Méthodes d`études de la dynamique dans la cellule par - gdr-Miv

Méthodesd’étudesdeladynamiquedans
lacelluleparphoto‐conversionouFRAP:
avantagesetlimites
XavierBaudin
Sophie Abélanet
MiFoBio 2016
Atelier«maitrise»

ContextebiologiqueduTP:β‐caténine
Β‐Caténine (90KDa autour 130 avec la GFP) :
•régulation et coordination des adhésions cellules à cellules via complexe avec E‐
Cadhérine localisé à la membrane plasmique. Régulation interaction des molécules
de jonctions avec l’actine du cytosquelette.
•Composant essentiel dans la cascade de signalisation Wnt = Activation des gènes
de transcription responsable de la prolifération et différentiation cellulaire
Membraneplasmique
Cytoplasme
Noyau
β‐Caténine
β‐Caténine
β‐Caténine
E‐Cadhérine
α‐Caténine
Filaments
Actine
BCL9
TCF1
Wnt gènescibles
Adhésion
CellulesàCellules
Jonctions
Cytosquelette
Dégradation
Proliférationet
différenciation
cellulaire

β‐caténine :Etudedynamique/synthèse/dégradation
Objectif:visualisationdynamique
Choixdel’approche
Photo‐conversion
•Etudedynamiquedesuivide
Fluorescencesurdeszoneslocales
(mesuredestOUT)
•Etudedégradationsurcellule
entièrementphotoconvertie
•Etuderelocalisationenprésence
dedroguesavecconversionsur
zonelocale
FRAP
•Etudedynamiquedesuivide
recouvrementFluorescencesur
deszoneslocales(mesuredestIN)
•Etudedesynthèseprotéique
compareleseffetsdemutationsetdedrogues

Utilisationdeprotéinesfluorescentesclassiques
•FRAP (Fluorescence recovery After Photobleaching)
Mesure du recouvrement de fluorescence dans la zone d’intérêt
Confocal à balayage ‐Plein Champ ou spinning disk avec module FRAP
Méthodesd’étudesdynamiquesdanslacellule
http://zeiss‐campus.magnet.fsu.edu/
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10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0246810
Intensitérelativedefluorescence
(en%)
Temps(minutes)

•Choisirlesystèmed’acquisition,choisiretréglerl’objectif(baguecorrectrice)
•Choisirlatailleduchampàobserver,latailledupinhole
•PrivilégierleS/Betlafréquenced’acquisition
•ChoisirlaformeettailledelaROIdephotoblanchiment
•Laduréedephotoblanchiment doitêtrelapluscourtepossiblecarles
moléculesdiffusentaussipendant
•Eviterlephotoblanchiment pendantlerestedel’acquisition(utilisationdu
binning)
•Lafréquenced’acquisitiondesimagesdoitêtreplushautequelavitessede
diffusion(pouracquérirunnombresuffisantdepointdetempspendantla
premièrepartiedurecouvrement)
•Tempsacquisitionsuffisammentlong(idéalementunplateau)
FRAP:β‐caténine‐GFPacquisition