E. coli pks+
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Cancer colorectal et microbiote intestinal : focus sur Escherichia coli, l’ennemi de l’intérieur? Richard Bonnet Microbes Infection Inflammation et Susceptibilité de l’Hôte UMR 1071 Inserm Université d’Auvergne usc INRA 2018 Centre National de Référence Résistance aux antibiotiques (Lab. associé Entérobactéries) Microbiote intestinal • ~1kg de bactéries actives réparties sur 400m2 Duodénum 103 Jéjunum 104 Iléon 107 Côlon 1013 Bactéries /g tissus • Répertoire génétique : ~100 x génome humain • ~1000 espèces bactériennes Microbiote intestinal • ~57 espèces partagées par 90% des personnes : => petit nombre d’espèces communes => un microbiote intestinal propre à chaque individu • 5 phylums conservés (ratio Firmicute/Bacteroidetes ≈ 10/1): – 60‐75% : Firmicutes (Clostridium, Lactobacillus, Eubacterium, Faecalibacterium…) – 30‐40% : Bacteroidetes (Bacteroides, Prevotella…) – 1‐5% : Actinobacteria – <1% : Proteobacteria (Enterobacteriaceae dont Escherichia coli) Microbiote et cancer colorectal Duodénum Jéjunum Iléon Côlon x12 103 104 107 1013 Le risque de cancer dans l’intestin augmente avec la densité microbienne Bactéries /g tissus Microbiote et cancer colorectal Développement de tumeurs colorectales chez des animaux axéniques (GF) ou conventionnels après induction avec AOM et la bile. C. Nombre moyen de tumeurs par groupe D. Taille moyenne des tumeurs par groupe Le nombre et la taille des tumeurs colorectales sont moins élevés chez des animaux prédisposés axéniques (GF) que chez ces mêmes animaux possédant un microbiote Reddy et al. Cancer Research 1975 Sacksteder Journal of the National Cancer Institute 1976 Vannucci et al. International Journal of Oncology 2008 Microbiote et cancer colorectal Taxon surreprésenté au contact du CCR ou dans les tissus sains adjacents. 1 : 6 patients (16s rDNA) 2 : 9 patients (Total DNA) 3 : 95 patients (16s rDNA) 4 : 9 patients (Total RNA) Une dysbiose bactérienne est associée au CCR Castellarin et al. Genome Research 2011 Marchesi et al. PLoS ONE 2011 Kostic et al. Genome 2012 Escherichia coli • Principale γ-protéobacterie du microbiote intestinal – ≤1% du microbiote intestinal – Observé dans 80-87% des CCR vs. 16-38% des tissus contrôles • Un pathobionte majeur : – Souches commensales : – Souches pathogènes : • Pathovars intestinaux : EPEC, EHEC, DAEC, EAggEC, EIEC, ETEC • Pathovar extra-intestinal : ExPEC Kaper et al., 2004 ; Sekirov et al., 2010 ; Köhler et Dobrindt, 2011 Escherichia coli et cancer colorectal Cyclomodulines : des toxines pouvant jouer un rôle dans le CCR Chez 50‐60% des tumeurs de patients atteints de CCR vs. 20% des muqueuses de patients contrôles CLB Helicobacter pylori Escherichia coli Arthur et al. 2012, Buc et al. 2013, Les E. coli producteurs de colibactine sont génotoxiques Phosphorylation H2A.x ser139P Cassures double brin de l’ADN colibactine Mutations Aberrations chromosomiques cytoplasme ATM CHK2 14‐3‐3 14‐3‐3 CDC25C CDC25C CDK1 Noyau CDC25C CDK1 Bactéries pks‐ Bactéries pks+ Blocage G2/M et mégalocytes Nougayrède et al. science 2006 ; Cuevas-Ramos et al. PNAS 2010 Les E. coli producteurs de colibactine sont promoteurs de tumeurs colorectales Bacteries pks‐ Model de cancer colorectal IL10‐/‐ + AOM + Monocolonisation par E. coli pks+ Ou + Monocolonisation par E. coli pks‐ Bactéries pks+ pks+ pks‐ Arthur et al. science 2012 Croissance tumorale induite par E. coli pks+ dans un modèle murin de xénogreffe E. coli pks+ E. coli pks‐ pks+ *** *** *** * pks‐ * * Immuno‐marquage Ki67 11 Cougnoux et al. Gut 2014 Cellules infectées E. coli pks+ / E. coli pks‐ Produit de sécrétion (PS) des cellules infectées à j5 prolifération cellulaire Cellules non infectées Prolifération cellulaire (%) Les E. coli producteurs de colibactine stimulent la croissance tumorale indirectement 150 ** ** + - + 100 50 PS pks+ PS pksSVF - + - E. coli pks+ stimulent la prolifération cellulaire de façon indirecte en induisant la sécrétion de facteurs de croissance par les cellules infectées pks+ pksSVF + - + + + - + + Cougnoux et al. Gut 2014 E. coli producteurs de colibactine stimulent la croissance tumorale via le facteur de croissance HGF Transcription de facteur de croissance dans les cellules infectées Facteur de croissance impliqué dans la prolifération cellulaire Multiplicité d’expression HCT116 Cougnoux et al. Gut 2014 13 E. coli pks+ induit la sénescence des cellules infectées • Caractéristiques des cellules infectées par les E. coli pks+ : – Blocage du cycle cellulaire – Mégalocytose – Phénotype sécrétoire (HGF…) Sénescence cellulaire : Voie p53/p21Cip par western‐blot pks+ pks‐ non infecté pks‐ Marquage de l’activité β‐galactosidase lysosomale ph6 pks+ • p53 phospho p53 p21Cip Rb p21Cip Rb E2F1 E2F‐1 GAPDH Sénescence Cougnoux et al. Gut 2014 E. coli pks+ induit une accumulation de p53 SUMOylé via SENP1 SENP1 pks‐ pks+ Western‐blot SENP1 Numération des cellules sénescentes dans un contexte de SENP1 surexprimé Cellules sénescentes (%) Immunoprécipitation SUMO1/p53 GAPDH Cougnoux et al. Gut 2014 Le miR‐20a‐5p régule l’expression de SENP1 et la sénescence Liaison du microARN 20a‐5p à l’ARNm codant SENP1 SENP1 GAPDH Cougnoux et al. Gut 2014 miR‐20a‐5p miR‐control Expression de SENP1 en présence de miR‐20a‐5p 3’UTR de ARNm SENP1 luciferase Sénescence en présence de miR‐20a‐5p et de l’anti‐miR‐20a‐5p L’entrée en sénescence cellulaire induite par E. coli pks+ est régulée par c‐Myc Expression de c‐Myc dans les cellules infectées Dénombrement des cellules sénescentes après transfection par des ARNi c‐Myc Western‐blot c‐Myc et SENP1 sur des cellules transfectées par des ARNi c‐Myc GAPDH Cellules sénescentes (%) c‐MYC pks‐ pks+ 100 80 60 40 *** c‐Myc 20 SENP1 0 GAPDH E. coli pks+ + + Cougnoux et al. Gut 2014 Les E. coli producteurs de colibactine induisent la croissance tumorale via le phénotype sécrétoire associée à la senescence cellulaire Tumeurs coliques humaines colonisées par E. coli pks+ ou E. coli pks‐ Cougnoux et al. Gut 2014 Les E. coli producteurs de colibactine induisent la croissance tumorale via le phénotype sécrétoire associée à la senescence cellulaire Cougnoux et al. Gut 2014 L’îlot pks de E. coli et la protéine ClbP (travail en cours) Le gène clbP de l’îlot pks responsable de la synthèse de colibactine code une enzyme putative à sérine active (motif S-X-X-K) Ö Cible pour des molécules inhibitrices ? L’îlot pks de E. coli et la protéine ClbP (travail en cours) Dubois et al. JBC 2011, Cougnoux et al. J Mol Biol 2012 Charges de surface et activité peptidase de ClbP ClbP Composés NRP (zwittermicin) Activité peptidase ClbP : une peptidase à sérine active Dubois J Biol Chem 2011, Cougnoux J Mol Biol 2012 Rôle des enzymes ClbP‐like Système de protection de la cellule à deux composants, ClbP + efflux : Ö Maturation de la colibactine à distance du cytoplasme Dubois J Biol Chem 2011, Cougnoux J Mol Biol 2012 Criblage in silico : sélection de 2 composés Construction d’une base de données : Sigma, Boron Molecular, ... ≈500 molécules Composés Efficacité de fixation du ligand prédite par docking (Kcal/mol/atome lourd) 1 ‐0,90 2 ‐0,88 Contrôle négatif ‐ Les composés présentent une activité inhibitrice nanomolaire Compound ID ClbP Ki (µM) ZmaM ΔG (Kcal/mol) Ki (µM) FmtA‐like ΔG (Kcal/mol) Ki (µM) ΔG (Kcal/mol) 1 0.240 ‐9.02 4.560 ‐7.28 >1000 > ‐4.09 2 0.360 ‐8.78 1.430 ‐7.96 966.0 ‐ 4.11 3 >1000 > ‐4.09 >1000 > ‐4.09 0.530 ‐8.55 Les composés se fixent dans le site actif de ClbP ClbP en complexe avec le composé 1 / ClbP en complexe avec le composé 2 Superposition des complexes de ClbP avec les composés 1 et 2 Les composés bloquent l’activité génotoxique des E. coli pks+ Détection de l’activité génotoxique des E. coli producteur de colibactine par immunomarquage anti histone γH2A.x en présence d’inhibiteur Les composés bloquent l’activité génotoxique des E. coli pks+ dans le modèle d’anse ligaturée Analyse de l’inhibition de l’activité génotoxique des E. coli producteur de colibactine par immunomarquage et western blot anti histone γH2A.x Les 2 composés (2mM) abolissent l’action génotoxique des bactéries Le ciblage de ClbP abolie l’activité protumorale du E. coli pks génotoxique Analyse de l’inhibition de l’activité stimulatrice de la croissance tumorale des E. coli producteurs de colibactine en xénogreffe pks+ pks‐ pks/cpd1 pks/cpd2 ** Les 2 composés (2mM) abolissent l’action stimulatrice de la croissance tumorale Le ciblage de ClbP abolie l’activité protumorale de E. coli pks+ au niveau intestinal Analyse de l’inhibition de l’activité pro‐tumorale des E. coli producteurs de colibactine dans un modèle murin de cancer colique Conclusions • Les bactéries productrices de colibactine pourrait jouer un rôle dans le développement du CCR via – Les mutations et aberrations chromosomiques induites – Le phénotype sécrétoire associé à la sénescence cellulaire • Le phénotype sécrétoire des cellules infectées par les E. coli pks+ stimule la migration/invasion cellulaire => métastases? • E. coli producteurs de colibactine et autres cancers? • ClbP pourrait être une cible intéressante pour prévenir les actions délétères des bactéries producteurs de colibactine Microbes Infection Inflammation et Susceptibilité de l’Hôte UMR 1071 Inserm Université d’Auvergne usc INRA 2018 A. Darfeuille‐Michaud, Bacterio. IUT N. Barnich E. Billard M. Bonnet H. Nguyen M. Bringer A. Sivignon A. DeVallée C. Chevarin E. Vazeille R. Bonnet, Bactério. UFR Médecine G. Dalmasso J. Delmas F. Robin A. Cougnoux, Doctorant L. Gibold, Doctorant R. Beyrouthy, Doctorant D. Pezet, Chir. digestive UFR Médecine E. Buc P. Sauvanet G. Bommelaer, Gastro. UFR Médecine M. André, Méd. Interne, UFR Médecine V. Livrelli, Parasito., UFR Pharmacie Pathogénie moléculaire et cellulaire des infections à E. coli CPTP, INSERM UMR 1043 / CNRS UMR 5282, Université Toulouse III Eric Oswald Gabriel Cuevas Dipartimento di Scienze della Vita Universita Degli Studi Di Modena E Reggio Emilia, Italia Fabio PRATI
