Stress nutri^onnel chez les bactéries: la réponse stringente
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Stress nutri*onnel chez les bactéries: la réponse stringente E. Bouveret CNRS – LISM [email protected]‐mrs.fr hFp://lism.cnrs‐mrs.fr/Bouveret Plan 1. La croissance bactérienne 2. La réponse stringente 3. Les enzymes Rsh et le métabolisme du (p)ppGpp 4. Mécanisme d’action du (p)ppGpp dans la cellule Croissance bactérienne végéta0ve 2 µM Escherichia coli Une nouvelle bactérie en 20 min à 37°C, milieu riche et aéré. Division cellulaire bactérienne 1 puis 2 puis 4 puis … La phase « exponen0elle » de croissance Les phases de croissance Phase sta0onnaire Arrêt de la croissance Cellules plus pe*tes Cellules plus rondes Autophagie Exponentielle! Stationnaire! Lange and Hengge, 1991! Adaptation des bactéries à la qualité nutritionnelle de leur milieu Qualité de l’environnement Ressources cellulaires Croissance/Reproduction Maintenance/Survie Rich medium Starvation Réponse stringente Cellular resources Reproduction Growth Maintenance Survival Cellular resources Reproduction Growth Maintenance Survival Nyström, 2004 Discovery of the stringent response rRNA quantification c.p.m Rich medium Stable RNA synthesis 70000 ribosomes/cell in rich medium Amino acid starvation Relative Optical Density 2000 ribosomes/cell during starvation GROWTH Stent et Brenner, 1961 rRNA synthesis inhibition is due to (p)ppGpp accumulation. rRNA ATP _ P 5’ 4’ _ ‐ ‐ _ ppGpp N3 _ pppGpp origin 5’ P P 4’ 1’ 3’ 2’ _ ‐ _ ‐ _ Magic Spot II _ Magic Spot I 2’ _ GTP 1’ 3’ _ Amino acid starvation Cashel and Gallant, 1969 N3 Cashel and Kalbacher, 1970 rRNA synthesis inhibition is due to (p)ppGpp accumulation. rRNA Amino acid starvation rRNA Amino acid starvation Magic Spot I Magic Spot II No Magic Spot Wild type Mutant Relaxed Cashel and Gallant, 1969 Alarmone=(p)ppGpp: Le ‘Magic Spot’ Cashel et Ladant, 1969 Une alarmone est une pe*te molécule qui est produite en conséquence d’un stress et qui influe sur l’expression d’un gène. GDP=‘ppG’ ou GTP (pppG) AFen*on, ce schéma est faux, ce n’est pas du GDP +pp Stringent Response in E. coli Starvation (p)ppGpp PrRNA RNAp stable RNA synthesis Ribosome biogenesis Stringent Response in E. coli Starvation Membrane biogenesis Phospholipid synthesis fatty acid synthesis DnaA (p)ppGpp stable RNA synthesis Replication Ribosome biogenesis Stop Growth σS factor amino acid biosynthesis genes of stress response Activate Survival Stringent Response in E. coli Starvation Membrane biogenesis ? Phospholipid synthesis fatty acid synthesis DnaA (p)ppGpp stable RNA synthesis Replication Ribosome biogenesis Stop Growth σS factor amino acid biosynthesis genes of stress response Activate Survival Rsh proteins are involved in (p)ppGpp metabolism. Starvation GDP Rsh GTP (p)ppGpp degradation PPi ATP (p)ppGpp Rsh synthesis ppGpp pppGpp AMP (p)ppGpp Stop Growth Activate Survival Identification des enzymes qui contrôlent le taux de (p)ppGpp. approche génétique chez E. coli= les gènes rel (1965) rRNA Amino acid starvation rRNA Amino acid starvation Magic Spot I Magic Spot II Wild type No Magic Spot Relaxed • Des mutants ‘relaxés’ ne font pas la réponse stringente: la synthèse d’ARN continue pendant 1 heure après l’arrêt de la synthèse protéique. • Gènes relA, relC (L11), relB relA code pour la (p)ppGpp synthétase I • Purification d’un « stringent factor » associé au ribosome (1972-1975) • Clonage de relA: surproduction de ppGpp et ralentissement de la croissance (1976) => démontre un effet direct du ppGpp sur la transcription Synthèse ARNr Témoin carence en acides aminés surexpression de RelA Identification du gène spoT (1974) • Mutant spoT =accumulation de ppGpp= apparition d’un ‘spot’ • spoT code pour une enzyme de dégradation du ppGpp • SpoT est une (p)ppGpp 3’-Pyrophosphohydrolase ATP GTP ppGpp pppGpp origine Souche spoT- Souche spoT + Laffler et Gallant, 1974 Identification d’une deuxième activité de synthèse: (p)ppGpp synthase II • Dans un mutant relA, il y a toujours une activité résiduelle de synthèse de (p)ppGpp (10 à 100 fois moindre) • Un autre gène…? 2 groupes américains, Cashel et Bremer, en 1991 2 approches géné*ques différentes Iden0fica0on de la ppGpp synthase II ppGpp _ ppGpp: pas lacZ, colonies blanches Sans ppGpp: lacZ, colonies bleues P1rrnB lacZ Background de départ: Souche relA‐, colonies toujours blanches (ac*vité de synthèse résiduelle) Mutagenèse aléatoire => Recherche de colonies très bleues => Gène spoT • Donc, spoT code à la fois une activité (p)ppGpp 3’-pyrophosphohydrolase et une activité ppGpp synthase II. Hernandez et Bremer, 1991 Passage à la biologie moléculaire: Rel/Spo homolog (Rsh) enzymes Rsh RelSpo HD (p)ppGpp degradation (p)ppGpp synthesis N‐terminal domain Relseq Hogg et al., 2004 (p)ppGpp synthesis (p)ppGpp degradation ACT TGS regulation Phylogenetic distribution of Rsh enzymes + SAS RelSpo TGS HD RelSpo TGS (p)ppGpp degradation (p)ppGpp synthesis RelA SpoT RelSpo ACT Rsh HD RelSpo (p)ppGpp degradation (p)ppGpp synthesis TGS ACT regulation Introduction (2) Rsh proteins in E. coli Amino acid starvation Carbon starvation S D RelA Growth Phosphate starvation Iron starvation S SpoT (p)ppGpp Survival Introduction (2) RelA-dependent stringent response in E. coli synthesis RelA N 1 regulation 386 C 739 Schreiber et al., 1991 Amino acid starvation: Wendrich et al., 2002 Breaken et al., 2006 Introduction (2) SpoT SpoT-dependent stringent response in E. coli N 1 synthesis degradation 344 85 regulation 357 C 203 702 Gentry and Cashel, 1996 Signal? allosteric transition (p)ppGpp synthesis (p)ppGpp degradation Structure of the N‐terminal domain; Hogg et al. ,2004 RelA and SpoT-dependent responses in E. coli amino acid starvation carbon, iron, or phosphate starvation Uncharged tRNA D mRNA TGS Cterm SpoT Cterm RelA S S TGS Cterm (p)ppGpp Stringent response ? Action du (p)ppGpp dans la bactérie Starvation Membrane biogenesis Phospholipid synthesis fatty acid synthesis DnaA (p)ppGpp stable RNA synthesis Replication Ribosome biogenesis Stop Growth σS factor amino acid biosynthesis genes of stress response Activate Survival Le (p)ppGpp est un régulateur pléiotrope de la transcription Régulateur posi*f ou néga*f suivant les cibles. Mode d’ac*on au niveau de la transcrip*on? => Modula*on de l’ac*vité de la RNAP. Effet dépend de la nature du promoteur. Ars0movitch et al., 2004 La forma*on du complexe d ’ini*a*on de la transcrip*on bactérienne dépend du facteur sigma (σ) Core polymerase (α2ββ’ω) Facteur σ σ3 σ1 Ext. ‐10 discr L’ holoenzyme Les étapes de l ’ini*a*on de la transcrip*on Ini0a0on Elonga0on Complexe fermé Complexe ouvert Transcrip*on Ini*ale (abor*ve) ~ 10 nt Promoter Escape (dégagement) Action directe sur la RNAP: le ppGpp inhibe la synthèse des ARN stables et active la synthèse des acides aminés Selon la nature d’une séquence discriminatrice et les propriétés cinétiques des promoteurs Séquence discriminatrice Inhibi0on rRNAs Séquence discriminatrice Ac0va0on Paa Srivatsan et al., 2008 Opérons de synthèse des ARNr chez E. coli Les 7 opérons codant pour l'ARNr d'E.Coli s'appellent rrnA à rrnG. Ils con*ennent tous 3 ARNr dans l'ordre 16S, 23S et 5S. Tous les opérons rrn ont 2 promoteurs : P1 (promoteur principal) et P2. Entre 16S et 23S, on a une séquence codant un ARNt dans 4 opérons rrn et 2 ARNt pour les 3 autres opérons rrn. On trouve 1 ou 2 ARNt après l'ARNr 5 S. Régulation de la synthèse des protéines ribosomales Gènes VI, Lewin Mécanismes différents suivant les espèces Absence de DksA Inhibi*on de la synthèse de GTP Krasny et al., 2004 Action indirecte: redistribution de la RNAP et implication des facteurs de transcription alternatifs sigma factor s70 s54 s32 sS sF sE sFecI gene rpoD rpoN (ntrA, glnF) rpoH rpoS rpoF rpoE fecI func0on principal sigma factor nitrogen‐regulated gene transcrip*on heat‐shock gene transcrip*on gene expression in sta*onary phase cells expression of flagellar operons involved in heat shock and oxida*ve stress responses; regulates expression of extracytoplasmic proteins regulates the fec genes for iron dicitrate transport Croissance Prrn Paa Arrêt de la Croissance Facteurs σ alterna*fs Prrn Paa Facteurs σ alterna*fs Magnusson et al., 2005 Régulation du taux de croissance par le ppGpp Activité des promoteurs rRNA en fonction de la concentration en ppGpp Rôle des iNTPs ou du ppGpp pour la régulation des promoteurs rRNA Hernandez et al., 1990 Paul et al., 2004 ppGpp inhibe la réplication ppGpp Bacillus ppGpp E. coli dnaA DnaA Caulobacter Primase Chiaramello et Zyskind, 1990; Wang et al., 2007; Lesley et Shapiro, 2008 ppGpp participe à l’induction de la réponse générale au stress Forte densité cellulaire Forte osmolarité Faible taux de croissance rpoS Basse température rpoS ARNm ppGpp PH faible Carence en carbone Haute température σS protéolyse EσS Régulon σs Hengge‐Aronis, 2002 ppGpp ppGpp Bougdour et al., 2008 Action du (p)ppGpp dans la bactérie, bilan Traxler et al., 2008
