Mirleau P. and Heeb P.

Analyses des communautés microbiennes :
approches expérimentales, métagénomiques et cultivables
Pascal Mirleau & Philipp Heeb
UMR 5174 CNRS / Université Paul Sabatier, Toulouse
Relations oiseaux – bactéries :
un modèle d'interactions vertébrés-microorganismes,
dans une approche d’écologie évolutive.
?
Les oiseaux en tant
qu’hôtes
Les microbes en tant que
pression de sélection
Habitat
île, métapopulations
Maintien de microbes bénéfiques
Commensalisme
Comportements sanitaire
Parasitisme, pathogénie
Effets sur la fitness
Effets sur la transmission
(survie / reproduction / sélection sexuelle)
horizontale de microorganismes
Comportement sanitaire : transmission horizontale de bactéries ?
(Le bain des oiseaux et la microflore de l’eau)
Questions: les oiseaux sont ils vecteurs de bactéries lors de la prise de bains ?
Æ Quelles espèces bactériennes au sein de la communautés saprophytes de l’eau ?
Æ Effets sur l’activité kératinolytique de l’eau ?
Æ Bactéries commensales ou pathogènes ?
Bathing
Bain
d’eau
exclusion:
: approcheexperimental
expérimentale
design
J10
J7
J5
J3
J1
J0
Pertes en eau, T°, pH, Conductivité
O
F
O
F
O
C
O
B
n=6
Filtration
Kératinolyse
extraction ADN
UFC
dénombrement
Ribosomal Intergenic
Spacer Analysis
A B
Bains d’eau : résultats
J 10
J0
O
F
t-test
Temperature (°C)
27 **
22
21.7
NS
pH
7.0 **
7.5
7.5
NS
Conductivité (μS.cm-2)
177 t
168
123
NS
Perte en eau (ml.jour-1)
-
167
93
0.02 *
3.2
0.001 **
3.2
0.001 **
1.6
0.05 t
0.4
0.01 *
Physicochimie
>
Microbiologie
Bactéries + Champignons
0.9 **
5.4
Bactéries totales
0.8 **
5.4
Entérobactéries
0.0 **
3.3
[ADN]
0.2 **
1.3
>
; Augmente les pertes en eau et
l’abondance bactérienne de l’eau
Bain d’eau : analyse des communautés bactériennes
Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA):
+
FAM-labelled PCR primers +
ROX-labelled MWM
Séquenceur
Séquenceur
capillaire
capillaire
GeneMapper©
>> échelle de taille (OTU) : 150-1200 pb
>> discrimination des tailles : 2 à 5 pb
>> échelle d’intensités : 10 à 4.104 RFU
Bain d’eau : analyse des communautés bactériennes
J 10
J0
O
C
t-test
4.2 *
4.8
4.8
NS
Nombre d’espèces
S = nombre d’OTUs
30
33
33
NS
Shannon
H = - Σ (Pi x Log Pi)
1.12 t
1.07
1.00
NS
0.88 t
0.86
0.83
NS
0.76 *
0.72
0.67
NS
Nombre total d’individus
Log N = Σ intensités
diversité
α
Simpson
1-λ = 1- Σ Pi2
Pielou
J = H / Log S
: N’affecte pas le nombre d’espèces bactériennes total de l’eau
Bathing
Bain
d’eau
exclusion:
: analyse water
des communautés
bacterial community
bactériennes
analyses
100
% similarité
75
diversité β
similarité entre communautés
p<0.0001
80.0
77.0 78.9
71.7 70.8
Bray-Curtis
50
47.1
p<0.0001
33.3
25
R=0.938, p=0.001
0
100% 95% 90%
répliquats
O
F
J0
O
F
J 10
C-D0
C-D10
O-D0
O-D10
2D Stress: 0.07
10-
F
06-
Statistiques descriptives
Analyse de variance (ANOVA)
01-
0910-
06-
0809-
07-
08-
O
07-
07-
NMDS
Analyse de similarité (ANOSIM)
01-
08- 01010709-
0908- 10060610-
T0
R=0.698, p=0.002
Bain d’eau : analyse des communautés bactériennes
2D Stress: 0.15
C
O
10
10
5
7
1010
7
7
5
7
10
7
10
5
53
10
10
7
10
7
7
3
10
5
5
5
7
3
3
3
7
3
5
3
5
5
3
73
3
5
5
3
3
1
1
1 0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
10
1
10
7
1
0
; Change la structure des communautés bactériennes
Bain d’eau : analyse des communautés bactériennes
Contribution à la similarité
820
Relation aire - nombre d’espèces (SAR)
793
624
802
778
638
863
Arrhenius : Log S = z Log N
809
824
900
797
395
494
zO = 0.50 (p = 0.014)
335
574
500
628
5.0
832
647
zC = 0.35
849
600
487
364
744
620
748
565
763
631
490
370
594
828
739
942
715
422
525
844
544
720
559
3.0
OTUs
214
4.0
783
3.5
Log nombre d’espèces
470
4.5
375
329
283
446
753
5
650
6
7
8
9
10
293
Log nombre d’individus (CFU)
185
582
302
867
; Augmente le nombre d’ espèces bactériennes nouvelles de l’eau
349
666
690
994
757
480
341
568
510
320
735
695
F
O
Bain d’eau : activité kératinolytique
test non-paramétrique Wilcoxon / Kruskal-Wallis
Indice de
Dégradation
visuel
J0
J10-O
J10-C
1.00 *
4.00
3.11
0.171
: N’augmente pas significativement l’activité kératinolytique de l’eau
? Bain = compromis entre soin et contamination du plumage ?
Dégradation du plumage : activité microbienne ancestrale ?
Micro-organismes sur les plumes
> 90 % kératine
La kératinolyse…
0
24h
48h
72h
96h
Microbacterium spp dégrade les plumes in vitro
Riffel, Lucas, Heeb & Brandelli,
Arch. Microbiol., 2003
Thys, Lucas, Riffel, Heeb & Brandelli, Let.Appl.Microbiol. 2004
… est ubiquiste dans le sol
Lucas, Broenniman, Febbraro & Heeb, Microbial Ecol. 2003
… et dans le plumage des oiseaux sauvages ?
Bacillus pumilis dégrade les plumes
et modifie leur couleur
Shawkey et al. Am. Nat. 2007
Sialea sialis
Activité keratinolytique : diversité taxonomique et diversité fonctionnelle
β-diversity
K-indices
ADN
‘meta-genomique’
O/F
ADNs
‘cultivable’
Phylogénie
bactérienne
ADNr 16S
Phénotypage
2.3
2.1
1.9
1.7
1.5
1.3
1.1
Keratine-Azur
0.9
0.7
0.5
BG
0
2
25
43
96
169
337
427
475
4
3.5
3
2.5
Plume blanche
2
1.5
1
25
43
169
337
427
475
Activité keratinolytique : diversité taxonomique et diversité fonctionnelle
DS
3%
NS
14%
Uncult
3%
2%
58%
6%
Achromobacter
Stenotrophomonas
Serratia
14%
Pseudomonas
; nouvelles bactéries kératinolytiques ?
Relations oiseaux – bactéries : travaux en cours…
- Phylogéographie, Kératinolyse & Plumage (C. Thébaud, UPS-Toulouse)
- Transmission sexuelle de bactéries (E. Danchin, CNRS-Toulouse)
- Radiation environnementale (A.P. Møller, CNRS-Paris)
… et projets de recherche
Comportements de soins du plumage
- Baignade & lissage
(thèse Gabor Czirjak)
(M.M. Lambrechts, CNRS-Montpellier)
- Glande Uropygiale
(thèse Mathieu Giraudeau)
(C. Gutierez UPS-Toulouse, V. Bretagnolle, CNRS-Chizé)
Pathogénie aviaire
- Microflore intestinale / Salmonella
(Dr. P. Velge, INRA)
Remerciements