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Stress nutri*onnel chez les bactéries: la réponse stringente E. Bouveret CNRS – LISM [email protected]‐mrs.fr hEp://lism.cnrs‐mrs.fr/Bouveret Plan 1. The stringent response 2. Rsh enzymes and (p)ppGpp metabolism 3. Action of (p)ppGpp in the cell Bacteria adaptation to their environment Quality of the environment Cellular resources Growth/Reproduction Maintenance/Survival Nyström, 2004 Bacteria adaptation to starvation Quality of the environment Cellular resources Growth/Reproduction Rich medium Cellular resources Reproduction Growth Maintenance Survival Maintenance/Survival Starvation Cellular resources Reproduction Growth Maintenance Survival Nyström, 2004 Bacteria adaptation to starvation Quality of the environment Cellular resources Growth/Reproduction Maintenance/Survival Rich medium Starvation Stringent response Cellular resources Reproduction Growth Maintenance Survival Cellular resources Reproduction Growth Maintenance Survival Nyström, 2004 Discovery of the stringent response rRNA quantification c.p.m Rich medium Stable RNA synthesis 70000 ribosomes/cell in rich medium Amino acid starvation Relative Optical Density 2000 ribosomes/cell during starvation GROWTH Stent et Brenner, 1961 rRNA synthesis inhibition is due to (p)ppGpp accumulation. rRNA ATP _ P 5’ 4’ _ ‐ ‐ _ ppGpp N3 _ pppGpp origin 5’ P P 4’ 1’ 3’ 2’ _ ‐ _ ‐ _ Magic Spot II _ Magic Spot I 2’ _ GTP 1’ 3’ _ Amino acid starvation Cashel and Gallant, 1969 N3 Cashel and Kalbacher, 1970 rRNA synthesis inhibition is due to (p)ppGpp accumulation. rRNA Amino acid starvation rRNA Amino acid starvation Magic Spot I Magic Spot II No Magic Spot Wild type Relaxed Cashel and Gallant, 1969 Stringent Response in E. coli Starvation (p)ppGpp PrRNA RNAp stable RNA synthesis Ribosome biogenesis Stringent Response in E. coli Starvation Membrane biogenesis Phospholipid synthesis fatty acid synthesis DnaA (p)ppGpp stable RNA synthesis Replication Ribosome biogenesis Stop Growth σS factor amino acid biosynthesis genes of stress response Activate Survival Stringent Response in E. coli Starvation Membrane biogenesis ? Phospholipid synthesis fatty acid synthesis DnaA (p)ppGpp stable RNA synthesis Replication Ribosome biogenesis Stop Growth σS factor amino acid biosynthesis genes of stress response Activate Survival Rsh proteins are involved in (p)ppGpp metabolism. Starvation GDP Rsh GTP (p)ppGpp degradation PPi ATP (p)ppGpp Rsh synthesis ppGpp pppGpp AMP (p)ppGpp Stop Growth Activate Survival Identification des enzymes qui contrôlent le taux de (p)ppGpp. approche génétique chez E. coli= les gènes rel (1965) rRNA Amino acid starvation rRNA Amino acid starvation Magic Spot I Magic Spot II Wild type No Magic Spot Relaxed • Des mutants ‘relaxés’ ne font pas la réponse stringente: la synthèse d’ARN continue pendant 1 heure après l’arrêt de la synthèse protéique. • Gènes relA, relC (L11), relB relA code pour la (p)ppGpp synthétase I • Purification d’un « stringent factor » associé au ribosome (1972-1975) • Clonage de relA: surproduction de ppGpp et ralentissement de la croissance (1976) => démontre un effet direct du ppGpp sur la transcription Synthèse ARNr Témoin carence en acides aminés surexpression de RelA Identification du gène spoT (1974) • Mutant spoT =accumulation de ppGpp= apparition d’un ‘spot’ • spoT code pour une enzyme de dégradation du ppGpp • SpoT est une (p)ppGpp 3’-Pyrophosphohydrolase ATP GTP ppGpp pppGpp origine Souche spoT- Souche spoT + Laffler et Gallant, 1974 Identification d’une deuxième activité de synthèse: (p)ppGpp synthase II • Dans un mutant relA, il y a toujours une activité résiduelle de synthèse de (p)ppGpp (10 à 100 fois moindre) • Un autre gène…? 2 groupes américains, Cashel et Bremer, en 1991 2 approches géné*ques différentes IdenEficaEon de la ppGpp synthase II ppGpp _ ppGpp: pas lacZ, colonies blanches Sans ppGpp: lacZ, colonies bleues P1rrnB lacZ Background de départ: Souche relA‐, colonies toujours blanches (ac*vité de synthèse résiduelle) Mutagenèse aléatoire => Recherche de colonies très bleues => Gène spoT • Donc, spoT code à la fois une activité (p)ppGpp 3’-pyrophosphohydrolase et une activité ppGpp synthase II. Hernandez et Bremer, 1991 Passage à la biologie moléculaire: Rel/Spo homolog (Rsh) enzymes Rsh RelSpo HD (p)ppGpp degradation (p)ppGpp synthesis (p)ppGpp synthesis (p)ppGpp degradation N‐terminal domain Hogg et al., 2004 ACT TGS regulation Phylogenetic distribution of Rsh enzymes + SAS RelSpo TGS HD RelSpo TGS (p)ppGpp degradation (p)ppGpp synthesis RelA SpoT RelSpo ACT Rsh HD RelSpo (p)ppGpp degradation (p)ppGpp synthesis TGS ACT regulation Introduction (2) Rsh proteins in E. coli Amino acid starvation Carbon starvation S D RelA Growth Phosphate starvation Iron starvation S SpoT (p)ppGpp Survival Introduction (2) RelA-dependent stringent response in E. coli synthesis RelA N 1 regulation C 386 739 Schreiber et al., 1991 Amino acid starvation: Uncharged tRNA * mRNA Inactive RelA mRNA GDP/GTP (p)ppGpp * Active RelA * Active RelA (p)ppGpp synthesis and accumulation Wendrich et al., 2002 Introduction (2) SpoT SpoT-dependent stringent response in E. coli N 1 synthesis degradation 344 85 regulation 357 C 203 702 Gentry and Cashel, 1996 Signal? allosteric transition (p)ppGpp synthesis (p)ppGpp degradation Structure of the N‐terminal domain; Hogg et al. ,2004 RelA and SpoT-dependent responses in E. coli amino acid starvation carbon, iron, or phosphate starvation Uncharged tRNA D mRNA TGS Cterm SpoT Cterm RelA S S TGS Cterm (p)ppGpp Stringent response ? Action du (p)ppGpp dans la bactérie Starvation Membrane biogenesis Phospholipid synthesis fatty acid synthesis DnaA (p)ppGpp stable RNA synthesis Replication Ribosome biogenesis Stop Growth σS factor amino acid biosynthesis genes of stress response Activate Survival Le (p)ppGpp est un régulateur pléiotrope de la transcription Régulateur posi*f ou néga*f suivant les cibles. Mode d’ac*on au niveau de la transcrip*on? Modula*on de l’ac*vité de la RNAP. ArsEmovitch et al., 2004 Action directe: le ppGpp inhibe la synthèse des ARN stables et active la synthèse des acides aminés A Séquence discriminatrice InhibiEon Séquence discriminatrice AcEvaEon B Paa Transcrits Srivatsan et al., 2008 Opérons de synthèse des ARNr chez E. coli Les 7 opérons codant pour l'ARNr d'E.Coli s'appellent rrnA à rrnG. Ils con*ennent tous 3 ARNr dans l'ordre 16S, 23S et 5S. Tous les opérons rrn ont 2 promoteurs : P1 (promoteur principal) et P2. Entre 16S et 23S, on a une séquence codant un ARNt dans 4 opérons rrn et 2 ARNt pour les 3 autres opérons rrn. On trouve 1 ou 2 ARNt après l'ARNr 5 S. Mécanismes différents suivant les espèces Absence de DksA Inhibi*on de la synthèse de GTP Krasny et al., 2004 Action indirecte: redistribution de la RNAP et implication des facteurs de transcription alternatifs Croissance Prrn Paa Arrêt de la Croissance Facteurs σ alterna*fs Prrn Paa Facteurs σ alterna*fs Magnusson et al., 2005 Régulation du taux de croissance par le ppGpp Activité des promoteurs rRNA en fonction de la concentration en ppGpp Rôle des iNTPs ou du ppGpp pour la régulation des promoteurs rRNA Hernandez et al., 1990 Paul et al., 2004 ppGpp inhibe la réplication ppGpp Bacillus ppGpp E. coli dnaA DnaA Caulobacter Primase Chiaramello et Zyskind, 1990; Wang et al., 2007; Lesley et Shapiro, 2008 ppGpp participe à l’induction de la réponse générale au stress Forte densité cellulaire Forte osmolarité Faible taux de croissance rpoS Basse température rpoS ARNm ppGpp PH faible Carence en carbone Haute température σS protéolyse EσS Régulon σs Hengge‐Aronis, 2002 Action du (p)ppGpp dans la bactérie Traxler et al., 2008
