostoc, un ensemencement en surface
(108 UFC/ml approximativement) a été effectué sur milieu Columbia (Oxoid) contenant 5%
de sang humain. Les boites ont été incubées 48 heures à 37°C.
Les zones au contour des colonies vont définir le type de l’hémolyse : zone verte pour
α-hémolytique, zone claire pour β-hémolytique et pas de zone pour γ-hémolytique.
6.3.5. Résistance aux antibiotiques
L’antibiogramme des souches de Leuconostoc a été déterminé selon Anonyme (2011).
Sur milieu MRS gélosé et à partir d’une culture de 18h, on a ensemencé toute la surface de la
boite à l’aide d’un écouvillon stérile après avoir ajusté la culture à 0.5 Mc Farland.
Après séchage des boites à température ambiante, on a déposé les trente-trois disques
d’antibiotiques (Tableau17) sur les boites en utilisant un distributeur permettant la dépose
standardisée des disques sur la gélose. L’incubation a été effectuée à 30°C pendant 24h.
Les diamètres des zones d’inhibition observés autour des colonies classent les bactéries
comme chimiquement sensibles (S), intermédiaires (I) ou résistantes (R) à un antibiotique
précis, selon Liasi et al. (2009).
Deux souches de référence de résistance aux antibiotiques connue, Staphylococcus
aureus ATCC 43300, Escherichia coli ATCC 25922, ont été inclus dans les essais (Taheri et
al., 2009)
87
Matériels et méthodes
Tableau 17: les différents antibiotiques à utiliser ainsi que leurs symboles et leurs
charges de disque.
Antibiotique
Amikacin
Ampicillin
Azetrepnam
Cefalotin
Cefazolin
Cefepime
Cefixime
Cefotaxime
Cefsulodin
Ceftazidime
Chloramphenicol
Clindamycin
Erythromycin
Fosfomycin
Fusidic acid
Gentamicine
Imipenem
Kanamycin
Lincomycin
Netilmicin
Nitrofurantoin
Ofloxacine
Pefloxacin
Penicillin
Piperacinlline
Polymixin
Pristinamycin
Rifampicin
Spiramycin
Teicoplanin
Ticarcillin
Trimethoprim +
Sulphamethoxazole
Vancomycin
Charge du disque
30 µg
10 µg
30 µg
30 µg
30 µg
30 µg
5 µg
30 µg
30 µg
30 µg
30 µg
2 µg
15 µg
200 µg
10 µg
120 µg
10 µg
1 mg
15 µg
30 µg
300 µg
5 µg
5 µg
6 µg
75 µg
300 UI
15 µg
30 µg
100 µg
30 µg
75 µg
1,25 µg + 23,75 µg
Symbole
AN
AM
ATM
CF
CZ
FEP
CFM
CTX
CFS
CAZ
C
CM
E
FOS
FA
GEN
IMP
KAN
L
NET
FT
OFX
PEF
P
PIP
PB
PT
RA
SP
TEC
TIC
SXT
30 µg
VA
88
Matériels et méthodes
7. Traitement des données
7.1. L'analyse statistique de l’activité antimicrobienne et l’étude
probiotique
Les résultats ont été évalués à partir de trois répétitions d’expérience. Le système
d'analyse statistique version 19.0 (IBM Corp, Armonk, NY, USA) a été utilisé pour les
différences significatives ont été jugés à P < 0.05 en utilisant l’analyse unidirectionnelle de
variance.
7.2. Le suivi cinétique
7.2.1. Calcule de taux de croissance (µ)
La caractérisation de la croissance bactérienne a été réalisée par la détermination du
taux de croissance moyen (µ) de la phase exponentielle. Le taux de croissance représente le
nombre de division bactérienne par heure, il correspond à la pente de la phase exponentielle
de la croissance de la courbe log N.
Les taux de croissance ont été calculés selon l’équation de Monod : N = N02µt (Monod,
1949) ou N est la densité bactérienne.
La densité bactérienne (en log de cellules / ml) a été représenté en fonction du temps,
les pentes (P) des phases linéaires de croissance ont été estimées par régression linéaire
(Hassen et al., 1989). Les taux de croissance ont été alors calculés en fonction des pentes de la
courbe de croissance en utilisant l’équation suivante :
µ= (log 10 / log 2) . P = 3.33 . P (en h)
7.2.2. Calcul de temps de génération (G)
C’est le temps nécessaire au doublement de la population (en minutes)
G = 1 / µ (en minutes)
7.2.3. Calcul des vitesses maximales
Chaque paramètre (évolution de la croissance, le pH et l’acidité) a été tracé en fonction
du temps et d’après les courbes obtenues, les vitesses ont été estimées par régression linéaire
dans la phase exponentielle et le calcul de la pente représente la vitesse appropriée.
89
Résultats
1. Échantillonnage
Les échantillons du lait cru provenaient des zones arides et semi-arides de différentes régions
d’Algérie à partir de différentes chamelles saines (Figure 17) dont la race est Camelus
Dromadarius, ajoutant que le pâturage qu’elles utilisées a été presque identique entre autres
Acacia raddiana Savi (Talh), Atriplex halimus (gu’ttaf), Artemisia herba alba Asso (Chih),
Tamarix articulata (fersikh), Retama retam Webb (Rtam), Euphorbia guyoniana Boiss. Rent.
(Moulbina), Trananurn nudatum Del (Damrane). Le Tableau (13) montre d’autres détails sur
les chamelles ainsi que leurs échantillons collectés.
a)
b)
Figure 17: les chamelles dont on a prélevé le lait
a : chamelle jaunâtre
b : chamelles marron
90
Résultats
2. Paramètres organoleptiques et physiques des échantillons du lait camelin
Les échantillons collectés du lait de chamelle avaient en général une couleur blanche
opaque avec un gout acceptable et mousseux. Le lait camelin frais a une saveur sucrée et
piquante au même temps, mais la plupart des échantillons avaient un gout plus salé. Le
Tableau 18 regroupe les valeurs moyennes de trois répétitions (n=3) ainsi que les écarts-types
relatifs aux caractéristiques physiques des douze échantillons du lait camelin frais collectés.
Tableau 18: Paramètres physiques des échantillons du lait camelin frais
T°
pH
Acidité
Densité
(à 20°C)
(gr/l)
(à 20°C)
Ech. 1
37.7±0.01
6.36±0.05
1.73±0.07
1.023±0.01
Ech. 2
36.5±0.01
6.97±0.01
1.70±0.01
1.023±0.02
Ech. 3
36
7.04±0.03
1.54±0.02
1.025±0.01
Ech. 4
37.1±0.02
6.92±0.01
1.68±0.03
1.024±0.02
Ech. 5
37
6.99±0.02
1.62±0.02
1.023±0.03
Ech. 6
35.8±0.02
7.01±0.03
1.55±0.07
1.026±0.02
Ech. 7
35.5±0.01
7.00
1.58±0.05
1.023±0.01
Ech. 8
35±0.01
6.99±0.03
1.60±0.03
1.023±0.02
Ech. 9
36
7.04±0.01
1.52±0.08
1.025±0.01
Ech. 10
36
6.38±0.03
1.75±0.03
1.023±0.02
Ech. 11
37.3±0.02
6.05±0.02
1.77±0.08
1.025±0.01
Ech. 12
35.8±0.01
6.58±0.03
1.68±0.04
1.025±0.01
91
Résultats
3. Isolements et
physiologique
caractérisation
phénotypique,
biochimique
et
3.1. Caractérisation phénotypique
3.1.1. Aspect morphologique
3.1.1.1. Aspect macroscopique
L’aspect des colonies isolées sur milieu MRS est de forme ronde, petite de couleur
blanchâtre (Figure 18, a) contrairement sur le milieu MSE, elles sont transparentes gluantes de
différentes grandeurs (Figure 18, b).
L’identification d’un microorganisme ne peut avoir lieu que lorsqu’il est à l’état pur.
3.1.1.2.
Aspect microscopique
En microscopie optique, après une coloration différentielle de Gram, nos cellules
bactériennes sont Gram + (Figure 19) d’une forme ovoïde en paires isolées ou en courtes
chainettes incurvées.
a)
b)
Figure 18: aspect macroscopique de Leuconostoc
a : sur milieu MRS
b : sur milieu MSE
92
Résultats
a)
a1)
10µm
10µm
b)
b1)
10µm
c)
c1)
Figure 19: observation microscopique des souches. Grx100x10x1.25
a) LnCH1, b) LnH20, c) LnC12.
Figure a1, b1 et c1 ont été rapprochées.
93
Résultats
3.2. Caractérisations biochimiques des souches
3.2.1. Test de la catalase
Conformément au genre Leuconostoc, toutes les espèces étudiées ne possèdent pas la
catalase.
3.2.2. Hydrolyse de l’arginine
Toutes nos souches isolées dégradent le lactose en produisant de l’acide lactique qui va
modifier le pH en l’acidifiant ce qui implique le changement de la couleur de l’indicateur, le
pourpre de Bromocrésol en jaune, mais elles sont incapables d’hydrolyser l’Arginine qui est
contenue dans le milieu M16 BCP, par conséquent il va rester jaune (Figure 20) donc les
souches sont ADH négatif.
3.2.3. Production de dextrane
L’utilisation du saccharose par les Leuconostoc du milieu MSE, s’est produite en
exopolysaccharide (dextrane), en colonies grandes, visqueuses et transparentes (Figure 21).
Le Tableau 19 montre les différentes productions de dextrane par toutes les souches
isolées.
3.2.4. Type fermentaire
Le CO2 produit par les souches testées est capté par une cloche de Durham. Toutes nos
souches produisent de gaz carbonique à partir du glucose (Figure 22), elles sont toutes
hétérofermentaires qui correspondent au genre Leuconostoc.
94
Résultats
a)
a1)
Figure 20: Aspect des colonies de Leuconostoc sur milieu M16BCP
a) : milieu M16BCP, a1) : milieu M16BCP ensemencer par LnC33.
Figure 21: aspect des souches LnH13, LnC1, LnC11 productrices de Dextrane
sur milieu MSE
Figure 22: la production du CO2 à partir du glucose
95
Résultats
3.3. Caractérisations physiologiques
3.3.1. Tolérance à la salinité, pH, température et la thermorésistance
Les résultats obtenus des tests de la tolérance à l’acidité, la croissance à différent pH et à différente température ainsi que la
thermorésistance des souches isolées sont regroupés dans le Tableau 19.
Tableau 19: Caractères biochimiques et physiologiques des isolats
souche
Ln.
Production de
Hydrolyse de
NaCl
pH
Température
Thermorésistance
Acétoine
Dextrane
ADH
Citrate
3%
6.5%
4.8
6.8
4°C
15°C
30°C
37°C
45°C
63,5°/30’’
55°/15’’
+/-
+/-
-
+/-
+
+/-
-
+
-
+
+
+
-
-/+
+
96
Résultats
3.3.2. Etude du profil fermentaire
Le test du profil fermentaire a été effectué en utilisant la plaque d’Elisa. On a testé la
capacité de fermenter 13 carbohydrates pour les quatre-vingt-trois isolats.
La fermentation des sucres par nos souches est représentée dans le Tableau 20.
Tableau 20: les résultats du profil fermentaire des souches isolées
LnH1
LnH2
LnH3
LnH4
LnH5
LnH6
LnH7
LnH8
LnH9
LnH10
LnH11
LnH12
LnH13
LnH14
LnH15
LnH16
LnH17
LnH18
LnH19
LnH20
LnH21
LnH22
LnH23
LnH24
LnH25
LnH26
LnH27
LnH28
LnH29
LnH30
LnH31
LnH32
LnH33
LnH34
LnH35
LnH36
LnH37
LnH38
LnH39
glu
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
gal
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
lac
+
+
+
+
+
+
+
+
+
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+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
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+
+
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+
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+
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+
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mal
+
+
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+
+
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+
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+
+
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+
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+
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+
+
+
+
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mnt
+
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+
+/+
+
+
+/+
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+
+
+
+
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97
fru
+
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-
Ara
+
+
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amd
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Résultats
+
+
+
+
+
+
+
+
LnCH1
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnCH2
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC1
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC2
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
+
LnC3
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
+
LnC4
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC5
+/- +
+
+
+
+
+
+
+/- +
LnC6
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
+
LnC7
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
+
LnC8
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
+
LnC9
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC10
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC11
+/- +
+
+
+
+/+
+
+
+
LnC12
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC13
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC14
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC15
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC13
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC14
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
+
LnC15
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
+
LnC16
+/- +
+
+
+
+
+
+
+/- +
LnC17
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC18
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
+
LnC19
+/- +
+
+
+
+
+
+
+/- LnC20
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
+
LnC21
+/- +
+
+
+
+/+
+
+
LnC22
+/- +
+
+
+
+
+
+
+/- +
LnC23
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC24
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC25
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
+
LnC26
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC27
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
+
LnC28
+/- +
+
+
+
+
+
+
+/- +
LnC29
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC30
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC31
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
+
LnC32
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
+
LnC33
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC34
+/- +
+
+
+
+
+
+
+/- LnC35
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
+
LnC36
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC37
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC38
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC39
+/- +
+
+
+
+
+
+
+/- +
LnC40
+/- +
+
+
+
+
+/+
+
+
LnC41
+/- +
+
+
+
+
+
+
+
LnC42
+/- glu : glucose, gal : galactose, lac : lactose, mal : maltose, mnt : mannitol, sac : saccharose,
fru : fructose, xyl : xylose, raf : raffinose, ara : arabinose, sor : sorbitol, rha : rhamnose,
amd : amidon.
98
Résultats
3.3.3. L’utilisation du citrate
60% de nos souches sont capables de dégrader le citrate. Ce caractère se présente par la
couleur bleu des colonies sur milieu KMK (Figure 23).
Les différents résultats sont
représentés dans le Tableau 19.
Figure 23: l’utilisation du citrate par l’apparition des colonies de contours bleuâtres sur KMK
des souches LnH1, LnH26, LnCH1, LnC42
3.3.4. La production d’acétoine
La production d’acétoine a été effectuée sur le milieu Clark et Lubs, elle se manifeste
par l’apparition d’un anneau rose-rouge (Figure 24) sur la culture après l’addition des deux
réactifs, NaOH et l’α-naphtol. 48 % de nos souches isolées produisent de l’acétoine. Les
différents résultats sont représentés dans le Tableau 19.
Anneau rouge
Figure 24: la production d’acétoine par quelques souches isolées
99
Résultats
D’après les résultats obtenus des tests biochimiques et physiologiques effectués, on a pu
identifier nos isolats bactériens du lait cru de chamelle Algérien.
Les souches bactériennes LnH1, LnH2, LnH3, LnH4, LnH5, LnH7, LnH14, LnH15,
LnH16, LnH23, LnH24, LnH25, LnH26, LnH27, LnH28, LnH29, LnH34, LnH35, LnH36,
LnH37, LnH38, LnC3, LnC4, LnC6, LnC7, LnC8, LnC9, LnC12, LnC15, LnC16, LnC17,
LnC19, LnC21, LnC23, LnC26, LnC28, LnC29, LnC32, LnC33, LnC36, LnC40, LnC41 sont
des Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides.
Les isolats bactériens LnH6, LnH8, LnH9, LnH10, LnH11, LnH12, LnH13, LnH17,
LnH18, LnH19, LnH20, LnH21, LnH22, LnH30, LnH31, LnH33, LnH39, LnCH1, LnCH2,
LnC1, LnC5, LnC10, LnC11, LnC13, LnC14, LnC18, LnC20, LnC22, LnC24, LnC27, LnC30,
LnC31, LnC34, LnC35, LnC37, LnC38, LnC39 sont considérés comme des Leuconostoc
mesenteroides subsp. dextranicum.
Les souches bactériennes LnH32, LnC2, LnC25, LnC42 sont des Leuconostoc
mesenteroides subsp. cremoris.
100
Résultats
4. Identification par galerie API
Une identification confirmative a été faite par l’utilisation des galeries API 20STREP
pour les souches productrices de substances antimicrobiennes. Les résultats des souches
testées sont compatibles et ils sont imagés dans la Figure 25.
Figure 25: identification des souches de Leuconostoc mesenteroides LnC12, LnC21, LnC23,
LnC26, LnC28, LnC29, LnC33 par galerie API 20STREP
101
Résultats
5. Caractérisation moléculaire des souches Leuconostoc
5.1. Identification génétique des souches Leuconostoc par le séquençage
du gène 16S ARNr
5.1.1. L’analyse génomique
Après l'extraction, la purification et la quantification de l'ADN selon le protocole décrit
dans la section matériel et méthode, l'amplification par PCR correspondant à une région
d'environ 1500 pb, une région du gène de l'ARNr 16S. Pour bien sélectionner cette région, les
amorces universelles d'amplification ont été utilisées:
p8FLP (5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ')
p806R (5'-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3').
Les amplicons de PCR de chaque échantillon ont été visualisés sur un gel d'agarose
avec le SYBR SAFE (Invitrogen, Espagne), un marqueur de fluorescence. La Figure 26
montre qu’il existe une bande d'environ 1500 pb correspondant à la taille attendue de la
région à amplifier.
Figure 26: photographie par le ChemiDoc™ MP Imaging System du gel d’agarose des
souches des Leuconostoc mesenteroides LnC12, LnC21, LnC23, LnC26, LnC28, LnC29,
LnC33 réalisé par électrophorèse.
102
Résultats
Une fois prouvée que l'amplification est correcte pour chaque échantillon, par
l’électrophorèse, les amplicons de PCR ont été séquençés avec le «Big Dye Terminator v 3.1"
kit de séquençage de cycle (Applied Biosystems, Foster City, CA). Les mêmes amorces
utilisées pour la PCR ont été également utilisées pour le séquençage des deux brins des
produits de la PCR.
Les résultats des chromatogrammes de séquençage ont été analysés avec le programme
de bio-informatique Chromas Lite 2.0 (Figure 27), qui nous a permis de passer l'information à
partir du séquençage de chaque chaîne au format FASTA, pour effectuer un alignement avec
le programme Clustal X 1.81 de chaque échantillon.
Avec l'affichage du chromatogramme du programme Chromas Lite 2.0 et les
informations obtenues à partir du programme d'alignement Clustal X 1.81, une révision
manuelle des erreurs des séquences du séquençage a été réalisée, ces erreurs se produisent
principalement du début à la fin de ce processus. Dans la Figure 28, nous pouvons apercevoir
cet exemple de l’examen manuel de la séquence de la souche L.MESEN_Ln_C21, où les
amorces apparaissent en bleu et les minuscules bases sont indiquées en orange qui ont été
corrigées manuellement.
103
Résultats
Figure 27: extrait du chromatogramme correspondant au spectre de la souche
L.MESEN_Ln_C21, vu dans Chromas Lite programme 2.0.
Figure 28: Exemple d'un examen manuel de la séquence appartenant à L.MESEN_Ln_C21.
Les amorces sont apparues en bleu et les bases en minuscules et en orange sont corrigées
manuellement.
104
Résultats
Les séquences de chaque échantillon examiné ont été comparées vis-à-vis d'autres
séquences de souches de référence mises dans la base de données NCBI GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov ) à l'aide de l'outil BLAST. Ainsi, confirmer son identité, on a
comparé le pourcentage maximum d’homologie des espèces avec la GenBank (Figure 29).
Échantillon: L.MESEN_Ln_C21
Amorces : p8FPL, p806R
agtttgaTCCtggCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCcTAATACATGCAAGTCGAACGCACAGCGA
AAGGTGCTTGCACCTTTCAAGTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGACAACcTGCCTCA
AGGCTGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGAATAAAACTTAGTGTCGCATGACAC
AAAGTTAAAAGGCGCTTCGGCGTCACCTAGAGATGGATCCGCGGTGCATTAGTTAGTTGGTGG
GGTAAAGGCCTACCAAGACAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGA
CTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCTGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGAAAG
CCTGATGGAGCAACGCCGCGTGTGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAGCACTGTTGTATGGG
AAGAACAGCTAGAATAGGAAATGATTTTAGTTTGACGGTACCATACCAGAAAGGGACGGCTAA
ATACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGTCCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAA
AGCGAGCGCAGACGGTTTATTAAGTCTGATGTGAAAGCCCGGAGCTCAACTCCGGAATGGCAT
TGGAAACTGGTTAACTTGAGTGCAGTAGAGGTAAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGC
GTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGACTGCAACTGACGtTGAgGCT
cgaaagtgtgggtagcaaaCaggattagataccctggtagtc
Figure 29: Identification de l’échantillon de L.MESEN_Ln_C21 en utilisant l'outil BLAST.
100% de compatibilité de l'identité avec l'espèce L. mesenteroides ATCC 8293.
105
Résultats
5.1.2. L'analyse phylogénétique
La réalisation d'un alignement complet des séquences a été réalisée pour les échantillons
des sept souches productrices de substances antimicrobiennes de nature protéique, en utilisant
le programme Clustal X 1.81. De cet alignement et l'utilisation du programme MEGA 5.1, on
a construit l’arbre phylogénétique en utilisant l'algorithme neigbor -Joining, en établissant
ainsi les relations phylogénétiques entre les différentes souches.
Pour la construction de l'arbre phylogénétique (Figure 30), on a choisi comme outgroup
le genre Lactococcus, qui appartient au groupe des bactéries lactiques. Et le genre
Leuconostoc pseudomesenteroides assez phylogénétiquement proche des Leuconostoc.
Les résultats sont présentés dans la Figure 30. Ainsi, l'analyse phylogénétique a indiqué
que toutes les souches isolées à partir de lait cru de chamelle ont été regroupés dans une
branche commune avec des souches de référence Leuconostoc mesenteroides (CECT 219) et
Leuconostoc mesenteroides (LMG 6908). Ceci a confirmé l'identité de ces souches comme
Leuconostoc mesenteroides. Cependant, Leuconostoc pseudomesenteroides (LMG 11482) et
Leuconostoc pseudomesenteroides (CECT 4027) ont été regroupés, mais n’étaient pas dans le
même groupe que les souches de Leuconostoc mesenteroides. Les souches de Lactococcus
regroupés en deux sous-groupes distincts correspondant à Lactococcus lactis subsp. cremoris
(MG 1363), et de L. lactis subsp. lactis (CECT 4432). Ces deux sous-groupes ont été séparés
par une courte distance en raison de leur similarité génétique élevée par rapport à L.
mesenteroides et L. pseudomesenteroides.
106
Résultats
Figure 30: l’arbre phylogénétique des souches de Leuconostoc mesenteroides LnH1, LnH14,
LnC12, LnC21, LnC23, LnC26, LnC28, LnC29, LnC33 sur la base de la séquence de l'ARNr
16S.
107
Résultats
5.2. Identification des souches Leuconostoc par le MALDI-TOF MS
D’après nos résultats, quatre spectres ont été obtenus pour chaque souche. La recherche
de masses maximales communes dans les spectres a été effectuée à l'aide de l'application de
SPECLUST. Les moyennes arithmétiques ont été calculées pour valeurs m/z et l'écart-type a
été calculé à ± 5 Da. Les listes de masse comprennent 72 pics de masse qui ont été générés
pour 7 souches de Leuconostoc avec deux souches de Lactococcus classés comme un groupe
externe. Alors que 54 pics ont été observés chez les souches de Leuconostoc, 18 pics étaient
spécifiques au genre Lactococcus et seulement deux pics ont été partagés par les deux genres.
Remarquablement, le profil spectral (empreintes digitales) a révélé des résultats
différents pour les genres Lactococcus et Leuconostoc. Le pic de plus forte intensité dans
Lactococcus apparu à m/z 4420 Da, tandis que le pic d'intensité le plus élevé dans
Leuconostoc apparu à m/z 7110 Da. Des différences significatives dans les listes de pics de
masse entre les deux genres ont été observées (Figures 32, 33, 34, 35, 36, 37 et 38).
Les profils spectraux pour les différents Leuconostoc spp. partagent un grand nombre de
sommets, mais il y avait quelques différences dans la présence / absence de pics (figure 4).
Ainsi, le pic à m/z 6242 Da était présent dans les deux Ln. mesenteroides et Ln.
pseudomesenteroides mais a été décalé à 6240 Da à Ln. carnosum. Sur les 54 pics présents
dans le genre Leuconostoc, 17 étaient présents dans plus de 75% des échantillons analysés. Il
convient de noter que les pics à m / z 6242 Da et m / z 5118 Da était présent dans toutes les
espèces de Leuconostoc. Ces pics sont spécifiques pour le genre Leuconostoc (Tableau 21 ;
Figure 39).
108
Résultats
Un arbre phyloproteomic (Figure 31) a été construit pour chaque souche à partir de la
liste de masse pic de chaque souche LnC12, LnC21, LnC23, LnC26, LnC28, LnC29, LnC33
représenté sur les Figures 32, 33, 34, 35, 36, 37 et 38, respectivement, en utilisant le
programme de SPECLUST pour différencier entre les espèces de Leuconostoc qui ont été
isolé à partir de lait cru de chamelle. Ainsi, deux groupes principaux ont été observés dans le
dendrogramme: un groupe correspond au genre Lactococcus, qui a été considéré comme un
groupe externe, tandis que l'autre groupe comprend les trois espèces Ln. carnosum, Ln.
pseudomesenteroides et Ln. mesenteroides. Fait remarquable, l'arbre phyloproteomic fournit
des informations plus intraspécifiques pour Ln. mesenteroides que l'analyse phylogénétique
basée sur l'ARNr 16S. L'analyse phyloproteomique a permis de constater que les souches Ln.
mesenteroides ont été regroupées en différentes sous-branches, tandis que tous les isolats Ln.
mesenteroides ont été regroupés dans la même branche, selon l'analyse phylogénétique.
109
Résultats
Figure 31: l’arbre phyloproteomique des souches Leuconostoc spp. basé sur le profil
des protéines obtenu par le MALDI-TOF MS.
110
Résultats
Figure 32: caractéristiques des pics de masse de la souche Leuconostoc mesenteroides LnC12. Les pics du genre spécifique sont marqués par
(▼) sont présent dans les autres souches Leuconostoc mesenteroides.
Figure 33: caractéristiques des pics de masse de la souche Leuconostoc mesenteroides LnC21. Les pics du genre spécifique sont marqués par
(▼) sont présent dans le genre Leuconostoc mesenteroides.
111
Résultats
Figure 34: caractéristiques des pics de masse de la souche Leuconostoc mesenteroides LnC23. Les pics du genre spécifique sont marqués par
(▼) sont présent dans les autres souches Leuconostoc mesenteroides.
Figure 35: caractéristiques des pics de masse de la souche Leuconostoc mesenteroides LnC26. Les pics du genre spécifique sont marqués par
(▼) sont présent dans les autres souches Leuconostoc mesenteroides.
112
Résultats
Figure 36: caractéristiques des pics de masse de la souche Leuconostoc mesenteroides LnC28. Les pics du genre spécifique sont marqués par
(▼) sont présent dans les autres souches Leuconostoc mesenteroides.
113
Résultats
Figure 37: caractéristiques des pics de masse de la souche Leuconostoc mesenteroides LnC29. Les pics du genre spécifique sont marqués par
(▼) sont présent dans les autres souches Leuconostoc mesenteroides.
Figure 38: caractéristiques des pics de masse de la souche Leuconostoc mesenteroides LnC33. Les pics du genre spécifique sont marqués par
(▼) sont présent dans les autres souches Leuconostoc mesenteroides.
114
Résultats
Figure 39: spectres de références correspondant aux espèces L. carnosum, L. mesenteroides et L. pseudomesenteroide. Les pics spécifiques pour
chaque espèce sont marqués dans chaque cas par (▼).
115
Résultats
Tableau 21: la liste des pics de masse des espèces spécifiques de L. carnosum, L. pseudomesenteroides et L. mesenteroides
Les espèces microbiennes
L. carnosum
L. pseudomesenteroides
L. mesenteroides
4424
5123
5866
6368
7065
7601
4388
5104
6225
7942
6242
5118
116
Résultats
6. Caractérisation technologique des souches Leuconostoc mesenteroides
6.1. Mise en évidence des inhibitions inter-bactériennes
6.1.1. Détection de l’activité antimicrobienne
6.1.1.1. Méthode directe
Le test d’antagonisme des souches Leuconostoc mesenteroides permet la détermination
du spectre d’activité (Figure 40) des isolats envers cinq souches pathogènes et/ou d’altération
à Gram positif et à Gram négatif (Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria innocua,
Staphylococcus aureus et Escherichia coli).
Le Tableau 22 montre des activités antimicrobiennes d’inhibition remarquable pour les
souches qui ont été retenues.
Tableau 22: diamètre (mm) des zones d’inhibition des souches testées par la méthode
directe.
Listeria
Listeria
monocytogenes
ivanovii
MRS MRST MRS MRST
LnC12
10
5
15
7
LnC21
8
7
15
5
LnC23
7
4
11
6
LnC26
7
6
17
9
LnC28
5
2
10
7
LnC29
6
5
9
5
LnC33
7
5
1
5
MRS : milieu MRS
MRST : milieu MRS tamponnée
Listeria
innocua
MRS MRST
10
5
9
7
8
3
9
5
8
7
8
5
7
4
117
Staphylococcus
aureus
MRS MRST
13
4
12
3
15
4
13
5
14
4
22
3
23
5
Escherichia
coli
MRS MRST
12
5
9
4
7
3
6
2
8
3
4
3
3
1
Résultats
a)
a1)
b)
b1)
c)
c1)
d)
d1)
e)
e1)
Figure 40: Interaction bactérienne par la méthode directe entre les souches LnC12, LnC21,
LnC23, LnC26, LnC28, LnC29, LnC33 et les souches pathogènes.
a) Listeria monocytogenes, b) Listeria ivanovii, c) Listeria innocua,
d) Staphylococcus aureus, e) Escherichia coli;
a, b, c, d et e : sur milieu MRS non tamponné
a1, b1, c1, d1 et e1 : sur milieu MRS tamponné.
118
Résultats
6.1.1.2. Méthode indirecte
Ce test nous a permis d’observer l’activité des surnageants des souches retenues (LnC12, LnC21, LnC23, LnC26, LnC28, LnC29, LnC33)
envers cinq souches pathogènes et/ou d’altération (Listeria ivanovii, Listeria innocua, Staphylococcus aureus, Escherichia coli et Lactobacillus
plantarum).
Les souches LnC12, LnC21, LnC23, LnC26, LnC28, LnC29, LnC33 ont montré un pouvoir bactériocinogènes assez remarquable. Le
Tableau 23 présente tous les détails.
Tableau 23: diamètres (mm) des zones d’inhibition des surnageant des souches testées par la méthode des puits.
Listeria ivanovii
LnC12
LnC21
LnC23
LnC26
LnC28
LnC29
LnC33
MRS
MRST
8.7±0.07 6.3±1.56
8.6±0.05 5.6±0.07
7.1±0.14
5
7.5±0.7
4.5±0.80
6
4
6.8±0.03 3.3±0.48
5.01±0.5 2.6±0.24
Listeria innocua
MRS
MRST
4.5±0.11
3.8±0.07
3
2.5±0.13
2.3±0.55
1.6±0.21
3.5±0.25
1
2
1±0.93
2.6±0.04
1±0.82
3.5±0.51
1±1.75
Staphylococcus aureus
MRS
MRST
8
5
7
4.3±0.03
8.6±0.23
4.6±1.02
7.3±1.02
3
5
2.1±0.23
7.6±0.22
2.4±0.35
5.7±0.1
2
MRS : milieu MRS
MRST : milieu MRS tamponnée
119
Escherichia coli
MRS
MRST
5.8±0.05
3
3
1.3±0.03
3.6±0.02
3
3.3±1.28 2.8±1.01
4.6±0.14 3.5±0.06
3.5±0.11
1
3.3±0.09 2.5±0.02
Lactobacillus
plantarum
MRS
MRST
8.8±0.5 6.5±0.5
7
5
6.3
3
7.5±0.02 2.8±1.34
6
3.8±2.01
7.3±0.1
3
7
2.6±1.25
Résultats
a)
a1))
b)
b1))
c)
c1)
d)
d1)
e)
e1))
Figure 41: Interaction bactérienne par la méthode des puits entre les souches LnC12, LnC21,
LnC23, LnC26, LnC28, LnC29, LnC33 et les souches pathogènes.
a) Listeria ivanovii, b) Listeria innocua, c) Staphylococcus aureus, d) Escherichia coli,
e) Lactobacillus plantarum ;
À gauche : sur milieu MRS non tamponné, à droite : sur milieu MRS tamponné.
120
Résultats
6.1.2. Mise en évidence de la nature de l’agent inhibiteur
6.1.2.1. Inhibition due à la production d’acides organique
Afin de minimiser le maximum de production d’acides organiques, on a opté pour
l’utilisation du milieu tamponnée à pH7 ; ce qui est le cas dans le test précédent. On a
remarqué que les diamètres des zones d’inhibition sur le milieu tamponné (Figure 40 : a1, b1,
c1, d1, e1 et 41 : a1, b1, c1, d1, e1) est moins important que celui du milieu normal (Figure
40 : a, b, c, d, e et 41 : a, b, c, d, e)
6.1.2.2. Inhibition due au peroxyde d’hydrogène
L’ensemble des souches de Leuconostoc mesenteroides produisent du peroxyde
d’hydrogène ce qui apparait dans les Figure 40 : a1, b1, c1 et 41 : a1, b1, c1). Cet agent peut
être dégradé par une enzyme, la catalase, présente chez certaines espèces bactériennes telles
que Staphylococcus aureus, Listeria innocua et Listeria ivanovii ; donc on a pris plus en
considération leurs résultats.
6.1.2.3. Inhibition due aux phages
Le test des phages s’est révélé négatif pour l’ensemble des souches, aucune plage de
lyse n’est apparue, qui montre que l’inhibition antimicrobienne n’était pas due à la lysogénie.
6.1.2.4. Recherche de la substance inhibitrice de nature protéique
Le traitement des surnageant des souches Leuconostoc mesenteroides par différents
enzymes protéolytiques (la trypsine et la α-chymotrypsine) dissouts dans du tampon
phosphate de sodium montre une absence totale de la zone d’inhibition inter-bactérienne
(Tableau 24 et Figure 42), concluant que la substance inhibitrice est de nature protéique.
121
Résultats
a)
b)
Figure 42: Effet des enzymes protéolytiques sur le surnageant des souches LnC12, LnC21,
LnC23, LnC26, LnC28, LnC29, LnC33.
a) pepsine, b) α-chymotrypsine
6.1.3. Optimisation de la production de substances antimicrobiennes
6.1.3.1. Effet de la température
L’effet de la température de 50°C, 60°C et 100°C pendant 60, 30 et 15 min,
respectivement, sur la substance protéique des sept souches sélectionnées a diminué
légèrement (Tableau 24). Trois souches ont pu résister à 100°C pendant 30 et 60 min, ce qui
révèle la thermostabilité des protéines, mais aucune substance antimicrobienne n’a été
produite par nos souches à 121°C pendant 15 min (Tableau 24).
6.1.3.2. Sensibilité au pH
L’activité antimicrobienne des souches Leuconostoc mesenteroides a été maintenue du
pH 4.0 jusqu’au 8.0 pour les sept souches testées (Tableau 24).
122
Résultats
Tableau 24: influence de la température, le pH et les protéases (trypsine et α-chymotrypsine) sur l’activité antimicrobienne.
LnC12
Température
50°C / 60 min
60°C / 30 min
100°C / 15 min
100°C / 30 min
100°C / 60 min
121°C / 15 min
ph
2
4
6
8
10
Enzymes protéolytiques
1 mg/ml
αchymotrypsine
1 mg/ml Pepsine
LnC21
LnC23
LnC26
LnC28
LnC29
LnC33
6.3±0.13
4
3.5±0.5
2
1
0
5.1±0.35
3
2.7±1.6
1.5±0.31
1.1±0.5
0
5
3.6±0.65
3.8±0.22
2.4±0.15
1
0
4.6±0.29
3.3±0.78
2
0
0
0
4.5±1.13
2.5±1.1
2.5±0.29
0
0
0
3.3±0.21
1.9±0.17
1
0
0
0
2.8±2.5
1
1.7±0.36
0
0
0
0
6
6.5±0.03
4.3±0.90
0
0
4.9±0.26
5
3.7±0.75
0
0
5.3±0.12
5.81±0.07
4±0.5
0
0
4
4.09±0.18
3
0
0
4.2±0.07
3.43±1.01
1.9±1.22
0
0
3.7±1.52
3
0.9±0.34
0
0
2±0.96
2.5
0.7±0.89
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
123
Résultats
6.1.3.3. Sensibilité aux solvants organiques
Le traitement des surnageants par les solvants organiques (l’urée et le tween 80) est
montré dans le Tableau 25 et la Figure 43. On a remarqué que l’addition du tween 80 à
augmenter l’activité inhibitrice de la substance antimicrobienne contrairement à l’urée qui la
diminuer.
Tableau 25: sensibilité aux solvants organiques
Solvants
organiques
LnC12
LnC21
1% Tween 80
1% Urée
9.7±0.27 9.6±0.9
3±0.23
2
LnC23
LnC26
8
2.5±0.8
7.7±0.48 5.2±0.43
2
1.9±1.11
a)
LnC28
LnC29
LnC33
3
0
1
0
b)
Figure 43: Effet des solvants sur le surnageant des souches LnC12, LnC21, LnC23,
LnC26, LnC28, LnC29, LnC33.
a) traitement avec le Tween 80, b) traitement avec l’urée.
124
Résultats
7. Suivi cinétique d’acidité et de croissance en culture pure et en culture
mixte
Les résultats illustrés en graphes dans la Figure 44 représentent l’évolution du pH de la
souche Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides C12 (Ln. C12) et Listeria innocua
(L. innocua) en culture pure et la culture mixte entre eux; la Figure 45 représente l’évolution
du pH de la souche Ln. C12 et Listeria ivanovii (L. ivanovii) en culture pure et la culture
mixte entre eux; les Figures 46 et 47 représentent l’évolution de l’acidité. Les Figures 48 et
49 représentent l’évolution de la croissance bactérienne de la souche Ln. C12 avec les deux
souches indicatrices Listeria innocua et Listeria ivanovii. On a suivi ces paramètres pendant
72 heures.
Une concentration de 2 107 CFU ml-1 de la souche Leuconostoc mesenteroides Ln C12,
L. innocua et L. ivanovii ont été inoculée. Le taux de croissance, le pH et l'acidité sont
mesurés toutes les 3 heures.
L’évolution du pH (Figure 44 et 45) de Ln. C12 en culture pure a commencé par un pH
de 6,7 à 0h jusqu’à 5,32 ± 0,45 comme valeur finale à 72 h tandis que le pH de L. innocua a
descendu de 7 jusqu’à 5,9 ± 0,48 et L. ivanovii à 5,8 ± 0,33, mais avec des vitesses
différentes. La souche LnC12 a présenté une vitesse de 0.58 h-1 qui est un peu plus lente
qu’aux souches L. innocua et L. ivanovii qui ont eu des vitesses 0.65 h-1 et 0.84 h-1,
respectivement. Dans les cultures mixtes le pH a atteint 5,35 ± 0,26 et 5,28 ± 0,38 tandis que
la vitesse a été de 0.61 h-1 et 0.74 h-1 avec les souches L. innocua et L. ivanovii,
respectivement.
125
Résultats
Notre souche a montré une acidification supérieur (Figure 46 et 47) en culture pure de
46,1 ± 0,05 °D à 72 h d'incubation comparer avec celle produite par L. innocua et L. ivanovii
35,3 ± 0,1 °D et 34,8 ± 0,12 °D, respectivement. Mais avec des vitesses diverses, la vitesse
d’acidification de la souche Ln. C12 a été de 0.80 h-1. Dans la culture mixte de Ln. C12 avec
L. innocua et L. ivanovii, nous avons observé une diminution dans la production d'acide
lactique 45,3 ± 0,39 et 43,7 ± 0,47 respectivement. La vitesse de diminution de la souche
LnC12 avec L. innocua était de 0.82 h-1 qui a été plus rapide qu’avec L. ivanovii qui était de
0.76 h-1.
L'énumération à partir de la culture pure de LnC12 (Figure 48) a été de 7,4 log
(UFC/ml) à 0h et 7 ± 0,02 log (UFC/ml), 7,3 ± 0,59 log (UFC/ml) pour L. innocua et L.
ivanovii, respectivement. Après la période d'incubation de 72 h, le nombre de Ln. C12 a
augmenté à 8,5 ± 0,49 log (UFC/ml) et de 8,3 ± 0,5 log (UFC/ml) et 8,1 ± 0,58 log (UFC/ml)
pour L. innocua et L. ivanovii, respectivement.
Le décalage entre la vitesse de LnC12 et L. innocua et L. ivanovii en culture pure a
montré que le taux de Ln. C12 (0.80 h-1) a augmenté plus rapidement que de L. innocua (0.72
h-1) et L. ivanovii (0.65 h-1).
126
pH
Résultats
7,4
7,2
7
6,8
6,6
6,4
6,2
6
5,8
5,6
5,4
5,2
5
Ln. C12
L. innocua
Ln. C12 + L. innocua
0
20
40
60
80
Temps (h)
Figure 44: L’évolution du pH en fonction du temps lors de la croissance en culture pure et
mixte de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides C12 et Listeria innocua
7,2
Ln. C12
7
6,8
L. ivanovii
6,6
Ln. C12 + L. ivanovii
pH
6,4
6,2
6
5,8
5,6
5,4
5,2
5
0
20
40
60
80
Temps (h)
Figure 45: L’évolution du pH en fonction du temps lors de la croissance en culture pure et
mixte de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides C12 et Listeria ivanovii
127
Résultats
55
Ln. C12
50
L. innocua
Acidité (°D)
45
Ln. C12 + L. innocua
40
35
30
25
20
15
10
0
20
40
60
80
Temps (h)
Figure 46: L’évolution de l’acidité en fonction du temps lors de la croissance en culture
pure et mixte de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides C12 et Listeria innocua
55
Ln. C12
Acidité (°D)
50
45
L. ivanovii
40
Ln. C12 + L. ivanovii
35
30
25
20
15
10
0
20
40
60
80
Temps (h)
Figure 47: L’évolution de l’acidité en fonction du temps lors de la croissance en culture
pure et mixte de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides C12 et Listeria ivanovii
128
Résultats
9,5
Ln. C12
L. innocua
LogN (ufc/ml)
9
Ln. C12 + L. innocua
8,5
8
7,5
7
0
20
40
60
80
Temps (h)
Figure 48: la cinétique de croissance de la souche Leuconostoc mesenteroides subsp.
mesenteroides C12 en culture pure et mixte avec Listeria innocua
9,5
Ln. C12
L. ivanovii
LogN (ufc/ml)
9
Ln. C12 + L. ivanovii
8,5
8
7,5
7
0
20
40
60
80
Temps (h)
Figure 49: la cinétique de croissance de la souche Leuconostoc mesenteroides subsp.
mesenteroides C12 en culture pure et mixte avec Listeria ivanovii
129
Résultats
8. Étude probiotique des souches de Leuconostoc mesenteroides
8.1. Tolérance à l’acidité
Le comptage des cellules viables des sept souches de Leuconostoc mesenteroides subsp.
mesenteroides productrices de substances antimicrobiennes après 3 heures d’exposition à un
pH 2.0, 3.0 et 4.0 est montré dans le Tableau 26.
Les souches LnC12, LnC23, LnC28 et LnC33 ont résisté à tous les pH testé (2.0, 3.0 et
4.0), les résultats montrent une baisse de croissance de 25.79%, 37.11%, 39.63% et 24.08%
après exposition à pH 2 ; tandis que les autres souches n’ont pas survit au même pH. Le taux
de survie de toutes les souches varie entre 1.69% et 7.62% à pH 3 et entre 3.57% et 17.82% à
pH 4.
8.2. Résistance aux enzymes
D’après les résultats obtenus qui sont illustrés dans le Tableau 27, aucune souche n’a
survie au pH 2 quand on a ajouté 3 mg/ml de pepsine. Par contre, une résistance remarquable
a été observée à pH 3 additionnant la même quantité du même enzyme. Une baisse de
viabilité varie entre 4.10% et 17.77% pour toutes les souches.
8.3. Hydrolyse et résistance aux sels biliaires
Les résultats du test in vitro de la tolérance aux sels biliaires sont regroupés dans le
Tableau 28.
Toutes les souches de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ont été capable
de croitre après 4 heures d’incubation en présence de 0.5%, 1% et 2% d’oxgall. La réduction
du taux de croissance s’étend de 0.47% et 5.4% après exposition à 0.5% d’oxgall et de 10.55%
- 28.11% et de 21.38% - 36.67% en présence de 1% et 2%, respectivement.
Aucune de nos souches isolées n’a été capable d’hydrolyser l’oxgall.
130
Résultats
Tableau 26: effet du pH acide sur la viabilité des souches de Leuconostoc
mesenteroides isolées
pH2
pH3
pH4
0h
3h
0h
3h
0h
3h
8.22±0.01
6.10
8.56±0.05 8.01±0.07 8.67±0.01 7.77±0.05
LnC12
8.32±0.2
0
8.79±0.05 8.12±0.01 8.38±0.01 7.54±0.02
LnC21
8.46±0.02
5.32
8.37±0.3
7.97±0.02 8.92±0.05 7.33±0.02
LnC23
8.61±0.02
0
8.49±0.03 7.84±0.02 8.35±0.02 7.46±0.05
LnC26
8.73±0.04
5.27
8.84±0.01 8.33±0.21 8.12±0.07 7.83±0.03
LnC28
8.39±0.05
0
8.27±0.04
8.10±0.1
8.41±0.06 7.68±0.07
LnC29
8.51±0.05
6.46
8.50±0.07 8.51±0.02 8.57±0.03
7.50
LnC33
Tous les résultats sont exprimés en log UFC/ml.
Tableau 27: Effet de la pepsine à différents pH sur la viabilité des souches de
Leuconostoc mesenteroides isolées
Pepsine (pH2)
Pepsine (pH3)
0h
3h
0h
3h
8.31 ±0.01
0
8.56 ±0.01
7.91 ±0.02
LnC12
8.22 ±0.02
0
8.03 ±0.03
7.70 ±0.02
LnC21
8.70 ±0.03
0
8.72 ±0.03
7.43 ±0.17
LnC23
8.12 ±0.07
0
8.89 ±0.05
7.31 ±0.01
LnC26
8.21 ±0.03
0
8.37 ±0.05
7.82 ±0.05
LnC28
8.81 ±0.05
0
8.25 ±0.01
7.18 ±0.05
LnC29
8.33 ±0.01
0
8.54 ±0.03
7.07 ±0.01
LnC33
Tous les résultats sont exprimés en log UFC/ml.
Tableau 28: Effet des différentes concentrations des sels
Leuconostoc mesenteroides isolées
0.5%
1%
0h
4h
0h
4h
8.32 ±0.05 8.24 ±0.02 8.15 ±0.01 7.29±0.04
LnC12
8.35 ±0.01 8.31 ±0.12 8.32 ±0.05 6.71±0.08
LnC21
8.45 ±0.07 8.02 ±0.07 8.10 ±0.07 6.57±0.05
LnC23
8.65 ±0.05 8.31 ±0.07 7.98 ±0.03 6.88±0.05
LnC26
8.30 ±0.07 7.97 ±0.05 8.26 ±0.02 7.02±0.01
LnC28
8.15 ±0.05 7.93 ±0.01 7.96 ±0.01 6.43±0.02
LnC29
8.33 ±0.08 7.88 ±0.03 8.02 ±0.03 6.26±0.01
LnC33
Tous les résultats sont exprimés en log UFC/ml.
131
biliaires sur les souches de
2%
0h
8.10±0.03
7.99±0.07
7.67±0.1
8.21±0.03
8.77±0.09
8.22±0.02
7.88±0.04
4h
6.11±0.1
5.76±0.02
6.03±0.03
5.33±0.05
5.48±0.05
5.42±0.01
4.99±0.01
Résultats
8.4. Activité hémolytique
Aucune des souches Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides isolées n’a été
capable d’hydrolyser le sang humain sur les deux milieux Colombia à l’état frais (Figure 50,
a) et cuit (Figure 50, b) indiquant que toutes les souches sont des bactéries non-hémolytique.
8.5. Résistance aux antibiotiques
Les diamètres des zones d’inhibition (en mm) des 33 antibiotiques testés vis-à-vis
Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides sont regroupés dans le Tableau 29.
Toutes les souches sont considérées sensibles aux Chloramphenicol, Clindamycin,
Lincomycin, Pristinamycin et à la Spiramycin. Une résistance modérée a été observée qu’à
deux antibiotiques, l’Ampicillin et l’Imipenem. Nos souches sont toutes résistantes aux
Amikacin, Azetrepnam, Ceftazidime, Cefalotin, Cefixime, Cefsulodin, Cefotaxime,
Cefazolin, Fusidic acid, Fosfomycin, Ofloxacine, Polymixin, Pefloxacin, Trimethoprim +
Sulphamethoxazole, Teicoplanin et à la Vancomycine.
132
Résultats
Résultat
a)
b)
Figure 50: la non-hémolyse des souches de Leuconostoc mesenteroides sur milieu
Columbia Agar contenant 5% du sang humain sur milieu frais (a) et cuit (b)
Figure 51: antibiogramme d’une souche Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides
133
Résultats
Tableau 29: résistance aux antibiotiques des souches Leuconostoc mesenteroides (mm)
(M±E)
C
CM
L
PT
SP
LnC12
23±0.05
24±0.06
26±0.2
28
22±0.07
S
S
S
S
S
LnC21
25±0.05
25±0.05
26±0.2
23±0.06
23±0.22
AM
IMP
S
S
S
S
S
LnC23
29±0.33
25±0.12
26±0.03
25±0.17
24
20±0.3
20±0.01
I
I
E
FFP
FT
GEN
KAN
NET
P
PIP
RA
TIC
14±0.05
0
18±0.05
15±0.06
18±0.09
9±0.1
15±0.1
18±0.08
13±0.09
20
AN
ATM
CAZ
CF
CFM
CFS
CTX
CZ
FA
FOS
OFX
PB
PEF
SXT
TEC
VA
10±0.01
0
0
0
0
0
0
10±0.1
10±0.06
0
0
0
0
0
0
0
S
S
S
S
S
LnC26
26±0.1
26±0.1
28±0.2
23±0.01
22±0.02
18±0.05
18±0.6
I
I
R
R
I
R
I
R
R
I
R
I
26±0.12
12±0.07
18
20±0.06
24±0.09
17±0.21
20±0.18
23±0.07
20±0.33
25±0.1
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
14±0.03
0
0
0
0
0
12±0.07
10±0.5
0
0
14±0.1
0
0
0
0
0
S
S
S
S
S
LnC28
24
25±0.02
23±0.01
26
22±0.1
20±0.05
20±0.01
I
I
S
R
I
I
S
I
I
S
I
S
28±0.03
12
15
20±0.21
20±0.11
16
22
25±0.11
25±0.17
26±0.05
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
14±0.02
0
0
0
0
0
13
10
10±0.7
0
15±0.08
9
0
0
0
0
S
S
S
S
S
LnC29
25±0.06
25±0.07
26±0.1
30±0.2
21±0.7
18
20±0.11
I
I
S
R
R
I
S
I
S
S
S
S
26±0.09
15±0.07
13±0.08
21±0.3
20
17±0.5
18±0.01
21
25±0.1
23±0.22
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
15±0.13
0
0
0
0
0
17±0.1
12
9±0.08
0
14±0.1
9
0
0
0
0
S
S
S
S
S
LnC33
24
25±0.05
30±0.2
25±0.1
25
S
S
S
S
S
18±0.08
20±0.7
I
I
20
20±0.09
I
I
20±0.12
20±0.09
I
I
S
R
R
S
I
I
I
S
S
S
14±0.03
18±0.14
20±0.07
16±0.2
18±0.05
9±0.05
15±0.3
18±0.01
15±0.02
20
R
I
I
I
I
S
R
I
R
I
13±0.01
0
16±0.4
15±0.13
18±0.07
8±0.06
15±0.13
17±0.8
14±0.05
20±0.22
R
R
I
R
I
R
R
I
R
I
28±0.07
12±0.05
18
20±0.12
25±0.6
18±0.09
21±0.07
25±0.08
25±0.5
25±0.08
S
R
I
I
S
I
S
S
S
S
R
R
R
R
R
R
I
R
R
R
R
R
R
R
R
R
10±0.02
0
0
0
0
0
0
10±0.14
16±0.05
0
14±0.05
0
0
0
0
0
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
8±0.03
0
0
0
0
0
0
12±0.08
15±0.08
0
0
0
0
0
0
0
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
13±0.09
0
0
0
0
0
17
12±0.13
9
0
15±0.05
9±0.08
0
0
0
0
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
[C]: concentration, R: resistant, I: intermediate, S: sensitive.
All results are expressed as log CFU/ml. Values in the same row followed by a different
letter are significantly different (P<0.05).
134
Discussion
Discussion
Le lait de chamelle constitue depuis des temps très lointains, la principale
ressource alimentaire pour les tribus nomades où le lait est un aliment hautement
nutritif par sa richesse en glucides, lipides, vitamines et sels minéraux. Il est apprécié
traditionnellement pour ses propriétés anti-infectieuse, anticancéreuse, antidiabétique et
plus généralement comme reconstituant chez les malades convalescents, (Kanuspayeva,
2007).
La teneur élevée du lait de chamelle en facteurs antibactériens (Lactoferrine,
Lactopéroxydase et Lysozyme) confère au lait de chamelle une capacité particulière à
se conserver quelques jours à des températures relativement élevées (de l’ordre de 25 °C)
(Sboui et al., 2009). De ce fait, Yagil et al. (1994) déduisent que la pasteurisation du lait
de chamelle n’est pas indispensable si tous les dromadaires du troupeau sont en bonne santé.
Les échantillons du lait cru de chamelle ont une couleur blanche mate, un aspect un peu
visqueux et mousseux, il a une saveur sucrée et piquante en même temps, mais la plupart des
échantillons avaient un gout salé, cette dernière est probablement due aux plantes
consommées dans le désert par les chamelles et la disponibilité de l'eau potable (Khaskheli et
al., 2005) ou dépend du stade et du rang de lactation (Saidi et al., 1999), car l’ingestion de
fourrages comme la luzerne donne un goût sucré, certaines plantes halophytes le rendent salé
(Farah et Bachman, 1987). Dans notre cas le pâturage est riche en plantes halophiles qui
donnent ce goût salé du lait.
Les leuconostocs sont des bactéries lactiques trouvées dans différents écosystèmes
notamment les végétations vertes, les racines des plantes, le lait et les produits laitiers ainsi
que le vin, elles se trouvent de même chez l’homme (sang, urée, vagin et lait maternel.)
(Hemme et Foucaud-Scheunemann, 2004 ; Xiraphi et al., 2007 ).
Afin d’isoler des du lait de chamelle, on a utilisé deux milieux, le premier est un milieu
sélectif (MRS) (GARVIE, 1967) et pour faciliter la distinction, l’additionnement de la
vancomycine est indispensable Selon Mathot et al. (1994) avec une quantité de 30 µg/ml
(Ruoff et al., 1988) (MRSv) par cette raison que les leuconostocs sont les seules à résister à
une concentration pareille par ce fait les autres bactéries lactiques seront éliminées et le
deuxième milieu est le MSE de Mayeux, Sandine et Elliker, 1962, ce dernier contient 10% de
saccharose qui le rend spécifique à la détection des Leuconostoc par la formation de dextrane
135
Discussion
(Kim et al., 2007) en plus la contenance en azide de Sodium inhibe les bactéries à Gram
négative les Streptocoques qui coexiste avec les leuconostocs dans les produits laitiers. Un
ensemencement en surface des colonies de Leuconostoc sur milieu gélosé (MRS) à l’œil nu
apparaissent petites, blanchâtres, de forme circulaire (Figure 18) et avec un ensemencement
en profondeur ont une forme lenticulaire.
La coloration différentielle utilisée est la plus connue c’est celle de Gram, qui permet de
trier les bactéries en deux groupes ; sous microscope optique, on observe une coloration
violette sur nos cellules bactériennes donc elles sont des Gram positifs (Figure 19) en se
présentant en paires et/ou en chainettes courtes et incurvées de forme ovoïde (Figure 19), non
mobile et ne forment pas de spores. Les leuconostocs ont des caractères identiques (Ogier et
al., 2008, Bjorkroth et Holzapfel, 2006).
Pour une bonne orientation d’identification, le test de la catalase était nécessaire, cette
dernière est une enzyme respiratoire qui permet la dégradation de l’eau oxygénée qui résulte
de l’oxydation, par l’oxygène de l’air où le test s’est révélé négatif, et c’est ce qu’on a
convoité, car ce caractère phénotypique nous oriente aux groupes des bactéries lactiques
(Whittenbury, 1964)
Toutes les souches isolées Gram positif et catalase négative ont été testé pour leur
production du CO2 à partir du glucose, le dégagement de ce gaz (Figure 22) qui est le résultat
recherché est nécessaire pour différencier entre nos isolats homofermentaires et
hétérofermentaires (production du dioxyde de Carbon en plus d’acides lactiques). Nos
souches ne sont pas capable d’hydrolyser l’arginine (ADH négative) (Figure 20). Ces deux
résultats sont la spécificité du genre Leuconostoc (Ogier et al., 2008 ; Khedid et al., 2009 ;
Ghazi et al., 2009).
La croissance à différentes températures, à différents pH et à différentes concentrations
de NaCl a été réalisée sur nos souches isolées et bien purifiées. Nos souches ont poussées à
15°C, 30°C et à 37°C, mais pas à 4°C et 45°C (Tableau 19) ce qui confirme leur optimum
température de croissance. Le pH 6.8 était convenable pour la croissance de nos souches
contrairement au pH 4.8. Concernant la croissance à différentes concentrations de NaCl
ajoutées au milieu MRS, 87% des souches isolées ont pu croitre à 3% et 18% de souche d’un
total de total de 83 souches de Leuconostoc mesenteroides ont résisté à 6.5% de NaCl.
136
Discussion
Les résultats des trois derniers tests sont semblables à ceux trouvés par Garvi (1979),
Wang et al. (2013) et Danilovic et al. (2014) où ils ont prouvé que Leuconostoc
mesenteroides est mésophile et elle croit dans un pH 6.8 et elle peut résister jusqu’à 6.5% de
NaCl.
La thermoresistance des souches est la capacité d’une flore de résister à la thermisation
au moins 5 secondes à une température entre 57 et 68°C (Guiraud, 1998). La totalité des
souches ont toléré la température 55° pendant 15 minutes et aucune souche été capable de
résister à 63.5°C pendant 30 minutes (Tableau 19); on peut dire que nos souches sont
thermoresistantes. Rivollierm et Christieanss (2009) ont démontré que leurs souches
Leuconostoc mesenteroides n’étaient pas capables de supporter la thermorésistance ni à 60°C
ni à 65°C. Ce qui est similaire à nos résultats.
Nos résultats des tests physiologiques sont conformes aux travaux de Guirand (1998) et
Hemme et Foucaud-Scheunemann (2004) effectués sur le genre Leuconostoc.
La production de dextrane a été testée sur milieu MSE qui est un milieu
hypersaccharosé (Mayeux et al., 1962) où les colonies semblent grandes, gluantes et
transparentes (Figure 21) qui rend la detection de l’espèce Leuconostoc mesenteroides facile
car elle est capable de synthétiser le dextrane à partir des polysaccharides comme le
saccharose qui s’accumulent dans le milieu (Martha et al., 2005). 93% des souches isolées
ont été capable de former le dextrane. La production de dextrane par les leuconostocs a été
démontrée par plusieurs auteurs tels que Holt et al. (2001) et Argüello-Morales et al. (2005).
Selon les résultats précédents obtenus, on peut identifier nos isolats, toutes ces
dernières sont des Leuconostoc mesenteroides. Afin de différencier entre les sous-espèces de
ces souches, la fermentation des carbohydrates peut compléter l’identification en étudiant le
profil fermentaire qui a été réalisé sur la plaque d’Eliza en se basant sur le changement de
couleur du milieu qui contient le pourpre de Bromocresol comme indicateur de pH. Treize
sucres ont été utilisés dans ce test et selon Bjorkroth et Holzapfel (2006), le sucre clé est
l’arabinose. Toutes nos souches ont utilisé les sucres suivants : glucose, galactose, lactose,
maltose, fructose, comme source de carbone, par contre elles n’ont toutes pas dégradé le
raffinose, le rhamnose, le sorbitol et l’amidon. Une variabilité de résultats a été remarquée sur
la fermentation du mannose, sucrose, xylose et l’arabinose. Le tableau 20 renferme tous les
résultats.
137
Discussion
Selon les résultats de la fermentation et en concentrant sur le sucre clé, ainsi sur la
production de dextrane ; les souches arabinose négatif et forment le dextrane sont considérées
selon Carr et al. (2002) comme des souches Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum
contrairement à celles qui fermentent l’arabinose et forment le dextrane appartiennent à
l’espèce des Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ; celles qui ne fermentent pas
l’arabinose ni forme de dextrane ont été considéré comme des Leuconostoc mesenteroides
subsp. cremoris.
En comparent nos résultats avec ceux de Kihal (1998), Carr et al. (2002), Badis et al.
(2005), Ghazi et al. (2009) et Zarour (2010), l’identification révèle que 42 souches sont
Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides,
37 souches
sont des Leuconostoc
mesenteroides subsp. dextranicum et 4 souches sont des Leuconostoc mesenteroides subsp.
cremoris.
La présence du genre Leuconostoc dans le lait de chamelle a été confirmée par plusieurs
auteurs comme Benkerroum et al. (2004) qui ont trouvé 1%, Nurgul et al. (2009) 10% et
Khedid el al. (2009) 11,7% du montant global de leurs souches isolées.
Pour une identification plus fiable et comparative aux méthodes classiques utilisées, une
identification taxinomique à l’aide des galeries API (biomerieux) a été utilisée (Figure 25)
pour la mise en évidence de l’activité enzymatique et le profil de fermentation des hydrates de
carbone. Les profils biochimiques et numériques ont été interprétés à l’aide des tableaux des
catalogues analytiques. L’identification était identique à celle trouvée par les méthodes
classiques.
Les méthodes classiques d'identification des leuconostocs suivent des analyses des
caractères morphologiques et des analyses des caractéristiques biochimiques, physiologiques
et métaboliques. Bien que l'identification basée sur les caractéristiques biochimiques et
métaboliques des bactéries a technologiquement évoluées en termes de miniaturisation de la
série de tests et d'automatisation de leur réalisation et de la lecture, sont encore en grande
partie s’appuyant sur les mêmes principes et les ressources que les tests utilisés pour 25 ou de
30 ans. Cela signifie que l'identification d’un micro-organisme est retardée des heures et
même plusieurs jours après sa croissance dans le milieu de culture.
Au cours des dernières années, le diagnostic moléculaire a acquis une grande
importance, ce qui représente une alternative intéressante aux techniques classiques de
138
Discussion
diagnostic. Les méthodes pour la détection efficace d’un micro-organisme comportent des
principes de base de la PCR, l'hybridation d'ADN, et plus récemment, les puces à ADN et les
biocapteurs. Malheureusement, ces techniques basées sur la génomique sont coûteuses et
fastidieuses (Böhme et al., 2011). Également, nous avons besoin des informations de la
séquence a priori, et une puissance limitée de la discrimination quand il s'agit des espèces
bactériennes à haute similarité de séquence. Pour cela, il serait souhaitable de développer une
méthode d'analyse complémentaire rapide et plus précise, ce qui permet l'identification d'un
micro-organisme dans le temps le plus court possible.
Remarquablement, seules quelques études ont porté sur l'identification génétique des
bactéries lactiques isolées de lait de chamelle et ces études analysées d'autres régions du
monde (Lacroix et Millette, 2011 ; Jans et al., 2012 et El Demerdash et Al Otaibi, 2012).
L’identification génétique de nos souches Leuconostoc a été effectuée par deux
techniques, la première une identification par PCR par le séquençage du gène 16S ARNr et la
deuxième c’est par une spectrophotométrie de masse (MALDI-TOF).
L’arbre phylogénétique des souches productrices de substances antimicrobiennes de
type protéique de Leuconostoc mesenteroides Ln H1, Ln H14, Ln C12, Ln C21, Ln C23, Ln
C26, Ln C28, Ln C29, Ln C33 est représentée dans la Figure 30. La première branche
regroupe le genre Leuconostoc dont on peut considérer que toutes les souches isolées à partir
du lait de chamelle ainsi que les souches de référence de la collection L.MESEN_LMG_219
et L.MESEN_LMG_6908 ; correspondent toutes à l’espèce Leuconostoc mesenteroides, et
regroupe les souches de collection L.PSEUD_CECT_4027 et L.PSEUD_LMG_11482 qui ont
été identifié séparément comme les espèces Leuconostoc pseudomesenteroides. Les résultats
du groupement phylogénétique correspondent avec les informations fournies par l'outil bioinformatique BLAST. Donc on peut constater comment les deux souches de la collection de
Leuconostoc sont regroupées, ce qui est logique puisque c'est le même genre, mais ce n’est
pas la même espèce, l'identification sur la base de la séquence partielle du gène de l'ARNr
16S, représente une discrimination de Leuconostoc et les espèces du genre.
Par conséquent, au mieux de notre connaissance, une seule information génétique
concernant Leuconostoc spp. isolée à partir de lait cru de chamelle en Afrique du Nord et
précisément de l’Algérie a été réalisée par Benmechernene et al. (Benmechernene et al.,
2014). En outre, l'utilisation de MALDI-TOF MS pour la caractérisation de LAB n'a été
139
Discussion
effectuée qu’une seule fois, cette étude a été réalisée par De Bruyne et al. (2011) concernant
l'identification protéomique de Leuconostoc provenant d'autres sources alimentaires
La présente étude a porté sur la caractérisation et l’identification protéomique de
Leuconostoc spp. à partir de lait cru de chamelle Algérien. Les souches Leuconostoc spp.
agissent comme des cultures starter et aussi exercent des effets bénéfiques sur la stabilité
microbiologique et la production de composés arômatique dans divers produits alimentaires.
Plus important encore, Leuconostoc spp. jouent un rôle crucial dans la biopréservation
alimentaire par la production de bactériocines à spectre d'inhibition différent (elles sont
particulièrement efficaces comme un agent antilisterial) (Sawa et al., 2010)
Enfin, cette étude représente le deuxième rapport sur l'application de l'analyse MALDI
TOF MS pour l'identification rapide et plus fiable des souches L. mesenteroides isolées à
partir de lait cru de chamelle Algérien en fonction de leur profil protéique de faible poids
moléculaire. Les spectres ont été générés en quatre exemplaires pour assurer la
reproductibilité de ces résultats. Les petites différences spectrales ont été observées dans la
majorité des cas qui peuvent provoquer de légères différences dans l'intensité des pics (Arnold
et al., 1999); cependant, les pics pertinents sont rarement touchés. Cela a également été
observé dans nos résultats illustrés dans les Figures 32 -38.
Les profils obtenus par spectrométrie de masse pour chaque Leuconostoc sp. permettent
pour la génération des listes de masse de pics spécifiques à l'espèce (tableau 4) pour de L.
mesenteroides, L. pseudomesenteroides et L. carnosum (Tableau 21). Remarquablement, ces
résultats ont permis d'identifier des masses de pics spécifiques à L. mesenteroides qui
pourraient servir de pics de biomarqueurs dans les analyses ultérieures. En outre, l'arbre
phyloproteomic de nos souches Leuconostoc spp. fournis des informations plus
intraspécifiques de l’analyse phylogénétique basée sur l'ARNr 16S de L. mesenteroides. Par
conséquent, l'analyse phyloproteomic a permis de grouper les souches L. mesenteroides en
différents sous-groupes (Figure 31), tandis que la proximité phylogénétique de ces souches ne
permettait pas une telle différenciation (De Bruyne et al., 2011).
L’application de MALDI TOF, empreinte de masse peptidique a été appliquée avec
succès à ce groupe bactérien et s'est avéré être une méthode complémentaire simple, rapide et
peu coûteuse pour l'identification bactérienne au niveau de l'espèce.
140
Discussion
L’utilisation du citrate en présence de sucre fermentescible (glucose) a été étudiée sur le
milieu KMK à fin de différencié entre les bactéries produisant ou non des composés
aromatiques; sa dégradation se fait grâce à la citratase, une enzyme qui existe dans certaines
espèces de Leuconostoc. Ce milieu contient une solution de ferricyanide de potassium et une
solution de citrate ferrique. La présence du citrate dans le milieu inhibe la réaction entre elles.
Les bactéries qui fermentent le citrate lancent la réaction entre ces ions et en résulte la
formation de colonies bleues (Figure 23). Ce métabolisme conduit à la formation du diacétyle,
qui est une composante importante pour la saveur des produits laitiers, et d'autres composés
tels que l'acétate, l'acétoïne et le 2,3-butanediol (McSweeney et Sousa, 2000). 77 % des
souches ont été capable d’hydrolyser le citrate ce qui correspond aux résultats trouvés par
Ghazi et al. (2009) et Zarour (2010), les 23 % restant ne forment pas de colonies bleues sur la
surface du milieu utilisé, donc ces souches ne dégradent pas le citrate, cette incapacité de
dégrader le citrate est peut être due à une perte des plasmides codant pour la citrate perméase
qui est localisée sur un plasmide de 23 kb dans Leuconostoc mesenteroides, ceci a été
démontré par Belguendouz et al., 1996 et Bourel et al., 2001.
La réaction de Vosges Proskauer (Figure 24) qui a été utilisée pour mettre en évidence
de l’acétoine (acéthylméthylcarbinol (AMC) dans le milieu Clark et Lubs s’est révélé
négative pour 52 % des souches ce qui est correspond aux caractéristiques des sous-espèces
de Leuconostoc mesenteroides (Badis et al., 2005). Les 48% des souches étudiées, avaient
produit de l’acétoine à partir du glucose qui s’est apparu par une coloration rose à la surface
du bouillon, cette coloration traduit la formation d’acéthylméthylcarbinol qui se transforme en
acétoine sous l’action de la soude qui se combine avec le α-naphtol (Guiraud, 1998).
Avec l'augmentation de la demande des consommateurs pour des produits moins
transformés et sans agents de conservation (Álvarez-León et al., 2006), les bactéries lactiques
antagonistes notamment les Leuconostoc ou leurs bactériocines ont été de plus en plus
utilisées pour contrôler les agents pathogènes dans certains aliments (Gong et al., 2010). Plus
précisément, les bactériocines qui représentent une option intéressante pour l'industrie
alimentaire, car ils ne modifient pas le goût ou l'odeur des produits finaux (Nes et Johnsborg,
2004).
L’étude des interactions bactériennes est très commune. De nombreuses méthodes
décrites pour la détection de souches lactiques productrices de substances protéiques
antimicrobiennes qui sont basées sur le principe que ces substances protéiques peuvent
141
Discussion
diffuser dans un milieu de culture solide ou semi-solide qu’on inocule préalablement avec une
souche cible. La production de bactériocine est détectée par le pouvoir inhibiteur du filtrat du
micro-organisme testé sur la croissance du germe cible. (Benkerroum et al., 1993).
Pour cela, on a opté pour deux méthodes, la première est le screening, un test direct,
dont la souche productrice et sensible est co-cultivée et incubé, ultérieurement, des zones
d’inhibition apparaissent autour de la colonie de la souche productrice. La deuxième,
dites indirectes, qui permet de mettre le surnageant des souches de Leuconostoc
productrices de substances antimicrobiennes en contact avec les souches indicatrices.
Les souches Leuconostoc mesenteroides isolées, ont été trouvés à posséder une activité
antibactérienne. À partir de 83 isolats, nous avons retenu 7 souches performantes (LnC12,
LnC21, LnC23, LnC26, LnC28, LnC29 et LnC33) qui ont montré une activité inhibitrice
contre les espèces de Listeria incluant Listeria monocytogenes. L'activité antimicrobienne de
ces bactéries peut être due à un certain nombre de facteurs. Parmi ceux-ci les acides lactiques
qui diminuent le pH, la compétition pour les substrats et la production de substances à action
bactéricide ou bactériostatique, y compris les bactériocines (Parente et Ricciardi, 1999).
L’étude des bactériocines de ses souches doit prendre en compte la grande quantité
d’acides organiques produite au cours du métabolisme bactérien et devrait écarter l’inhibition
due à ces acides organiques (Marth et Hussong, 1963 ; Sorrells et Speck, 1970). C’est la
raison pour laquelle l’utilisation du milieu tamponnée aide à stabiliser le pH et à écarter l’effet
d’acidité dû à la production d’acides lactiques (Labioui et al., 2005) ce qui facilite la
révélation de l’effet d’un autre agent possédant l’activité inhibitrice. Tous les diamètres
mesurés (mm) des zones d’inhibition des souches testées (Tableaux 22 et 23) quelle que soit
par la méthode directe ou indirecte ont diminué, car l’activité antagoniste des bactéries
lactiques contre les souches pathogènes est due majoritairement à la diminution du pH
résultant de la production des acides organiques. La croissance de certaines bactéries lactiques
entraîne la production de peroxyde d’hydrogène (H2O2) qui est considéré comme un
inhibiteur de la croissance bactérienne (Cogan et al., 1981 ; Titiek et al., 1996 ). Cet agent
peut être dégradé par une enzyme, la catalase, présente chez certaines espèces bactériennes
telles que Staphylococcus aureus, Listeria innocua et Listeria ivanovii donc l’inhibition due à
ce composant a été écartée. Ainsi, l’effet des phages a été écarté par l’utilisation de deux
techniques dont les résultats sont identiques, absence totale des phages, la technique où on
utilise le chloroforme et la deuxième où on déplace complètement la gélose en l’inversant, ce
142
Discussion
dernier essai minimise les effets d'acides et l’action des bactériophages, du fait que les deux
souches testes et indicatrices sont séparées physiquement par une couche d’Agar.
Les bactéries Gram positives sont généralement plus sensibles à l’effet bactéricide des
bactéries lactiques (Onda et al., 2003). Les bactériocines sont surtout actives sur les
pathogènes à Gram positif et agissent en formant des pores dans la membrane cytoplasmique
qui entraînent des perturbations des fonctions cellulaires (Biswas et al., 1991). On remarque
une compatibilité selon nos résultats. Song et Richard (1997) ont montré chez Listeria,
bactéries à Gram positif, que les cellules résistantes aux bactériocines ont une membrane de
composition différente de celle des cellules sensibles.
Afin de s’assurer que les substances inhibitrices produites sont de nature protéique, on a
traité le surnageant des cultures de Leuconostoc mesenteroides par différents enzymes
protéolytiques (Tableau 24, Figure 42). On a remarqué absence totale des zones d’inhibitions
(Figure 42). Ce qui fait suggérer que les souches Leuconostoc mesenteroides étudiées
produisent une biomolécule de natures protéiques qui causent l’inhibition des autres bactéries
indicatrices. Ces composés peuvent être des bactériocines. La production de bactériocines par
le genre Leuconostoc mesenteroides est affirmé (Orberg et Sandine, 1984; Sudirman et al.,
1994 ; Osmanafaoflu, 2007; Xiraphi et al., 2008 ; Trias et al., 2008).
Concernant l’optimisation de la production de substances antimicrobiennes, dans la
présente étude, les sept souches étudiées (LnC12, LnC21, LnC23, LnC26, LnC28, LnC29
et LnC33) conservent l’activité de la substance antimicrobienne de la nature protéique du pH
4.0 au pH 8.0 (Tableau 24). La stabilité de cette activité à faible pH est très importante pour
leur application potentielle dans les aliments, comme les produits fermentés, dans lequel les
conditions sont acides. Elles sont plutôt stables à la chaleur (Tableau 24), étant donné que la
perte de l’activité de cette substance des souches Leuconostoc mesenteroides est de 57% après
incubation à des températures élevées (100 °C pendant 30 minutes). D'autres bactériocines
isolées du genre Leuconostoc mesenteroides ont des caractéristiques similaires. Entérocine
1146 (Parente et Hill, 1992) a été également décrite comme stable à la chaleur, même si, il a
été partiellement ou totalement inactivé à des températures supérieures à 60 °C.
Le traitement par l'ajout de la Tween 80 a un effet positif en comparaison avec le
témoin sur l'activité antimicrobienne par l'augmentation de la production de la substance
antimicrobienne (Tableau 25). Être un agent tensioactif, le Tween 80 peut empêcher
l'adsorption de la bactériocine de la cellule productrice et cela pourrait être dû à une
143
Discussion
stabilisation d'une configuration favorable des molécules de bactériocine (Huot et al., 1996)
qui veut dire la suppression de l’adhésion bactériocine-cellule par cette agent de surface. Le
maintien de l'activité après l'addition de Tween 80 a été observé pour lactacin F à partir de
Lactobacillus (Muriana et Klaenhammer, 1991). Le bon effet de la Tween 80 sur nos souches
pourrait être due à une stabilisation d'une configuration favorable des molécules de
bactériocine (Huot et al., 1996). Tandis que, après traitement des substances antimicrobiennes
par l’urée montrent une diminution dans l’activité antibactérienne (Tableau 25), qui
s’explique par la dénaturation de nos substances protéiques par solvant organique. Nos
travaux sont compatibles avec plusieurs travaux, dont Lacroix et Millette (2011).
La substance antibactérienne que contient le surnageant traité expose une action
modérée contre les souches pathogènes d'origine alimentaire comme Listeria spp. y compris
Listeria monocytogenes. Par conséquent, elle pourrait être utilisée comme starter ou des
cultures de protection dans l'industrie alimentaire. Depuis, les composés antimicrobiens
produits par nos souches étant de nature protéique, thermorésistante et un mode d'action
bactéricide, ils pourraient satisfaire aux critères de bactériocines (Van Laack et al., 1992). Il
faut noter que ces substances antimicrobiennes ne sont pas forcément des bactériocines, des
expériences sont indispensables pour connaitre la nature exacte de ces composants.
Il faut aussi garder en tête que la production de bactériocines peut-être affectée par une
série de facteurs. Parmi ceux-ci on peut citer la composition du milieu de culture, y compris le
carbone, l'azote et les sources de phosphates, des cations et des agents inhibiteurs, le pH
optimal, l'aération et la température de croissance (Daba et al., 1993).
Afin d’étudier l’inhibition de Listeria spp. par Leuconostoc mesenteroides dans le milieu lait
qui est un milieu favorable pour la croissance des deux genres. Les Leuconostoc y vivent
naturellement comme ils a été prouvé par plusieurs auteurs (Gonzalez et al., 2003; Duthoit et
al., 2003; Ercolini et al., 2003) ainsi que Listeria qui s’y trouvent d’après Khelef et al., 2006.
On a opté donc pour la cinétique de croissance de Leuconostoc mesenteroides ainsi que les
souches Listeria innocua et ivanovii en culture pure et mixte ; la souche Ln C12 a été inoculée
dans du lait écrémé additionné de 0.3% d’extrait de levure suite à une incubation à 30°C. On a
suivi le dénombrement, le pH et l’acidité Dornic à un intervalle de temps régulier qui était de
trois heures.
D’après la production de l’acidité titrable (Figure 46 et 47), l’évolution du pH (Figure 44 et
45) et le dénombrement de cellules de Leuconostoc mesenteroides (Figure 48 et 49) autant
144
Discussion
que les souches Listeria innocua et ivanovii au cours de la croissance, on a révélé une grande
corrélation entre eux, qui représente un indice indirect sur le développement bactérien. En
remarquant que l’augmentation du taux de croissance a été suivie par une diminution de pH
qui, à son rôle a augmenté la production des acides organiques. Cette production d’acides a
été confirmée par Damelin et al. (1995). Le pH acide ainsi que les acides lactiques produits
ont inhibé la croissance de Listeria spp. Comme il a été démontré par Trias et al. (2008) où ils
ont confirmé que les acides organiques produits par Leuconostoc mesenteroides ont été le
principal mécanisme d’inhibition contre Listeria monocytogenes.
Depuis une dizaine d’années, un intérêt considérable s’est développé autour de
l’utilisation de cultures lactiques à effets bénéfiques pour la santé ou « probiotique »
pour des applications alimentaires, pharmaceutiques ou encore en alimentation animale.
Dans la majorité des cas, les produits laitiers tels les yaourts, laits fermentés, fromages, laits
en poudre et crèmes glacées ont été choisis comme véhicules privilégiés des cultures
probiotiques (Doleyres et al., 2002).
Dans les applications probiotiques, les bactéries lactiques les plus sélectionnées
appartiennent principalement aux genres Lactobacillus et Bifidobacterium. Mais peux d’études
sont faites sur le genre Leuconostoc, puisqu'on l'a généralement supposé que les Leuconostoc
ne survivent pas lors du passage à travers l’appareil digestif, cela est dû au pH faible de
l'estomac et à la présence de sels biliaires dans l'intestin. Cependant, des travaux récents ont
suggéré que Leuconostoc puissent survivre (Allameh et Kazemnejad, 2012 ; Seo et al., 2012).
Afin de sélectionner des souches Leuconostoc mesenteroides à potentiel probiotique,
elles doivent défier le tractus gastro-intestinal. Par conséquent, nous avons caractérisé le profil
probiotique des sept souches productrices de substances antimicrobiennes de nature protéique
(LnC12, LnC21, LnC23, LnC26, LnC28, LnC29 et LnC33).
En ce sens, le faible pH de l'estomac et l'action antimicrobienne de la pepsine sont
connus comme une véritable barrière contre l'entrée et la survie des bactéries dans le tractus
intestinal (Huang et Adams 2004). Bien que nos souches ont présenté une bonne viabilité à
des pH faibles (2.0, 3.0 et 4.0) pendant 3 heures (Tableau 26), cette durée reflète la moyenne
du temps passé par les aliments dans l'estomac (Argyri et al., 2013), ainsi qu’à la fois en
présence de pepsine, où on a remarqué une bonne viabilité de nos souches au pH 3.0 (Tableau
27). La bactérie utilisée comme probiotique, se rendra dans l'estomac et entre dans le tractus
intestinal qui contient la bile. À ce stade, les souches devraient avoir la capacité de résister
145
Discussion
aux procédés de digestion. Il est rapporté que le temps à la première entrée prend trois heures
de l'estomac de le libérer. Les souches doivent être résistantes aux conditions de stress de
l'estomac et de l'intestin, qui contient de la bile (Chou et Weimer 1999), qui est une solution
aqueuse jaune-verte dont la fonction est comme un détergent biologique qui émulsionne et
solubilise les lipides, jouant ainsi un rôle essentiel dans la digestion des graisses. Cette
propriété détergente de bile confère également une activité antimicrobienne puissante,
principalement par la dissolution des membranes bactériennes.
Dans l'intestin grêle, la tolérance aux sels biliaires est un facteur important qui contribue
à la survie des probiotiques. Les bactéries qui survivent aux conditions acides de l'estomac
doivent alors faire face à l’action détergente des sels biliaires libérés dans le duodénum après
ingestion des repas gras. Les bactéries peuvent réduire l’effet émulsifiant des sels
biliaires en les hydrolysant avec des hydrolases, de ce fait diminuant leur solubilité
(Ammor et Mayo, 2007 ; Gu et al., 2008).
D’après notre test in vitro, et pour tester la résistance bactérienne aux sels biliaires, des
concentrations dans l'intervalle 0.15 à 0.3% qui a été recommandé par d'autres auteurs
(Gilliland et al., 1984) pour la sélection de bactéries probiotiques à usage humain, pendant 4
heures reflétant le temps passé par les aliments dans l'intestin grêle (Argyri et al., 2013). Nos
souches étudiées montrent une viabilité élevée en présence de toutes les concentrations testées
de sels biliaires. Les probiotiques qui peuvent tolérer un faible pH et des sels biliaires
signifient qu'ils ne peuvent pas seulement transiter par l'estomac et être actifs dans l'intestin,
mais aussi sont capables d'être viables et de survivre dans des conditions de stress (Cebeci et
Gurakan, 2003).
Concernant l’hydrolyse des sels biliaires, cette hydrolyse a été corrélée à réduire le
cholestérol (Begley et al., 2006). Une hypothèse propose que l'abaissement du cholestérol de
Lactobacillus soit une propriété due à l'incorporation du cholestérol dans les membranes
cellulaires des bactéries du milieu au cours de sa période de croissance (Gilliland et al., 1985).
Le principal mécanisme est cependant lié à l'activité d'hydrolase des sels biliaires de cellules
(Taranto et al., 1997). En effet, certaines souches de bactéries lactiques sécrètent la bile
hydrolase des enzymes qui hydrolysent les acides biliaires conjugués à libérer des déconjugués des acides biliaires et des acides aminés (Franz et al., 2011). Lorsque ces sels sont
sécrétés par le tractus gastro-intestinal, la demande pour le cholestérol est augmentée, ce qui
abaisse le taux de cholestérol (De Rodas et al., 1996).
146
Discussion
D'autre part, il est pas encore tout à fait clair si l'activité de l’hydrolyse des sels biliaires
est une propriété souhaitable pour les probiotiques, car de grandes quantités de sels biliaires
peuvent avoir des effets indésirables pour l'hôte humain (Mamianett et al., 1999). Toutefois,
les données de recherche actuelles suggèrent fortement que la fonction de l’hydrolyse des sels
biliaires microbienne dans la détoxification des sels biliaires augmente la survie intestinale et
la persistance des souches productrices, qui à son tour augmente les effets bénéfiques globaux
associés à la souche (Begley et al., 2006). En outre, les genres bactériens qui seraient très
probablement utilisés comme probiotiques (Bifidobactéries et Lactobacilles) ne sont pas
capables de déshydroxylant des dé-conjugés des sels biliaires (Ahn et al., 2003). Aucune de
nos souches n’a pu hydrolyser les sels biliaires.
L'absence de l'activité hémolytique et la résistance aux antibiotiques est considérée
comme une condition préalable de la sécurité pour la sélection d'une souche probiotique
(FAO/WHO, 2002).
Aucun de nos isolats bactériens hydrolyse le sang humain quand on les a cultivés sur
milieu Columbia du coup elles sont non-hémolytiques (Figure 50). Ce caractère a été
confirmé par Holzapfel et Schillinger (1992).
Les bactéries lactiques sont naturellement résistantes à beaucoup d’antibiotiques
grâce à leur structure et physiologie. Les travaux de Temmerman et al. (2003) ont
montré que 68.4% des probiotiques isolés ont une résistance à un antibiotique ou plus. Le
comportement de chaque isolat vis-à-vis les trente-trois différents antibiotiques en termes de
sensibilité et de résistance est montré dans le Tableau 29 et la Figure 51. Aucune souche
n’était susceptible à tous les antibiotiques testés, Le profil de résistance aux antibiotiques de
nos souches Leuconostoc mesenteroides présentes d’une manière générale une résistance à
plusieurs antibiotiques. Nos souches sont résistantes à plus de 18 antibiotiques testés. La
résistance à un antibiotique spécifique signifie que le probiotique peut être administré en
même temps que le traitement avec l’antibiotique est nécessaire. Deuxièmement, la microflore
de l'intestin peut rétablir plus rapidement (Cebeci et Gurakan, 2003; Kim et Austin, 2008).
Lorsque la résistance des souches aux antimicrobiens dans le groupe (bêta-lactame) a
été testé, nos souches ont montré une résistante modérée à l'Ampicilline et l’Imipenem et une
plus grande résistance à Ceftazidime, Cefalotin, Cefixime, Cefsulodin, Cefotaxime, Cefazolin.
Les β-lactamases, une famille d'enzymes de résistance qui comprend les pénicillinases et
céphalosporinases, sont impliquées dans la résistance aux b-lactamines (Bush et al., 1995). En
147
Discussion
ce qui concerne les antimicrobiens dans Group (non β-lactame), toutes les souches étaient
résistantes à la Vancomycine et à la Teicoplanine, les deux font partie du sous-groupe des
glycopeptides. Étant donné que les Leuconostoc sont déjà résistante à la Vancomycine
(Hemme et
Foucaud-Scheunemann, 2004), cette résistance est en général intrinsèque
(Delcourt, et al., 1999). Ceci est en accord avec les différents rapports indiquant que les
bactéries lactiques sont normalement résistantes aux principaux types d'antibiotiques, tels que
β-lactamines, les céphalosporines, les aminosides, quinolones, imidazole, la nitrofurantoïne et
fluoroquinolines (Halami et al., 2000).
Les propriétés de résistance aux antibiotiques ont également été indiquées que les
souches des bactéries lactiques isolées seraient capables de survivre dans l'environnement et
le milieu intestinal par la résistance aux situations indésirables survenus en raison des
concentrations élevées des antibiotiques occasionnels (Bhakta et al., 2012)
Une sur-utilisation des antibiotiques dans le traitement et la prophylaxie des infections
bactériennes pourrait être le principal facteur à l'égard de la résistance bactérienne à ces
médicaments et expliquer les niveaux élevés affichés par les souches examinées par rapport à
la plupart des antibiotiques étudiés. En outre, d'autres pratiques visant à accroitre la
production dans les exploitations agricoles peuvent également favoriser le développement de
la résistance aux antibiotiques chez les bactéries qui infectent les animaux (Lukàsovà et
Sustàckovà, 2003).
Nos études in vitro ont démontré que les sept souches de Leuconostoc mesenteroides
avaient de bons profils probiotiques et pourraient être des candidats probiotiques idéals.
148
Discussion
Conclusion
Nous avons réussi à identifier 83 souches de Leuconostoc mesenteroides par des tests
biochimiques, physiologiques et le profil fermentaire dont on à 42 souches identifiées comme
étant des Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides,
37 souches
comme des
Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum et 4 souches comme des Leuconostoc
mesenteroides subsp. cremoris. Une identification confirmative des sept souches Leuconostoc
mesenteroides subsp. mesenteroides productrices de substances antimicrobiennes de nature
protéique a été aboutie par l’utilisation des galeries API ainsi qu’une identification génétique
par deux méthodes ; l’usage de la PCR 16S ARNr a été appliqué pour ces souches où le
résultat était compatible avec l’identification classique. La deuxième est l’utilisation de la
spectrophotométrie de masse (MALDI-TOF) dont on a réussi à avoir des résultats plus précis
et on peut conclure que ces souches productrices sont bien des Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides.
La détection de l’activité antimicrobienne a illustré une bonne activité antagoniste visà-vis les bactéries cibles (Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria ivanovii,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli et Lactobacillus plantarum).
De plus, les études cinétiques de la souche Leuconostoc mesenteroides subsp.
mesenteroides en milieu lait et en présence de Listeria innocua et Listeria ivanovii, nous a
permis de déduire que la souche à réduit clairement leurs charges microbiennes. Donc elle
peut être utilisée sous forme de culture protectrice pour inhiber la croissance de bactéries
pathogènes dans les aliments.
Après une évaluation des propriétés probiotiques possibles de nos souches
bactériennes qui ont nécessité des tests planifiés intensifs et avec précaution, elles peuvent
survivre à travers le passage gastro-intestinal pour être en mesure d'exprimer leurs propriétés
d'intérêt mentionnées pour être de bonnes souches probiotiques.
149
Discussion
Nos résultats ont montré preuve que les sept souches Leuconostoc mesenteroides
(LnC12, LnC21, LnC23, LnC26, LnC28, LnC29 et LnC33) ont été trouvées à posséder
de bonnes propriétés probiotiques in vitro. Nos souches montrent une bonne résistance aux
pH acides, à la même fois aux enzymes tels que la pepsine. Elles défient les concentrations
des sels biliaires testés et surtout elles ne présentent aucun danger sur le consommateur par
étant non hémolytique. Leur résistance aux antibiotiques qui a été évaluée nous a permis de
conclure que nos souches révèlent une poly-résistance envers plusieurs antibiotiques.
Par conséquent, ces souches sont de bons candidats pour une étude plus approfondie
pour élucider leurs avantages potentiels pour la santé comme une culture protectrice et comme
un starter dans les produits alimentaires afin d'évaluer leurs caractéristiques technologiques
pour les applications en tant que nouveaux départs de souches Leuconostoc mesenteroides
isolées à partir du lait cru de chamelle en Algérie.
§
L’identification, la purification et l’étude des propriétés de ces bactériocines.
§
L’application in vivo des bactériocines sur des produits alimentaires
§
Élargir la gamme de souches pathogènes testées.
§
Tests d’adhésion des probiotiques in vitro;
§
Tests in vivo sur des animaux de laboratoire ou des humains volontaires.
150
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Annexes
Composition des milieux de culture
Milieu MRS (de Man-Rogosa et Sharp, 1960)
Extrait de levure 5 g
Extrait de viande 10 g
Polypeptone 10 g
Citrate de sodium 2 g
Acétate de sodium 5 g
Glucose 20 g
KH2 PO4 2 g
MgSO4 0,25g
MnSO4 0,05 g
Agar/Agar 15 g
Eau distillée 1000 ml
pH 6.8
Autoclavage 120°C/ 20 minutes
Milieu MSE (Mayeux, Sandine et Eliker, 1962)
Tryptone 20g
Gélatine 2.5g
Extrait de levure 5g
Sachharose 100g
Glucose 5g
Citrate de sodium 1g
Azide de sodium 0.075g
Agar/agar 15g
Eau distillée 1000ml
pH 6.8
Autoclavage à 120°C/20 minutes
Milieu M16 BCP (Thomas, 1973)
Peptone 10g
Extrait de viande 5g
Extrait de levure 2.5g
Lactose 2g
Acide ascorbique 0.5g
L-arginine .4g
Pourpre de bromocrésol 0.05g
Agar-agar 15g
Eau distillée 1000ml
pH 6.8
Autoclavage à 120°C pendant 20 min
169
Annexes
Milieu Bouillon nutritif (BN)
Extrait de viande 1 g
Extrait de levure 2 g
Peptone 5 g
Chlorure de sodium 5 g
Eau distillée 1000 ml
pH 7,4
Autoclavage 120 °C pendant 20 minutes
Milieu BHI (Brain Heart Infusion)
Infusion cœur-cervelle (matières solides) 8 g
Digestion peptique de tissu animal 5g
Digestion pancréatique de caséine 16g
Chlorure de sodium 5g
Glucose 2g
Phosphate d’hydrogène disodique 2,5g
pH 7,4
Autoclavage 120°C pendant 20 minutes.
Lait écrémé à 0.3% d’extrait de levure
Lait en poudre 100 g
Eau distillée 1000 ml
Extrait de levure .3g
Autoclavage 110°C pendant 10 minutes
Milieu KMK (Kempler Mc Kay, 1980)
Extrait de levure 3 g
Biopolytone 2.5 g
Glucose 5 g
Agar .15 g
Eau distillée 1000ml
pH 6.6
Le milieu est rempli à raison de 100ml par flacons, puis autoclavé 15 minutes à 120°C
Au moment de l’emploi on ajoute :
1ml d’une solution aqueuse de ferricyanide de potassium 10% (p/v).
1ml d’une solution aqueuse à 2.5% (p/v) de citrate ferrique et citrate de sodium (p/p).
Ces solutions sont stérilisés par filtration sur filtres millipores 0.22 µm et ils sont
conservés à l’obscurité à 4°C.
170
Annexes
Milieu Mueller-Hinton (Mueller et Hinton, 1941)
Infusion de viande de bœuf 300cm3
Peptone de caséine 17.5 g
Amidon de maïs 1.5 g
Agar-agar 17 g
pH 7.4
Autoclavage à 120°C pendant 20 min
Eau Physiologique
Chlorure de sodium 8,5 g
Peptone 0,5 g
Eau distillée 1000 ml
pH 7,0
Autoclavage 120°C pendant 20 minutes.
Milieu MRS-BCP sans extrait de viande
MRS bouillon sans extrait de viande 1000 ml
Pourpre de Bromocrésol 0.025 mg
pH 7
Autoclavage 120°C pendant 20 min
Composition des réactifs
Tampon phosphate
Solution A : 9.08g KH2PO4 dans 1000ml d’eau distillée
Solution B : 9.47 K2HPO4 dans 1000 ml d’eau distillée
Tampon pH 6.8 : 99 ml (A) + 101 ml (B)
Reactifs de Kovacs
Dimethyl-amino-4benzaldéhyde 50g
Acide chlorohydrique 250 ml
Pentanol 1 750 ml
Lugol
Iode 1g + 2 iodure de potassium + quelques ml d’eau distillée
Diluer peu à peu jusqu’à 300 ml
Cristal violet
Solution A : 2 g violet de gentiane + 20 ml alcool 95°
Solution B : 0.8 g oxalate d’ammonium + 80 ml d’eau distillée
A + B et laisser filtrer 24 heures.
171
Annexes
NaOH 1 M
40 g NaOH dans 1000 ml eau distillée
NaOH à N/9
Hydroxyde de sodium 4, 445 g
Eau distillée 1000 ml
La préparation de cette solution doit être effectuée avec une grande précision.
Phénolphtaléine à 1%
Phénolphtaléine 1 g
Ethanol à 95% 100 ml
Enzymes protéolytiques
Enzyme 10 mg
Tampon phosphate (10 mM, pH 7) 1 ml
Préparation du gel d’agarose avec le SYBR SAFE
TAE 1X:
1140 µl acide acétique glacial.
4,84 g Trisbase.
2 ml d'EDTA (0.5 M ; pH = 8).
1000 ml d'eau Milli Q
Ajuster le pH à 8,0 avec de l'acide acétique.
Gel d’agarose (2.5%):
2.25 g Agarose
90 ml TAE 1X
Mettre le tout dans le four à microonde, le refroidir un peu et ajouter
9 µl SYBR safe
Agiter pour diluer le SYBR safe et verser le dans le moule de la cuve. Placer le peigne
et laisser se solidifier (approx. 45 min)
Charger le gel :
3-5 µl du tampon du chargement
5 µl d’échantillon
Mettre sur un parafilm le mélange 3 µl d’échantillon et 5 µl du marqueur dans le puit
dont la composition est 30% de glycerol et 0,25% de bleu de bromophénol.
Le mélange de l'échantillon avec le "tampon", a été chargé dans les puits du gel. Ainsi
que le marqueur du poids moléculaire commercial contenant des fragments d'ADN de tailles
entre 100 - 3000 pb, concentration 80 pg / ml (EZ Charger 100 pb PCR moléculaire règle).
Charge 5 ul de marqueur dans une cuvette de gel.
Électrophorèse : 100 V (aprox 45 min) en TAE 1X
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