Complémentation fonctionnelle chez l`Arabette
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Complémentation fonctionnelle chez l'Arabette des Dames : une expérimentation menée par la classe de seconde 9 à l'INRA de Versailles-Grignon 4 juin 2010 Nous sommes la 2nd MI SVT du Lycée La Bruyère (Versailles) Pourquoi y a-t-il des différences de taille entre les plantes? Arrivée à l'INRA Fleur Le modèle: l’Arabidopsis Thaliana Hampe florale. Feuilles en rosette. Racine Pourquoi Arabidopsis a-t-elle été choisie comme plante modèle? - Maella, Leslie et Phimasonne Fiche signalétique d'Arabidopsis Thaliana Famille :Brassicasées/ crucifères Nom commun : ''Arabette des dames'' Origine : Europe et Asie Milieu de vie: murs, friches, talus.. Taille: 30 à 40 cm à l'âge adulte Apparence: plante en grappe à racines pivotantes. Mode de reproduction: autofécondation Semence: 30 à 60 graines par fruits. Facilement manipulable et cultivable en grande quantité - Son cycle de développement court - Sa culture in vitro possible - Son petit caryotype - La taille réduite de son génome... Arabidopsis sert ainsi de modèle dans tous les domaines d'étude des plantes: cytologie, physiologie, génétique...Chez Arabidopsis, plus de 50000 mutants différents ont été observés. Le mutant sur lequel nous avons travaillé Amina, Jeanne et Pauline Un mutant de phénotype « nain » Réalisation de coupes transversales de tiges et observation au microscope Coupe de l'Arabidopsis Sauvage x100 Coupe de l'Arabidopsis mutante x100 Détail des vaisseaux du xylème Comparaison des coupes au grossissement 400 (coloration au phloroglucinol, colorant spécifique des lignines) Qu'est-ce que la lignine ? Claire, Marianne et Amandine La lignine 3 monomères http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/bois/09-chimie.htm Polymère complexe ! http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Structure_de_la_Lignine.jpg Localisation de la lignine dans la plante Vaisseaux du xylème Coloration de la lignine des parois au phloroglucinol (microscope optique) Microscopie électronique à balayage Le rôle de la lignine Donne aux plantes : - rigidité, - imperméabilité - imputrescibilité http://www.yaduwap.com/logo-1213.htm l http://www.marieclaire.fr/,le-pommier-du-25-juin-au4-juillet-et-du-23-decembre-au-1erjanvier,20176,104,13 Comment sont produites les lignines ? Flora, Roman Synthèse de la lignine dans les cellules végétales Synthèse des monomères dans le cytoplasme grâce à des enzymes Phénylalanine Intermédiaires réactionnels . Enzymes (exemple: Cinnamate Coenzyme A Reductase = CCR1) monomères (monolignols) Les enzymes (ex : CCR1) sont des protéines codées par des gènes Individus nains→ Moins de lignines que individu sauvage Inactivation gène CCR, responsable d’enzymes créant des lignines→ moins de lignines→ individu nain Hypothèse : L’inactivation d'un gène CCR doit être la cause de la différence de taille. VÉRIFIONS NOTRE HYPOTHÈSE Nous allons complémenter par transgenèse le génome des mutants en leur insérant un gène CCR1 isolé chez le peuplier, ces plantes devraient présenter un même phénotype (même taille) qu’une plante sauvage. Le début des manipulations Lucie, Léa et Blandine LA MISE EN CULTURE Savez-vous planter les Arabidopsis à la mode de chez nous? Terrine de semis Tube de graines Réglettes Le matériel de semis Le semis Nous nous aidons d'une réglette pour espacer les graines car celles-ci sont très petites: moins d'un millimètre de diamètre Les terrines sont disposées dans des plateaux d'arrosage et soigneusement étiquettées Ajout d'une couche de copeaux de liège Ils sont destinés à protéger les plantes contre les insectes. Nos plantes sont ensuite mises en culture en serre Nous attendons environ deux mois... et... Arabidopsis COLØ Arabidopsis CCR1 Comment transférer le gène CCR1 ? Agrobacterium tumefaciens : un outil pour les chercheurs Mathilde,Elodie et Mathilde Qu'est ce que l'Agrobacterium tumefaciens? Agrobacterium tumefaciens est une bactérie du sol en forme de bâtonnet. Une bactérie est un organisme unicellulaire procaryote (ne comportant aucun organite à membrane comme le noyau). Ses composants sont libres à l'intérieur du cytoplasme. Photo d'Agrobacterium tumefaciens (microscopie électronique à balayage) Pourquoi avoir choisi l'Agrobacterium tumefaciens ? Agrobacterium est une bactérie pathogène pour les plantes. C'est l'agent de la maladie de la gale du collet. Elle infecte les plantes en leur transférant naturellement une partie de ses gènes. Photo d'Arabidopsis thaliana ayant été infecté par l'Agrobacterium tumefaciens Comment l' Agrobacterium tumefaciens réussitelle à infecter une plante dans la nature ? La bactérie est attirée par des composés chimiques émis par une plante blessée. Schéma représentant le cycle de l'infection d'un végétal par l'Agrobacterium tuméfaciens Qu'est ce qu'un plasmide ? Le plasmide est une molécule d 'ADN circulaire capable de se multiplier de manière autonome dans un organisme procaryote. La transgénèse est réalisée grâce à l'Agrobacterium Schéma représentant le transfert d'ADN de la bactérie à une cellule végétale La transgenèse consiste à transférer un gène d'un organisme donneur à un organisme receveur. L'échelle entre les deux cellules n'est pas respectée Les deux plasmides que nous avons utilisés Comment faire entrer le plasmide dans la bactérie ? Fanny, Guillemette, Léa Construction du plasmide = 3 gènes de résistance aux antibiotiques + 1 gène CCR1 L'Électroporation Choc électrique Mise en culture des bactéries électroporées Vérification : test de résistance aux antibiotiques Division des cellules Amas visible à l'œil nu Antibiotique + milieu de culture 1 semaine plus tard... Seules les bactéries résistantes se sont multipliées Amas de bactéries = colonies Comment faire entrer l'ADN dans la plante ? Lucile, Justine et Pauline L'Infiltration ● Immersion des fleurs dans un bain d'Agrobacterium tumefaciens pour que le vecteur soit transmis à la plante ● Pourquoi a-t-on trempé les fleurs et non les racines ? La fleur et la reproduction Les étapes de la reproduction ● Pollinisation grain de pollen → stigmate ● Formation tube pollinique spz → tube pol. → ovule ● Fécondation ovule + spz ● Fructification ovule → graine → fruit L'ADN et la reproduction La reproduction permet le transfert d'ADN : l'union entre le spermatozoïde et l'ovule de la fleur aboutit à un individu végétal, qui dans ses cellules possédera les mêmes gènes que les cellules germinales qui l'ont formé. L'infiltration Introduire CCR1 par l'immersion des fleurs dans un bain d'Agrobacterium tumefaciens contenant ce gène. ● Nous réalisons cette manipulation au dernier stade floral afin que le gène soit transféré aux cellules germinales et donc à la descendance Résultats attendus Col Ø (sauvage ) CCR1 (mutant) ● ● 3 témoins + 1 expérience ColØ + PBIB CCR1 ColØ + PBIB vide PBIB CCR1 ? PBIB vide ? ? CCR1 + PBIB vide CCR1 + PBIB CCR1 ? La récolte des graines Mickael, Clément et illiam Récolte des graines Plante renversée dans un sac = Récupération des graines se trouvant dans les siliques de la plante Récolte des graines Tamiser les graines = Retirer tous les résidus du végétal qui pourraient rester Désinfection des graines Désinfection des graines avec Seed Clean et Seed Wash afin d'éviter toute contamination. Les graines sont cultivées in vitro dans un milieu avec un antibiotique : si la plante n’a pas transmis le plasmide contenant les résistances aux antibiotiques, les graines meurent. A l'inverse, celles qui l'ont intégré résistent à l'antibiotique et se développent. Graines de mutant CCR1 transformées par PbibCCR1 sur hygromycine Plasmide non intégré Plasmide intégré Graines col 0 avec plasmide vide + hygromycine Plasmide non intégré Plasmide intégré Graines col 0 avec plasmide vide sans hygromycine toutes les graines se sont développées en l'absence d'antibiotiques. Nous attendons environ deux mois... Découverte des résultats Lucas, Giampaolo Des phénotypes différents pour 4 Arabidopsis Comparaison des caractéristiques d'Arabidopsis sauvage et mutant CCR1 Phénotype sauvage Une taille de 45 cm Phénotype mutant Une petite taille Comparaison des caractéristiques d'arabidopsis sauvage et du sauvage Col0 + CCR1 Phénotype col0 + ccr1 Taille supérieure à la plante sauvage Phénotype sauvage Taille de 45 cm Tableau de résultats pBIB CCR pBIB vide Col Ø (sauvage) CCR1 (mutant) Même taille qu'un individu sauvage (quelques plants légèrement plus grands) Même taille qu'un individu sauvage Même taille qu'un individu sauvage Même taille qu'un individu mutant Hypothèse vérifiée Le gène CCR1 intervient dans la taille de l'Arabidopsis De plus un gène CCR1 de peuplier peut complémenter l'Arabidopsis Universalité de l'ADN et Origine commune des êtres vivants La sécurité dans les serres, les chambres de culture et les laboratoires Gautier, Hugo et Guilhem Quels sont les risques de la dispersion des OGM ? Et comment limiter ces risques ? Les Serres et les chambres de cultures ● Les Serres : C'est l'endroit où ont été cultivées les plantes pendant toute la durée de l'expérience ● Les niveaux de sécurité : -Niveau 1 -Niveau 2 -Niveau 3 (non visité ) ● Les Chambres de culture Dans une chambre de culture plus de paramètres sont contrôlés par rapport à une serre. Les laboratoires Un grand MERCI à toute l’équipe pour nous avoir fait découvrir leur métier de chercheur
