Key Code TSMX7840B www.oxoid.com/ifu Europe +800 135 79 135 CA 1 855 805 8539 US 1 855 2360 190 ROW +31 20 794 7071 compare les différences de la valeur de DO entre des échantillons de LCR et de sérum6. dosé pour des utilisations ultérieures (voir la Section 8.2.11). En raison de l’immunocapture sélective des anticorps des classes IgG et IgM, il n’y a aucune interférence par compétition de la part des autres classes d’immunoglobuline. L’usage d’antigène diagnostique conjugué empêche aussi toute interférence de la part du facteur rhumatoïde (FR). Prêt à l'usage. Conserver le Contrôle Positif IgG non utilisé à 2-8°C. 4. DEFINITIONS Les symboles suivants sont utilisés dans l’ensemble des informations relatives au produit.. 5.2.6 IDEIA Lyme Neuroborreliosis K602811-2 ����������������������������������������� Numéro de référence Dispositif médical de diagnostic in vitro 96 Consulter le mode d’emploi FR Limite de température (température de conservation) Dosage immuno-enzymatique pour la détermination des anticorps IgG et IgM intrathécaux humains dirigés contre Borrelia burgdorferi sensu lato. Contenu suffisant pour "n" tests N 1. USAGE PREVU Le kit IDEIA™ Lyme Neuroborréliose est un dosage immunoenzymatique qui sert à détecter la présence d’anticorps des classes IgG et IgM humaines et dirigés contre Borrelia burgdorferi sensu lato. Ce kit est conçu pour aider à établir le diagnostic de la maladie de Lyme. 2. RESUME La maladie de Lyme est une infection polysystémique causée par le spirochète B. burgdorferi sensu lato et transmise par piqûre de tique1,2. La neuroborréliose, qui implique le système nerveux, est une manifestation courante et grave de la borréliose de Lyme3. Il est nécessaire d’effectuer un test diagnostique sensible et fiable pour détecter la neuroborréliose, d’une part parce qu’il existe un certain nombre d’autres maladies qui produisent des symptômes analogues, et d’autre part parce que la neuroborréliose, contrairement à plusieurs de ces maladies, répond à l’antibiothérapie. Actuellement, le meilleur indicateur d’une neuroborréliose évolutive est l’observation d’un changement de nature inflammatoire au niveau du liquide céphalo-rachidien (LCR), qui se manifeste particulièrement sous la forme d’une augmentation du nombre de cellules mononucléaires (pléocytose mononucléaire), associée à l’apparition d’anticorps spécifiques de Borrelia produits dans le LCR. La détection d’une réaction immunitaire intrathécale spécifique est plus importante au point de vue diagnostique que la mesure des anticorps spécifiques dans le sérum. Qui plus est, en ce qui concerne la neuroborréliose, la synthèse des anticorps spécifiques est souvent détectée plus tôt dans le LCR que dans le sérum4,5. Code de lot (numéro de lot) A utiliser avant le (date de péremption) Fabriqué par Ajouter de l’eau 5. REACTIFS FOURNIS Normalement les teneurs en IgG et en IgM totales du LCR sont très faibles par rapport à celles obtenues dans le sérum. De ce fait, quand il y a production intrathécale d’anticorps spécifiques de B. burgdorferi, la quantité d’anticorps IgG ou IgM spécifiques dans le LCR représentera un pourcentage bien plus important de la quantité totale d’IgG et d’IgM, respectivement, que les pourcentages trouvés dans le sérum. S’il n’y a pas production d’anticorps spécifiques intrathécaux, ou si la présence d’anticorps spécifiques dans le LCR est la conséquence soit d’une contamination du sang, soit d’une transsudation en provenance du sérum, la valeur de DO pour le LCR moins la valeur de DO pour le sérum sera <0. Par conséquent, dans le cas de la neuroborréliose, on obtiendra une valeur de DO beaucoup plus élevée pour le LCR que pour l’échantillon de sérum. Dans de tels cas, la valeur de DO pour le LCR moins la valeur de DO pour le sérum sera, de ce fait, >0. La comparaison entre les valeurs de DO des échantillons sérum et LCR, analysées en série, permet de déterminer si des anticorps spécifiques de B. burgdorferi ont été ou non produits. La formule pour calculer les résultats de l’analyse a été conçue de manière à prendre en considération toute variation intra-dosage lorsque l’on Conjugué Flagellaire, Peroxydase et Tampon de / / Reconstitution - Reconstituer le Conjugué Flagellaire de Borrelia lyophilisé biotinylé avec le Tampon de Reconstitution et ajouter 650µL de Complexe Peroxydase. Mélanger en agitant le flacon par renversements successifs. Le Conjugué flagellaire reconstitué doit être préparé au moins une heure avant utilisation. Le Conjugué Flagellaire Reconstitué doit être conservé entre 2-8°C et utilisé dans les trois mois. 5.2.8 Solution d'arrêt - Prête à l’emploi. Conserver la Solution d'Arrêt non utilisée à 2-8°C. 6. AUTRES REACTIFS 6.1. REACTIFS Eau fraîchement désionisée ou distillée. 7. MATERIEL Le matériel suivant est nécessaire: Eprouvette graduée (2L) Tubes à essais d'une capacité approximative de 5mL Micropipettes de précision et embouts jetables permettant de dispenser des volumes de 10 à 1000µL 5.1. Agitateur de plaque de microtitration pouvant atteindre une vitesse minimale de 500rpm et doté d’un diamètre orbital de 3 à 4mm. Pour connaître les agitateurs de plaque compatibles, veuillez contacter votre distributeur local(e). CONTENU DU TEST IDEIA LYME NEUROBORRELIOSIS Un livret d’instructions d’utilisation. 48 micro-puits (6 barrettes de 8 micro-puits) revêtus d’anticorps anti-IgG humaines (couleur verte). 48 micro-puits (6 barrettes de 8 micropuits) revêtus d’anticorps anti-IgM humaines (couleur jaune). Les micro-puits non utilisés peuvent être conservés dans une poche en plastique refermable hermétiquement fournie à cet effet. Un flacon de chacun des produits suivants: 100mL Diluant pour Echantillon: Solution tamponnée avec agent anti-microbien et couleur rouge. 50mL Tampon de Lavage concentré x25: Solution tamponnée avec détergent et agent anti-microbien. 1,5mL Contrôle Positif IgG: Sérum humain dans une solution tampon avec agent antimicrobien et colorant vert. 1,5mL Contrôle Positif IgM: Sérum humain dans une solution tampon avec agent antimicrobien et colorant jaune. Conjugué Flagellaire lyophilisé: flagelles de B. afzelii biotinylés à reconstituer avant usage avec la solution tampon de reconstitution et formant un complexe avec un conjugué streptavidine-peroxydase. 12,5mL Tampon de Reconstitution: solution tamponnée avec agent anti-microbien and colorant bleu. 1mL Complexe Peroxydase: Conjugué streptavidine-peroxydase dans une solution tampon contenant des protéines porteuses et un agent anti-microbien. 12mL Substrat: peroxyde stabilisé et 3,3’-5,5’-tétraméthylbenzidine dans une solution tampon diluée. Le substrat TMB n’est pas carcinogène. Cependant, il convient de porter un équipement de protection personnelle, afin d’éviter toute exposition directe. 25mL Solution d’Arrêt: Acide sulfurique 0,46mol/L. 5.2. PREPARATION, CONSERVATION ET REUTILISATION DES CONSTITUANTS DU KIT Le format de kit IDEIA Lyme Neuroborreliosis permet de pratiquer jusqu’à 6 cycles individuels pendant une période de 3 mois avant la date de péremption. Pour des performances optimales, il convient de préparer et de conserver les composants du kit inutilisés en respectant les consignes suivantes: 5.2.1 Micro-puits - Ouvrir la poche contenant la microplaque en coupant le long du joint. Détacher le nombre requis de barrettes anti-IgG humaines (code couleur vert) et de barrettes anti-IgM humaines (code couleur jaune) et les replacer sur le cadre. Chaque barrette permet le dosage en double réplique du LCR et du sérum d’un patient; les quatre micropuits restants de la barrette sont utilisés pour le Contrôle Positif et le tampon. Chaque barrette IgG et IgM supplémentaire permet d’analyser des échantillons en paire de deux patients. Il est possible de détecter les anticorps de la classe des IgG et des IgM dans les échantillons de LCR et de sérum de 11 patients en utilisant un cadre complet de 6 barrettes IgG et de 6 barrettes IgM. Papier absorbant propre (pour sécher les micropuits en les tapotant) Couvercle en plastique pour la plaque à micro-puits Minuterie Appareil automatique de lavage pour microplaques (facultatif) ou matériel adapté au lavage de 8 barrettes de micropuits (voir la Section 10.2.3). Remarque: si moins de 8 micropuits de test doivent être lavés dans un laveur automatique équipé d’un support pour 8 micropuits, il faut veiller à remplir entièrement la barrette à l’aide de micropuits vides. Spectrophotomètre ou lecteur de plaques EIA capable de lire l’absorbance à 450nm (longueur d’onde de référence de 620650nm) sur une plaque à 96 micropuits répartis en barrettes de 8 puits. (facultatif: voir la Section 10,3 intitulée Interprétation des résultats). Il existe pour ce test des Notes d’Application pour l’utilisation sur des systèmes automatisés ouverts. Veuillez contacter votre distributeur local(e). 8. PRECAUTIONS - Pour usage diagnostique in vitro. L’utilisateur doit maitriser les procédures générales de laboratoire et être spécifiquement formé pour I’emploi de ce test. 8.1. PRECAUTIONS DE SECURITE 8.1.1 Le sérum utilisé dans la préparation des contrôles positifs a été testé séparément et est négatif aux antigènes de surface du virus de l’hépatite B et aux anticorps anti-VIH et anti-hépatite C. Cependant, les contrôles positifs doivent tout de même être considérés comme des matériaux potentiellement infectieux. 8.1.2 La Solution d'Arrêt contient de l'acide sulfurique (0,46mol/L). Eviter le contact avec la peau et les yeux en portant un vêtement de protection approprié et un appareil de protection des yeux. 8.1.3 Ne pas manger, boire, fumer, conserver ou préparer des aliments ni se maquiller dans la zone de travail. 8.1.4 Ne pas pipetter à la bouche. 8.1.5 Porter des gants jetables pour manipuler les échantillons cliniques et toujours se laver les mains après avoir travaillé avec des échantillons infectieux. 8.1.6 Éliminez l’ensemble des échantillons cliniques et des contrôles positifs conformément à la législation en vigueur. 8.1.7 Fiche toxicologique disponible pour les utilisateurs professionnels, sur demande. 8.1.8 Le substrat de TMB contient de la 1-méthyl-2pyrrolidone (NMP) à une concentration >5 % et <10 %, classifiée comme un danger par la règlementation de la Communauté européenne (CE) en vigueur. Voici les mentions de danger (H) et les conseils de prudence (P) appropriés. DANGER H360 Peut nuire à la fertilité ou au fœtus. P201 Se procurer les instructions avant utilisation. P202 Ne pas manipuler avant d’avoir lu et compris toutes les précautions de sécurité. P281 Utiliser l’équipement de protection individuel requis. P308+P313 EN CAS d’exposition prouvée ou suspectée: consulter un médecin. Prêt à l'emploi. Conserver le Diluant non utilisé à 2-8°C. 8.2. PRECAUTIONS DE NATURE TECHNIQUE 8.2.1 Les constituants ne doivent pas être utilisés après la date limite d'utilisation indiquée sur les étiquettes. Ne pas mélanger ou interchanger les divers portions/lots de réactifs, à l'exception des réactifs types (Diluant pour Echantillons, solution Tampon de Lavage, Substrat et Solution d'Arrêt) qui sont aussi utilisés dans les kits IDEIA Borrelia burgdorferi IgG (Réf. No. K602911-2) et IDEIA Borrelia burgdorferi IgM (Réf. No. K603011-2). 5.2.3 8.2.2 Les réactifs sont fournis à des concentrations dosées fixes. Les performances du test seront altérées si les réactifs sont modifiés ou conservés dans des conditions autres que celles décrites dans la Section 5.2. 8.2.3 Eviter toute contamination des réactifs. 8.2.4 Utiliser des pipettes ou des embouts de pipette jetables individuels pour chaque échantillon, témoin ou réactif afin d'éviter la contamination croisée soit des échantillons, soit des témoins, car cela donnerait des résultats erronés. Placer les micropuits inutilisés dans la poche plastique refermable, avec le dessiccateur, refermer la poche soigneusement et la conserver entre 2-8°C. Il est possible d’utiliser les micropuits pendant les 12 semaines qui suivent la première ouverture, à condition qu’ils soient conservés de la sorte. 5.2.2 Diluant pour Echantillons Solution Tampon de Lavage Concentrée - Fournie concentrée x25. Préparer une solution de lavage fraîchement dosée en ajoutant une unité de Tampon de Lavage concentré à 24 unités d'eau fraîchement désionisée ou distillée (ou ajouter le contenu du Tampon de Lavage concentré à 1200mL d’eau fraîchement désionisée ou distillée). Reconstituer la solution de Lavage Tamponnée fraîchement dosée, en fonction des besoins, le jour de son utilisation. Stocker le concentré inutilisé à une température comprise entre 2-8°C. Ne pas conserver le reste du Tampon de Lavage fraîchement 8.2.6 Stocker l’eau désionisée ou distillée destinée à la dilution des réactifs concentrés dans des conteneurs propres afin d’empêcher toute contamination microbienne. 8.2.7 Ne pas utiliser un substrat qui a une couleur bleue avant de l'ajouter aux micro-puits. 8.2.8 Protéger le Substrat de la lumière. 8.2.9 Ne pas réutiliser les micro-puits. 8.2.10 Le matériel de lavage manuel ou automatique ne doit présenter aucune contamination microbienne, et il doit être étalonné et entretenu conformément aux instructions du fabricant. 8.2.11 Ne pas conserver le Tampon de Lavage fraîchement dosé inutilisé en vue d’une utilisation future. Lorsqu’ils ne sont pas utilisés, les réservoirs à Tampon de Lavage doivent être rincés avec de l’eau désionisée ou distillée, puis sécher à l’air libre. Substrat - Prêt à l’emploi. Conserver le Substrat non utilisé à 2-8°C. Réservoirs à réactifs pour la pipette à 8 canaux (facultatif) 3. PRINCIPE DU DOSAGE Le test a pour base le principe de capture ELISA et consiste en un dosage par capture d’IgG humaine et d’un dosage par capture d’IgM humaine, pour détecter la présence d’anticorps des classes IgG et IgM produits et dirigés contre B. burgdorferi. Le dosage par capture d’IgG humaine est décrit en détail: Le dosage par capture d’IgM humaine est analogue au dosage par capture d’IgG humaine, à la seule différence que les micro-puits sont revêtus d’anticorps de capture anti-IgM humaine. Prêt à l'usage. Conserver le Contrôle Positif IgM non utilisé à 2-8°C. 5.2.7 Eviter la contamination avec des ions métal et des agents oxydants. Contrôle Positif IgM - Pipette à 8 canaux pour fournir 100µL (facultatif) Le test utilise le flagelle de la souche DK1 de B.afzelii natif purifié comme antigène diagnostique. Ce flagelle est extrêmement immunogène, provoque une réaction immunitaire précoce, prononcée et persistante7,8 et constitue l’antigène principal pour la réaction des anticorps intrathécaux9,10. Comparé à l’antigène classique, qui est à base d’extrait cellulaire du spirochète entier, l’antigène flagelle natif et purifié améliore la sensibilité diagnostique et la spécificité des dosages sérologiques pour la borréliose de Lyme5,11. Qui plus est, on peut se servir des flagelles comme antigène diagnostique dans toutes les régions géographiques étant donné que les flagelles d’une souche de B. burgdorferi ne diffèrent pas beaucoup de ceux d’une autre souche de cette même bactérie. Après lavage des micro-puits pour éliminer tout excès de protéine, on verse dans les micro-puits un complexe de flagelles de Borrelia natif biotinylé et d’un conjugué streptavidineperoxydase (Conjugué flagellaire). Le conjugué flagellaire sera lié à l’IgG spécifique de B. burgdorferi uniquement tandis que l’IgG non spécifique de B. burgdorferi ne se fixera pas à l’anticorps flagellaire. Le conjugué flagellaire en excès est éliminé par lavage. La quantité de conjugué flagellaire liée par micropuits est visualisée par ajout d’un substrat chromogène, ce qui entraîne une coloration bleue. La réaction est interrompue en ajoutant de l’acide, ce qui fait virer la couleur du bleu au jaune. L’intensité de la coloration correspond à la teneur en IgG spécifique de B. burgdorferi capturée à la phase solide de l’échantillon. 5.2.5 8.2.5 Contrôle Positif IgG - 96 - Chaque kit contient suffisamment de réactifs pour permettre 96 déterminations. La date de péremption du kit est indiquée sur l’étiquette extérieure de la boîte. Conserver les composants non utilisés à une température comprise entre 2 et 8 °C. Le kit IDEIA Lyme Neuroborréliose est conçu pour la détection sensible et directe des anticorps des classes IgG et IgM humaines produits et dirigés contre B. burgdorferi 6. Il n’est pas nécessaire de mesurer des substances de référence (comme l’albumine, etc.) et d’apporter des corrections compliquées en raison de la transsudation des anticorps sériques dans le LCR causée par les dégâts au niveau de la barrière sang-LCR. Même une contamination sanguine du LCR pendant une ponction lombaire ne donnera pas des résultats faussement positifs. Des échantillons de LCR et de sérum de patient sont placés dans des micro-puits revêtus d’anticorps spécifiques de l’IgG humaine. La dilution du LCR et du sérum garantit que l‘anticorps de capture anti-IgG humaine soit saturé avec l’IgG du LCR ou avec l’IgG sérique. De ce fait, on capture la même quantité d’IgG totale à partir du LCR ou du sérum dans les micro-puits. 5.2.4 PRELEVEMENT ET CONSERVATION DES ECHANTILLONS 9.1. PRELEVEMENT DES ECHANTILLONS Le kit IDEIA Lyme Neuroborréliose permet d'analyser simultanément des échantillons humains de LCR et de sérum. Ces échantillons de LCR et sérum doivent être prélevés chez le patient au même moment. Il est nécessaire de recueillir un minimum de 0,5mL, et de préférence 1 à 2mL, de LCR, car cette quantité permettra de répéter l'analyse et/ou la performance de l'analyse avec une dilution de LCR plus faible. En ce qui concerne le sérum, 0,5mL suffit. 9. L'analyse d'échantillons troubles et visqueux peut donner des résultats douteux dûs à des erreurs lors du prélèvement à la pipette. Les échantillons de LCR et de sérum peuvent être conservés pendant 14 jours à 2-8°C avant d'être analysés, et pendant un minimum de 6 mois à une température de –20°C ou inférieure. 9.2. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS Diluer les échantillons de LCR 1+4 en ajoutant 100µL de LCR à 400µL de Diluant pour Echantillons. Diluer les échantillons de sérum 1+200 en ajoutant 10µL de sérum à 2mL de Diluant pour Echantillons. 10. PROCEDURE D'ANALYSE VEUILLEZ VOUS RÉFÉRER À LA SECTION 8.2, PRÉCAUTIONS DE NATURE TECHNIQUE, AVANT DE SUIVRE LA PROCÉDURE D'ANALYSE. 10.1. NOTES RELATIVES A LA PROCEDURE 10.1.1 Les réactifs types (Diluant pour Echantillons, Solution Tampon de Lavage Concentrée, Substrat, et la Solution d'Arrêt) et une procédure d'analyse analogue sont aussi utilisés pour les kits IDEIA Borrelia burgdorferi IgM (réf. K603011-2) et IDEIA Borrelia burgdorferi IgG (réf. K602911-2). Cela permet de pouvoir effectuer les trois essais en parallèle. 10.1.2 La validation de la performance du dosage a pour base l'analyse en double simultanée de tous les échantillons. Si les échantillons du patient ne doivent être analysés qu'une seule fois, il est recommandé aux utilisateurs de ne pratiquer l’analyse qu'après s'être familiarisés avec les caractéristiques de la performance du dosage. La variation intra-dosage (CV%) est approximativement 50% plus marquée lorsqu’on se fonde sur une seule détermination. 10.1.3 Si l'on ne dispose pas d'un agitateur fonctionnant à 500 tours/minute, la vitesse d'agitation des barrettes de micro-puits pendant les 2 étapes d'incubation peut être réduite à 300 tours/minute, sans que la performance du dosage ne soit affectée; un protocole d’incubation statique est également disponible. Pour toute information complémentaire concernant des protocoles adéquats, veuillez contacter votre distributeur local(e). 10.2. PROCEDURE DU DOSAGE REMARQUE: La procédure de dosage exige l’utilisation d’un agitateur de plaque de microtitration. Pour connaître les agitateurs compatibles, veuillez contacter votre distributeur local(e). En cas d’utilisation de barrettes multiples, il est recommandé d’avoir recours à une pipette à 8 canaux pour l’ajout du Conjugué, du Substrat et de la Solution d’Arrêt. 10.2.1 Ajout d’échantillons et de contrôles Placer le nombre de micropuits nécessaire sur le support de micropuits. Ajouter 100µL de LCR et de sérum de patient dilués à des micropuits en double de la barrette verte anti-IgG et de la barrette jaune anti-IgM. Ajouter 100µL de Contrôle Positif IgG à deux micropuits anti-IgG et 100µL du Contrôle Positif IgM à deux micropuits anti-IgM. Ajouter le Diluant pour Echantillon aux micropuits distincts IgG et IgM. (Au moins un micropuits de Diluant pour Echantillon doit être inclus à chaque lot d’échantillons testé). 10.2.2 Incubation des échantillons Recouvrir les micropuits et laisser incuber dans un agitateur à température ambiante (20-25°C) sous agitation pendant 60 minutes. 10.2.3 Lavage des micropuits Laver les micropuits à l’aide de Tampon de Lavage fraîchement dosé (voir la Section 5.2.3). La technique de lavage utilisée a un impact majeur sur les performances du test. Veiller à complètement remplir (avec au moins 350µL de Tampon de Lavage fraîchement dosé) puis vider les puits. Il est primordial de réaliser quatre cycles de lavage, à l’aide de techniques automatiques ou manuelles, comprenant une période d’imprégnation de 2 minutes lors du deuxième lavage, ou une période d’imprégnation totale de 2 minutes sur l’ensemble du cycle. Lavage manuel En cas de lavage manuel des micropuits, aspirer ou faire tomber le contenu des micropuits. Utiliser ensuite du Tampon de Lavage fraîchement dosé pour remplir complètement les micropuits, puis les vider entièrement. Entre chaque étape du processus de lavage, veiller à ôter tout Tampon de Lavage restant en tapotant les micropuits renversés sur un morceau de papier absorbant propre. L’efficacité d’un lavage manuel est accrue si le Tampon de Lavage est introduit de façon inclinée afin de produire un vortex dans les micropuits. Après le dernier lavage, la plaque doit être renversée et tapotée sur du papier absorbant afin de faire disparaître toute trace de Tampon de Lavage. Lavage automatique Les appareils de lavage automatiques doivent être programmés pour effectuer quatre cycles de lavage et pour inclure une période d'imprégnation de 2 minutes sur l’ensemble du cycle de lavage. Les appareils de lavage doivent être correctement étalonnés afin d’assurer un remplissage et un vidage complets des micropuits entre chaque lavage. Après le dernier lavage, la plaque doit être renversée et tapotée sur du papier absorbant pour faire disparaître toute trace de Tampon de Lavage. Résultat positif pour la production d'anticorps IgG intrathécaux dirigés contre B. burgdorferi: 10.2.4 Ajout de conjugué Mélanger le Conjugué Flagellaire en agitant le flacon par renversements successifs. Ajouter 100µl de Conjugué Flagellaire dans chaque micropuits. I IgM <0,3 ou DO lcr <0,150 Résultat positif pour la production d'anticorps IgM intrathécaux dirigés contre B. burgdorferi: 10.2.5 Incubation du conjugué Recouvrir les micropuits et laisser incuber dans un agitateur à température ambiante (20-25°C) sous agitation pendant 60 minutes. 11.4.2 Interprétation Semi-quantitative 10.2.6 Lavage des micropuits Laver les micropuits selon les instructions données en 10.2.3. 10.2.7 Ajout et incubation du substrat Ajouter 100µL de Substrat dans chaque micropuits. Recouvrir les micropuits et laisser incuber à température ambiante (20-25°C) sans agiter pendant 10 minutes. 10.2.8 Arrêt de la réaction Ajouter 100µL de Solution d’Arrêt dans chaque micropuits. Mélanger soigneusement. Le produit coloré est stable pendant 30 minutes. Ne pas exposer à la lumière du soleil car un blanchissage optique du produit coloré risquerait de se produire. I IgG ≥0,3 Résultat négatif pour la production d'anticorps IgM intrathécaux dirigés contre B. burgdorferi: L'indice d'anticorps spécifiques est une mesure de la production d'anticorps intrathécaux semi-quantitative très sensible parce qu'elle est fonction du taux de la production d'anticorps intrathécaux, de la perméabilité de la barrière sang-LCR, et de la teneur en anticorps sériques spécifiques. Ainsi donc, dans des échantillons post-traitement consécutifs, un changement ne doit être considéré comme significatif que si un indice positif tombe en-dessous de 0,3, ou s'il se divise ou se multiplie par plus de 5. Ces valeurs ne sont données qu'à titre indicatif. 11.4.3 Commentaires Relatifs à l'Interprétation des Résultats En outre, si le spectrophotomètre, ou le lecteur de plaque EIA, permet l’utilisation d’une longueur d’onde de référence de 620– 650nm, une lecture à double longueur d’onde doit être effectuée afin d’éliminer toute interférence possible causée par des aberrations telles que la présence de poussière ou de marques sur la surface optique des micropuits. Résultats Positifs Un indice IgG et/ou IgM >0,3, accompagné d'une pléocytose mononucléaire dans le LCR, évoque très fortement la présence d'une neuroborréliose de Lyme. (A elle seule, une valeur DOLCR élevée n'est pas indicatrice d'une production d'anticorps intrathécaux). 10.4. RESUME DE LA PROCEDURE DE DOSAGE IDEIA LYME NEUROBORRELIOSIS 11. CONTROLE DE QUALITE ET INTERPRETATION DES RESULTATS 11.1. TAMPON DE CONTRÔLE Calculer les valeurs de DO moyennes correspondant aux deux micro-puits pour le tampon de contrôle. La valeur de DO moyenne du tampon de contrôle doit être inférieure à 0,100 mais supérieure à 0,000 (lecture de longueur d’onde double). Si la valeur dépasse 0,100, cela peut être dû à un lavage inadéquat ou bien à la contamination du substrat. Si la valeur est inférieure à 0,000, le lecteur de plaques doit effectuer un nouveau blanc sur l'air et la lecture des micro-puits doit être de nouveau réalisée. Si les exigences du contrôle de la qualité ne sont pas satisfaites, les résultats de l'analyse ne sont pas valides et le dosage doit être refait. 11.2. CONTRÔLE POSITIF IgG ET CONTRÔLE POSITIF IgM Calculer les valeurs de DO moyennes correspondant au Contrôle positif IgG et au Contrôle Positif IgM. La différence entre les valeurs de DO individuelles des analyses en double réplique et la valeur de DO moyenne ne doit pas dépasser 15%. La valeur de DO moyenne du Contrôle Positif IgG et du Contrôle Positif IgM, respectivement, doit atteindre au moins 0,500. Si ces valeurs sont inférieures à 0,500, cela peut être dû à un lavage inadéquat, à une agitation inadéquate pendant les incubations, ou à une température ambiante trop basse, tout particulièrement pendant l'incubation avec le Substrat. Si les exigences du contrôle de la qualité ne sont pas satisfaites, les résultats de l'analyse ne sont pas valides et le dosage doit être refait. 11.3. ECHANTILLONS DES PATIENTS Calculer la DO moyenne de LCR (DOLCR) et de sérum (DOSérum) de chaque patient, pour la détermination IgG et IgM. Les valeurs de DO ne doivent pas varier de plus de 15% par rapport à la moyenne. Si tel est le cas, les échantillons doivent être à nouveau analysés. Cependant, si le résultat des deux puits analysés est négatif, il se peut qu'une différence de plus de 15% soit acceptée sans que l'on refasse l'analyse car des valeurs de DO basses sont mesurées avec moins de précision. La formule pour obtenir l'indice d'anticorps spécifiques est donnée ci-dessous. Calculer l'indice d'anticorps spécifiques pour IgG (IIgG) et IgM (IIgM), respectivement. Le calcul de l'indice ne doit pas être effectué si la valeur de DO moyenne de la détermination LCR est inférieure à 0,15. Tout résultat d'analyse de ce genre sera considéré comme négatif. DO lcr Indice = x (DOLCR - DO sérum) DO sérum 11.4. INTERPRETATION DES RESULTATS 11.4.1 Interprétation Qualitative Interpréter les résultats de la manière suivante: Résultat négatif pour la production d'anticorps IgG intrathécaux dirigés contre B. burgdorferi: ou I IgG <0,3 DO lcr <0,150 IDEIA Lyme Neuroborréliose Nombre de patients Résultat positif pour anticorps IgG intrathécaux produits 18 Résultat négatif pour anticorps IgG produits 7 Résultat positif pour anticorps IgM intrathécaux produits 12 Résultat négatif pour anticorps IgM intrathécaux produits 13 Résultat positif pour anticorps IgG et/ou IgM intrathécaux produits 19 Résultat négatif pour anticorps IgG et IgM intrathécaux produits 6 Plus la valeur de l'indice obtenu est élevée, plus la production d'anticorps intrathécaux spécifiques est prononcée. Les valeurs de l'indice peuvent atteindre, et même dépasser 100. Vérifier que le fond des micropuits est propre avant de procéder à la lecture, et vérifier qu’aucun corps étranger n’est présent dans les micropuits. Le lecteur doit effectuer un blanc sur l'air (c'està-dire en l'absence de plaque sur le support) avant que la plaque ne soit scannée. La lecture photométrique des micropuits doit s'effectuer dans les 30 minutes suivant l'ajout de la Solution d'Arrêt. Mélanger le contenu des micropuits et lire l’absorbance de chaque puits à l’aide d’un spectrophotomètre approprié ou d’un lecteur de plaque EIA pouvant lire l’absorbance à 450nm. 14. CARACTERISTIQUES SPECIFIQUES DE PERFORMANCE On a analysé des échantillons de LCR et de sérum prélevés chez 25 patients avec une neuroborréliose de Lyme cliniquement définie au moyen du kit IDEIA pour la Neuroborréliose de Lyme. I IgM ≥0,3 Expression des Résultats Théoriquement, il y a production d'anticorps intrathécaux si DOlcr/DOsérum >1. Cependant, cette supposition n'est pas sûre en raison de la variation intra-dosage, surtout pour les valeurs basses de DO. La différence DO nette (DOlcr - DOsérum) donne une information plus précise mais, en raison de la variation intradosage, la différence DO minimale indicatrice d'une synthèse des anticorps intrathécaux augmentera au fur et à mesure que les valeurs DO augmenteront. Ces inconvénients sont éliminés en multipliant le rapport DO par la différence DO, tel qu'exprimé par l'indice d'anticorps spécifiques (I). La limite inférieure de la valeur de l'indice, soit 0,3 pour un résultat positif, garantit que DOlcr est bien significativement plus élevée que DOsérum6. 10.3. INTERPRETATION DES RESULTATS DES TESTS 10.3.1 Lecture photométrique d'anticorps spécifiques dans le LCR due à une transsudation en provenance du sérum ou à une contamination sanguine du LCR donnera des indices d'anticorps <0. On a obtenu un indice d'anticorps spécifique >0,3 pour IgG chez 72% et pour IgM chez 48% des 25 patients avec une neuroborréliose de Lyme précoce. Un seul patient a eu une synthèse spécifique d’IgM sans synthèse d’IgG concomitante. Toutefois, certains patients avec de faibles indices IgG ont eu des indices IgM >0,3. De ce fait, l'évidence diagnostique est accrue en examinant les synthèses spécifiques des IgG et des IgM. On a réussi à diagnostiquer une neuroborréliose de Lyme précoce chez 19 des 25 patients (76%) avec le kit IDEIA pour la Neuroborréliose de Lyme. 14.1. RÉACTIVITÉ CROISÉE Un résultat positif indique toujours une synthèse d'anticorps dirigés contre Borrelia burgdorferi, sauf dans le cas d'échantillons provenant de patients atteints de neurosyphilis. Ces échantillons peuvent donner des résultats faussement positifs. Toutefois, l'indice d'anticorps spécifiques de B. burgdorferi reste très bas. De plus, les anticorps dans le LCR qui provoquent une réaction croisée, et les anticorps sériques, appartiennent à la classe des IgG3. On ne connaît toujours pas la signification de l'activation des lymphocytes B polyclonaux intrathécaux en tant que cause de résultats IgM" faussement positifs"3. 15. REFERENCES 1. Burgdorferi W, Barbour AG, Hayes SF, Benach JL, Grunwaldt E, Davis JP. (1982) 2. Lyme disease - a tick-borne spirochetosis? Science 216: 1317-9. Steere AC, Grodzicki RL, Kornblatt AN, Craft JE, Barbour AG, Burgdorferi W, et al. (1983) Un indice IgM >0,3 est d'habitude compatible avec une maladie qui dure depuis au moins 6 mois. La synthèse d'IgM spécifique intrathécale indique fortement la présence d'une neuroborréliose, mais la présence d’IgM n’est pas obligatoire. Chez les patients qui ont une neuroborréliose évolutive depuis plus de 6 mois, seule une synthèse d'IgG spécifique apparaîtra, et on détectera un indice IgG >0,3. 3. The spirochetal etiology of Lyme disease. N Engl J Med 308: 733-40. Hansen K. (1994) Lyme neuroborreliosis: Improvements of the laboratory diagnosis and a survey of epidemiological and clinical features in Denmark 1985 - 1990. Acta Neurol Scand (suppl. 151); 89: 1-44. Stiernstedt GT, Granström M, Hederstedt B, Sköldenberg B. (1985) Résultats Négatifs Un résultat négatif, soit un indice IgG et IgM <0,3, accompagné d'une pléocytose mononucléaire dans le LCR, n'exclut pas le diagnostic clinique d'une neuroborréliose de Lyme. Cela se produit tout particulièrement quand peu de temps s'écoule entre l'apparition des symptômes neurologiques et le prélèvement du sérum et du LCR. Chez la plupart des patients non traités présentant des signes cliniques bien définis de la neuroborréliose, les anticorps spécifiques peuvent être détectés dans le LCR au cours de la seconde semaine suivant l'apparition des symptômes neurologiques6. Chez les patients avec une neuroborréliose précoce mais qui obtiennent un résultat négatif à l'analyse, il se peut qu'un échantillon prélevé à une date ultérieure donne un résultat positif, même après instauration du traitement. Un indice IgM <0,3 n'exclut pas toujours une synthèse d'IgM spécifique. Une valeur de DO d'IgM élevée dans le LCR (>1,0), qui est égale ou même inférieure à la valeur IgM correspondante dans le sérum, pourrait encore indiquer la présence d'une synthèse d'anticorps intrathécaux, si on peut exclure la possibilité d'un trouble grave au niveau de la barrière sang-LCR6. Echantillons post-traitement Evaluation d'échantillons LCR/Sérum post-traitement consécutifs : après une antibiothérapie appropriée, un indice IgM spécifique diminuera, et après 6 à 9 mois, l'indice est d'habitude <0,3. Un indice IgG élevé persistera parfois pendant de nombreuses années, même si le malade est complètement rétabli. Un indice IgG >0,3 non accompagné d'une pléocytose mononucléaire dans le LCR est un résultat rare, si ce n'est dans des échantillons prélevés après un traitement. De ce fait, ce résultat pourrait indiquer qu'un épisode de neuroborréliose s'est produit auparavant. 12. LIMITES DE PERFORMANCE 12.1. Une contamination sanguine excessive de l'échantillon de LCR peut donner des indices d'anticorps spécifiques faussement bas. 12.2. En raison de la relation antigénique entre B. burgdorferi et Treponema pallidum, il est possible que des réactions croisées sérologiques (bien que cela soit rare) se produisent chez des patients qui ont des antécédents de neurosyphilis. La discrimination sérologique est possible en se servant de l'essai d'hémagglutination passive pour le sérodiagnostic de la syphilis (TPHA) ou de tests sur les cardiolipides non-tréponémiens: le test VDRL, le test rapide sur la réagine plasmatique (RPR), et la réaction de Wassermann. Ces tests donneront un résultat négatif chez les patients qui n'ont qu'une infection à B. burgdorferi. 12.3. Une antibiothérapie antérieure risque d'abroger la réaction des anticorps et, de ce fait, rendre les résultats sérologiques moins prévisibles. 12.4. Les échantillons prélevés durant le premier stade de la maladie peuvent donner des résultats négatifs lors de l'analyse (voir Section 11). 12.5. Les performances du test seront altérées si les réactifs sont modifiés ou stockés dans des conditions autres que celles décrites dans la Section 5.2. 12.6. Le résultat du test doit être interpété en considérant les informations données par les études épidémiologiques, l’évaluation clinique du patient et les autres analyses diagnostiques. 13. VALEURS ATTENDUES Un indice d'anticorps spécifiques >0,3 indique toujours la présence d'une synthèse intrathécale d'anticorps spécifiques. Chez des patients avec une neuroborréliose, la synthèse d'anticorps intrathécaux débute d'habitude durant la seconde semaine suivant l'apparition des symptômes neurologiques. La production spécifique d'IgG et/ou d'IgM est détectable chez plus ou moins 80% des patients avec une neuroborréliore définie dès le début de la troisième semaine et chez tous les patients 6 à 8 semaines après l'apparition des symptômes neurologiques6. L'absence de production d'anticorps intrathécaux ou la présence 4. 5. 6. 7. 8. 9. Diagnosis of spirochetal meningitis by enzyme-linked immunosorbent assay and indirect immunoflourescence assay in serum and cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol; 21: 819-25. Hansen K, Hindersson P, Pedersen NS. (1988) Measurement of antibodies to the Borrelia burgdorferi flagellum improves serodiagnosis in Lyme disease. J Clin Microbiol 26: 338-46. Hansen K, Lebech A-M. (1991) Lyme neuroborreliosis: a new sensitive diagnostic assay for intrathecal synthesis of Borrelia burgdorferi-specific immunoglobulin G, A, and M. Ann Neurol; 30: 197-205. Craft JE, Duncan KF, Shimamoto GT, Steere AC. (1986) Antigens of Borrelia burgdorferi recognized during Lyme disease. Appearance of a new immunoglobulin M response and expansion of the immunoglobulin G response late in the illness. J Clin Invest 78: 934-9. Karlsson M, Möllegard I, Stiernstedt G, Henriksson M, Wretlind B. (1988) Characterization of antibody response in patients with Borrelia meningitis. Serodiagn Immunother Infect Dis; 2: 375-86. Wilske B, Schierz G, Preac-Mursic V, von Busch K, Kühbeck R, Pfister HW, et al. (1986) Intrathecal production of specific antibodies against Borrelia burgdorferi in patients with lymphotic meningoradiculitis (Bannwarth’s syndrome). J Infect Dis; 153: 304-14. 10. Hansen K, Cruz M, Link H. (1990) Oligoclonal Borrelia burgdorferi-specific IgG antibodies in cerebrospinal fluid in Lyme neuroborreliosis. J Infect Dis; 161: 1194-202. 11. Karlsson M. (1990) Western immunoblot and flagellum enzyme-linked immunosorbent assay for serodiagnosis of Lyme borreliosis. J Clin Microbiol 28: 2148-50. IFU X7840B Révisé Janvier 2017 OXOID Limited, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, RG24 8PW, Royaume-Uni Pour toute information, veuillez contacter votre distributeur local(e).