Action de la vitamine et de Fantivitamine B6 sur le myocarde d

/ . Embryol. cxp. Morph., Vol. 14, Part 1. pp. 53-61, August 1965
Printed in Great Britain
Action de la vitamine et de Fantivitamine B6 sur le
myocarde d'embryon de poulet cultive in vitro
par
G. CONTI et G.
MILIO1
Institut d'Histologie et d'Embryologie generate de VUniversite de Fribourg (Suisse)
AVEC TROIS PLANCHES
N o u s avons essaye les effets de la vitamine (PX) et de l'antivitamine B 6 (DPX)
sur des organes d'embryons de poulet cultives in vitro; et cela dans le but de voir
si Faction inhibitrice de la DPX se manifestait sur la croissance in vitro des
organes et si cette action inhibitrice eventuelle pouvait etre annulee, ou du moins
partiellement empechee, par l'adjonction simultanee de la vitamine B 6 au milieu
de culture.
On a realise 512 explants de coeur d'embryons de poulet de 9 jours; le materiel
a explanter a toujours ete preleve sur le ventricule gauche. Les explants ont ete
cultives sur le milieu de culture mis au point par Wolff et Haffen en 1952 (milieu
standard). La DPX et la PX ont ete dissoutes dans du liquide de Tyrode et
ajoutees a differentes doses au milieu de culture. Les cultures ont ete maintenues
a l'etuve, a 38° C , et controlees tous les jours au stereomicroscope.
Les experiences ont ete divisees en 16 series dont chacune comportait 32
explants. Ceux-ci ont ete fixes dans du liquide de Bouin et colores a Fhematoxyline-eosine. Les cultures destinees a l'etude de la reaction de la phosphatase
alcaline ont ete traitees selon la methode de Gomori.
Le schema complet du traitement est presente dans le Tableau 1.
RESULTATS
Etude morphologique
Structure normale du myocarde
Le coeur non cultive d'embryons de poulet de 9 et 13 jours (Planche 1, Fig. A)
montre des elements musculaires qui, selon l'orientation de la coupe, se presentent
comme des elements ronds et d'aspect epithelial, ou bien comme des elements
allonges au sein desquels on peut parfois voir des myofibrilles paralleles; par
1
Adresse des auteurs: Institut d'Histologie et d'Embryologie generate, Universite de
Fribourg, Fribourg, Suisse.
54
G. CONTI et G. MILIO
places, les myoblastes ressemblent encore, par leur aspect fusiforme, a des
elements conjonctifs. Les cellules en division mitotique sont toujours assez
nombreuses; la vascularisation est abondante. On ne reconnait pas, a cet age,
l'aspect anastomose syncytial. Entre l'age de 9 et 13 jours, on ne remarque pas
de difference sensible de structure.
rABLEAUr 1
rie 1 (controles) 32 explants cultives sur milieu standard
„ 2 (traites)
DPX 40 y par explant
,, 3
, 80y ,
„ 4
, 120y ,
» 5
, 160y ,
P X 2,5y ,
„ 6
,
5y ,
„ 7
„ 8
,
,
10y ,
, 20y ,
,, 9
„ io
, 40y ,
80 y ,
„ 11
, 120y ,
,, 12
, 160y ,
„ 13
DPX-PX 1:1 (DPX: 160 y-PX: 160 y)
„ 14
DPX-PX 1:10 (DPX: 160 y-PX: 16 y)
„ 15
DPX-PX 1:100 (DPX: 160y-PX: l,6y)
„ 16
,
Cultures de coeur sur le milieu standard
Sur le milieu standard, les fragments de myocarde vivent tres bien; meme
apres 4 jours de culture (Pianche i, Fig. B), l'aspect des cellules est parfaitement
conserve et les explants continuent a battre. Mais les elements cellulaires se
dedifferencient notablement en culture: ils prennent peu a peu un aspect fibrocytaire ou epithelioide, en perdant la morphologie d'elements allonges qu'ils
avaient au moment de Pexplantation. La periode la plus delicate pour les explants
se situe au premier jour: les mitoses cessent presque completement et, par-ci,
par-la, on voit quelques signes de souffrance cellulaire; apres cette periode
initiale d'adaptation, le coeur reprend pleinement sa vitalite et Ton n'observe
jamais de signes de degenerescence. Par rapport au coeur non cultive, les mitoses
sont en nombre sensiblement inferieur.
Cultures de coeur sur le milieu standard avec DPX
La dose de 40 y de DPX (Pianche 1, Fig. C) n'exerce aucune influence defavorable sur les cultures de coeur; parfois, on a seulement l'impression que la
dedifferenciation cellulaire est encore plus marquee par rapport aux cultures
standard.
La dose de 80 y commence a reveler des proprietes legerement toxiques: dans
les cultures de 3 ou 4 jours, on peut voir des elements presentant des signes
evidents de souffrance cytoplasmique (cytoplasme pulverulent ou fortement
eosinophile); mais ces elements restent toujours en nombre limite.
Les explants traites avec 120 y de DPX presentent, a parti r du troisieme et du
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Vol. 14, Part 1
t
A
H
EXPLICATIONS DES PLANCHES
PLANCHE 1
Coeur d'embryons de poulet de controle, non cultive et cultive sur milieu standard; cultive sur
milieu standard avec DPX, PX et avec DPX-PX associees.
FIG. A. Coeur d'embryon de 13 jours, non cultive. HE, 200 x .
FIG. B. Coeur d'embryon de 9 jours, cultive sur milieu standard pendant 4 jours. L'image est
tres semblable a celle du coeur d'un embryon de 13 jours. HE, 200 x .
FIG. C. Coeur d'embryon de 9 jours cultive pendant 4 jours sur milieu standard avec 40 y de
DPX. HE, 300 x .
FIG. D. Coeur d'embryon de 9 jours cultive pendant 4 jours sur milieu standard avec 160 y de
DPX. HE, 300 x.
FIG. E. Coeur d'embryon de 9 jours cultive pendant 4 jours sur milieu standard avec 40 y de
PX. HE, 350 x.
FIG. F. Coeur d'embryon de 9 jours cultive pendant 2 jours sur milieu standard avec 160 y de
PX. HE, 500 x.
FIG. G. Culture de 96 hr. DPX-PX 160 y aa. HE, 300 x .
FIG. H. Culture de 96 hr. DPX 160 y-PX 16 y. HE, 300 x .
G. CONTI et G. MILIO
{Facing page 55)
Action de Vantivitamine B$ sur le myocarde d'embryon
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quatrieme jour de culture, des signes importants de degenerescence pulverulente
ou lipidique.
La dose de 160 y montre des effets toxiques encore plus marques: en effet, les
signes de degenerescence et de necrose augmentent parallelement a la duree de
la culture et atteignent le maximum vers le quatrieme jour (Planche 1, Fig. D).
Cultures de coeur sur le milieu standard avec PX
Avec la PX, nous avons du employer des dosages plus bas qu'avec la DPX
car nos premiers essais, avec 80 et 160 y, nous avaient montre que la PX a une
action toxique, pour les explants, nettement plus elevee que celle de la DPX aux
memes doses. Les doses de 2,5, 5 et 10 y sont bien tolerees par les explants.
Mais si Ton compare ces cultures agees de 4 jours avec les cultures analogues de
myocarde cultivees sur le milieu standard, on voit clairement que, sur le milieu
standard, les explants de coeur presentent une image nettement meilleure. Les
doses plus fortes (Planche 1, Figs. E & F), et cela deja a partir de 20 y, montrent
un effet toxique qui ne permet en aucune maniere la survie des explants.
En definitive, ces experiences nous montrent que la vitamine B 6 est beaucoup
moins bien toleree par les explants de coeur que l'antivitamine, aux doses
correspondantes.
Cultures de coeur sur milieu standard avec DPX-PX associees
Le but principal de ce groupe d'experiences etait de savoir si la dose nettement
toxique de DPX, c'est-a-dire la plus elevee que nous avions employee (160 y)
pouvait etre neutralised par des doses adequates de vitamine. A cet effet, nous
avons associe 160 y de DPX avec 160 y de PX (rapport 1:1); dans d'autres series
d'experiences, 160 y avec 16 y de PX (rapport 1:10) et dans d'autres enfin, avec
1,6 y de PX (rapport 1:100). Les resultats sont les suivants:
a. Rapport 1:1 {DPX 160 y + PX 160 y): L'association des deux substances a
ces doses elevees n'a fait qu'augmenter leur pouvoir toxique (Planche 1, Fig. G):
toutes les cultures, apres 2, 3 ou 4 jours, etaient presque totalement necrosees.
b. Rapport 1:10 {DPX 160 y + PX 16 y): L'image microscopique du myocarde
apres 24 heures de culture parait nettement meilleure que celle du myocarde
traite avec les deux substances separement (Planche 1, Fig. C & F.). Apres 2-3
jours, les explants sont encore discretement conserves et ils montrent une pulsation rythmique en culture; apres 4 jours, le coeur, tres dedifferencie, se presente
encore en etat passable de conservation, malgre que les signes de degenerescence
lipidique soient augmentes (Planche 1, Fig. H).
c. Rapport 1:100 {DPX 160 y + PX 1,6 y): Les explants cultives jusqu'au
quatrieme jour ne montrent pas de difference sensible par rapport a ceux du
groupe precedent.
Les resultats obtenus en ajoutant simultanement les deux substances au
milieu de culture permettent de ne resoudre que partiellement le probleme que
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G. CONTI et G. MILIO
nous nous etions pose au debut de ces recherches, a savoir si la vitamine a la
propriete d'annuler, sur le coeur en culture, les effets toxiques de l'antivitamine.
L'adjonction de la vitamine a doses egales a la DPX ne fait qu'augmenter la
toxicite se manifestant par une necrose totale des explants a partir du deuxieme
jour. L'adjonction de la vitamine a 1'antivitamine a des doses sensiblement
inferieures (16 et 1,6 y) attenue sans doute 1'erTet toxique, sans toutefois le faire
totalement disparaitre. Bien entendu, il est difficile, voire meme impossible, en
se basant sur les simples resultats offerts par la culture d'organes, d'arriver a une
conclusion precise. La seule donnee valable que Ton peut tirer de nos experiences
est la suivante: chacune des deux substances a, en culture d'organes, et a certaines
doses, un effet deletere sur les explants de coeur d'embryon de poulet. Nous
n'avons jamais pu, par les doses que nous avons employees, faire disparaitre
totalement ces effets toxiques.
Etude histochimique: la phosphatase alcaline
Nous avons etudie le comportement de la phospho-monoesterase alcaline sur
le coeur non cultive, sur le coeur cultive sur milieu standard seul ou avec adjonction de DPX, de PX ou de DPX-PX associees. Les resultats sont les suivants:
V activite phosphatasique alcaline du myocarde d'embryons depoulet de 9 et 13 jours
Sur le myocarde de 9 jours, la reaction se manifeste deja apres 15 minutes
d'incubation, bien que de facon tres faible et discontinue; une heure apres, la
positivite augmente d'intensite et, apres 2 heures, elle devient encore plus marquee. La reaction se stabilise d'une maniere definitive apres environ 4 heures
d'incubation. Les elements qui ne presentent pas de reaction positive a cette
periode restent negatifs meme apres 24 heures (temps d'incubation le plus long
que nous ayons employe). La reaction est surtout positive dans le noyau intercynetique: le ou les deux nucleoles apparaissent comme des plages tres noires,
ce qui demontre une forte activite enzymatique; les grains de chromatine,
disperses dans le noyau, sont brun-noir, bien definis mais moins positifs que les
nucleoles. La membrane nucleaire et le sue ne sont pas visibles. Les cytoplasmes
sont negatifs. La reaction est egalement positive dans la paroi des petits vaisseaux.
Les images observees dans le myocarde d'embryons ages de 13 jours (Planche 2,
Figs. A et B) sont essentiellement les memes.
Cultures de coeur sur le milieu standard
Sur les explants cultives, il n'a pas ete possible d'avoir un nombre sufnsant
de coupes permettant de realiser la reaction a des temps echelonnes. Nous avons
par consequent choisi la periode d'incubation qui permettait d'observer des
images de reaction nette: cette periode a ete de 12 hr. d'incubation.
Seuls les explants cultives pendant 24 hr. (Planche 2, Fig. C) rappellent quelque
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Vol. 14. Part I
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PLANCHE 2
Activite de la phosphatase alcaline du coeur d'embryon de poulet de controle non cultive et
cultive sur milieu standard et sur milieu standard avec DPX.
FIG. A. Coeur d'embryon de 13 jours, non cultive. 150 x .
FIG. B. Detail de la figure precedente. 300 x .
FIG. C. Coeur d'embryon de 9 jours, cultive sur milieu standard pendant 24 hr. 150 x .
FIG. D. Coeur d'embryon de 9 jours cultive sur milieu standard pendant 48 hr. 150 x .
FIG. E. Coeur d'embryon de 9 jours cultive sur milieu standard pendant 4 jours. 150x .
FIG. F. Culture de 3 jours avec 40 y de DPX. 255 x .
FIG. G. Culture de 3 jours avec 80 y de DPX. 255 x .
FIG. H. Culture de 3 jours avec 120 y de DPX. 255 x .
FIG. I. Culture de 4 jours avec 160 y de DPX. 255 x .
G. CONTl et G. MILIO
{Facing page 56)
Action de Vantivitamine B$ sur le myocarde d'embryon
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peu les images du myocarde non cultive; mais la reaction est nettement moins
intense, elle ne porte pas sur la totalite des elements, et est specialement visible au
centre de l'explant. Apres 24 hr. de culture, la positivite de la reaction se ralentit
graduellement pour disparaitre completement au cours du troisieme et du
quatrieme jour (Planche 2, Figs. D et E).
Cultures de coeur sur le milieu standard avec DPX
a. Cultures avec 40 et 80 y de DPX: Au cours des deux premiers jours, la
reaction est a peine accusee et uniquement dans un nombre restreint d'elements
cellulaires dont les noyaux sont positifs. Au cours du troisieme jour (Planche 2,
Figs. F et G), la reaction parait plus nette: non seulement les nucleoles sont
nettement positifs, mais les cellules endotheliales des vaisseaux sanguins le
deviennent aussi. Vers le quatrieme jour de culture, la reaction devient negative.
Dans l'ensemble, l'adjonction de telles doses de DPX ne fait pas varier le comportement de l'explant par rapport a celui observe sur le milieu standard.
b. Cultures avec 120 y de DPX: Apres 1 et 2 jours de culture, la reaction est
nettement positive dans le meme nombre limite d'elements cellulaires que nous
avions observe avec les doses inferieures. Toutefois, la reaction positive est bien
differente de celle que nous avions observee sur le coeur non cultive: en effet, la
ou la reaction est positive, les noyaux semblent noircis en forme diffuse et laissent
reconnaitre les nucleoles avec difficulte. Apres 3 et 4 jours (Planche 2, Fig. H),
la reaction est presque totalement negative.
c. Cultures avec 160 y de DPX: Sur les 16 explants cultives, nous n'avons
constate que deux cas ou la reaction etait un peu positive (Planche 2, Fig. I);
dans tous les autres cas, la reaction etait totalement negative.
En definitive, nous avons l'impression que la DPX, ajoutee au milieu standard,
ne fait pas varier sensiblement la reaction par rapport a ce que Ton observe chez
les explants cultives sur le milieu standard. D'autre part, si Ton compare la
positivite des explants cultives sur le milieu standard avec ou sans DPX et la
reaction presentee par les coeurs non cultives, il apparait clairement que le
myocarde cultive presente une reaction beaucoup plus faible des le debut et
que celle-ci disparait completement au cours du troisieme et du quatrieme jour
de culture. II semble par consequent que le biochimisme de la cellule myocardique
en culture est bien different de l'activite biochimique et enzymatique in vivo.
Dans tous les cas, nous n'avons jamais pu observer chez les explants cultives
des images positives tout aussi nettes et demonstratives que dans le myocarde
non cultive.
Cultures de coeur sur le milieu standard avec PX
a. Cultures avec 2,5 et 5 y de PX: La reaction de la phosphatase alcaline est
toujours faiblement positive et porte sur les noyaux des cellules; le cytoplasme
reste negatif.
58
G. CONTI et G. MILIO
b. Cultures avec 10 y de PX: La reaction reste positive pendant les 4 jours de
culture; bien entendu, la reaction n'est pas toujours aussi belle que sur les coupes
de coeur non cultive; elle interesse seulement certaines zones de l'explant et non
la totalite des elements (Planche 3, Fig. A). Dans tous les cas, la donnee qui semble
la plus importante est la suivante: apres 4 jours de culture, l'explant se trouve
en phase avancee de degenerescence et de necrose; les elements degeneres et
necroses ne sont pas positifs, mais les cellules se trouvant encore en discrete
condition de vie, presentent une reaction positive.
c. Cultures avec 20 y de PX: Le traitement avec une dose double fait ressortir
des images superposables a celles que nous avons observees avec la dose de
10 y: la reaction reste positive, meme apres 4 jours de culture, uniquement dans
les elements se trouvant encore en bon etat de conservation (Planche 3, Fig. B).
d. Cultures avec 40 et 80 y de PX: Parallelement a Paugmentation des
phenomenes degeneratifs et necrotiques provoques par ces doses de vitamine, la
positivite de la reaction se ralentit graduellement; mais elle ne disparait jamais
totalement et persiste encore au quatrieme jour de culture, au moins dans les
elements cellulaires discretement conserves (Planche 3, Fig. C).
e. Cultures avec 120 et 160 y de PX: Les images restent a peu pres les memes et
confirment ce que Ton a vu precedemment, a savoir que la reaction reste positive
jusqu'au quatrieme jour dans les elements encore discretement conserves (Planche
3, Figs. D et E).
En definitive, ces experiences faites avec differentes doses de vitamine B 6
demontrent que celle-ci est, a partir de certaines doses, assez et parfois meme
tres toxique pour les cultures de myocarde. Toutefois, la vitamine a la propriete
de rendre plus evidente l'activite phosphatasique des elements cellulaires. La
preuve en est que la reaction est toujours nettement plus positive dans ces cultures
que dans les cultures de controle sur milieu standard, meme apres 4 jours de
culture et m6me avec des doses qui sont toujours hautement toxiques.
Cultures de coeur sur milieu standard avec DPX-PX associees
a. Rapport 1:1 (DPX160 y + PX 160 y): La reaction est positive apres 24 hr.
de culture; les jours suivants, elle est presque totalement negative; ce fait est en
rapport avec les phenomenes tres prononces de necrose provoques par ces doses
tres elevees (Planche 3, Figs. F, G, H et I).
b. Rapport 1:10 {DPX 160 y + PX 16 y): La reaction est assez positive apres
1 jour de culture, beaucoup plus au cours du deuxieme jour et totalement negative
le troisieme et le quatrieme jour. En comparant ces images avec les images
obtenues avec la PX, il semble que cette derniere, seule, a un effet meilleur sur
les cultures que lorsqu'elle est associee a la DPX: on devrait par consequent
conclure que l'action favorable de la PX sur la reaction phosphatasique est
totalement annulee par la forte dose de DPX.
c. Rapport 1:100 (DPX 160 y + PX 1,6 y): Les images sont a peu pres les
memes que celles decrites sous b. La reaction est discretement positive le premier
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Vol. 14, Part I
7./
H
-
•
I
PLANCHE 3
Activite de la phosphatase alcaline du coeur d'embryon de poulet de 9 jours cultive sur le
milieu standard avec PX et avec DPX-PX associees.
FIG. A. Culture de 4 jours avec 10 ydePX. 300 x.
FIG. B. Culture de 4 jours avec 20 y de PX. 300 x .
FIG. C. Culture de 4 jours avec 80 y de PX. 300 x .
FIG. D. Culture de 4 jours avec 120 y de PX. 150 x .
FIG. E. Culture de 4 jours avec 160 y de PX. 150 x .
FIG. F. Culture de 24 hr. avec DPX-PX 1:1, 400 x .
FIG. G. Culture de 2 jours avec DPX-PX 1:1, 400 x .
FIG. H. Culture de 3 jours avec DPX-PX 1:1, 400 x .
FIG. I. Culture de 4 jours avec DPX-PX 1:1, 400 x .
Le comportement de la reaction de la phosphatase alcaline sous l'action combinee des deux
substances est tres semblable au comportement de la reaction du coeur cultive sur milieu
standard.
G. CONTI et G. MILIO
{Facing page 58)
Action de Vantivitamine B$ sur le myocarde d'embryon
59
jour, presque negative le deuxieme et totalement negative le troisieme et le
quatrieme jour.
CONCLUSIONS
Les resultats de nos recherches permettent de tirer les conclusions suivantes:
(a) Le coeur vit assez bien, en culture organo-typique, jusqu'a une periode de
4 jours (limite de nos observations). On remarque toujours un certain degre de
dedifferenciation cellulaire, mais la structure de l'organe persiste. Les mitoses
sont assez nombreuses.
(b) L'adjonction de DPX au milieu de culture est bien toleree par les explants
jusqu'a la dose de 80 y. La dose de 120 y provoque des phenomenes degeneratifs
qui se rendent particulierement evidents a partir du troisieme jour de culture. La
dose de 160 y est nettement toxique des les premieres 24 hr. de culture et les
phenomenes de degenerescence et de necrose sont toujours tres importants.
(c) L'adjonction au milieu de culture de PX a des doses correspondantes a
celles de DPX est beaucoup moins bien toleree par les explants de myocarde.
Pour obtenir une bonne survie des fragments explantes, il faut que la dose de PX
ne depasse pas 10 y par saliere; d'ailleurs cette dose, deja, commence a reveler
des effets nuisibles. Meme avec des doses de 5 et 2,5 y, la morphologie du coeur
cultive ne se presente pas aussi belle que sur les cultures de controle bien que, a
ces doses, les phenomenes degeneratifs soient presque absents.
(d) L'adjonction de DPX et de PX associees, a fourni des resultats qui etaient
differents selon les concentrations employees. En aucun cas, les images du
myocarde cultive ne sont aussi belles que sur les cultures de controle. Le rapport
1:10 a fourni des cultures meilleures que les rapports 1:1 et 1:100. Cela nous
montre vraisemblablement qu'aucun des trois rapports utilises ne represente le
rapport optimal de neutralisation et que, dans le milieu de culture, il reste sans
doute une fraction libre de l'une ou l'autre des deux substances qui manifeste
son action toxique sur les explants.
(e) La reaction de la phosphatase alcaline dans le myocarde en culture parait
moins prononcee que dans le myocarde non cultive; de plus, elle montre la
tendance a disparaitre assez rapidement pendant la periode de culture. L'adjonction au milieu de culture de doses meme elevees de DPX, ne provoque pas
de variation sensible du comportement de la reaction. Par contre, l'adjonction
de PX au milieu de culture semble prolonger, durant la periode de culture, la
persistance de la reaction de la phosphatase dans le myocarde. Avec l'adjonction
simultanee de DPX et de PX dans differents rapports, on peut observer un comportement qui se rapproche davantage du comportement de la reaction de la
phosphatase observe sur les fragments cultives sur milieu standard et sur les
fragments traites avec la DPX: la reaction est toujours negative au cours du
troisieme et du quatrieme jour de culture, ce qui nous autorise a conclure que
l'action favorable de la PX sur la reaction phosphatasique est totalement annulee
par la forte dose de DPX.
60
G. CONTI et G. MILIO
RESUME
L'action de la vitamine et de l'antivitamine Bg sur des explants de myocarde
d'embryons de poulet peut se resumer de la maniere suivante.
1. L'antivitamine est assez bien toleree par les explants jusqu'a la dose de
80 y; des doses plus elevees sont nettement toxiques.
2. La vitamine B 6 est beaucoup moins bien toleree par les explants que les
doses correspondantes d'antivitamine.
3. L'association des deux substances ne fait jamais disparaitre les effets
toxiques que chacune des deux substances provoque separement.
4. La reaction de la phosphatase alcaline dans le myocarde cultive en presence
d'antivitamine ne montre pas de variations sensibles par rapport a celle du
myocarde cultive sur le milieu standard. Par contre, l'adjonction de vitamine
au milieu semble prolonger, durant la periode de culture, la persistance de la
reaction enzymatique.
SUMMARY
The action of vitamin B6, and its antivitamin on the myocardium of the fowl embryo
cultured in vitro
The action of vitamin B 6 and of its antivitamin on explants of fowl embryo
myocardium can be summarized as follows.
1. The antivitamin has little effect on explants in doses of up to 80 y; higher
doses are clearly toxic.
2. Vitamin B 6 is much less well tolerated by explants than corresponding doses
of the antivitamin.
3. Joint administration of the two substances does not ameliorate the toxic
effects that each exercises separately.
4. Alkaline phosphatase activity in the myocardia cultured in the presence of
the antivitamin does not differ from that of cultures on standard media. On the
other hand, the addition of the vitamin to the medium prolongs the period during
which high levels of enzyme activity can be demonstrated.
REMERCIEMENTS
Ces recherches ont ete faites grace a un subside du Fonds national suisse de la recherche
scientifique et de la Fondation E. Barell.
Nous remercions le departement des recherches medicates de la Hoffmann-La Roche SA,
Bale, qui nous a fourni les substances utilisees au cours de nos recherches.
BIBLIOGRAPHIE
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{Manuscrit regu le 8 Fevrier 1965)