Méthodes d`études de la dynamique dans la cellule par - gdr-Miv
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Méthodes d’études de la dynamique dans la cellule par photo‐conversion ou FRAP : avantages et limites MiFoBio 2016 Atelier « maitrise » Xavier Baudin Sophie Abélanet Contexte biologique du TP : β‐caténine Β‐Caténine (90KDa autour 130 avec la GFP) : • régulation et coordination des adhésions cellules à cellules via complexe avec E‐ Cadhérine localisé à la membrane plasmique. Régulation interaction des molécules de jonctions avec l’actine du cytosquelette. • Composant essentiel dans la cascade de signalisation Wnt = Activation des gènes de transcription responsable de la prolifération et différentiation cellulaire Adhésion Cellules à Cellules E‐Cadhérine Membrane plasmique Cytoplasme β‐Caténine α‐Caténine Noyau β‐Caténine BCL9 Filaments Actine Jonctions Cytosquelette β‐Caténine Dégradation Prolifération et différenciation cellulaire TCF1 Wnt gènes cibles β‐caténine : Etude dynamique/synthèse/dégradation Objectif : visualisation dynamique Choix de l’approche FRAP Photo‐conversion • Etude dynamique de suivi de recouvrement Fluorescence sur des zones locales (mesure des tIN) • Etude dynamique de suivi de Fluorescence sur des zones locales (mesure des tOUT) • Etude de synthèse protéique • Etude dégradation sur cellule entièrement photoconvertie • Etude relocalisation en présence de drogues avec conversion sur zone locale compare les effets de mutations et de drogues Méthodes d’études dynamiques dans la cellule Utilisation de protéines fluorescentes classiques http://zeiss‐campus.magnet.fsu.edu/ • FRAP (Fluorescence recovery After Photobleaching) Mesure du recouvrement de fluorescence dans la zone d’intérêt Confocal à balayage ‐ Plein Champ ou spinning disk avec module FRAP Intensité relative de fluorescence (en %) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 Temps (minutes) 8 10 FRAP : β‐caténine‐GFP acquisition • Choisir le système d’acquisition, choisir et régler l’objectif (bague correctrice) • Choisir la taille du champ à observer, la taille du pinhole • Privilégier le S/B et la fréquence d’acquisition • Choisir la forme et taille de la ROI de photoblanchiment • La durée de photoblanchiment doit être la plus courte possible car les molécules diffusent aussi pendant • Eviter le photoblanchiment pendant le reste de l’acquisition (utilisation du binning) • La fréquence d’acquisition des images doit être plus haute que la vitesse de diffusion (pour acquérir un nombre suffisant de point de temps pendant la première partie du recouvrement) • Temps acquisition suffisamment long (idéalement un plateau) FRAP : β‐caténine‐GFP traitement Background (B) • Correction des mouvements lors de l’acquisition • Problème lors des déformations de l’échantillon • Soustraction du Background FRAP (F) • Correction du facteur de bleaching sur une cellule témoin, sur la cellule entière, sur la ROI de bleach avant bleach ou au plateau REF (R) • Normalisation des données Ri x (Ft‐F0) x 100 (Fi‐F0) Rt normaliser pour la fraction mobile Ri x (Ft‐F0) Rt (Fplateau‐F0) normaliser pour les autres paramètres cinétiques (Ƭ½, faire du fit) x 100 FRAP : β‐caténine‐GFP Analyse Intensité relative de fluorescence (en %) Background (B) FRAP (F) REF (R) Modèle de FIT : méthode Ellenberg (Ellenberg J., Siggia E.D., Moreira J.E., Smith C.L., Presley J.F., Worman H.J., Lippincott‐Schwartz J. (1997) J. Cell Biol. / 1 4 ω = Rayon du bleach (en pixel ou µm) Dt = Coefficient de diffusion 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 1 3 5 7 Temps (minutes) ω = 3,7µm Dt = 0,18µm²/min 9 Méthodes d’études de la dynamique dans la cellule Utilisation de protéines fluorescentes photo‐transformables • Photo‐Activable Passage d’un état noir à un état fluorescent de manière irréversible Confocal à balayage ‐ Plein Champ ou spinning disk avec module FRAP ‐ Biphoton • Photo‐réversible Passage d’un état noir à un état fluorescent de manière réversible Confocal à balayage ‐ Plein Champ ou spinning disk avec module FRAP ‐ Biphoton • Photo‐convertible Passage d’un état fluorescent à un état fluorescent d’une autre couleur de manière irréversible. Confocal à balayage ‐ Plein Champ ou spinning disk avec module FRAP ‐ Biphoton Protéines Fluorescentes photo‐transformables : Panel large de choix Protein Photoconversion Activating Light Oligomeric State Quantic Efficiency Extinction Coefficient PA‐GFP None to Green UV or Violet Monomer 0,79 17400 (PS‐)Dronpa None to Green UV or Violet Monomer 0,85 95 000 PS‐CFP2 Cyan to Green UV or Violet Monomer 0,23 47 000 PA‐mCherry1 None to Red UV or Violet Monomer 0,46 18 000 Kaede Green to Red UV or Violet Tetramer 0,88 / 0,33 98800 / 60400 mKikGR Green to Red UV or Violet Monomer 0,69 / 0,63 49000 / 28000 EosFP Green to Red UV or Violet Tetramer 0,62 37 000 mEos2 Green to Red UV or Violet Monomer 0,43 / 0,35 78000 / 39000 mEos3.2 Green to Red UV or Violet Monomer 0,84 / 0,66 56000 / 46000 Dendra2 Green to Red UV or Violet or Blue Monomer 0,5 / 0,55 45000 / 35000 mClavGR2 Green to Red UV or Violet Monomer 0,77 / 0,54 19000 / 32000 mMaple Green to Red UV or Violet Monomer 0,74 / 0,56 15000 / 30000 PA : photo‐activable PS : photo‐switchable = réversible les autres : photo‐conversion = irréversible http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/applications/opticalhighlighters.html Méthodes d’études dynamiques dans la cellule Utilisation de protéines fluorescentes photo‐transformables • Protéines Photo‐Convertibles (ex: Eos and Kaede) : Clivage du chromophore induit par de la lumière violette Before Photoconversion http://zeiss‐campus.magnet.fsu.edu/ Photoconverted Passage entre 2 états fluorescents avec 2 couleurs d’émissions distinctes Photoconversion : β‐caténine‐mMaple β‐caténine mEos2 ou β‐caténine Dendra2 Expressions non stables β‐caténine mMaple A. McEvoy PLosOne 2012 dt5min Caractéristiques de mMaple : bilan • Photoconvertible du vert au rouge (irréversiblement) avec un haut contraste, par activation avec un faisceau lumineux de lumière UV ou bleue • Protéine fluorescente, photoactivable (légèrement en GFP, ce qui rend les calculs de TIN non possible avec cette lignée) • La forme photoconvertie (rouge) est hautement stable • Protéine fluorescente monomérique, donc particulièrement adaptée pour les fusions • Ces propriétés en font un outil précieux ‐ pour faire un suivi de cellules, d’organelles ou de protéines ‐ pour des études de dynamiques de protéines ou de structures intracellulaires. Photoconversion : β‐caténine‐mMaple • Choisir le système d’acquisition, choisir et régler l’objectif (bague correctrice) • Choisir la taille du champ à observer, la taille du pinhole • Privilégier le S/B et la fréquence d’acquisition • Choisir la forme et taille de la ROI de photoblanchiment • La durée de photoactivation doit être la plus courte possible car les molécules diffusent aussi pendant • Eviter le photoblanchiment pendant le reste de l’acquisition (utilisation du binning) • La fréquence d’acquisition des images doit être plus haute que la vitesse de diffusion (pour acquérir un nombre suffisant de point de temps pendant la première partie du recouvrement) • Temps acquisition suffisamment long (idéalement un plateau) Photoconversion : β‐caténine‐mMaple Analyse Analyse: Suivi du recouvrement de fluorescence en vert (Image J ‐ Image ‐ stack ‐ plot Z axis profile sur la ROI) Intensité relative de fluorescence (en %) Normalisation des résultats : Ref (R) 120 Vert 100 Rouge 80 60 40 Photoconversion (P) 20 0 0 5 10 ‐20 Temps (minutes) 15 20 Bruit (B) Autre application de la photoconvertion • Suivi de protéine Taux de mouvement et direction Coefficient de diffusion Fraction mobile Temps de résidence dans un compartiment Taux d’échange entre compartiment Taux de synthèse et dégradation • Suivi d’organelle Taux de mouvement et direction Fusion fission • Suivi de cellules Taux de mouvement et direction Localisation de cellule Taux de division cellulaire
