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Thesis
Etude in vivo des promoteurs de C2TA
WALDBURGER, Jean-Marc
Abstract
Les malades qui souffrent du syndrome des lymphocytes dénudés souffrent d'infections à
répétition. La plupart sont porteurs de mutations dans le gène CIITA qui empêchent le
complexe majeur d'histocomptabilité de classe II (MHCII) de s'exprimer normalement. Ce
travail décrit deux lignées de souris auxquelles il manque une, respectivement deux des trois
séquences d'ADN qui règlent l'expression de CIITA. Dans la première lignée, les lymphocytes
B, les cellules dendritiques, les macrophages et la microglie sont toujours capables d'exprimer
le MHCII. Par contre, les cellules épithéliales du cortex du thymus et les tissus périphériques
n'expriment plus le MHCII. La sélection positive des lymphocytes T CD4+ est donc abolie. La
deuxième lignée présente les mêmes défauts d'expression du MHCII auxquels s'ajoutent
l'absence sélective de MHCII sur les lymphocytes B et les cellules dendritiques
plasmacytoïdes.
Reference
WALDBURGER, Jean-Marc. Etude in vivo des promoteurs de C2TA. Thèse de doctorat :
Univ. Genève, 2005, no. Méd. 10440
URN : urn:nbn:ch:unige-3527
DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:352
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:352
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UNIVERSITE DE GENEVE
FACULTE DE MEDECINE
Section de médecine fondamentale
Département de pathologie et
Immunologie
Thèse préparée sous la direction du Professeur Walter Reith
ETUDE IN VIVO DES PROMOTEURS DE C2TA
THESE
présentée à la Faculté de Médecine
de l'Université de Genève
pour obtenir le grade de Docteur en médecine
par
Jean-Marc Waldburger
de
Chêne-Bougeries (GE)
Thèse N°
Genève
2005
2
Remerciements
J'adresse mes plus vifs remerciements au Professeur Walter Reith qui m'a soutenu durant cette
thèse, et qui m'a enseigné les aspects techniques aussi bien qu'intellectuels de la démarche
scientifique en biologie. Ce travail n'aurait pas été possible sans les contributions essentielles
du Professeur Hans Acha-Orbea et de Salomé LeibundGut-Landmann. Le Professeur Adriano
Fontana et Tobias Suter ont aussi contribué à l’analyse et l’obtention des résultats. Ma
gratitude va également à Luc Otten et Annick Mühlethaler-Mottet qui ont initié les travaux
sur les promoteurs de CIITA dans le laboratoire de Bernard Mach. Je remercie la Roche
Research Fundation, qui m'a octroyé la bourse MD-PhD, ainsi que le Professeur Alain Junod
pour la bourse qui a financé mon salaire lors de la dernière année de mon doctorat.
3
Table des matières
I. Résumé de 150 mots ................................................................................................page 5
II. Description courte du travail......................... .........................................................page 6
III. Introduction
1. Structure et fonction des gènes et des protéines du complexe majeur d'histocompatibilité
1.1 Organisation génomique du MHC..............................................................page 9
1.2 Fonction du MHCI et des lymphocytes T CD8+........................................page 9
1.3 Les molécules du MHCII
1.3.1 Génétique des molécules du MHCII............................................page 11
1.3.2 Présentation des Ag par le MHCII...............................................page 12
1.3.3 Sélection des lymphocytes CD4+................................................page 14
1.3.4 Réponse immunitaire spécifique
1.3.4.1 Réponses immunitaires de type Th1 et Th2…………..page 16
1.3.4.2 L’hypothèse de co-stimulation………………………..page 18
1.3.4.3 Autres mécanismes de modulation de la réponse
immunitaire…………………………………………………...page 19
1.3.5 Expression du MHCII..................................................................page 20
1.3.6 Mécanismes moléculaires de la régulation de l'expression des
molécules du MHCII par CIITA..……………………………….page 22
a. Résumé...................................................................................page 23
b. Revue: "Regulation of MHC class II gene expression by
CIITA"....................................................................................page 24
4
IV. Résultats……………………………………………………………………………page 65
1ère partie: La délétion du promoteur IV du gène CIITA chez la souris abolit l'expression du
MHCII uniquement sur les cellules des tissus extra-hématopoïétiques……….……….page 66
a. Résumé du 1er article......................................................................................page 67
b. 1er article: "Selective abrogation of mhc class II expression on extra-hematopoietic
cells in mice lacking promoter IV of the CIITA gene".…...........……….…......page 68
2ème partie: Caractérisation des lymphocytes T CD4+ chez les souris avec une délétion du
promoteur IV du gène CIITA………………………………………………………….page 82
a. Résumé du 2ème article..................................................................................page 83
b. 2ème article: "Characterization of the CD4+ T cell compartment in mice lacking
promoter IV of the class II transactivator
gene".............................................................................................…..................page 84
3ème partie: L'expression du MHCII est régulée différemment entre les cellules dendritiques
conventionnelles et plasmacytoïdes………………................................…..………….page 95
a. Résumé du 3ème article..................................................................................page 96
b. 3ème article: "MHC class II expression is differentially regulated in plasmacytoid
and conventional dendritic cells"................................................…..................page 97
V. Conclusions et perspectives.......................................................…………………..page 107
VI. Annexes
1. Abréviations.......................................................................….....…...............page 113
VII. Bibliographie..........................................................………....................................page 116
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I. Résumé de 150 mots
Les malades qui souffrent du syndrome des lymphocytes dénudés souffrent d'infections à
répétition. La plupart sont porteurs de mutations dans le gène CIITA qui empêchent le
complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (MHCII) de s’exprimer normalement. Ce
travail décrit deux lignées de souris, auxquelles il manque une, respectivement deux des trois
séquences d'ADN qui règlent l'expression de CIITA. Dans la première lignée les lymphocytes
B, les cellules dendritiques, les macrophages et la microglie sont toujours capables d’exprimer
le MHCII. Par contre les cellules épithéliales du cortex du thymus et les tissus périphériques
n’expriment plus le MHCII. La sélection positive des lymphocytes T CD4+ est donc abolie.
La deuxième lignée présente les mêmes défauts d'expression du MHCII auxquels s'ajoutent
l'absence sélective de MHCII sur les lymphocytes B et les cellules dendritiques
plasmacytoïdes.
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II. Description courte du travail
Les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC), aussi appelées
antigènes leucocytaires humains (HLA), et antigènes Ia ou H2- chez la souris, sont codées par
des gènes regroupés au sein de la même région chromosomique. Le MHC est divisé
arbitrairement en trois régions qui regroupent les gènes de la classe I (MHCI), de la classe II
(MHCII) et les gènes de classe III. Les gènes de classe II (MHCII) sont l'objet de ce travail de
thèse. Ils jouent un rôle essentiel dans les réponses immunitaires spécifiques (adaptative
immune response) chez les vertébrés.
La structure, la fonction et la régulation des gènes du MHCII sont hautement
conservées entre l'homme et la souris. Leur rôle est essentiel pour le développement,
l'activation et l'homéostasie des lymphocytes T auxiliaires CD4+ (helper T lymphocytes).
Chez l'homme et la souris l'expression des gènes du MHCII est strictement régulée et est
restreinte dans la plupart des situations physiologiques à quelques types cellulaires hautement
spécialisés. Ceux ci comprennent principalement les cellules dendritiques (DC), les
lymphocytes B, les macrophages et les lymphocytes T activés humains. La plupart des autres
types cellulaires n'expriment pas les molécules du MHCII mais peuvent être induites par
divers stimuli, dont le plus puissant est l'interféron-γ (IFN-γ). Ce type d'expression du MHCII,
aussi appelé expression ectopique ou inappropriée, est observé dans beaucoup de situations
pathologiques et notamment des maladies auto-immunes.
Dans le thymus, un compartiment spécialisé dans la sélection positive des
lymphocytes T exprime les molécules de classe I et II. Les lymphocytes T qui reconnaissent
le MHCII deviendront des lymphocytes T auxiliaire matures et seront exportés vers les
organes lymphoïdes périphériques. Ceux-ci comprennent notamment la rate, les ganglions
lymphatiques et le MALT (système lymphoïde des muqueuses). En périphérie, les
macrophages, les lymphocytes B et les cellules dendritiques (DC) sont spécialisés dans la
présentation des antigènes (Ag). Les lymphocytes T auxiliaires CD4+ sont capables de
reconnaître par leur récepteur T (TCR) les complexes formés par un hétérodimère de
molécules de classe II associés à une chaîne peptidique dérivée d'un Ag, et présentés à la
surface des cellules présentatrices d'antigène (APC). Si l'Ag déclenche l'activation du
lymphocyte T CD4+, ce dernier va engendrer le développement d'une réponse immunitaire
spécifique, notamment en sécrétant des cytokines qui stimuleront la production d'anticorps
(Ab) par les lymphocytes B et activeront les cellules T cytotoxiques CD8+.
7
Les molécules de classe II jouent un rôle vital dans les défenses immunitaires contre
les micro-organismes. Une forme rare d'immunodéficience congénitale, le syndrome du
lymphocyte nu (Bare lymphocyte syndrome ou BLS) est causée par une absence héréditaire
de l'expression du MHCII. La grande majorité des patients atteints par ce syndrome
autosomique récessif meurent dans la petite enfance. Le seul traitement efficace connu est la
greffe de moelle osseuse. L'étude des gènes responsables de ce syndrome a grandement
contribué à la compréhension des mécanismes moléculaires qui régulent l'expression du
MHCII. Quatre groupes de complémentation regroupent tous les cas connus de BLS. Chaque
groupe de malades comporte une mutation dans un gène différent, à savoir RFX5, RFX-ANK,
RFX-AP ou CIITA dont aucun ne se situe sur le chromosome porteur du MHC. Ces gènes
codent en effet pour des protéines qui sont chacune nécessaires à la transcription du MHCII.
D'un côté les protéines RFX5, RFXANK et RFX-AP sont exprimées dans tout l'organisme.
Bien que l'absence d'une seule d'entre elles empêche toute expression du MHCII, leur
expression ubiquiste ne permet pas d'expliquer l'expression tissu-spécifique du MHCII. A
l'inverse, l'expression de CIITA contrôle l'expression du MHCII dans la plupart des cellules
étudiées. Un système de promoteurs multiples (quatre chez l'homme dont trois sont conservés
chez la souris) permet de réguler l'expression de CIITA, et partant, des gènes du MHCII.
Schématiquement, le promoteur I est actif dans les DC, les macrophages et les cellules
microgliales. Le promoteur II est absent chez la souris. Son rôle chez l'homme n'est pas
connu. Le promoteur III permet l'expression de CIITA dans les lymphocytes B. Le promoteur
IV est nécessaire à l'expression de CIITA après induction, principalement à la suite d'une
stimulation par l'IFNγ. Il est également indispensable à l'expression de CIITA dans les
cellules épithéliales du cortex thymique chez la souris.
Ce travail de thèse est consacré à l'étude de la régulation des gènes du MHCII, et en
particulier à la régulation de l'expression de CIITA chez la souris. Il décrit deux lignées de
souris "knockout" générée par inactivation génique conditionnelle. Le promoteur IV de
CIITA a été délété dans la première lignée. Dans la deuxième lignée, les promoteurs III et IV
ont été délétés. Ces expériences a été réalisée dans le double but de tester le modèle des
promoteurs multiples de Mhc2ta et d'obtenir un modèle animal permettant d'étudier l'absence
d'expression inductible du MHCII dans le système immunitaire murin. Lorsque le promoteur
IV (pIV) est délété, CIITA et les gènes du MHCII ne peuvent plus être induits par l'IFNγ sauf
par les APC tels que la microglie ou les macrophages. Comme les promoteurs I et III sont
restés intacts dans la première lignée, l'expression constitutive de CIITA (dans les
lymphocytes B et les DC) et donc du MHCII est maintenue. De plus, les cellules épithéliales
8
du cortex thymique perdent aussi l'expression du MHCII ce qui produit un déficit grave dans
la sélection positive des lymphocytes T CD4+. Malgré l'expression normale du MHCII par les
APC professionnels, les lymphocytes T CD4+ dans les souris délétées pour le pIV (pIV-/-)
sont 1) présents en nombre aussi réduit que dans les souris totalement dépourvues de MHCII
et 2) présentent des caractéristiques similaires à celles décrites pour les knockout du MHCII.
Ainsi, les lymphocytes T CD4+ résiduels des souris pIV-/- comprennent une proportion
élevée de lymphocytes NKT. Il en résulte un phénotype de surface de type "cellule mémoire"
et un biais dans la représentation du répertoire Vβ.
Dans la deuxième lignée, la délétion comprend les deux promoteurs III et IV. Le
phénotype de la première lignée est récapitulé fidèlement, mais en plus on constate l'absence
d'expression du MHCII sur les lymphocytes B et les cellules dendritiques de type
plasmacytoïde. Les autres types de cellules dendritiques expriment toujours le MHCII du fait
du fonctionnement normal du dernier promoteur de CIITA (le promoteur I).
9
III. Introduction
1. Structure et fonction des gènes et des protéines du complexe majeur d'histocompatibilité
1.1 Organisation génomique du MHC
Le complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) forme une région sur le chromosome
qui regroupe différents gènes. La plupart des gènes du MHC remplissent des fonctions
immunitaires mais plusieurs sont impliqués dans d'autres systèmes biologiques. Le MHC est
présent dans tous les vertébrés étudiés jusqu'à présent 1-12. Parmi les vertébrés exothermes,
l'architecture du MHC a été étudiée chez les poissons cartilagineux (requin), chez plusieurs
espèces de téléostéens (poissons osseux évolués), chez les amphibiens (xénope). En
particulier, la présence de gènes de classe IIA et IIB chez le requin, ainsi que des gènes TCRa,
TCRb, TCRd et TCRg implique l'existence d'un système immunitaire basé sur la
reconnaissance T/MHC chez l'ancêtre commun à tous les vertébrés prognathes 13-18.
Le MHC a été découvert au cours d'études de transplantation chez la souris, en tant que
complexe H2 19;20. Le MHC murin est situé sur le chr. 17, tandis que le MHC de l'homme se
trouve sur le chr. 6. La région du chromosome qui contient le MHC peut être divisée en trois
régions « géographiques» (le filament d’ADN qui représente le chromosome représente un
espace à une dimension). Cette séparation en trois régions a déjà été suggérée en 1977 21. La
région du MHCII est la plus proche du centromère (fig. 1). La région du MHC classe III se
trouve juste après, puis vient le MHCI en position télomérique. Les MHC murin et humain
sont le plus conservés dans les régions II et III. Les cartes génomiques des MHC de ces deux
espèces sont comparées dans la fig. 1. Les structures des gènes sont souvent identiques, et les
séquences codantes sont hautement conservées (60 à 80 % de nucléotides identiques).
1.2 Fonction du MHCI et des lymphocytes T CD8+
Les premiers gènes du MHC ont été identifiés avant l’avènement du séquençage de
l’ADN. Les protéines produites par ces gènes réagissaient avec des anticorps spécifiques ou
dans des expériences de transplantation. Par conséquent il s’agissait souvent de protéines de
surface. Depuis lors, des centaines d'autres gènes ont été identifiés dans le MHC, dont
beaucoup ne jouent pas de rôle dans la réponse immunitaire. Certains d’entre eux ont identifié
uniquement par séquençage de l’ADN. Parfois ils n’y a pas de traduction possible en
10
protéines, se sont alors des pseudogènes. Le terme molécule du MHC désigne par convention
les glycoprotéines membranaires de classe I ou II, capables de présenter les Ag. Les
molécules MHCI et MHCII appartiennent à la famille des immunoglobulines. Leurs rôles
respectifs sont identiques chez l'homme et la souris. Les molécules du MHCI et du MHCII
présentent des analogies de structure qui reflètent la similitude de leur fonction. Toutes deux
sont impliqués dans la présentation de peptides aux lymphocytes T 22;23. Chacune possède un
sillon constitué d'un "plancher" de feuillets β et de "murs" d'hélices α, qui présente la faculté
de lier de façon extrêmement stable beaucoup de peptides différents pour la même molécule
24-26
. Cette propriété est désignée par le terme "promiscuité". Ainsi, un nombre limité de
molécules MHCI/II peuvent présenter la plupart des peptides antigéniques existants. Ceci
rend quasi nul le risque qu’un pathogène ne soit pas reconnu par le système immunitaire
spécifique (qui dépend des lymphocytes T CD4 et CD8, et du MHC). Les peptides qui sont
liés par les molécules du MHCI proviennent d’une grande variété de sources. La plupart sont
dérivés de protéines normales de l’organisme. En cas d’infection par un virus qui se réplique à
l’intérieur d’une cellule donnée, le MHCI de cette cellule liera aussi un certain nombre de
peptides provenant du virus. Les lymphocytes T CD8+ sont capables de reconnaître les
complexes MHCI-peptides viraux et d’éliminer les cellules infectées. Ce type de réponse
immunitaire nécessite l’intervention de lymphocytes T CD4+ auxiliaires, de type Th1 (voir
paragraphe 1.3.4 : Réponse immunitaire spécifique).
Les molécules de MHCI (HLA- A, -B, -C chez l'homme et H2-K, H2-D, H2-L chez la
souris) sont formées par l'association d'une chaîne transmembranaire de 44 kD associée de
manière non-covalente à la β2-microglobuline, de 12 kD. Les protéines du MHCI sont
exprimées sur presque toutes les cellules nucléées. Les peptides dérivés des protéines
intracellulaires (virus ou toute autre protéine même normale) est présenté par le MHCI au
TCR des cellules T cytotoxiques (positives pour le co-récepteur CD8) 27-30. Le rôle des
lymphocytes CD8+ est de lyser les cellules infectées par des virus ou autres parasites
intracellulaires. Par contre si la cellule n’exprime pas de peptides étrangers liés sur ses
molécules de classe I le lymphocyte CD8+ ne déclenchera pas de réaction immunitaire. Les
lymphocytes T CD4+ et CD8+ ont en effet la particularité de reconnaître spécifiquement les
Ag étrangers des protéines du soi. Ils acquièrent cette faculté grâce au processus de sélection
thymique, qui sera détaillé plus bas (paragraphe 1.3.3 Sélection des lymphocytes CD4+9.
D’autres types spécialisés de lymphocyte (les cellules NK) reconnaissent également le
MHCI Dans certaines conditions ces lymphocytes sont capables de lyser des cellules qui
n'expriment plus les chaînes de classe I 31;32.
11
1.3 Les molécules du MHCII
1.3.1 Génétique des molécules du MHCII
Parmi les gènes impliqués dans la réponse immune qui seront discutés dans ce travail,
il faut relever:
1) les trois isotypes humains des molécules du MHCII dites classiques (HLA –DR, -DP et
DQ), chacun formés d'une chaîne α (HLA-DRA, HLA-DPA1, HLA-DQA1) et d'une chaîne β
(HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DPB1, HLA-DQB1).
2) chez la souris les gènes H2-IEa, H2-IEb1, H2-IEb2 codant pour H2-E, homologue de
HLA-DR, et H2-IAa, H2-IAb1, H2-IAb2 codant pour H2-A, homologue de HLA-DQ, HLADP n'ayant pas d'homologue murin.
3) les gènes HLA-DMA et HLA-DMB qui codent pour les chaînes α et β de la molécule HLADM.
4) leurs homologues murins H2-Ma, H2-Mb1, H2-Mb2.
Les molécules MHCII humaines, comme d'ailleurs les molécules MHCI, sont
caractérisées par un très haut degré de polymorphisme allélique, et un haut degré
d'hétérozygotie (de 80 à 90%). Le gène HLA-DRB1 qui est le plus polymorphique compte
près de 300 allèles différents (consulter le site http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/ qui maintient
les séquences de chacun des allèles). Le polymorphisme du MHC est également présent dans
d'autres espèces de mammifères, dont les souris sauvages 33. Les parties les plus
polymorphiques des molécules MHCII se trouvent dans la région servant à lier les Ag et à les
présenter au TCR, ce qui produit une vaste gamme d'affinité différentes pour un peptide
donné et pour un TCR donné. Un mécanisme des variations dans les séquences HLA sont les
mutations ponctuelles, mais elles surviennent à un taux qui n'est pas supérieur au reste du
génome. Au contraire, le mécanisme de conversion génique est responsable de l'apparition
d'un nombre élevé de nouveaux allèles, ainsi que la recombinaison. Le polymorphisme du
MHCII est un outil dans l'étude des populations 34 et doit être pris en compte dans les
transplantations d'organes et de moelle. Certains allèles jouent un rôle dans les maladies autoimmunes 35;36. Par exemple, le diabète de type I est associé au HLA-DR4 et/ou -DR3, la
thyroïdite de Hashimoto au DR5, le lupus au DR3, l'arthrite rhumatoïde au DR4 et/ou DR1, la
spondylarthrite ankylosante au HLA-B27. Plusieurs types de mécanismes ont été proposés
12
pour expliquer le polymorphisme du MHC. Un premier groupe de mécanismes invoque une
sélection par les pathogènes 37. Chez l'homme cependant, il n'a pas été possible de mettre en
évidence d'association claire entre un allèle donné du MHC et la résistance à un pathogène,
contrairement au poulet 38. Un autre type de mécanisme serait lié au rôle du MHC dans le
comportement d'accouplement. En effet, chez la souris par exemple le MHC est impliqué
dans la reconnaissance du partenaire par l'odorat, et favoriserait la sélection de partenaires
sexuels porteurs d'allèles différents 39.
1.3.2 Présentation des Ag par le MHCII
Les molécules de MHCII (HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ chez l'homme et H2-E, H2A chez la souris) sont des hétérodimères formés par l'association non covalentes de deux
glycoprotéines transmembranaires appelées α (33 kD) et β (29 kD). Leur expression est
restreint aux APC (cellules B, DC, cellules T activées chez l'homme, macrophages) et aux
cTEC (les cellules épithéliales du cortex du thymus). Contrairement au MHCI, les molécules
du MHCII des APC présentent des peptides dérivés de protéines exogènes qui ont été
dégradées dans le compartiment lysosomal. Les lymphocytes capables de reconnaître ces
complexes Ag-MHCII expriment le co-récepteur CD4 40;41.
Les APC sont capables de capter les Ag par différentes routes pour finalement les
présenter par les molécules du MHCII: endocytose récepteur dépendante, phagocytose,
macropinocytose et autophagie 42;43. L'Ag progresse dans le compartiment endosomal où il
subit des dégradations protéolytiques progressives 44. Un éventail aussi vaste que possible
d’Ag différents doit pouvoir se lier au MHCII, pour être présenté ensuite aux lymphocytes
CD4+ qui déclencheront la réponse immunitaire. Plusieurs mécanismes permettent
d’échantillonner des peptides aux propriétés chimiques très différentes: 1) existence de
mécanismes favorisant l'échange de peptides 2) présence de molécules MHCII tout au long du
trajet de dégradation 3) promiscuité du site de liaison de l'Ag du MHCII, qui peut lier une
large variété de peptides 45. Ces caractéristiques sont essentielles car il n’existe que quelques
molécules du MHCII chez chaque individu. Or chacune de ces molécules doit être capable de
présenter un très large éventail de peptides antigéniques, qui proviennent d’un très grand
nombre de protéines du soi mais surtout des protéines des microorganismes pathogènes. La
promiscuité du MHCII pourrait aussi être contre-productive car les nombreux peptides
endogènes présents dans le reticulum endoplasmique pourraient se lier aux molécules du
13
MHCII. Un tel scénario empêcherait les Ag exogènes (provenant de pathogènes) de jamais
atteindre le sillon de liaison du MHCII. La chaîne invariante Ii permet d'éviter ce phénomène.
Cette protéine protège le MHCII tant qu’il n’est pas parvenu dans le compartiment
intracellulaire où se trouvent les peptides antigéniques. Ii remplit cette fonction en liant le site
de liaison de l'Ag du MHCII par sa région CLIP 45. Une fois que le complexe Ii-MHCII
parvient au compartiment contenant des Ag, la chaîne Ii est dégradée en plusieurs étapes. Ceci
permet de préparer les molécules du MHCII pour qu’elles puissent lier les Ag. Des enzymes
appelées cathepsines sont essentielles à la dégradation de Ii. Certains compartiments
cellulaires riches en MHCII ont leur propre type de cathepsine comme les cTEC (cathepsine
L) et les cellules B et DC (cathepsine S). Cette dégradation résulte un en peptide CLIP qui
reste attaché au MHCII. Enfin le peptide CLIP est échangé contre des peptides antigéniques
dans une réaction catalysée par les molécules HLA-DM/HLA-DO 46-48. Finalement, le
complexe Ag-MHCII est acheminé à la surface cellulaire de l'APC où il pourra être reconnu
par le TCR des lymphocytes CD4+ (fig. 2).
Figure 2 49. Dégradation, transport et présentation des Ag liés au MCHII. Les molécules MHCII
synthétisées dans le réticulum endoplasmique de l'APC sont liées par la chaîne invariante (Ii, non représentée),
bloquant le site de liaison aux Ag. Les protéines extracellulaires (souvent dérivées à partir de micro-organismes
pathogènes) sont endocytosées et atteignent les endosomes. Les protéines sont dégradés en peptides antigéniques
par les protéases. Les molécules du MHCII protégées par la chaîne Ii atteignent les endosomes pour former le
compartiment MHCII. Ii est dégradée (par les cathepsines L et S) et finalement le peptide CLIP qui occupe le
sillon du MHCII est échangé pour permettre la liaison des Ag. Cette réaction est catalysée par la molécule HLADM. Le complexe Ag-MHCII est transporté à la surface cellulaire de l'APC où a lieu la reconnaissance par le
TCR des lymphocytes T CD4+.
14
1.3.3 Sélection des lymphocytes CD4+
Les lymphocytes T CD4+ sont capables de reconnaître les Ag étrangers liés au MHCII
et de réagir en sécrétant des cytokines qui aboutiront à une réponse immunitaire de type
humorale ou Th2, soit à une réponse de type cellulaire ou Th1 (voir paragraphe suivant).
Comme pour les lymphocytes T CD8+, les peptides du soi (dérivés de protéines endogènes)
ne sont pas capables d'activer les lymphocytes T CD4+. En effet, un processus de maturation
complexe des lymphocytes T CD4+ (ainsi que des lymphocytes T CD8+) a lieu dans le
thymus. Les lymphocytes CD4+ qui ont achevé ce processus sont capables de reconnaître des
peptides liés au MHCII et ne réagiront que si les peptides ne sont pas dérivés de protéines du
soi. Les lymphocytes T qui réagissent contre les peptides endogènes sont éliminés par
apoptose dans le thymus. Ceci représente un des mécanismes par lesquels le système
immunitaire devient tolérant aux protéines du soi, afin d’éviter des réactions autoimmunitaires.
Les étapes du développement des thymocytes peuvent être grossièrement délimitées
par l'expression de surface des co-récepteurs CD4 et CD8 (fig. 3). Les thymocytes les plus
précoces sont dérivés de cellules souches de la moelle osseuse et sont CD4- CD8- double
négatifs ou DN (à peu près 3% des thymocytes). Les cellules DN prolifèrent abondamment en
devenant CD4+ CD8+ double positifs. Ils expriment aussi un répertoire TCR très vaste grâce
au réarrangement de la chaîne β puis de la chaîne α 50. Pour qu'un thymocyte DP survive, son
TCR doit reconnaître les molécules MHCI ou MHC II exprimées par les cTEC 51. Sinon il est
éliminé par apoptose. Dans le thymus, le MHCI ou le MHCII exprimés par les cTEC sont
complexés à des peptides endogènes. C’est la force de la liaison TCR-MHC-peptide endogène
qui détermine si le lymphocyte T en cours de sélection possède un TCR lui permettant de
reconnaître le MHC de manière appropriée. Si cette liaison est trop faible, elle ne permettra
pas la sélection positive. Dans ce cas le lymphocyte T est éliminé par apoptose avant même
que la sélection positive ait lieu. L’apoptose est déclenchée par défaut en cas d’absence de
sélection positive. Plus de 95% des lymphocytes T ne sont pas sélectionnés à cette étape et
meurent dans le thymus, au stade CD4+ CD8+ DP. Si le TCR du lymphocyte T est capable de
reconnaître le MHC des cTEC avec une affinité moyenne, alors le lymphocyte T a subi avec
succès la première étape dit de sélection positive. Parvenu à ce stade les lymphocytes T CD4+
CD8+ double positifs n’expriment plus que le CD4+ ou le CD8+, selon que leur TCR a
reconnu le MHCII ou le MHCI, respectivement. La liaison entre le TCR et le MHCI ou le
MHCII subit encore un dernier contrôle. Si l’affinité TCR-MHC est trop forte, le thymocyte
15
sera éliminé par les cellules dendritiques MHC positives présentes dans la médulla du thymus,
dans un processus dit de sélection négative 52;53. Les thymocytes migrent alors dans les
organes lymphoïdes périphériques (ganglions, rate et MALT). Ceux qui ont été sélectionnés
par des molécules du MHCII deviennent des lymphocytes T auxiliaires CD4+, tandis que
ceux sélectionnés par le MHCI maturent pour devenir des lymphocytes T cytotoxiques CD8+.
apoptose si le TCR ne
reconnaît pas le
MHC I/II
Figure 3. Sélection des lymphocytes T CD4+ et CD8+.
Les précurseurs T provenant de la moelle osseuse atteignent le thymus où ils prolifèrent et expriment les
molécules CD4, CD8 et le TCR. Si le TCR réarrangé par un thymocyte donné est capable de reconnaître le MHC
exprimé par les cTEC avec une affinité faible, le thymocyte peut se différencier et deviendra un lymphocyte
CD4+ helper ou un lymphocyte CD8+ cytotoxique, selon que son TCR a reconnu un molécule du MHCII ou du
MHCI, respectivement. Si l'affinité de son TCR est trop forte, il reçoit un signal de sélection négative par les DC
de la médulla du thymus, et sera éliminé par les macrophages.
16
1.3.4 Réponse immunitaire spécifique
1.3.4.1 Réponses immunitaires de type Th1 et Th2
La réponse immunitaire spécifique contre la plupart des protéines est
dépendante de lymphocytes T helper CD4+. 2 types de réponses immunitaires peuvent être
générées par les lymphocytes T CD4+. Le premier type dépend des lymphocytes Th1 (Fig. 4,
à gauche), et le deuxième des lymphocytes Th2 (Fig. 4, à droite). Plusieurs paramètres
déterminent si une réponse immunitaire va être de type Th1 ou Th2, dont le type d'APC, les
cytokines présentes lors de la stimulation initiale des CD4+, l'affinité de la liaison Ag/MHCII,
et le type de molécules impliquées dans le signal 2 (voir paragraphe suivant).
Une réponse immunitaire de type Th1, dirigée contre une infection virale, est
représentée dans la partie gauche de la Fig. 4. Un APC (macrophage ou DC) présente des
peptides antigéniques dérivés du virus aux lymphocytes T CD4+ (en bas à gauche). Les APC
stimulent les lymphocytes CD4+ vers une réponse de type Th1 en produisant de
l’interleukine-12 (IL-12) 54. Les lymphocytes Th1 produisent à leur tour de l’IL-2 et de
l’IFNγ. Ces 2 cytokines stimulent les lymphocytes T CD4+ et CD8+, ainsi que les APC et
amplifient la réponse immunitaire. Les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques sont maintenant
capables de reconnaître les cellules infectées (en haut à gauche). Ces dernières expriment en
effet des peptides viraux complexés au MHCI. Les lymphocytes T CD8+ tuent les cellules
infectées par au moins 2 mécanismes différents. Le premier consiste à insérer des perforines
dans la membrane de la cellule cible. Ces peforines forment des pores par lesquels sont
introduits des enzymes protéolytiques depuis le lymphocyte CD8+ jusqu’à l’intérieur de la
cellule cible. Une de ces enzymes promeut l’apoptose de la cellule cible en activant les
caspases. Un second mécanisme implique le système Fas-Fas ligand, qui aboutit également au
déclenchement de l’apoptose de la cellule cible. De plus, l'IFNγ produit par les lymphocytes,
et les IFNα et IFNβ produits par les cellules infectées induisent une réponse antivirale dans
les autres cellules de l’organisme, qui sont saines mais exposées à ces cytokines (en haut à
l’extrême gauche).
A droite de la fig. 4, une réponse de type Th2 dirigée contre un micro-organisme extracellulaire est représentée 54. Les lymphocytes Th2 produisent les cytokines IL-4, IL-5, IL-6,
IL-10 et IL-13 et favorisent la production d'Ac. Ceci aboutit à une réponse immunitaire de
type humoral dans laquelle les pathogènes sont neutralisés par les Ac (fig. 4 en haut à droite).
Une caractéristique surprenante de la réponse immunitaire de type Th2 (appelée aussi
17
humorale) est que les lymphocytes T CD4+ et les lymphocytes B collaborent pour lutter
contre le même Ag. Dans les réponses Th2, les lymphocytes B jouent un rôle prépondérant en
tant qu’APC. Or, chez les lymphocytes B, la présentation des antigènes est fortement
dépendante de l'internalisation par le récepteur Ig de surface 55. L'Ag reconnu par les Ig
produites par un lymphocyte donné sera donc préférentiellement capté, partiellement digéré
puis présenté aux lymphocytes CD4+ sous forme de peptides (fig. 4 au centre droit). Par
conséquent, les Ig spécifiques du lymphocyte B fonctionne comme capteur d’Ag pour recruter
des lymphocytes T CD4+ capables de reconnaître le même Ag. Il n’y a donc rien d’étonnant
que ces deux partenaires reconnaissent le même Ag. L'épitope est cependant différent puisque
la partie liée au lymphocyte B est masquée au TCR du lymphocyte T CD4+ 56.
Figure 4 57. Les réponses immunitaires de type Th1 et Th2.
Une réponse immunitaire Th1 est représentée dans la partie de gauche. L’IFNγ est la cytokine effectrice
principale sécrétée par les lymphocytes CD4+ Th1. A droite, une réponse de type Th2 est représentée. Elle
aboutit à la production d’Ac par les lymphocytes B. Les lymphocytes B sont stimulés par les cytokines IL-4, IL5 et IL-6, produites par les lymphocytes CD4+ Th2.
18
1.3.4.2 L’hypothèse de co-stimulation
La Fig. 5 58 représente les sites anatomiques les plus importants lors de la rencontre
avec un pathogène cutané. Les micro-organismes (en rouge) sont reconnus par les récepteurs
des cellules de l’immunité naturelle (ici une DC épithéliale, ou cellule de Langerhans est
représentée). La DC migre ensuite vers le ganglion lymphatique qui draine la région cutanée
en question, où elle est capable d’activer les lymphocytes T CD4+ naïfs.
Figure 558. La génération d’une réponse immunitaire contre un pathogène cutané.
Le micro-organisme pathogène de la peau (en rouge) est digéré et ses peptides antigéniques amenés au ganglion
lymphatique par la DC. Dans la zone T du ganglion lymphatique, les DC activent les lymphocytes T CD4+ naïfs.
Le processus serait identique pour les antigènes du soi modifiés, comme ceux générés par une cellule
précancéreuse de la peau (représentée à gauche).
19
Le modèle le plus répandu pour expliquer l'activation des lymphocytes T CD4+ postule
l'existence de 2 signaux 59;60. Le premier signal est fourni par le TCR des lymphocytes CD4+.
Ce signal 1 est généré quand le TCR interagit avec un complexe Ag-MHCII présentés par les
APC. Le signal 2 dit de co-stimulation est fourni par l'interaction CD28-B7 61 (voir Fig. 5)62.
En l'absence de signal 2, le signal 1 rend les lymphocytes T réfractaires à une activation
subséquente 63. Un signal 2 délivré sans signal 1 est un événement neutre. Le signal 2 ne peut
être fourni que par une APC activée ou par une DC. De ce fait, au début d'une réponse
antigénique l'activation d'un lymphocyte CD4+ nécessite vraisemblablement un premier
contact avec une DC (Fig. 5). Le signal de stimulation initial entre le lymphocyte T CD4+
naïf et l’APC implique les molécules B7 sur l’APC, et CD28 sur le lymphocyte T naïf.
Le CD4+ activé est ensuite chargé d’amplifier la réponse immunitaire. En effet, il est
maintenant capable de reconnaître le même Ag, même s’il est présenté par une APC au repos
(qui n’exprime pas les molécules B7). Son rôle est d’interagir avec cette APC et de la stimuler
grâce aux cytokines qu’il sécrète. Le lymphocyte T CD4+ stimulé exprime aussi des protéines
de surface qui lui permettent de former un contact cellulaire avec les APC (Fig. 6). Ces
protéines de surface jouent un rôle important dans la stimulation des APC. Le lymphocyte
CD4+ activé exprime le CD40 ligand, qui va reconnaître le CD40 sur l’APC au repos. La
liaison CD40 ligand-CD40 provoque l’expression de B7.1 et B7.2 sur l’APC. Ces 2
molécules, B7.1 ou CD80, et B7.2 ou CD86 sont les ligands du récepteur CD28 comme
mentionnés plus haut. CD28 est constitutivement exprimé à la surface des CD4+ y compris
des CD4+ naïfs. Ainsi, l’APC stimulée par les CD4+ activés va être à son tour capable de
recruter des lymphocytes T CD4+ naïfs pour les activer 64.
1.3.4.3 Autres mécanismes de modulation de la réponse immunitaire
Les molécules B7 (CD80 et CD86) exprimées par les APC jouent un rôle important
aussi pour limiter l’ampleur de la réponse immunitaire. CD80 et CD86 peuvent également
être reconnues par CTLA-4. Cet homologue de CD28 possède une plus haute affinité pour les
molécules B7. Son expression est régulée au niveau du mRNA ainsi que par des mécanismes
post-transcriptionels, et CTLA-4 apparaît à la surface des CD4+ 24 à 36h après leur
stimulation. Son principal rôle est de moduler la réponse immune en fournissant un signal
antiprolifératif au CD4+ 62 (fig. 6).
20
Figure 6 65. Représentation schématique des
1)
mécanismes de co-stimulation impliqués dans
l'activation des lymphocytes CD4+ et des APC.
1) L'interaction entre un APC et une cellule T activée
(exprimant CD40L) aboutit à 2) l'expression du CD86 et
CD80 par l'APC. Grâce à CD86 (B7.2) et CD80 (B7.1)
2)
3)
les APC sont maintenant capables d’activer les CD4+
naïfs (non représentés) qui expriment le CD28. 3) De
plus, CD86 et CD80 provoquent l'expression de CTLA4 par les CD4+ activés en se liant à leur CD28. CTLA-4
CD86
reconnaît à son tour CD86 et CD80 (avec une plus
grande affinité que CD28). CTLA-4 régule
négativement la prolifération des lymphocytes CD4+, limitant l'ampleur de la réponse immune. Le signal 1
fournit par la reconnaissance du complexe MHCII-Ag par le TCR n'est pas représenté.
Les molécules du MHCII sont également capables de transmettre des signaux
transmembranaires pour activer les APC 66;67. Cette activation peut ainsi être déclenchée par
la liaison du TCR, d'Ac anti-MHCII, de superantigènes. Elle aboutit à des modifications dans
l'expression de molécules de surfaces (par exemple B7), à la sécrétion de cytokines (TNF-α,
IL-1, IL-6, IL-8), à une augmentation de l'adhésion cellulaire des APC ou à leur prolifération.
3.3.5 Expression du MHCII
A l'opposé des molécules du MHCI qui sont exprimées par un grand nombre de types
cellulaires, les molécules du MHCII sont exprimées par un nombre restreint de cellules. Les
mécanismes moléculaires responsables de ce profil d'expression seront discutés dans le
chapitre suivant. Au niveau cellulaire, on distingue deux modes généraux d'expression du
MHCII, constitutif et inductible 68-74. Ainsi, l'expression constitutive du MHCII est
principalement le fait des APC dérivés de la moelle osseuse, comme les lymphocytes B, les
DC, les lymphocytes T humains activés (les lymphocytes T murins restant MHCII négatifs),
les macrophages (dont les cellules de Küpffer du foie et la microglie du CNS). Certains
epithelia spécialisés expriment également le MHCII de façon constitutive, parmi lesquels les
cTEC qui jouent un rôle primordial dans la sélection thymique des lymphocytes T CD4+ (voir
ci-dessus) 51;75.
21
Cette expression dite constitutive est néanmoins susceptible d'être modulée, soit de
façon physiologique soit par des facteurs endogènes ou exogènes (lymphokines, interférons,
prostaglandines, glucocorticoïdes, facteurs de croissance, virus, métaux lourds, etc.). Un
exemple de régulation physiologique est observé dans la lignée B. Les lymphocytes B
immatures n'expriment pas le MHCII, puis deviennent positives une fois matures, tandis que
les plasmocytes sont à nouveau MHCII négatifs. Certains virus comme le CMV seraient aussi
capables de diminuer l'expression du MHCII par les macrophages 76 tandis que l'IFNγ ou le
GM-CSF par exemple l'augmentent fortement.
L'expression du MHCII de type inductible est également régulée par un grand nombre
de paramètres 68-74. En l'absence d'infection ou d'état inflammatoire, la plupart des cellules de
l'organisme sont MHCII négatives à l'exception des APC mentionnés ci-dessus. L'expression
du MHCII peut cependant être induite dans la plupart des types cellulaires suite à l'exposition
à un grand nombre de stimuli différents, capables d'induire le MHCII à des degrés divers
selon le type cellulaire.
L'IFNγ est stimulus le plus puissant et le mieux étudié, et il semble capable d'induire
l'expression du MHCII dans la grande majorité des types cellulaires: îlots β du pancréas,
kératinocytes, macrophages, cellules de Schwann, astrocytes en culture, microglie,
endothelium vasculaire, fibroblastes, mélanocytes, neutrophiles, éosinophiles, tubules rénaux,
podocytes, épithelium bronchique, cellules musculaires striées, hépatocytes, entérocytes 77-98.
Comme c'est le cas pour l'expression constitutive du MHCII, l'expression inductible
peut être atténuée ou augmentée par un grand nombre de facteurs. De plus, des modulateurs
efficaces dans un type cellulaire sont souvent dénués d'effet pour un autre, ou alors produisent
l'effet inverse. Par exemple, le TNFα augmente l'expression du MHCII induite par l'IFNγ
dans les macrophages et les astrocytes 77;81;99;100, mais dans la plupart des cas il la diminue,
comme dans les cellules endothéliales 101 ou les macrophages péritonéaux murins 102. Parmi
d'autres facteurs capables de diminuer l'expression du MHCII induite par l'IFNγ figurent
l'IFNα/β et le TGFβ.
Il faut aussi mentionner que l’étude de la régulation de l’expression du MHCII est
encore compliquée par le type cellulaire utilisé. Par exemple, les astrocytes ne semblent pas
être capables d'exprimer le MHCII in vivo 103, contrairement aux études in vitro mentionnées
ci-dessus. Un signal fourni par un contact cellulaire direct avec des neurones fonctionnels
pourrait expliquer cette différence 104;105. Les cTEC représentent par ailleurs un cas
particulier, puisque ces cellules expriment constitutivement le MHCII in vivo. Cependant,
22
elles deviennent MHCII négatives si elles sont maintenues en cultures de cellules isolées ou
en monocouches, mais restent MHCII positives dans des techniques de culture
tridimensionnelle 106;107. Enfin, les cTEC MHCII négatives en culture bi-dimensionnelle
peuvent être induites par l'IFNγ et réexprimer le MHCII 108-110.
1.3.6 Mécanismes moléculaires de la régulation de l'expression des molécules du MHCII par
CIITA.
Cette section a fait l’objet d’une publication qui est reproduite ci-après. Le texte en
anglais est résumé sur la page suivante.
Titre : "Regulation of MHC class II gene expression by CIITA"
Auteurs: Walter Reith, Salomé LeibundGut-Landmann, Jean-Marc Waldburger.
Référence: Nature Reviews Immunology, in press (September 2005).
23
a. Résumé
Les molécules du MHCII dirigent le développement, l'activation et l'homéostasie des cellules
CD4 auxiliaires. Ces molécules jouent un rôle central dans plusieurs processus clés du
système immunitaire spécifique, dont la sélection des lymphocytes T, les réponses
immunitaires T-dépendantes, la production des Ab, la réponse inflammatoire et le
développement et le maintien de la tolérance immunitaire. L'expression du MHCII est
contrôlée par des séquences régulatrices de l'ADN très conservées qui recrutent le complexe
RFX et le coactivateur CIITA. Chacune des trois protéines du complexe RFX ainsi que CIITA
sont indispensables à l'expression du MHCII. En effet il existe des mutations dans ces 4
gènes, différentes selon les familles étudiées mais aboutissant au même grave syndrome
d'immunodéficience causé par l'absence d'expression du MHCII. Parmi ces 4 protéines,
CIITA est le régulateur maître qui contrôle l'expression qualitative et quantitative du MHCII.
En effet, son expression est nécessaire et suffisante à l'expression du MHCII aussi bien
constitutive qu'inductible, y compris dans les types cellulaires initialement MHCII négatifs.
Le niveau de l'expression de CIITA est régulé de façon extrêmement précise et fine par 3
promoteurs différents qui possèdent chacun une spécificité propre. Comme le montre les
résultats présentés dans la partie résultats de cette thèse, la génération de mutations de ces
promoteurs chez la souris a permis de mieux définir leurs rôles respectifs. Le promoteur I est
actif dans les DC, ainsi qu'après induction des macrophages et de la microglie par l'IFNγ, le
promoteur III est actif dans les lymphocytes B et les cellules dendritiques plasmocytoïdes, et
le promoteur IV dans les cTEC et après induction de la plupart des types cellulaires. CIITA
est de plus une cible pour certains composés bactériens et viraux, ce qui représente un moyen
pour les pathogènes infectieux de diminuer les réponses immunes. A l'inverse, CIITA semble
inhiber la réplication du VIH et du HTLV-2. Certaines maladies auto-immunes sont associés à
une surexpression de CIITA et du MHCII, alors que des cancers suppriment l'expression de
CIITA ce qui leur permet probablement d'échapper au système immunitaire anti-tumoral.
L'étude des mécanismes de régulation de CIITA et de l'expression du MHCII a déjà permis de
mettre au point des thérapies efficaces dans certains modèles expérimentaux en cancérologie.
Des études cliniques sont aussi en cours dans des maladies auto-immunes avec des molécules
capables de diminuer l'expression de CIITA et partant, du MHCII.
24
Regulation of MHC class II gene expression by CIITA
Walter Reith1, Salomé LeibundGut-Landmann1,2 and Jean-Marc Waldburger1
1
Department of Pathology and Immunology, University of Geneva Medical School, CMU, 1
rue Michel-Servet, CH-1211, Geneva, Switzerland
2
Current address: Immunobiology Laboratory, Cancer Research UK London Research
Institute, 44 Lincoln's Inn Fields, London WC2A 3PX, UK
Correspondence to W.R.
E-mail: [email protected]
25
Abstract.
MHC class II molecules are pivotal for the adaptive immune system because they guide
the development and activation of CD4+ T helper cells. Fulfilling these functions requires that
the genes encoding these molecules be transcribed according to a strict cell type specific and
quantitatively modulated pattern. This complex expression profile is controlled almost
exclusively by a single master regulatory factor called the class II transactivator (CIITA). As
we discuss here, differential activation of the three independent promoters that drive
expression of the gene encoding CIITA ultimately determines the exquisitely regulated
pattern of MHC class II gene expression.
Introduction
The past decade has witnessed a veritable explosion in our knowledge of the
molecular mechanisms that regulate transcription of the genes encoding MHC class II in
health and disease. Of prime importance has been an unusually detailed genetic dissection of
the system. This was achieved thanks to the study of a severe immunodeficiency disease
called Bare Lymphocyte Syndrome (BLS) (Box 1)1,2 - and by the generation of several
informative knockout mice3-7. This genetic dissection, combined with a wealth of information
derived from biochemical and cell culture based studies, has placed the regulation of MHC
class II genes among the best understood transcription control systems in mammals. It has in
many respects also turned out to be one of the most unique. As discussed here, the task of
conferring the exquisitely regulated cell-type specific and precisely fine-tuned pattern of
MHC class II expression is shouldered almost entirely by the MHC class II transactivator
(CIITA), a highly regulated non-DNA binding co-activator that exhibits a remarkable degree
of specificity for MHC class II genes2,8-10. It is the only known system in which a complex
pattern of gene expression is imparted by a single dedicated co-activator rather than by
combinatorial control exerted by several different DNA-binding transcription factors. In this
review we summarise our current knowledge of the decisive role of CIITA as the master
regulator of MHC class II genes. We concentrate on novel insights, derived from recent gene
targeting experiments in mice, that have allowed us to integrate a profusion of results obtained
by numerous in vitro studies into a single coherent model of how the differential usage of
three independent promoters of the gene encoding CIITA determines the tightly regulated
pattern of cell-type specific and inducible MHC class II expression in vivo.
26
Function and expression of MHC class II molecules
MHC class II molecules are cell-surface glycoproteins that are of central importance to
the adaptive immune system because they present peptides - derived mainly from
extracellular proteins - to the antigen receptor of CD4+ T cells. MHC class II mediated
peptide presentation is essential for the positive and negative selection processes that shape
the specificity of the T cell receptor repertoire of the CD4+ T cell population during its
development in the thymus, for the homeostasis of the mature CD4+ T cell population in the
periphery, and for the initiation, amplification and regulation of protective immune responses
directed against pathogens and tumors. Moreover, it is pivotal for the maintenance of self
tolerance as well as the breakdown of tolerance in autoimmune diseases.
To ensure tight control of these functions, MHC class II genes are themselves regulated
in a precise cell type specific manner2. Their expression is largely restricted to thymic
epithelial cells (TEC) and cells specialized for the capture and presentation of extracellular
antigens. The latter - collectively referred to as antigen presenting cells (APC) - include B
cells, cells of the monocyte-macrophage lineage and dendritic cells (DC). In humans,
activated T cells also express MHC class II molecules. Within APC lineages, MHC class II
expression is fine tuned as a function of various parameters including the developmental
stage, activation status and exposure to extracellular stimuli. For example, MHC class II
expression is increased in B cells stimulated with interleukin-4 (IL-4) and lipopolysaccharide
(LPS) and in macrophages activated with interferon-γ (IFN-γ). Conversely, the differentiation
of B cells into plasma cells and the maturation of DC are accompanied by a shut down of de
novo MHC class II synthesis.
Cells other than TEC and APC – such as fibroblasts, astrocytes, endothelial and
epithelial cells in various organs - do not express MHC class II molecules unless they are
exposed to specific stimuli, particularly IFN-γ, produced during infection, inflammation or
trauma. With the notable exception of trophoblasts, these cells activate their MHC class II
genes in response to stimulation with IFN-γ2. This IFN-γ induced expression can be further
modulated by a variety of secondary stimuli, of which prominent examples include
transforming growth factor β (TGF-β), IFN-β, tumour-necrosis factor (TNF), IL-1, IL-10,
infection by various pathogens and certain drugs.
27
Regulation of MHC class II expression
MHC class II expression is controlled mainly at the level of transcription by a highly
conserved regulatory module situated 150 to 300 bp upstream of the transcription initiation
sites of all MHC class II genes (Figure 1)2,8,9 . This MHC class II specific regulatory module,
referred to as the SXY module, consists of four subsequences - the S, X, X2 and Y “boxes” present in a tightly constrained order, orientation and spacing (Figure 1). Characteristic SXY
modules are found in the promoters of the genes encoding the α and β chains of all MHC
class II molecules in all vertebrate species examined, including the three human (HLA-DR,
HLA-DQ, HLA-DP) and two mouse (H-2E, H-2A) MHC class II isotypes. Typical SXY
modules are also found in the promoters of the genes encoding invariant chain (Ii) and the
non-classical MHC class II molecules HLA-DM (known as H-2M in mice) and HLA-DO
(known as H-2O in mice), which are accessory proteins required for intracellular trafficking
and peptide loading of MHC class II molecules. More recently, additional SXY modules
functioning as enhancers controlling MHC class II genes from a distance have been identified
at distal positions throughout the MHC class II locus and within the first intron of the gene
encoding Ii11,12. Sequences resembling SXY modules also contribute to the function of MHC
class I promoters2,8,9.
Four key trans-acting factors that regulate the transcription of MHC class II genes by
interacting with the SXY module were identified by studying B cell lines exhibiting
regulatory defects in MHC class II expression13,14 and by isolating the genes that are mutated
in BLS, a hereditary immunodeficiency disease resulting from virtually complete absence of
MHC class II expression (Box 1)1,2. BLS is a genetically heterogeneous disease that is caused
by mutations in the genes encoding the regulatory factors CIITA, regulatory factor X (RFX)-5
(RFX5), RFX associated protein (RFXAP) and RFX subunit containing ankyrin repeats
(RFXANK)15-19. All four are dedicated to the transcription of MHC class II and related genes.
They are, to a large extent, essential for this function, since only weak residual MHC class II
expression is retained in BLS patients and in mice lacking RFX5 or CIITA1-5.
RFX5, RFXAP and RFXANK form the heterotrimeric RFX complex, which binds
specifically to the X box of the SXY module16-20. RFX nucleates the assembly of a higher
order nucleoprotein complex by means of cooperative binding interactions with the X2 box
specific cyclic-AMP response element binding protein (CREB), the Y box specific nuclear
factor-Y (NF-Y) and a factor recognizing the S box (Figure 1)21-23. Although the S box can be
bound by RFX in vitro, its function is actually mediated by a different as yet unidentified
28
factor23. The multiprotein complex assembled at the SXY module - referred to as the MHC
class II “enhanceosome” - serves as a platform to which CIITA is recruited by multiple
synergistic protein-protein interactions2,8,9,24. The enhanceosome and CIITA then cooperate to
activate transcription of MHC class II genes2,8,9 .
CIITA, the master regulator of MHC class II genes
As several comprehensive reviews have addressed the structure and mode of action of
CIITA2,8,9,25 we limit ourselves to summarizing the most salient points. Prominent features in
the primary sequence of CIITA include an N-terminal region rich in acidic amino acids, three
segments rich in proline, serine and threonine, a centrally placed GTP binding domain and a
C-terminal region consisting of leucine rich repeats (LRR) (Box 2). The association of a
central nucleotide binding domain with a C-terminal LRR region is characteristic of the
nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) family of proteins, also referred to as the
CATERPILLER (caspase recruitment domain (CARD), transcription enhancer, R (purine)binding, pyrin, lots of leucine rich repeats) family (Box 2)26,27 . The N-terminal moiety of
CIITA contains transcription activation domains believed to mediate interactions with effector
proteins implicated in promoting transcription, including components of the general
transcription machinery, chromatin remodeling factors and other co-activators (see below).
The C-terminal two-thirds of the protein are implicated in self-association, nuclear
localization and recruitment to the enhanceosome2,8,9.
CIITA functions as a non-DNA binding coactivator that coordinates multiple events
required for the activation of transcription (Figure 1). It has been implicated in promoting
transcription by various mechanisms: first, recruiting components such as transcription factor
II D (TFIID) and TFIIB of the general transcription initiation machinery28,29; second, inducing
phosphorylation of RNA polymerase II30; third, interacting with the positive transcription
elongation factor b (P-TEFb)31; fourth, recruiting co-activators that alter chromatin
accessibility by inducing histone acetylation or methylation25; and finally, recruiting the
Brahma-related gene 1 (BRG1) chromatin remodeling factor32. CIITA has also been reported
to contain an endogenous histone acetylase activity33. The relative importance of these
effector functions and the precise order in which they are enlisted during the activation of
MHC class II genes remain to be established.
The function of CIITA can be modulated by posttranslational modifications.
Phosphorylation of certain residues in CIITA can enhance its oligomerization, interactions
29
with other key factors and ability to transactivate MHC class II promoters34,35. Conversely,
phosphorylation at other sites downregulates CIITA function36. Finally, ubiquitination of
CIITA enhances its ability to transactivate MHC class II genes37.
In contrast to the components of the enhanceosome - which are produced widely in most
cell types irrespective of their MHC class II expression status - the synthesis of CIITA is
tightly controlled. Indeed, it is the highly regulated pattern of transcription of the gene
encoding CIITA (MHC2TA in humans, C2ta in mice, originally mapped to the AIR1 locus14)
that ultimately dictates where, when and to what level MHC class II genes are expressed2,8-10.
This is exemplified by the following key observations. MHC class II expression in TEC and
APC is strictly dependent on activation of the MHC2TA/C2ta gene2,3,5-7,38. IFN-γ induced
MHC class II expression in other cell types is mediated by induction of the MHC2TA/C2ta
gene7,39-42. The extinction of MHC class II expression in trophoblasts, plasma cells, mature
DC and various tumors is a direct consequence of silencing of the MHC2TA/C2ta gene43-50.
Finally, stimuli that downregulate IFN-γ induced MHC class II expression - including TGF-β,
IL-1, IL-4, IL-10, various pathogens and certain drugs - generally achieve this by interfering
with induction of the MHC2TA/C2ta gene31,51-66.
The classical and non-classical MHC class II genes and the Ii chain gene are the best
documented targets of CIITA. Although a number of other potential targets have been
proposed, the impact of CIITA on their expression is either minor, not observed in an in vivo
setting, due to indirect mechanisms distinct from those operating at MHC class II genes or a
subject of controversy10 (Box 3). CIITA is thus remarkably specific for MHC class II
expression. Because of its restricted target gene specificity and decisive regulatory role,
CIITA is referred to as the “master control factor” for the expression of MHC class II and
related genes.
Regulation of the gene encoding CIITA
The role of CIITA as the master regulator of MHC class II expression has motivated a
considerable amount of interest in the molecular mechanisms controlling its expression.
CIITA expression is regulated primarily at the level of transcription, although it can be further
modulated by changes in mRNA and protein stability67,68. Transcription of the human
MHC2TA gene is driven by a large regulatory region containing four distinct promoters called
pI, pII, pIII and pIV (Figure 2)42. Three of these promoters - pI, pIII and pIV- are strongly
30
conserved in the mouse C2ta gene. A mouse equivalent of pII has not been identified and its
function is not known; therefore pII will not be discussed further here.
Promoters pI, pIII and pIV precede alternative first exons that are spliced to the shared
downstream exons to give rise to three types of CIITA mRNA differing at their 5’ ends
(Figure 2). All three mRNAs share a translation initiation codon in the common second exon.
However, the alternative 5’ exons following pI and pIII contain additional upstream initiation
codons and thus encode specific N-terminal extensions of 101 and 24 amino acids,
respectively. Three CIITA isoforms differing at their N-termini are consequently produced
(Figure 2). All three restore MHC class II expression when produced in CIITA deficient B
cells and activate MHC class II genes to equivalent levels when expressed in cells of nonhematopoietic origin. Whether these isoforms have different functions is therefore not clear.
The isoform derived from pI is however slightly more efficient than the other two in
activating MHC class II promoters (S. LeibundGut-Landmann and W. Reith, unpublished
data)69. This enhanced efficiency has been attributed to the N-terminal sequence encoded by
the alternative first exon following pI, which contains a weak CARD homology69. This
CARD-like
sequence
strengthens
the
similarity
between
CIITA
and
other
NOD/CATERPILLER proteins, several of which contain N-terminal CARD domains (Box
2)26,27.
Cell-type specific, cytokine induced and developmentally modulated MHC class II
expression is determined by transcriptional control of the MHC2TA/C2ta gene through the
differential usage of pI, pIII and pIV. Initial experiments with established cell lines and a
limited number of primary cells suggested that pI is used mainly in DC, pIII is activated
specifically in B cells and pIV is induced by IFN-γ 41,42. However, subsequent in vitro studies
challenged this relatively simple picture. For instance, all three promoters were reported to be
inducible by IFN-γ, both pI and pIII were found to be active in DC, and pIII was shown to be
used in certain tumours of non-hematopoietic origin47,66,70-74. Therefore, to define the true
specificity of the promoters, mice carrying targeted deletions of the regulatory region of the
C2ta gene were generated. pIV-/- mice carry a deletion that excises pIV and its associated
exon 1 but leaves pI and pIII intact7. In p(III+IV)-/- mice, pIII, pIV and their associated first
exons are excised such that only pI remains intact6. The analysis of MHC class II expression
in multiple cell types of these mice has led to an unambiguous and faithful definition of the
functions of the three C2ta promoters in vivo. The division of labour between these promoters
is remarkably strict and much more precise in vivo than was anticipated from earlier in vitro
31
studies. Moreover, the promoters function independently of each other without any significant
cross-talk between them.
Lessons from pIV deficient mice
In vitro studies had led to the suggestion that pIV is activated by IFN-γ in cells of the
macrophage lineage as well as in numerous non-hematopoietic cells, including astrocytes,
fibroblasts, endothelial and epithelial cells40-42,52,72. A key role in IFN-γ induction was
confirmed by the phenotype of pIV-/- mice, which exhibit a selective abrogation of IFN-γ
induced MHC class II expression by a wide variety of cells of non-hematopoietic origin,
including glandular, respiratory and intestinal epithelia, endothelial cells, astrocytes and
fibroblasts7. In the absence of pIV, pI and pIII are not sufficient to support IFN-γ induced
MHC class II expression in these cell types, despite the fact that both promoters have been
reported to be activated by IFN-γ in certain fresh cells and cell lines6,7,66,72-74. pIV is thus
essential for driving IFN-γ induced CIITA expression in cells of non-hematopoietic origin
(Figure 3).
In contrast to non-hematopoietic cells, IFN-γ stimulated macrophages from pIV-/- mice
have normal levels of MHC class II expression7. This is true for peritoneal macrophages as
well as tissue resident macrophages, such as microglia in the central nervous system. Thus,
although transcription from pIV is activated by IFN-γ in macrophages66,73-76, this does not
contribute significantly to IFN-γ induced MHC class II expression in these cells.
A second key role of pIV was revealed by the finding that pIV-/- mice exhibit a dramatic
reduction in CD4+ T cell numbers7,38. This results from a severe defect in positive selection of
CD4+ T cells in the thymus, which is normally driven by MHC class II+ epithelial cells in the
thymic cortex (cTEC)77. Positive selection of CD4+ T cells is abolished in the pIV-/- mice
because MHC class II expression by cTECs is eliminated7,38. CD4+ T cell numbers are as low
as in mice deficient in MHC class II molecules, indicating that the defect in MHC class II
expression by cTEC in pIV-/- mice is complete. Due to the absence of CD4+ T cells, protective
immune responses are severely hampered7,38 and pIV-/- mice succumb to infection by
pathogens commonly found in non-barrier facilities (J.M. Waldburger and W. Reith,
unpublished observations). Weak T-cell-dependent immune responses are nevertheless
observed, perhaps due to the positive selection of some CD4+ T cells by MHC class II+ bonemarrow-derived APC78.
32
Induction of pIV by IFN-γ
A conserved 300 bp promoter-proximal region is sufficient for the activation of pIV by
IFN-γ. This region contains three regulatory elements - a gamma-activated sequence (GAS),
an E box and an interferon regulatory factor (IRF) element (IRF-E) – all of which are required
for the induction of pIV (Figure 4)40-42,72,75. The GAS and E-box are bound co-operatively by
signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) and upstream stimulatory factor 1
(USF1)41. The IRF-E is co-occupied by IRF140,41 and IRF279,80. Binding of STAT1 is induced
by the classical IFN-γ signal transduction pathway. Upon binding of IFN-γ to its receptor,
activation of the receptor-associated tyrosine kinases Janus kinase 1 (JAK1) and JAK2 leads
to the phosphorylation of STAT1, which then dimerizes, translocates to the nucleus and
activates its target promoters, including pIV. IRF1 is encoded by another gene controlled by
STAT1, and is thus also induced by IFN-γ. The dependence on IRF1 explains the delayed
kinetics of IFN-γ induced CIITA expression relative to the rapid induction of genes controlled
only by STAT139,81. The relative importance of STAT1 and IRF1 for the activation of pIV
varies as a function of cell type40,41,72,76,82. For instance, both the GAS and IRF-E are equally
critical in certain melanoma and fibrosarcoma cell lines41,72, whereas the IRF-E is more
important than the GAS in astrocytes40,76.
Activation of pIV by IFN-γ is dependent on remodelling of the local chromatin
structure. This requires BRG1, the ATPase subunit of nucleosome remodelling complexes83.
Moreover, binding of STAT1 to pIV enhances chromatin accessibility by inducing histone
acetylation81.
Several cytokines suppress IFN-γ induced expression of CIITA. For example, TGF-β
inhibits IFN-γ induced activation of pIV51,53-55,72 . The inhibitory effect of TGF-β is mediated
by Smad-355. IL-1, IL-4 and IL-10 also inhibit the induction of CIITA in human astrocytes
(IL-1) and mouse microglia (IL-4, IL-10), but the molecular mechanisms that are implicated
remain undefined52,53.
Trophoblasts are unique in that they can not activate MHC class II genes in response to
IFN-γ. The absence of MHC class II molecules on trophoblasts is thought to play a critical
role in preventing rejection of the foetus by the maternal immune system. The inability of
trophoblasts to express MHC class II genes is due to epigenetic silencing of the gene encoding
CIITA43,44. Most studies have suggested that DNA methylation is responsible for
silencing43,44,50, but alternative mechanisms have also been proposed84,85.
33
Regulation of pIV in TEC
TEC retain MHC class II expression and the ability to drive positive selection of CD4+
T cells when cultured in three-dimensional reaggregate thymic organ cultures86. By contrast,
they dedifferentiate and loose expression of MHC class II molecules when they are
maintained in monolayer cultures87,88. This indicates that pIV activity is dependent on signals
provided by the thymic microenvironment. However, the nature of these signals and the
transcription factors on which they converge remain elusive38,89. Although CIITA and MHC
class II expression can be induced by IFN-γ in ex vivo TEC and thymic stromal cell lines90,91,
the mechanism operating in vivo is independent of the IFN-γ signalling pathway (Figure 4).
Indeed, positive selection of CD4+ T cells is normal in mice lacking essential components of
the IFN-γ signalling pathway, including IFN-γ, the IFN-γ receptor, STAT1 or IRF192,93,
indicating that MHC class II expression by TEC is not perturbed in these mice. Moreover,
defective CD4+ T cell selection resulting from the absence of MHC class II expression in the
thymus has not been described in any other mouse lacking a specific cytokine, cytokine
receptor, STAT protein or IRF transcription factor38,89. Other signalling pathways involved in
development and function of the thymus (such as the Wnt, fibroblast growth factor (FGF),
TGF and sonic hedgehog (Shh) pathways)94 have also not been implicated in driving MHC
class II expression by TEC. Elucidation of the mechanism mediating pIV activation in TEC
thus remains a major challenge.
Lessons from p(III+IV) deficient mice
Several lines of evidence had initially indicated that pIII is active in B cells. The first
CIITA cDNA clone to be isolated was derived from a B cell line and corresponded to a type
III CIITA mRNA15. Moreover, transcripts derived from pIII are preponderant in B cell lines
and pIII exhibits B cell specificity in reporter gene assays42,95. That pIII is indeed crucial for B
cells in vivo was formally demonstrated by the finding that p(III+IV)-/- mice lack CIITA and
MHC class II expression in all B cell subsets, including B2 cells in the spleen, lymph nodes,
thymus, peritoneum and blood, B1 cells in the peritoneum and blood, and splenic marginal
zone B cells6. The functional consequence of the loss of expression of MHC class II
molecules by B cells is exemplified by the failure of p(III+IV)-/- mice to produce antibodies
against T cell-dependent antigens6.
Plasmacytoid DC (pDC) constitute a unique and highly specialized type of DC. They
have also been referred to as interferon producing cells because their most remarkable
34
characteristic is that they are the major source of type I IFN during viral infection96.
Surprisingly, pDC from p(III+IV)-/- mice are MHC class II- and lack CIITA6. This sets pDC
apart from all other DC subsets, which do not exhibit altered CIITA or MHC class II
expression in p(III+IV)-/- mice. Defective MHC class II expression in pDC is due to the
deletion of pIII rather than pIV, since CIITA and MHC class II expression are normal in pDC
from pIV-/- mice6. The dependence of pDC on pIII is consistent with the fact that the majority
of CIITA mRNAs synthesised in wild type mouse6 and human pDC (S. LeibundGutLandmann and W. Reith, unpublished data) are derived from pIII.
pDC differ from conventional DC in several respects relating to their function and
origin. Two distinctive features are directly relevant to their dependence on pIII for driving
MHC class II expression. First, compared to other DC, pDC have relatively low antigen
presentation and T cell stimulatory activity96. This is due, at least in part, to their lower
abundance of cell-surface MHC class II molecules, which is likely to be a consequence of
their use of pIII rather than pI as in conventional DC. A second issue is the origin of pDC.
Several lines of evidence suggest that, unlike conventional DC, pDC could be more closely
related to lymphoid cells than myeloid cells96. Since pIII is highly specific to B cells, and
activated T cells in humans (see below), the use of pIII by pDC could represent a heritage of
their lymphoid origin.
Human-mouse differences in pIII function
pIII of the MHC2TA gene can be induced by IFN-γ in human fibrosarcoma and
glioblastoma cells72. This induction is mediated by a STAT1 dependent enhancer situated 5
kb upstream of the transcription initiation site72 (Figure 4). Surprisingly, IFN-γ responsiveness
of pIII is not observed in rodents: pIII is not induced by IFN-γ in primary rat astrocytes76 or
mouse macrophages7,74. Moreover, pIII is not sufficient to drive IFN-γ-induced CIITA
expression in non-hematopoietic cells of pIV-/- mice7. There is thus a species-specific
difference in the induction of pIII by IFN-γ, probably because the IFN-γ responsive enhancer
found upstream of human pIII is not present in the mouse gene.
It is well established that activated human T cells are MHC class II+ whereas activated
mouse T cells express little or no MHC class II97. This is due to a difference in the function of
pIII, which is activated strongly in human T cells98,99 but not in mouse T cells97. The
molecular basis of this differential activation of pIII is not known.
35
Regulation of pIII
The molecular mechanisms controlling the B cell specific activity of pIII have been
studied in human cell lines (Figure 4). A 320 bp promoter-proximal regulatory region is
sufficient to confer B cell specificity42,95. This region contains five sequences shown by
genomic footprinting to be occupied in vivo100. At least two of these sequences – activation
response element 1 (ARE-1) and ARE-2 – are key regulatory elements in B cell lines100,101.
CREB-1 and activating transcription factor 1 (ATF-1) have been proposed to bind to ARE2101. However, these factors are expressed widely in many cell types and are thus unlikely to
confer B cell-specificity. More recently, an E-box motif and a composite Ets-bindingsite/IFN-stimulated-response-element (ISRE) have been described upstream of the ARE
motifs102. The E-box binding factor E47, the Ets family member PU.1 and IRF4 were found to
bind to these elements in vivo and to act synergistically to promote B cell specific activation
of pIII102. All three factors have previously been shown to control the expression of genes
required for the development or function of B cells. Notably, synergy between PU.1, IRF4
and E47 has been implicated in the activation of several B cell specific genes. Interestingly, a
polymorphism situated next to the ISRE was recently found to be associated with reduced
CIITA expression and increased susceptibility to autoimmune disease103.
The pattern of transcription factor occupation observed at pIII in vivo differs slightly
between activated human T cells and B cells98. In addition, the factors that bind to the ARE-1
and Ets/ISRE elements in activated T cells differ from those binding in B cells98,99. These
differences are likely to reflect that constitutive expression in B cells and induced expression
in T cells are mediated by distinct mechanisms.
MHC class II expression is lost during terminal differentiation of B cells into plasma
cells because the MHC2TA/C2ta gene is switched off45,46. This repression has been proposed
to be mediated by binding of human positive regulatory domain I-binding factor 1 (PRDIBFI), and its mouse homologue B-lymphocyte-induced maturation protein 1 (Blimp-1), to a
site in pIII104,105. PRDI-BFI/Blimp-1 is a transcriptional repressor that participates in plasma
cell differentiation by repressing B-cell gene expression programs. The PRDI-BFI/Blimp-1
binding site in pIII overlaps with the ISRE, suggesting that it may repress pIII by interfering
with its activation by IRF4 (Figure 4)102.
Function of pI.
36
CIITA mRNAs derived from pI are predominant in most DC subsets, including mouse
splenic DC, mouse bone marrow-derived DC and human monocyte-derived DC7,42,47,73. This
DC specificity was confirmed by the analysis of p(III+IV)-/- mice, in which only pI remains
functional6. With the exception of pDC, MHC class II expression is normal in all DC subsets
in the p(III+IV)-/- mice, including bone marrow-derived DC, epidermal Langerhans cells and
conventional DC in the spleen, thymus and lymph nodes6. pI is thus sufficient to sustain
CIITA and MHC class II expression in all conventional or “myeloid” DC subsets.
As observed for pIV-/- mice, macrophages from the p(III+IV)-/- mice express normal
levels of basal and IFN-γ induced MHC class II expression, indicating that pI is sufficient for
maintaining CIITA expression in these cells6,7. This was surprising in view of earlier reports
showing that pIV is induced by IFN-γ in macrophage cell lines, peritoneal macrophages and
tissue resident macrophages, such as microglia66,73-76. To reconcile these findings we and
others compared the induction of transcription from pI and pIV in macrophages stimulated
with IFN-γ6,74. The abundance of mRNAs derived from each promoter was found to increase
rapidly. However, pIV derived mRNA levels were raised only transiently, whereas the
increase in pI derived mRNA attained 10 fold greater levels (S. LeibundGut-Landmann and
W. Reith, unpublished data) and was sustained for long periods of time6,74. It is therefore the
robust activation of pI that is critical for maintaining CIITA and MHC class II expression in
IFN-γ stimulated macrophages. This fact, together with the finding that pI is the key promoter
in all conventional DC subsets, led us to redefine pI as a myeloid cell specific promoter.
Regulation of pI
The molecular mechanisms underlying the activation of transcription from pI in DC
remain largely unknown. A 400 bp promoter-proximal region is sufficient to confer
specificity for cells of myeloid origin (S. LeibundGut-Landmann and W. Reith, unpublished
data). This region contains several sequence motifs representing potential binding sites for
known transcription factors, and footprints within or near some of these motifs have been
revealed in vivo in human monocyte-derived DC47. However, these observations have not yet
been reinforced by functional studies. Even less is known about the mechanisms driving IFN-
γ induction of pI in macrophages. In contrast to pIV, no known IFN-γ-responsive sequences
have been identified in the vicinity of pI, raising the possibility that pI is not controlled
directly by the factors that mediate the classical IFN-γ signalling pathway. A likely alternative
is that enhanced pI function is an indirect consequence of IFN-γ induced macrophage
37
activation, which could lead to an increase in the concentration or activity of transcription
factors required for the expression of pI.
The activity of pI is markedly decreased during maturation of DC induced by
inflammatory and pathogenic stimuli47. Changes in the synthesis, peptide loading and cellular
localization of MHC class II molecules represent key aspects of DC maturation. The density
of cell surface MHC class II molecules is increased as a result of changes in the intracellular
localization and increased stability of pre-existing MHC class II proteins. By contrast, de novo
MHC class II synthesis is shut down. This is a consequence of transcriptional inactivation of
the MHC2TA/C2ta gene by a global repression mechanism involving histone deacetylation
over a large domain spanning its entire regulatory region47.
CIITA expression in disease
Pathogens exploit various strategies to avoid protective immune responses mounted by
the host. To inhibit MHC class II expression and the establishment of CD4+ T-cell dependent
immune responses many pathogens have developed ways of interfering with the function or
expression of CIITA (Table 1). The Tat protein of HIV interferes with the function of CIITA
by competing for binding to cyclin T1, a component of the transcription elongation factor PTEFb31,56. Varicella zoster virus57, human cytomegalovirus58,59, human parainfluenza virus
type
360,
Chlamydia61,
Toxoplasma
gondii62,
Mycobacterium
tuberculosis63
and
Mycobacterium bovis64 interfere at various known or unknown steps of the pathway
mediating the induction of CIITA expression by IFN-γ. For example, M. tuberculosis
produces a 19 kD lipoprotein that inhibits IFNγ induced expression of IRF1 and CIITA63.
Another emerging concept is that CIITA may interfere with the activity of certain
pathogen derived products (Table 1). CIITA can inhibit the replication of HIV and human Tcell leukemia virus type 2 (HTLV-2) by blocking the function of the viral transactivators Tat
and Tax-2, respectively106,107.
The loss of MHC expression contributes to the ability of cancers to escape host immune
surveillance108. Since malignant cells are eliminated mainly by cytotoxic CD8+ T cells, the
loss of MHC class I expression is observed most frequently. However, since efficient
rejection requires CD4+ T cell help during both the priming and effector phases of antitumour responses109, silencing of MHC class II expression is also commonly observed. This is
particularly relevant for cancers of hematopoietic origin48,110,111. For instance, the loss of
MHC class II expression is a negative prognostic marker in diffuse large B-cell lymphoma112.
38
Similarly, MHC class II expression levels in certain mouse B cell lymphomas correlates with
increased immunogenicity and reduced tumorigenicity113. There is no clear relationship
between MHC class II expression and prognosis in the case of malignancies of nonhematopoietic origin114. Nevertheless, non-hematopoietic tumour cells also frequently lose
their ability to activate MHC class II genes in response to IFN-γ. The major cause for the loss
of constitutive or inducible MHC class II expression on tumour cells of hematopoietic and
non-hematopoietic origin is epigenetic silencing of the gene encoding CIITA48-50. The
mechanism implicated most frequently is DNA methylation at pIII or pIV.
By contrast, several tumours acquire abnormal MHC class II expression. Myeloma cells
- the malignant counterpart of plasma cells - tend to reactivate MHC class II genes as a result
of constitutive activation of transcription from pIV115. MHC class II+ myelomas may escape
immune surveillance in vivo by various mechanisms, including the induction of T cell anergy
due to the lack of costimulatory molecule expression116. Certain melanomas and gliomas
acquire MHC class II molecules due to constitutive activation of pIII70,117 or both pIII and
pIV71. The existence of these highly malignant MHC class II+ tumours indicates that the loss
of MHC class II expression is not always essential for immune escape.
The induction of MHC class II expression on non-hematopoietic cells is intimately
associated with pathological immune responses118. It is typically observed on the parenchyma
and endothelia of various organs during allograft rejection, and in many autoimmune and
inflammatory disorders. Although not formally demonstrated in most situations, this aberrant
MHC class II expression is believed to contribute to disease pathology. A good illustration is
provided by a mouse glomerulonephritis model, in which disease development is strictly
dependent on MHC class II expression by renal parenchyma cells119. This is probably
mediated by pIV, which is induced by most inflammatory stimuli in the kidney82. Given its
key role in driving CIITA expression in non-hematopoietic cells, pIV is likely to be
implicated in most pathological situations involving up-regulated MHC class II expression on
non-bone marrow derived cells.
Therapeutic modulation of CIITA expression
Detailed knowledge of the regulation of CIITA expression paves the way for the
development of novel therapeutic strategies aimed at modulating MHC class II mediated
antigen presentation. Inhibiting CIITA expression may be an advantage in situations where
up-regulation of MHC class II molecules is detrimental, such as transplantation or
39
autoimmune disease. Conversely, increasing CIITA expression could be beneficial for
enhancing tumour immunogenicity or bolstering protective immune responses against certain
pathogens, particularly those that down-regulate MHC class II expression.
Statins (HMG-CoA reductase inhibitors) recently received considerable attention
because they exhibit anti-inflammatory properties that may be beneficial in autoimmune
diseases. They were found to protect against experimental autoimmune encephalomyelitis66.
A protective effect was also documented in collagen-induced arthritis120, although discordant
results were reported by others121. A recent clinical trial in rheumatoid arthritis revealed only
a modest anti-inflammatory trend in treated patients122. The favourable impact on
autoimmune disorders was proposed to result, among other effects, from an inhibition of
MHC class II expression. The mechanism responsible for this inhibition is controversial; the
initial hypothesis that statins attenuate IFN-γ induced CIITA expression65,66 was recently
challenged by evidence suggesting that another mechanism is likely to be responsible123.
The notion that MHC class II expression by tumours can enhance immunogenicity has
fostered hopes that it might be possible to boost anti-tumour immune responses using tumour
cells rendered MHC class II+ by means of CIITA expression vectors. Although not successful
in a lung carcinoma model124, this strategy enhanced tumour immunogenicity and rejection,
and elicited tumour-antigen specific immunological memory, in a mouse mammary
adenocarcinoma model125. Promising results were also obtained by combining CIITA overexpression with down-regulation of Ii126. Such MHC class II+Ii- tumour cells have been
shown to be prophylactic and therapeutic agents for the treatment of primary and metastatic
mouse cancers127. Ii down-regulation was proposed to enhance tumour vaccine potency by
favouring the presentation of endogenous over exogenous antigens. However, the precise
pathway involved in the presentation of endogenous antigens by MHC class II+Ii- tumour cells
remains unclear128. The efficacy of such approaches can be enhanced by combining them with
adjuvant therapies, such as radiotherapy and cytokines, to strengthen the anti-tumour
response129.
Another promising anti-cancer strategy relies on therapeutic monoclonal antibodies
directed against MHC class II molecules. Although encouraging preclinical results have been
obtained with this approach130, clinical trials, mainly in B cell malignancies, have so far not
lived up to expectations131. However, the efficacy of this new treatment could well benefit
from an improved understanding of the regulation of MHC class II expression in cancer cells.
One could for instance envisage coupling MHC class II specific antibodies with drugs that
40
prevent silencing of the MHC2TA gene, such as DNA-alkylating agents, which can prevent
methylation-dependent silencing of pIII in lymphomas49.
Concluding remarks
We have acquired a remarkably detailed understanding of how CIITA expression is
regulated in vivo by multiple promoters exhibiting different cell-type specific and inducible
activities. However, a number of important lacunae remain. Prominent questions are: what is
the identity of the signal transduction pathways and transcription factors that activate pIV in
TEC; is pIII activated by the same or distinct pathways in B cells and pDC; what is
responsible for the activation of pI in DC; how is pI turned on in IFN-γ activated
macrophages; what mechanisms trigger silencing of the CIITA gene upon plasma cell
differentiation and during the maturation of DC; and finally, which features of the
MHC2TA/C2ta gene confer its high propensity to undergo epigenetic silencing in tumours?
Filling many of these gaps in our knowledge will be particularly challenging because it is
hampered by the absence of suitable TEC, DC and pDC cell lines reproducing faithfully the
pattern of MHC class II gene regulation exhibited by the corresponding primary cells in vivo.
Studying the regulation of CIITA expression in these cells will consequently require timeconsuming in vivo approaches or sophisticated in vitro experiments with small numbers of
primary cells. Nevertheless, we can expect active progress in these areas because research into
the molecular mechanisms regulating MHC class II expression is driven by the combined
interests of both fundamental biologists and clinicians studying the function of the adaptive
immune system in health and its deregulation in disease. We anticipate that this research will
set the stage for the development of novel therapeutic interventions based on the modulation
of MHC class II expression, including strategies aimed at boosting protective immune
responses against pathogens and tumours or attenuating unwanted immune responses during
transplantation, autoimmune and inflammatory diseases.
41
Box 1. Bare Lymphocyte Syndrome
Bare Lymphocyte Syndrome (BLS) - also referred to as MHC class II deficiency - is a
rare autosomal recessive immunodeficiency (MIM, Mendelian Inheritance in Man, number
209920)1,2. In this disease, failure to express MHC class II molecules on all cells that should
normally express them – including thymic epithelial cells, B cells, macrophages, dendritic
cells and interferon-γ induced cells - leads to both reduced positive selection of CD4+ T cells
in the thymus and the inability of these cells to respond to antigens in the periphery. A
combined deficiency of cellular and antibody-mediated immune responses ensues. As a result,
patients suffer from severe and recurrent bacterial, viral, fungal and protozoan infections,
primarily of the gastrointestinal, pulmonary, respiratory and urinary tracts. These infections
lead to chronic diarrhoea, malabsorption, growth retardation and death in early childhood.
Bone marrow transplantation remains the only curative therapy.
The genetic lesions responsible for BLS do not lie in the MHC class II genes
themselves but in genes encoding trans-acting factors required for their transcription. Patients
have been assigned to four complementation groups (A, B, C and D) by cell fusion
experiments. The regulatory genes mutated in these groups encode the class II transactivator
(CIITA), regulatory factor X (RFX) containing ankyrin repeats (RFXANK, also known as
RFX-B), RFX5 and RFX associated protein (RFXAP), respectively2,15-19. Despite this genetic
heterogeneity, BLS is phenotypically homogeneous in the sense that no phenotypes restricted
to a given complementation group have been identified1,2. Moreover, all clinical and
immunological abnormalities can be accounted for by the absence of MHC class II expression
and no major perturbations of other biological systems have been documented. The same is
true for mouse models of BLS generated by disruption of C2ta or Rfx53-5. Taken together,
these observations imply that CIITA and the three RFX factors are to a large extent dedicated
to the regulation of MHC class II genes.
42
Box 2. CIITA is a member of a family of structurally related proteins.
CIITA is a member of a family of cytosolic proteins known under several names,
including nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) and CATERPILLER (caspase
recruitment domain (CARD), transcription enhancer, purine (R)-binding, pyrin, lots of leucine
repeats) proteins26,27. These proteins have a conserved tripartite architecture consisting of a
variable N-terminal effector-binding domain (EBD), a centrally placed NOD and a C-terminal
region containing a variable number of leucine rich repeats (LRR). The family is
evolutionarily ancient as this tripartite domain arrangement is conserved in certain disease
resistance proteins (R-proteins) mediating immune responses in plants. In most mammalian
family members, the N-terminal EBD is either a CARD or Pyrin domain (PYD). The EBD in
many R proteins is a Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain. CIITA is the only member that
has an N-terminal transcription activation domain (AD) and a documented role as a
transcription factor. The N-terminal extension specific to the CIITA isoform derived from the
use of promoter I (pI) of the MHC2TA gene contains a weak CARD homology.
NOD/CATERPILLER proteins play diverse roles in inflammation, apoptosis and
immune regulation. NOD1 and NOD2 function as intracellular receptors for specific motifs in
bacterial peptidoglycan. Mutations affecting the genes coding for several prominent family
members are associated with immunological or inflammatory disorders: the MHC2TA gene in
bare lymphocyte syndrome (Box 1); the NOD2 gene in Crohn’s disease and Blau Syndrome;
the CIAS1 gene (which encodes cryopyrin) in familial cold urticaria syndrome, Muckle-Wells
syndrome and neonatal-onset multi-system inflammatory disease.
43
Box 3. Target gene specificity of CIITA.
By far the most well-established target genes of the class II transactivator (CIITA)
remain those encoding MHC class II molecules and the Ii, HLA-DM and HLA-DO proteins
required for MHC class II antigen presentation2,8-10. CIITA also plays a more limited role in
the activation of MHC class I genes132,133. This high specificity of CIITA was recently
challenged by reports indicating that it can influence - albeit in most cases relatively modestly
- the expression of a surprising variety of genes involved in numerous distinct functions
within and outside the immune system10. The Plexin-A1 gene was found to be stimulated by
CIITA in mouse dendritic cells134. Microarray experiments identified over 40 genes that were
proposed to be up-regulated by CIITA in human B cells and interferon-γ induced cells135.
Genes proposed to be repressed by CIITA in specific cell types include those encoding
interleukin-4 (IL-4), Fas ligand (FasL), cathepsin E, IL-10, collagen type I α2, tymidine
kinase, cyclin D1 and 16 additional proteins of diverse functions135-139. Repression of the
genes encoding IL-4, FasL, collagen type I α2, thymidine kinase, cyclin D1 and cathepsin E
was proposed to be mediated by sequestration of the co-activator cAMP-responsive-elementbinding-protein (CREB)-binding protein (CBP) by CIITA136-139. The mechanisms mediating
activation or repression of the other candidate target genes have not been defined, but are
likely to be distinct from those operating at MHC class II genes since none of these genes
contain the characteristic SXY module to which CIITA is recruited at MHC class II
promoters. For most of the potential new target genes, the biological importance of their
regulation by CIITA has not been evaluated in vivo. It remains to be documented whether
their altered expression leads to a clear-cut phenotype in CIITA deficient BLS patients or
mice. Furthermore, conflicting results have been reported for certain target genes, such as IL-
497,139,140 . Until further notice, CIITA should consequently not be regarded as a pleiotropic
factor having widespread functions extending beyond its role in the control of MHC class II
expression.
44
Figures
Figure 1. Regulation of the
transcription of MHC class
II genes
The SXY module present in
all classical MHC class II
genes - as well as in the genes
encoding invariant chain (Ii),
HLA-DM,
HLA-DO
and
MHC class I molecules - is
bound co-operatively by the
heterotrimeric X box binding
factor called regulatory factor
X (RFX), which is composed
of RFX5, RFX associated
protein (RFXAP) and RFX
containing ankyrin repeats
(RFXANK),
the
X2
box
binding factor cyclic-AMP
response
element
binding
protein (CREB), the Y box
binding factor nuclear factorY (NF-Y) and an as yet
unidentified S box binding factor. This multiprotein complex - called the MHC class II
enhanceosome - serves as a landing pad for the class II transactivator (CIITA), which is a
non-DNA binding co-activator that is recruited by multiple protein-protein interactions with
several components of the enhanceosome. CIITA co-ordinates the recruitment of additional
factors involved in chromatin modification and remodelling, as well as in the initiation and
elongation of transcription: cAMP response element binding protein (CREB)-binding protein
(CBP), p300, p300/CBP-associated factor (pCAF), Brahma-related gene 1
(BRG1),
coactivator-associated arginine methyltransferase 1 (CARM1), transcription factors II D
(TFIID) and B (TFIIB), positive transcription elongation factor b (P-TEFb).
45
Figure 2. Modular structure of the regulatory region of the gene encoding CIITA.
The gene encoding the class II transactivator (CIITA) is controlled by three independent
promoters (pI, pIII and pIV) preceding alternative first exons that are spliced to the shared
downstream exons (exons 2 to 19). A fourth promoter described in the human gene (pII) is not
conserved in the mouse gene. The three types of CIITA mRNA (types I, III and IV) derived
from pI, pIII and pIV encode protein isoforms of 132, 124 and 121 kD. These isoforms differ
only at their N-termini. The region shared by all three isoforms contains an acidic domain
(DE), three segments rich in proline, serine and threonine (PST), a centrally placed GTP
binding domain (GTP), a series of leucine rich repeats (LRR) and at least three nuclear
localisation signals (NLS1, NLS2, NLS3). The N-terminal third of the protein functions as a
transcription activation domain whereas the central and C-terminal regions are implicated in
self-association and recruitment to the MHC class II enhanceosome. Effector proteins shown
to interact with the transcription activation domain include cAMP response element binding
protein (CREB)-binding protein (CBP), p300/CBP-associated factor (pCAF), transcription
factors II D (TFIID) and B (TFIIB), and positive transcription elongation factor b (PTEFb).The type I specific N-terminal extension contains a sequence showing a weak CARD
homology.
46
Figure 3. Regulation of CIITA expression in health and disease.
Top) The three regulatory modules (pI, pIII and pIV) of the gene encoding the class II
transactivator (CIITA) have distinct functions. pI is a myeloid cell specific promoter that is
sufficient for driving CIITA expression in conventional dendritic cells (DC) and interferon-γ
(IFN-γ) activated macrophages. pIII is a lymphoid cell specific promoter that is essential for
CIITA expression in B cells and activated human T cells. pIII is also required for CIITA
expression in plasmacytoid DC (pDC). pIV is essential for driving CIITA expression in
thymic epithelial cells (TEC) and for mediating the induction by IFN-γ in cells of nonhematopoietic origin such as endothelia, epithelia, fibroblasts and astrocytes. Bottom)
Various pathogens have developed ways of interfering with the expression of CIITA, often by
attenuating the activation of pIV in response to IFN-γ. Statins have been proposed to interfere
with the activation of pIV by IFN-γ, but this mechanism is controversial (dotted line). Many
tumours tend to lose MHC class II expression as a result of epigenetic silencing of pIII or
pIV. Conversely, certain melanomas, myelomas and gliomas acquire abnormal expression of
MHC class II as a result of the constitutive activation of pIII or pIV.
47
Figure 4. Molecular regulation of pIII and pIV
Top) pIV is activated in response to the classical interferon-γ (IFN-γ) signalling pathway.
Binding of IFN-γ to its receptor induces the activation of Janus kinase 1 (JAK1) and JAK2,
which leads to the phosphorylation, dimerisation and nuclear translocation of signal
transducer and activator of transcription 1 (STAT1). STAT1 binds co-operatively with
upstream stimulatory factor 1 (USF1) to a composite gamma activated sequence (GAS)/E box
motif. STAT1 also activates expression of the gene encoding interferon regulatory factor 1
(IRF1), which then binds together with IRF2 to its cognate IRF binding element (IRF-E) in
pIV. The mechanisms that activate pIV in thymic epithelial cells (TEC) in response to signals
from the thymic microenvironment remain completely unknown, but must be distinct from the
IFN-γ induction pathway. Bottom) Several regulatory elements have been defined in pIII, and
factors capable of recognising these elements have been identified in B and T cells by in vitro
and in vivo binding studies. A member of the cAMP response element binding protein
(CREB)/activating transcription factor (ATF) family binds to the activation response element
2 (ARE-2) in B and T cells. The ARE-1 site is bound by Acute Myeloid Leukaemia 2
(AML2) in B cells and by AML2 and 3 in T cells. The E-box motif and the composite Ets-
48
binding-site/IFN-stimulated-response-element (ISRE) are bound, respectively, by E47, PU.1
and IRF4 in B cells. Silencing of pIII in plasma cells is believed to be mediated by binding of
human positive regulatory domain I-binding factor 1 (PRDI-BFI)/B-lymphocyte-induced
maturation protein 1 (Blimp-1) to a site that coincides with the ISRE. Sites A and B are
potential binding sites for octamer binding factors (Oct) and nuclear factor 1 (NF1). The
human gene contains an additional distal enhancer that is activated by STAT1 in response to
the classical IFN-γ induction pathway. This distal IFN-γ inducible enhancer is not conserved
in the mouse gene.
49
Table 1. CIITA and host-pathogen interactions
Pathogen
Inhibition of CIITA and MHC class II expression
Human immunoHIV Tat protein interferes with the function of CIITA
deficiency virus (HIV) by competing with it for binding to cyclin T1, a subunit
of the transcription elongation factor P-TEFb.
ref.
31,56
Varicella zoster virus
Inhibits IFN-γ-induced CIITA expression by downregulating the expression of STAT1 and JAK2.
57
Human cytomegalovirus
Inhibits IFN-γ-induced CIITA expression at a step
downstream of STAT1 phosphorylation and nuclear
translocation.
58
Inhibits IFN-γ-induced CIITA expression by enhancing
proteasome mediated degradation of JAK1.
59
Human parainfluenza
virus type 3
Inhibits the IFN-γ-induced expression of MHC class II
directly by interfering with the induction of CIITA at a
step downstream of STAT1 activation and indirectly by
inducing IFN-α/β, which targets a step downstream of
CIITA.
60
Chlamydia
Inhibits IFN-γ-induced CIITA expression by inducing
the degradation of USF1.
61
Toxoplasma gondii
Inhibits IFN-γ-induced CIITA expression by an
unknown mechanism.
62
Mycobacterium
tuberculosis
Produces a 19 kDa lipoprotein that inhibits IFN-γ
induced expression of IRF1 and CIITA.
63
Mycobacterium bovis
BCG
Inhibits IFN-γ-induced CIITA expression by a
mechanism that is dependent on the natural resistance
associated macrophage protein 1 (Nramp1) gene.
64
Pathogen
Inhibition of viral products by CIITA
Human immunoCIITA inhibits viral replication by blocking function of
deficiency virus (HIV) the viral transactivator Tat
106
CIITA inhibits viral replication by blocking function of
the viral transactivator Tax-2
107
Human T-cell
leukemia virus type 2
(HTLV-2)
50
Glossary
Microglia: small glial cells distributed throughout the grey and white matter in the central
nervous system. Are monocytes derived cells that invade neural tissue before birth and are
capable of differentiating into macrophages.
pDC: plasmacytoid DC; unique type of DC, also know as interferon producing cells because
they are the major source of type I interferon (IFN-α, IFN-β) during viral infections.
RFX family: family of evolutionarily related DNA binding proteins playing diverse functions
in eukaryotic organisms ranging from yeast to man. There are five family members (RFX1 to
RFX5) in mammals.
General transcription machinery: factors required for the initiation of transcription at all or
most genes transcribed by RNA polymerase II. Include RNA polymerase II itself and a large
number of general transcription factors that assemble at the core promoters of these genes.
Core promoter: DNA sequence that surrounds the transcription initiation site and serves as a
docking site for assembly of the general transcriptional machinery.
Enhancer: composite regulatory region composed of several distinct sequence elements that
are bound by sequence-specific transcription factors acting positively or negatively on
transcription of an adjacent gene.
Chromatin remodelling: alterations induced in the accessibility of DNA in chromatin
through the displacement of nucleosomes by ATP-dependent multi-protein complexes.
BRG1: Brahma related gene 1; ATPase subunit present in some chromatin remodelling
complexes, often referred to as SWI/SNF complexes.
Chromatin modification: alterations induced in the accessibility of DNA in chromatin by
enzymes that modify the extent of acetylation, methylation or other covalent modifications of
histones.
Trophoblast: cells of the outer layer of the mammalian blastocyst that gives rise to the
embryonic portion of the placenta.
T-cell-dependent antigen: antigens for which the production of high affinity antibodies
requires CD4+ T cell help.
Astrocyte: star-shaped glial cells of the central nervous system that form a structural and
functional interface between non-nervous tissues and neurons.
51
EAE: experimental autoimmune encephalomyelitis; an experimental model for multiple
sclerosis that is induced by immunization of susceptible animals with myelin antigens such as
myelin basic protein (MBP), proteolipid protein (PLP) or myelin oligodendrocyte
glycoprotein (MOG).
CIA: collagen-induced arthritis; an experimental model of rheumatoid arthritis that is induced
by immunization of susceptible animals with collagen type II.
Fibrosarcoma: malignant tumour derived from connective tissue fibroblasts.
Glioblastoma: malignant tumour derived from glial cells.
Glomerulonephritis: an inflammation of the kidney glomeruli that may result in destruction
of the glomeruli and renal failure.
Reaggregate thymic organ culture: three dimensional thymus lobe structures formed in cell
culture by the reaggregation of cells in mixtures of purified thymocytes and thymic stromal
cell subsets.
DNA-alkylating agents: anti-cancer drugs that are cytotoxic to rapidly proliferating cells
because they lead to the alkylation of bases in DNA.
Statins: inhibitors of HMG-CoA reductase, an enzyme that catalyzes the conversion of
HMG-CoA to L-mevalonate, are primarily used as cholesterol lowering drugs but also have
immunoregulatory and anti-inflammatory properties. L-mevalonate and its metabolites are
implicated in cholesterol synthesis and other intracellular pathways.
52
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This paper describes the generation of mice lacking pIII and pIV of the C2ta
gene and shows that plasmacytoid dendritic cells differ from all other dendritic
cell subsets with respect to C2ta promoter usage. The results define pI as a
myeloid cell specific promoter and pIII as a lymphoid cell specific promoter.
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This paper describes the generation of mice lacking pIV of the C2ta gene, and
shows that this promoter is essential for driving IFN-γ induced CIITA and
MHC class II expression in non-hematopoietic cells but is dispensable for this
function in macrophages.
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these genes are mutated in Bare Lymphocyte Syndrome patients classified in
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This paper demonstrates that pIII of the human MHC2TA gene can be induced by IFN-
γ via a STAT1 dependent enhancer situated 5 kb upstream.
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This paper reports that a combined gene therapy approach using CIITA, IFN-γ,
Il-2 cDNA and anti-sense Ii plasmids, together with radiotherapy, achieved a
50% cure in a mouse prostate cancer model. Cured animals were moreover
100% resistant to tumour re-challenge.
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64
Acknowledgements
We are grateful to Bernard Mach, in whose laboratory this subject was first initiated, and to
all current and past members of our laboratories, particularly Bénédicte Durand, Michal
Krawczyk, Krzysztof Masternak, Annick Muhlethaler-Mottet, Luc Otten and Viktor Steimle,
who made pivotal contributions to the field. We also thank Hans Acha-Orbea, Adriano
Fontana and Caetano Reis e Sousa for important collaborations. Work in our laboratory was
supported by the Swiss National Science Foundation, the Roche Research Foundation, the
Gabriella Giorgi-Cavaglieri Foundation, the Schmidheiny Foundation, the Swiss Multiple
Sclerosis Society and the National Center of Competence in Research on Neural Plasticity and
Repair.
65
IV. Résultats
Ce travail a fait l’objet de trois publications en anglais qui forment le chapitre des
résultats de cette thèse.
Le premier article décrit la génération de souris génétiquement modifiées par
inactivation génique. Ces souris ont perdu le promoteur IV du gène CIITA. La conséquence
est la perte de l’expression de CIITA dans les cellules qui sont normalement inductibles par
l’IFNγ, mais aussi dans les cTEC. La perte de l’expression de CIITA empêche l’expression
inductible du MHCII. Les cTEC n’expriment plus le MHCII ce qui empêche la sélection
positive des lymphocytes T CD4+.
Le deuxième article est l’analyse détaillée des lymphocytes T CD4+ résiduels dans les
souris délétées pour le promoteur IV du gène CIITA. Malgré le fait que ces souris expriment
normalement le MHCII sur les APC professionnels, le nombre de lymphocytes T CD4+ est
très diminué. Leur phénotype est semblable aux souris complètement déficientes pour le
MHCII. De plus ces souris comprennent une proportion élevée de lymphocytes NKT,
restreints par le CD1.
Dans le troisième article, une deuxième lignée de souris a été génétiquement modifiée
pour n'exprimer CIITA qu'à partir de son promoteur I, suite à la délétion du fragment d'ADN
génomique comprenant les promoteurs III et IV. L'analyse de cette lignée a permis de montrer
qu'en plus de récapituler le phénotype obtenu par la délétion isolée du promoteur IV, la
délétion combinée des deux promoteurs abolissait l'expression du MHCII dans les
lymphocytes B mais aussi dans les cellules dendritiques plasmacytoïdes. Par contre, le
promoteur I étant toujours actif, les macrophages et les cellules dendritiques conventionnelles
expriment toujours CIITA et le MHCII à leur surface.
66
1ère partie: La délétion du promoteur IV du gène CIITA chez la souris abolit l'expression du
MHCII uniquement sur les cellules des tissus extra-hématopoïétiques.
Titre : Selective Abrogation of Major Histocompatibility Complex Class II Expression on
Extrahematopoietic Cells in Mice Lacking Promoter IV of the Class II Transactivator Gene.
Auteurs: Jean-Marc Waldburger, Tobias Suter, Adriano Fontana, Hans Acha-Orbea, and
Walter Reith.
Référence: Journal of Experimental Medicine, Volume 194, Aout 2001, pp 393-406.
67
a. Résumé du 1er article
CIITA est un est co-activateur transcriptionnel hautement spécifique et essentiel à la
transcription des gènes du MHCII. Il est le déterminant principal qui dicte l'expression tissuspécifique et inductible du MHCII. L'expression de CIITA est régulée par au moins 3
promoteurs (pI, PIII, PIV). Des études menées in vitro avec des lignées cellulaires et un
certain nombre de cellules primaires montrent que pI est responsable de l'expression de
CIITA dans les DC. pIII est actif dans les lymphocytes B et pIV est activé par l'IFNγ dans un
grand nombre de types cellulaires. Afin de mieux comprendre les mécanismes responsables
de l'expression de CIITA in vivo, et par conséquent des molécules du MHCII, nous avons
obtenu (par inactivation génique) des souris déficientes pour le pIV de CIITA. La technologie
loxP a permis d'exciser 500 bp contenant le pIV de C2ta. Dans les fibroblastes embryonnaires
(PMEF) préparés à partir de souris pIV-/-, l'expression de CIITA induite par l'IFNγ est
perdue, alors qu'elle est conservée dans les PMEF pIV+/- et +/+. Par contre, le mRNA
transcrit à partir du pIII et du pI est présent dans les lymphocytes B et les DC des souris pIV/-, respectivement, sans diminution par rapport aux contrôles. Comme attendu, l'expression du
MHCII dans les lymphocytes B et les DC est donc normale dans tous les organes examinés
(rate, thymus, ganglions, plaques de Peyer, lamina propria de l'intestin). De plus le pI de
CIITA est induit par l'IFNγ dans les macrophages et la microglie, qui expriment un niveau
normal de CIITA et de molécules du MHCII même en l'absence du pIV. Nous avons ensuite
étendu l'analyse de l'expression de surface du MHCII par cytofluorométrie et histologie aux
tissus qui sont normalement inductible par l'IFNγ. L'expression inductible par l'IFNγ est
perdue dans la souris pIV-/- pour les types cellulaires suivants: PMEF, astrocytes,
endothelium, épithélium bronchique et intestinal, glandes salivaires et intestinales, plèvre,
péritoine. Enfin, de manière surprenante les cTEC perdent l'expression du MHCII. Par
conséquent la sélection positive des lymphocytes T CD4+ est abolie. Les souris pIV-/représentent donc un modèle attractif pour étudier les mécanismes responsables de
l'expression du MHCII et de CIITA dans les cTEC. Ces animaux permettront aussi de mieux
comprendre le rôle de l'expression inductible (appelée aussi ectopique) du MHCII dans des
situations physiopathologiques variées.
68
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2ème partie: Caractérisation du déficit en lymphocytes T CD4+ chez les souris avec une
délétion du promoteur IV du gène CIITA.
Titre: Promoter IV of the class II transactivator gene is essential for positive selection of
CD4+ T cells
Auteurs: Jean-Marc Waldburger, Simona Rossi, Georg A. Hollander, Hans-Reimer
Rodewald, Walter Reith, and Hans Acha-Orbea.
Référence: Blood, Volume 101, May 2003, pp 3550-9
83
a. Résumé du 2ème article
Les lymphocytes T CD4+ sont indispensables à la survie en permettant de générer une
réponse immunitaire lors d'infections provoquées par les bactéries, virus et champignons. La
reconnaissance de ces pathogènes par le récepteur des lymphocytes T CD4+ passe par la
présentation de petits fragments antigéniques (des peptides formés de quelques acides aminés)
qui sont liés à des hétérodimères de molécules du MHCII. La présentation des Ag par le
MHCII est centrale non seulement à la génération de la réponse immunitaire spécifique, mais
aussi au développement des lymphocytes T CD4+, à l'induction de la tolérance immunitaire et
à l'homéostasie des lymphocytes T CD4+. L'expression du MHCII est régulée avant tout au
niveau transcriptionnel par la protéine CIITA. Deux types d'expression doivent être
distingués: l'expression inductible qui est le fait de la plupart des cellules exposées à des
stimulus inflammatoires (par exemple en cas d'induction par l'IFNγ), et l'expression
constitutive qui est restreinte à certains types cellulaires spécialisés (lymphocytes B,
macrophages, DC et cTEC). C'est la régulation de l'expression de CIITA qui permet d'obtenir
cette expression différentielle. L'expression de CIITA est contrôlée au niveau transcriptionnel
par un système constitué de trois promoteurs ayant chacun leur spécificité propre. La
génération de souris knockout pour un de ces promoteurs, pIV, a permis pour la première fois
de confirmer définitivement le rôle physiologique de ces promoteurs tel qu'il avait été supposé
d'après des données dérivées de l'étude de lignées cellulaire in vitro. De plus, une fonction
inattendue du pIV de CIITA est son rôle essentiel dans l'expression du MHCII par les cTEC.
Ceci cause l'abrogation de la sélection positive dans les souris pIV -/-. Ces souris knockout
ont donc très peu de lymphocytes T CD4+, aussi peu que des souris knockout pour le MHCII.
L'étude de souris pIV-/- irradiées et reconstituées avec des cellules souches normales a permis
de confirmer que le défaut de sélection positive était bien provoqué par l'absence de MHCII
dans le cortex thymique. De plus, la sélection négative qui a lieu grâce aux DC de la médulla
du thymus est conservée chez les souris pIV-/-. Les lymphocytes T CD4+ résiduels présents
dans les différents organes lymphoïdes des souris pIV-/- présentent plusieurs similitudes avec
ceux des souris knockout pour le MHCII. Ces lymphocytes T CD4+ présentent un phénotype
activé, et comprennent une proportion élevée de cellules NKT dont une grande partie sont
restreints sur le CD1. Cette caractéristique commune explique que le répertoire Vβ des
lymphocytes CD4 pIV-/- est altéré d'une façon similaire dans le knockout du MHCII.
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3ème partie:
Titre: MHC class II expression is differentially regulated in plasmacytoid and conventional
dendritic cells.
Auteurs: LeibundGut-Landmann S*, Waldburger JM*, Reis e Sousa C, Acha-Orbea H, Reith W.
* equal contribution
Référence: Nature Immunology, volume 5, September 2004, pp. 899-908.
96
a. Résumé du 3ème article
Les cellules dendritiques sont une famille de cellules spécialisées dans la présentation
des antigènes, et qui remplissent des rôles clés dans le système immunitaire: maintien de la
tolérance immunitaire dans le thymus et la périphérie, déclenchement et régulation des
réponses immunitaires adaptatives. Ces fonctions parfois opposées sont accomplies par des
sous-populations de cellules dendritiques qui diffèrent les unes des autres par leurs
caractéristiques génotypiques, phénotypiques et fonctionnelles ainsi que leur localisation
anatomique et leur niveau de différentiation cellulaire. La pierre angulaire de la fonctionalité
des cellules dendritiques réside dans leur capacité d'internalisation et de présentation des
antigènes aux cellules T dans le contexte des molécules de MHCII exprimées à leur surface.
Le transactivateur CIITA contrôle la transcription du MHCII et son expression différentielle
dans la plupart des types cellulaires y compris les cellules dendritiques. CIITA possède un
système de régulation de sa propre expression qui est contrôlée par trois promoteurs conservés
chez l'homme et la souris (pI, pIII et pIV). Les deux articles précédents ont décrit le
phénotype de souris déficientes pour l'expression de CIITA à partir de pIV. Ces études ont
démontrés que pIV est indispensable pour exprimer CIITA et le MHCII dans les cellules
épithéliales du thymus et les cellules non-hématopoïétiques après induction par l'interféron-γ.
Par contre, les souris déficientes pour pIV conservent l'expression de CIITA et du MHCII
dans les cellules dendritiques et les macrophages via pI, et les cellules B via pIII. Pour mieux
définir le rôle respectif de pI et pIII, cet article décrit l'analyse d'une deuxième lignée de
souris qui est déficiente pour l'expression de pIII et pIV. Seule l'expression de CIITA à partir
de pI est intacte dans ces souris. L'étude de cette lignée knockout pour pIII et pIV a permis de
découvrir qu'un sous-type de cellules dendritiques exprime CIITA et le MHCII exclusivement
à partir du pIII. Il s'agit des cellules dendritiques plasmacytoïdes, alors que les cellules
dendritiques d'autres sous-types conservent l'expression de CIITA et du MHCII à partir du pI.
Les cellules dendritiques plasmacytoïdes ont d'autres caractéristiques qui les rattachent à la
famille lymphoïde, ce qui confirme le rôle du pIII comme promoteur de la lignée lymphoïde.
Ce nouveau modèle de souris permettra de mieux définir le rôle des cellules dendritiques
plasmacytoïdes, en particulier leur fonction supposée en tant que cellules présentatrices
d'antigène.
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V. Conclusions et perspectives
Ce travail de thèse décrit la production d'un modèle de souris dans lequel le promoteur
IV de C2ta a été délété par inactivation génique. Chez la souris comme chez l'homme, CIITA
est un régulateur maître de l'expression du MHCII (voir chapitre 3.3.6). Le promoteur IV est
conservé chez l'homme et la souris, tout comme les promoteurs I et III
111;112
. Le rôle du
promoteur II humain n'est pas élucidé pour l'instant.
L'étude des souris dépourvues de promoteur IV a permis de révéler plusieurs aspects de
la régulation de CIITA. Comme attendu, l'expression de CIITA à partir des promoteurs I et III
est intacte. Ceci permet aux lymphocytes B, aux DC, à la microglie et aux macrophages
d'exprimer normalement les molécules du MHCII. Dans ces deux derniers types cellulaires, le
promoteur I est également induit par l'IFNγ, ce qui permet une expression inductible du
MHCII même en l'absence du promoteur IV. Par contre, les cellules qui ne font pas partie du
système hématopoïétique sont entièrement dépendantes du promoteur IV pour exprimer
CIITA, et partant les molécules du MHCII, suite à une induction par l'IFNγ. Enfin,
l'expression constitutive du MHCII par les cTEC est abolie dans les souris pIV-/-, ce qui
empêche la sélection positive des thymocytes T CD4+.
Le premier élément nouveau révélé par les souris pIV-/- concerne l'induction du
promoteur I par l'IFNγ. Jusque là, cette observation n'avait été faite que dans les cellules de la
microglie 113. Elle concerne en fait aussi les macrophages. Aucun élément en cis du promoteur
I ne semble typique pour des facteurs de transcription induits par la voie de signalisation de
l'IFNγ. Des éléments typiques des promoteurs inductibles à l'IFNγ (GAS ou IRF-E par
exemple) pourraient cependant constituer un enhancer situé à distance du promoteur I. Un tel
enhancer pourrait activer le promoteur I après activation par l'IFNγ. Une autre hypothèse
pourrait également expliquer l'induction du promoteur I dans les macrophages et la microglie.
En effet de très nombreux facteurs de transcription sont induits par l'IFNγ dans ces cellules, et
certains d'entre eux pourraient activer le promoteur I. L’induction pourrait donc être indirecte.
L'absence d'expression du MHCII par les cTEC constitue la caractéristique
phénotypique la plus surprenante des souris pIV-/-. Les cTEC MHCII+ sont essentielles à la
sélection positive des lymphocytes T CD4+
106;114
. L'absence d'expression du MHCII par les
cTEC empêche la sélection positive des CD4+ dans les souris déficientes en molécules du
MHCII
115-117
et chez les mutants de RFX5
118
et CIITA
119-121
. Les cTEC des souris pIV-/-
sont également MHCII négatives et les souris pIV-/- présentent le même défaut de sélection
108
positive. Par contre la sélection positive des CD4+ est conservée dans les souris déficientes
pour l'IFNγ ou son récepteur, ce qui implique que les cTEC expriment normalement le MHCII
dans ces animaux
122;123
. Par conséquent, contrairement aux cellules extra-hématopoïétiques
périphériques, l'IFNγ ne joue aucun rôle dans l'activation du promoteur IV dans les cTEC, au
moins in vivo. La situation est cependant très différente in vitro. Les lignées dérivées de cTEC
et cultivées en couches monocellulaires perdent l'expression constitutive du MHCII. Ces
lignées restent capables d'induire le MHCII après exposition à l'IFNγ
108-110
. Il reste à
démontrer que les cTEC en culture monocellulaire utilisent bien le pIV pour induire CIITA.
De façon surprenante, les cTEC maintenues sous forme d'agrégats tridimensionnels (les
RTOC) restent MHCII positives en l'absence d'IFNγ 106. Ce type particulier de culture semble
donc refléter plus fidèlement le thymus in vivo. Même des RTOC préparés sans cellules du
mésenchyme thymique expriment toujours le MHCII sur les cTEC 106. Des thymus cultivés en
présence de déoxyguanosine, un traitement qui élimine les thymocytes, contiennent toujours
des cTEC MHCII positives
124
. Ces expériences suggèrent que le signal responsable de
l'activation du promoteur IV provient vraisemblablement des cTEC elles-mêmes, plutôt que
des thymocytes ou d'autres cellules du mésenchyme thymique. La nature de ce signal pourrait
être un facteur soluble, ou impliquer un contact intercellulaire. Quand les cTEC perdent leur
organisation tri-dimensionnelle ce signal disparaît.
Le gène whn est responsable du phénotype des souris nude qui n'ont pas de thymus 125.
Ces souris dépourvues de lymphocytes T sont utilisées dans de très nombreux modèles
expérimentaux. L'expression du gène whn est connue pour être diminuée dans les cultures
monocouches de cTEC, par rapport aux cTEC isolés ex vivo
107
. Whn est normalement
exprimé dans les cTEC dans les souris de type sauvage 125;126. La protéine whn est un facteur
de transcription qui régule l'expression de plusieurs autres protéines dans les cTEC
127
. La
fonction de plusieurs de ces protéines n'est pas élucidée, et on peut spéculer que certaines
pourraient être impliquées dans l'expression du pIV de CIITA. Il existe une autre possibilité
par laquelle le gène whn pourrait participer à l'expression du pIV de CIITA dans les cTEC.
Whn reconnaît spécifiquement une séquence-cible consensus formée de 11 bp qui doit
contenir la séquence 5'-ACGC
128
. Cette séquence n'est pas retrouvée dans le pIV de CIITA.
Cependant, deux sites de liaison potentiels existent dans le promoteur de IRF-7, entre les sites
IRF-E et sp1 129. Le rôle potentiel de IRF-7 dans l'activation du pIV de CIITA dans les cTEC
est discuté plus bas.
109
D'autres éléments de la machinerie cellulaire sont nécessairement impliqués en amont
de la cascade qui aboutit à l'activation d'un promoteur. Pour le promoteur IV de CIITA, il
s'agissait dans tous les cas connus jusqu'ici de la cascade dépendante de l'IFNγ. Or comme on
l'a déjà souligné cette cytokine n'est pas impliquée dans les cTEC. Il existe de nombreux
modèles de souris déficientes pour un vaste éventail de cytokines (IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, IL15Rβ, etc.) mais aucune n'a permis de démontrer un rôle essentiel pour ces facteurs dans la
130
sélection positive des CD4+
. Il n'est pas exclu cependant que d'autres cytokines puissent
provoquer l'activation du promoteur IV dans les cTEC, ou encore qu'une redondance existe.
Plus bas dans la cascade de signalisation induite par l’IFNγ, les facteurs IRF1, IRF2 et
STAT-1 sont responsables de l'activation de la transcription du promoteur IV en se liant aux
sites IRF-E et GAS
111;131;132
. Or il n'y a pas de déficit dans la sélection des CD4+ chez les
souris déficientes dans chacun de ces trois facteurs
133-135
. Il semble donc exclu qu'un de ces
facteurs soit à lui seul responsable de l'activation du pIV dans les cTEC. L'analyse de double
voire de triple souris knockout pour IRF1, IRF2 et ou STAT-1 permettra peut-être de mettre
en évidence un déficit de l'expression de CIITA.
La famille STAT contient 7 membres, dont les sites de liaison au DNA sont conservés
et reconnaissent des séquences consensus semblables
136;137
. Il est donc théoriquement
possible qu'un autre membre de la famille STAT soit responsable de l'activité du promoteur
IV dans les cTEC. Cependant, les souris déficientes en STAT2
141-143
138
, STAT4
139;140
, et STAT6
ont toutes une sélection normale des CD4+. Il en va de même du double knockout de
STAT5a et STAT5b 144;145. Le knockout de STAT3 produit un phénotype létal au moment de
l'embryogénèse. Cependant, des mutants conditionnels qui ont délétés STAT3 dans la peau et
l'épithélium thymique 146 sont capables d'exprimer le MHCII dans les cTEC 147.
Il est aussi possible que la liaison d’un facteur au site IRF-E seul soit capable d'activer
le promoteur IV
81
. Les membres de la famille IRF (IRF1, IRF2, IRF3, IRF4, IRF5, IRF6,
IRF7, IRF8 ou ICSBP, IRF9 ou p48, ISGF3γ) partagent un site de liaison au DNA conservé et
sont tous théoriquement capables d'activer des promoteurs contenant IRF-E
148
. Aucune des
souris déficientes pour chacun de ces facteurs ne présente de déficit dans la sélection des
lymphocytes CD4+. Il faut cependant relever que le phénotype des mutants pour IRF-7 n'est
pas encore décrit. Il n'est bien sûr pas exclut que plusieurs membres des familles STAT et/ou
IRF soient présents dans les cTEC, et que cette redondance permette d'exprimer CIITA via le
promoteur IV même en l'absence d'un seul des facteurs STAT ou IRF.
110
L'identification des molécules responsables de l'expression du MHCII dans les cTEC,
depuis le signal membranaire jusqu'au facteurs de transcription qui se lient au promoteur IV
de C2ta, s'avère donc une tâche complexe. Une approche possible serait de constituer une
banque de gènes à partir de thymus traités avec de la déoxyguanosine. Une étape de
soustraction génétique à partir de gènes isolés de cultures de cTEC bi-dimensionnelles
permettrait d'enrichir les gènes spécifiques pour les cTEC MHCII+. Les gènes candidats
pourraient ensuite être testés pour leur expression dans les cTEC maintenues en agrégats
tridimensionnels (RTOC), pour leur capacité de se lier aux éléments cis du promoteur IV s'il
s'agit de facteurs de transcription, et enfin pour un effet potentiel sur l’expression de CIITA.
Les souris pIV-/- constituent également un modèle attractif pour étudier le rôle de
l'expression ectopique du MHCII. En effet, le rôle de l'expression inductible du MHCII (par
les cellules ne faisant pas partie du système lymphohématopoïtétique) est beaucoup moins
bien comprise que pour les APC. Chez l'homme et l'animal, elle est par exemple observée
dans des situations infectieuses, inflammatoires, auto-immunes, tumorales ou de rejet de
greffe 70;149-152. Parmi les maladies auto-immunes pour lesquelles une expression ectopique du
MHCII a été documentée, il faut citer la maladie de Basedow, le goitre lymphomateux de
Hashimoto 152;153, la sclérose en plaques et l'encéphalomyélite allergique expérimentale 154-156,
le diabète de type I 157;158, la maladie coeliaque 159;160, l'arthrite rhumatoïde 161;162, les maladies
inflammatoires de l'intestin
interstitielle
163;164
, la cystopathie interstitielle sous-muqueuse
166
165
, la néphrite
167-169
, le purpura thrombocytopénique idiopathique 5, la
, la néphrite lupique
maladie de Berger 170, le vitiligo 171, le lichen planus 172;173, le syndrome de Sjögren 174;175, et
la cirrhose biliaire primitive
176
. Les cellules épithéliales bronchiques des patients
asthmatiques expriment anormalement le MHCII
kératite atopique
177;178
ainsi que la conjonctive dans la
179
. Différents types de tumeurs peuvent également exprimer le MHCII
180;181
. Finalement, lors du rejet de greffe de rein, foie, coeur, et intestin divers types
cellulaires du greffon et de l'hôte se mettent à exprimer le MHCII 150;182-202.
La souris pIV-/- constitue le premier modèle murin dans lequel les APC restent MHCII
positifs tandis que l'expression ectopique ou inductible du MHCII est abolie. De plus il est
vraisemblable que dans la souris pIV-/- la plupart sinon tous les stimuli qui provoquent
l'expression ectopique du MHCII par les cellules extra-hématopoïétiques sont bloqués. Bien
que seul l'effet de l'IFNγ ait été testé jusque là dans les souris pIV-/-, des études sur
l'expression du MHCII par le rein montrent que l'IFNγ et son récepteur sont nécessaires pour
l'induction du MHCII suite à une grande variété de stimuli
203
. Le rôle de l'expression
ectopique du MHCII dans un modèle de pathologie auto-immune du rein a été démontré en
111
utilisant des souris MHCII déficientes, reconstituées avec un thymus et une moelle osseuse de
type sauvage
. Les souris déficientes pour TGFβ1 sont un autre modèle de pathologie
204
autoimmune associé à une expression ectopique généralisée du MHCII
205;206
. Ces animaux
meurent spontanément d’un syndrome inflammatoire généralisé, associé de plus à des
marqueurs biologiques typiques des pathologies auto-immunes
207;208
. Le syndrome auto-
immunitaire dont souffrent les souris TGFβ1 est aboli par l’absence de MHCII 209. Cependant,
les lymphocytes sont également essentiels dans l’apparition du phénotype des souris TGFβ1 /-
210
. Le rôle respectif des lymphocytes T CD4+ et CD8+ n’est pas encore élucidé
209;211
. Il
sera intéressant d’examiner l’impact de l’absence sélective de l’expression inductible du
MHCII, en croisant les souris pIV-/- avec le knockout du TGFβ1. En parallèle il sera possible
de reconstituer le compartiment CD4+ de ces animaux. Des greffes de thymus pourraient être
utilisées. Une autre possibilité pourrait consister à croiser les souris pIV-/- avec des souris qui
expriment CIITA sous le contrôle d'un promoteur spécifique au thymus (par exemple K5 ou
K14 52), de façon à reconstituer une expression du MHCII normale dans les cTEC.
Le rôle prédominant du promoteur IV de CIITA dans la sélection positive des
lymphocytes T CD4+ chez la souris a peut-être également des conséquences en
physiopathologie humaine. Les patients souffrant du BLS, y compris ceux appartenant au
groupe de complémentation A (déficient en CIITA) ont également une réduction de leur
nombre de lymphocytes T CD4+, bien qu'elle soit moins marquée que chez la souris pIV-/72;212;213
. Ceci suggère que les cTEC humaines aient également besoin de CIITA pour
exprimer le MHCII et effectuer la sélection positive des lymphocytes T CD4+. Le système
des promoteurs de CIITA est utilisé dans toutes les lignées de cellules humaines qui ont été
testées jusqu'ici. Chez l'homme, l'importance de leur fonction in vivo est soulignée par une
étude récente qui révèle l'absence de polymorphismes dans chacun des trois promoteurs
analysés 214. Il y aurait donc une pression de sélection qui maintiendrait les séquences de ces
promoteurs invariantes d'un individu à l'autre. La séquence excisée dans la souris pIV-/- est
très courte et a été choisie en fonction de sa très haute analogie avec la séquence humaine.
Des mutations de quelques bp dans le promoteur IV suffisent à rendre ce promoteur non
fonctionnel in vitro 111. Des mutations du pIV pourraient donc exister et provoquer un défaut
de sélection aussi chez l'homme. Plusieurs syndromes héréditaires humains sont associés avec
une diminution des lymphocytes T CD4+. Par exemple, l'hypogammaglobulinémie à
expression variable est une maladie dont l'étiologie n'est pas clairement établie
215
. Les
patients qui en sont atteints souffrent d'une diminution des IgG et dans 30% des cas d'un
112
rapport CD4/CD8 diminué. Il sera donc intéressant de rechercher d'éventuelles mutations du
pIV de CIITA chez ces patients. Deux cas de lymphopénie héréditaire en CD4+ avec des IgG
normales sont également publiés dans la littérature 216. Il est intéressant de noter que ces deux
patients souffraient de verrues généralisées, ce qui rappelle un autre syndrome héréditaire,
l'epidermodysplasia verruciformis. Bizarrement, ce troisième syndrome est également souvent
associé à une lymphopénie en CD4+, et les patients qui en souffrent sont aussi victimes
d'autres infections opportunistes caractéristiques du manque de CD4+
217
. L'analyse du
promoteur IV dans ces différentes situations permettra peut-être de mettre à jour une étiologie
génétique chez certains de ces malades.
113
VI. Annexes
1. Abréviations
Les abréviations les plus couramment utilisées dans la littérature anglaise sont indiquées.
Elles n'ont pas été traduites dans le texte mais la traduction française est indiquée entre
parenthèses dans la liste ci-dessous.
Ab, antibody (anticorps)
Ag, antigen (antigène)
APC, antigen-presenting cell (cellule présentant l'antigène)
ATP, adenosine triphosphate (et autres nucléotides: ADP, AMP, CTP, UDP, etc.)
bp, basepair (paire de base)
BSA, bovine serum albumin (albumine de sérum bovin)
cM, centimorgan
chr., chromosome
CLIP, class II associated Ii chain peptide (peptide dérivé de la chaîne Ii, associé au MHCII)
CNS, central nervous system (système nerveux central)
cTEC, cortical thymic epithelial cells (cellules épithéliales du cortex du thymus)
DC, dendritic cells (cellules dendritiques)
DN, double négatifs (thymocytes CD4- CD8-)
DNA, Deoxyribuonucleic acid (acide déoxyribonucléique)
DNase, deoxyribonuclease
DP, double positifs (thymocytes CD4+ CD8+)
EDTA, ethylenediaminetetraacetic acid
ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay
FACS®, fluorescence-activated cell sorter (appareil de cytofluorométrie de flux)
CIITA, Class II TransActivator protein
FITC, fluorescein isothiocyanate
GM-CSF, granulocyte/macrophage colony-stimulating factor
Hepes, N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethane sulfonic acid
HLA, human histocompatibility leukocyte antigens
IFNγ, interferon gamma
IFNα, interferon alpha
114
IFNβ, interferon beta
Ig, immunoglobulin
IL, interleukin (e.g., IL-2)
i.m., intramuscular (par voie intra-musculaire)
i.p., intraperitoneal (par voie intra-péritonéale)
i.v., intravenous (par voie intraveineuse)
kb, kilobase
LN, lymph node (ganglion lymphatique)
MALT, mucosal associated lymphoid tissue (système immunitaire commun aux muqueuses)
mAb, monoclonal antibody (anticorps monoclonal)
MHC, major histocompatability complex (complexe majeur d'histocompatibilité)
MHCI, complexe majeur d'histocompatibilité de classe I
MHCII, complexe majeur d'histocompatibilité de classe II
C2ta gène murin codant pour CIITA
MHC2TA gène humain codant pour CIITA
mRNA, messenger ribonucleic acid (acide ribonucléique messager)
ND, not determined (pas de données)
NK cell, natural killer cell (cellule tueuse naturelle)
NKT cell, natural killer T lymphocyte (cellule tueuse naturelle de type T)
OD, optical density (densité optique)
ORF, open reading frame (cadre de lecture ouvert)
PBL, peripheral blood lymphocyte (lymphocyte du sang périphérique)
PBMC, peripheral blood mononuclear cell (cellule mononucléée du sang périphérique)
PBS, phosphate-buffered saline (solution saline tamponnée au phosphate)
PCR, polymerase chain reaction
PE, phycoerythrin
pI, pIII, pIV promoteur I, III, IV de CIITA
PMEF, primary murine embryonic fibroblasts (fibroblastes murins dérivés d'embryons)
PMN, polymorphonuclear leukocyte (lymphocyte polymorphonucléaire)
r, recombinant (e.g., rIFN-gamma)
R, receptor (e.g, IL-2R)
RBC, red blood cell (érythrocyte)
RFX5, RFX-ANK, RFX-AP Regulatory Factor X 5, Ankyrin, Associated Protein
115
RNA, ribonucleic acid (acide ribonucléique)
RNase, ribonuclease
RTOC, reaggregate thymus organ cultures (culture de thymus en agrégats)
SCID, severe combined immunodeficiency (déficit immunitaire combiné sévère)
SD, standard deviation (écart-type)
SP, simple positifs (thymocytes CD4+ CD8- ou CD4- CD8+)
TCR, T cell receptor for antigen (récepteur des lymphocytes T)
TNFα, tumor necrosis factor alpha
TGFβ, transforming growth factor beta
116
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