L`échange de chaînes de la protéine HU comme nouvelle cible

Année 2016-2017 - Demande d’allocation doctorale 2016
ED Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (SSBCV) n°549
1. Informations administratives :
Nom du directeur de thèse (HDR) responsable de la thèse : Céline LANDON
Unité : Centre de biophysique moléculaire – CNRS UPR4301
Equipe : RMN des Biomolécules
Email: [email protected]
Co-Directeur (HDR) éventuel :
Email:
Co-encadrant (non-HDR) éventuel : Karine LOTH
Email: [email protected]
2. Titre de la thèse : L’échange de chaînes de la protéine HU comme nouvelle cible contre
les entérobactéries.
3. Résumé :
Les entérobactéries (Escherichia coli, Salmonella, Yersinia pestis ou encore Shigella) sont
responsables de très nombreuses infections dont des infections alimentaires graves, comme
l’épidémie de E. coli O104 :H4 qui a touché 4000 personnes en 2011, ou les infections
nosocomiales (principales bactéries responsables E. coli, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa), pour lesquelles l’augmentation des infections à E. coli ces
dernières années est particulièrement préoccupante. Avec l’accroissement mondial des
bactéries résistantes, voire multi-résistantes (MDR) à la plupart des antibiotiques utilisés en
clinique actuellement, et le faible développement de nouveaux composés ces dernières années
– restreints à des modifications des composés déjà existants - il devient extrêmement urgent
de développer de nouvelles voies d’attaque des bactéries.
L’Histone-like HU d’E. coli est une protéine basique dimérique de 19kDa essentielle à la
survie et la croissance de la bactérie. Les séquences d’HU sont très conservées chez les
bactéries. Cependant, alors que dans la plupart des bactéries HU est sous la forme d’un
homodimère, chez les enterobactéries HU est présent sous forme de deux homodimères HUα2,
HUβ2 et un hétérodimère HUαβ. Chaque dimère assure un rôle fonctionnel défini (par exemple
HU β2 de E. coli est impliqué dans l’adaptation au choc froid), et l’abondance relative de
chacun des dimères est dépendante des conditions environnementales. Nous nous focalisons
depuis plusieurs années sur la compréhension du mécanisme moléculaire qui permet
l’échange rapide des chaînes à température physiologique pour assurer les proportions
relatives de chaque dimère adaptées au contexte. Nous avons pu confirmer que le mécanisme
d'échange de chaînes de HU se déroulait en 3 étapes principales : i) passage d'un dimère natif

(pouvant interagir avec l'ADN à température physiologique) à un dimère intermédiaire (peu
compétant pour interagir avec l'ADN). Un premier modèle de la conformation intermédiaire a
été réalisé sur la base des données RMN (déplacements chimiques, angles dièdres) et de la
dynamique moléculaire (gros grains) ; ii) association de 2 dimères intermédiaires pour former
un tétramère transitoire (étape limitante). La forme tétramèrique, qui ne représente que
quelques % de la protéine a pu être mis en évidence par spectrométrie de masse en condition
native; et iii) dissociation très rapide de ce tétramère en 2 nouveaux dimères dans leur
conformation native (non limitante).
Au cours de cette thèse, nous chercherons à cibler cet échange de chaînes, pour
provoquer la mort de la bactérie selon une voie nouvelle et originale. Nous affinerons
dans un premier temps notre compréhension du mécanisme d’échange d’un point de vue
structural et cinétique, pour concevoir de petits composés qui perturbent cet échange : i) Pour
caractériser finement la première étape du mécanisme, et en particulier la structure 3D du
dimère intermédiaire partiellement déstructuré et très dynamique, nous poursuivrons l’étude
structurale RMN en milieu semi orienté pour combiner les contraintes de distances en milieu
isotrope et les RDCs en milieu semi orienté ; ii) La caractérisation structurale du tétramère
transitoire sera le 2ème défi du projet. En effet, il faut concevoir des mutants permettant des
pontages spécifiques entre les chaînes de HU pour conduire l'échange dans un cul-de-sac de
réactions en faveur de l'accumulation du tétramère permettant sa purification et sa
cristallisation. Ces mutants d’EcHU seront produits suivant des protocoles déjà optimisés
dans l’équipe de B. Castaing (thèse R. Le Meur). Des pontages chimiques ciblés peuvent
également être envisagés. Ces mutants seront soumis aux études structurales (RMN, RX,
simulations de dynamique moléculaire tout atome et gros-grain) et cinétiques (RMN, SM).
Pour concevoir des petits composés qui perturbent cet échange, des études de
bioinformatique structurale et chemoinformatique associées à un screening virtuel de base de
données seront réalisées (Coll. P. Bonnet ICOA). Elles permettront de sélectionner les
premiers composés inhibiteurs à tester expérimentalement.
4. Résumé en anglais :
The enterobacteria belong to a large family of pathogenic Gram-negative bacteria such
as Salmonella, Escherichia coli, Yersinia pestis, Klebsiella and Shigella. They are responsible
for numerous nosocomial and food infections (effecting skin, bone, joints, soft-tissue, urinary
tract, and ophthalmic). For example, the 2011 epidemic due to E. coli O104:H4 affected 4000
people in 16 different countries and killed 50. Bacterial antibiotic and multidrug resistance
(MDR) is a serious and growing phenomenon in contemporary medicine and has emerged as
one of the pre-eminent public health concerns of the 21st century. However, there has been a
continued decline in the number of newly approved drugs and the development of new
antibiotics in recent decades has been focused on modifications of existing molecules. To
counteract this problem, the research has to pass through the discovery of new bacterial
molecular targets and new drugs directed against these new targets.
The histone-like HU protein is the major nucleoid-associated protein involved in the
structural dynamics of the bacterial "chromosome" and thus is essential for bacterial growth
and survival. The HU conservation in eubacteria (without equivalent in higher eukaryotes)
makes this protein a promising and safe target for innovative antibiotic strategies.
HU is a small dimeric basic protein (19 kDa, pI = 10.5) and, similarly to eukaryotic histones,
promotes high order DNA architecture playing thus pleiotropic role in DNA transactions. HU
peptide chains are highly conserved in bacteria. Although in most bacteria, HU is present as a
single homodimer, in enterobacteria such as E. coli, the HU peptide chains  and  are

encoded by two genes and thus can exist as two homodimers (EcHUα2 and EcHUβ2) and a
heterodimer (EcHUαβ). Each HU isoform has a defined role (for example, EcHUβ2 is
required for E. coli cold shock adaptation) and their relative abundance depends on the
environmental conditions and is driven by an essential, yet unknown, fast chain exchange
mechanism. Since several years, we focus on the understanding of the HU chain exchange
mechanism.
Within this framework, the main objective of the thesis is to target the protein in the aim to
impair the chain exchange mechanism. To achieve this goal two steps have been identified:
(i) Elucidation of the molecular bases of the chain exchange mechanism using X-ray
crystal structure investigations and multidimentional NMR studies in combination with
molecular dynamic simulations, computer aided molecular docking and modelling, mass
spectroscopy and site directed mutagenesis.
(ii) Rational (structure-guided and virtual docking screening) discovery and/or design
of inhibitors preventing the formation of the heterodimer from homodimers (coll. P. Bonnet,
ICOA, University of Orléans).
5. Thèses encadrées au cours des 4 dernières années (par le directeur et co-directeur)
Nom du doctorant : Le Meur Remy
Directeur de thèse : co-direction C. Landon & B. Castaing, encadrante K. Loth
Date de début - date de soutenance : 01/10/2011 – 23/01/2015
Financement de la thèse : Allocation Ministère
Publications de l’étudiant en 1er auteur :
1- Le Meur, R., Loth, K., Culard, F., Castaing, B., and Landon, C. (2015)
Backbone assignment of the three dimers of HU from Escherichia coli at 293 K:
EcHUalpha2, EcHUbeta2 and EcHUalphabeta. Biomol NMR Assign 9, 359-363
2- Le Meur, R., Culard, F., Nadan, V., Goffinont, S., Coste, F., Guerin, M., Loth,
K., Landon, C., and Castaing, B. (2015) The nucleoid-associated protein HU
enhances 8-oxoguanine base excision by the formamidopyrimidine-DNA
glycosylase. The Biochemical journal 471, 13-23
Brevets : néant
Devenir de l’étudiant après la thèse : PostDoc Vanderbilt University, Nashville USA
Nom du doctorant : Violette Senille
Directeur de thèse : Céline Landon
Date de début - date de soutenance : 01/10/2008 – 23/11/2012
Financement de la thèse : Région Centre
Publications de l’étudiant en 1er auteur :
1- Senille, V., Lelievre, D., Paquet, F., Garnier, N., Lamb, N., Legrand, A., Delmas,
A. F., and Landon, C. (2013) The addressing fragment of mitogaligin: first insights
into functional and structural properties. Chembiochem : a European journal of
chemical biology 14, 711-720
Brevets :
Devenir de l’étudiant après la thèse : Enseignement et préparation CAPES

6. Thèses en cours (par le directeur et co-directeur) : Néant
7. Cinq publications principales ou brevets du directeur de thèse (co-directeur) au cours
des 4 dernières années :
1- Le Meur, R., Loth, K., Culard, F., Castaing, B., and Landon, C. (2015)
Backbone assignment of the three dimers of HU from Escherichia coli at 293 K:
EcHUalpha2, EcHUbeta2 and EcHUalphabeta. Biomol NMR Assign 9, 359-363
2- Le Meur, R., Culard, F., Nadan, V., Goffinont, S., Coste, F., Guerin, M., Loth,
K., Landon, C., and Castaing, B. (2015) The nucleoid-associated protein HU
enhances 8-oxoguanine base excision by the formamidopyrimidine-DNA
glycosylase. The Biochemical journal 471, 13-23
3- Loth, K., Costechareyre, D., Effantin, G., Rahbe, Y., Condemine, G., Landon,
C., and da Silva, P. (2015) New Cyt-like delta-endotoxins from Dickeya dadantii:
structure and aphicidal activity. Sci Rep 5, 8791
4- Paquet, F., Delalande, O., Goffinont, S., Culard, F., Loth, K., Asseline, U.,
Castaing, B., and Landon, C. (2014) Model of a DNA-protein complex of the
architectural monomeric protein MC1 from Euryarchaea. PloS one 9, e88809
5- Herve, V., Meudal, H., Labas, V., Rehault-Godbert, S., Gautron, J., Berges, M.,
Guyot, N., Delmas, A. F., Nys, Y., and Landon, C. (2014) Three-dimensional
NMR Structure of Hen Egg Gallin (Chicken Ovodefensin) Reveals a New
Variation of the beta-Defensin Fold. The Journal of biological chemistry 289,
7211-7220
n dans le cadre de cette thèse d’une 1ère collaboration avec l’équipe de P. Bonnet pour le
screening virtuel et l’approche chemoinformatique.