immunogenicite de la mort cellulaire induite par

UNIVERSITE PARIS XI
FACULTE DE MEDECINE PARIS-SUD
THESE
pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS XI
Champ disciplinaire : Immunologie
Ecole doctorale de rattachement : Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé
Présentée et soutenue publiquement par
Laetitia AYMERIC
Le 08 juillet 2011
IMMUNOGENICITE DE LA MORT CELLULAIRE INDUITE
PAR LES CHIMIOTHERAPIES ANTI-CANCEREUSES
Directeur de thèse : Pr. Laurence ZITVOGEL
Composition du jury :
Président
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Directeur de thèse
Pr. Eric SOLARY
Pr. Muriel MOSER
Pr. Nicolas GLAICHENHAUS
Dr Jenny VALLADEAU
Dr Kamel BENLAGHA
Pr. Laurence ZITVOGEL
1
REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier ma directrice de thèse, le professeur Laurence ZITVOGEL, pour m’avoir
accueillie dans son laboratoire, pour sa présence et son dynamisme moteur au quotidien.
Merci également aux docteurs Evelyn ULLRICH, Magali TERME, Grégoire MIGNOT et
Mathieu BONMORT, pour m’avoir aidée à faire mes premiers pas dans le laboratoire, en
ayant pris le temps de m’enseigner le fonctionnement de celui-ci et quelques bases
expérimentales.
Un merci particulier à Sophie VIAUD, aussi serviable que compétente, qui a su m’apporter
de précieux conseils techniques tout au long de ma thèse.
Merci également aux docteurs Nathalie CHAPUT, Sylvie RUSAKIEWICZ et Dalil
HANNANI pour les discussions scientifiques passionnantes que nous avons eues ensembles.
Merci à tous mes collègues qui savent travailler dur dans la bonne humeur et avec un bon état
d’esprit, sans lesquels ma thèse n’aurait pas été la même.
Je tiens à remercier très sincèrement les responsables de l’animalerie de l’IGR (SCEA), M.
Patrick GONIN et Mme Karine SER LE ROUX, pour leur compétence et leur ouverture
d’esprit. Ils ont toujours su concilier au mieux les exigences de leur structure avec nos
travaux scientifiques.
Merci à tous nos collaborateurs pour leur générosité. Un merci particulier au docteur Kamel
BENLAGHA, pour m’avoir fait profiter de son expertise sur les NKT à un moment de ma
thèse.
Enfin, je remercie chacun des membres de mon jury pour avoir accepter d’apporter leur
jugement éclairé à mon travail. Je remercie sincèrement les professeurs Muriel MOSER et
Nicolas GLAICHENHAUS pour avoir accepté la tâche d’évaluer mon rapport de thèse.
2
RESUME
Le développement d’un cancer chez un individu immunocompétent témoigne de
l’inefficacité de ses défenses immunitaires naturelles à entraver la progression tumorale. La
restauration ou l’induction de réponses immunitaires anti-tumorales efficaces sont des enjeux
majeurs des stratégies thérapeutiques actuelles. En plus des immunothérapies classiques,
visant à activer le système immunitaire des patients contre leurs tumeurs, les thérapies
conventionnelles, telles que les chimiothérapies et la radiothérapie, peuvent avoir des effets
immunostimulants, en parallèle de leur effet directement cytotoxique sur les cellules
tumorales. Parmi celles-ci, les anthracyclines, l’oxaliplatine et la radiothérapie sont
notamment capables d’induire une mort cellulaire immunogène. L’efficacité thérapeutique de
ces traitements dépend de l’activation de lymphocytes T (LT) CD8 anti-tumoraux,
producteurs d’interféron-gamma (IFN-γ). En utilisant des modèles murins de tumeurs
transplantées, nous montrons que le traitement des cellules tumorales par des drogues
immunogènes induit la libération d’adénosine triphosphate (ATP) dans le milieu extracellulaire. Ce signal de danger endogène se lie à son récepteur P2RX7 sur les cellules
dendritiques et permet la formation de l’inflammasome NLRP3/ASC/pro-caspase 1,
conduisant à l’activation protéolytique de la caspase 1, qui active la pro-interleukine-1β (proIL-1β) en interleukine-1β (IL-1β). L’IL-1β peut directement agir sur les LT CD8 pour
faciliter leur polarisation vers un phénotype de lymphocytes T cytotoxiques de type 1 (Tc1).
De plus, le traitement de tumeurs établies par des drogues immunogènes induit une
production d’IL-17A (IL-17) dans le lit tumoral, au cours de la première semaine suivant le
traitement. Les LT gamma delta (LTγδ) sont les principaux producteurs de cette cytokine
dans nos modèles. Ces cellules s’accumulent transitoirement dans la tumeur dès le troisième
jour suivant le traitement et leur taux est parfaitement corrélé à celui des LT CD8 producteurs
d’IFN-γ tumoraux. Comme l’IFN-γ, l’IL-17 et les LTγδ sont nécessaires à l’efficacité
thérapeutique des drogues immunogènes. L’IL-1β produite par les cellules dendritiques
exposées à des corps apoptotiques immunogènes stimule directement la production d’IL-17
par les LTγδ. Ces travaux ont contribué à identifier l’ATP extra-cellulaire comme un
déterminant moléculaire de l’immunogénicité des cellules tumorales exposées à certaines
thérapies anti-cancéreuses conventionnelles. De plus, nous montrons que les traitements
cytotoxiques classiques peuvent moduler l’environnement immunitaire dans le lit tumoral, et
contribuer à remplacer une inflammation chronique et immunosuppressive en une
inflammation aigüe et immunogène. L’étude des interactions entre le système immunitaire et
les thérapies anti-cancéreuses conventionnelles est nécessaire pour utiliser ces traitements de
manière plus rationnelle, en les combinant par exemple à des immunothérapies plus
classiques.
3
ABREVIATIONS
ADN : acide désoxyribonucléique
ARN : acide ribonucléique
ASC : “apoptosis-associated speck-like protein”
ATP : adénosine triphosphate
BM-DC : cellules dendritiques dérivées de la moëlle osseuse
CD : “cluster of differentiation”
CMH : complexe majeur d’histocompatibilité
COX-2 : cyclo-oxygénase 2
HMGB1 : ”high mobility group box 1”
IFN : interféron
IL: interleukine
IL-1R : récepteur à l’interleukine 1
IL-1RA : antagoniste naturel du récepteur à l’interleukine 1
IL-17 : interleukine 17A
LB : lymphocyte(s) B
LT : lymphocyte(s) T
LTγδ : lymphocytes T gamma delta
MDSC : cellules myéloïdes immatures immunosupressives
NFκB : “nuclear factor-κB”
NLRP3 : “NLR family, pyrin domain-containing 3”
NO : oxyde nitrique
pDC : cellules dendritiques plasmocytoïdes
TAM : macrophages associés aux tumeurs
Tc : lymphocytes T cytotoxiques
TGF-β : “transforming growth factor-β”
Th : lymphocyte T CD4 auxiliaire
TLR : récepteur de type Toll
Treg : lymphocytes T régulateurs
VEGF : “vascular endothelial growth factor”
WT : non mutées
4
SOMMAIRE
REMERCIEMENTS ............................................................................................................... 2 RESUME .................................................................................................................................. 3 ABREVIATIONS ..................................................................................................................... 4 SOMMAIRE............................................................................................................................. 5 INTRODUCTION.................................................................................................................... 6 1 La présence d’un danger : une condition nécessaire à l’activation du système immunitaire ?
............................................................................................................................................................ 6 1.1 La théorie du danger et les signaux de danger ................................................................................... 6 1.2 Les réponses immunitaires au danger ................................................................................................. 9 2 Les réponses immunitaires naturelles dans le cancer............................................................... 19 2.1 Les tumeurs : tolérance ou immunité ? ............................................................................................. 19 2.2 Environnement tumoral et immunosuppression .............................................................................. 31 3 Les solutions thérapeutiques pour activer des réponses immunitaires anti-tumorales
efficaces ............................................................................................................................................ 39 3.1 L’utilisation de ligands de TLR en immunothérapie anti-cancéreuse ........................................... 39 3.2 Effets immunostimulants des thérapies anti-cancéreuses conventionnelles ................................... 43 4 Contexte d’étude et objectifs de la thèse .................................................................................... 51 4.1 Les mécanismes moléculaires de l’immunogénicité de la mort cellulaire induite par certaines
thérapies anti-cancéreuses conventionnelles ........................................................................................... 51 4.2 Problématiques de la thèse ................................................................................................................. 53 MATERIEL ET METHODES ............................................................................................. 54 RESULTATS .......................................................................................................................... 57 1 Rôle de l’activation de l’inflammasome NLRP3 et de la production d’IL-1β par les cellules
dendritiques dans l’efficacité des chimiothérapies immunogènes .............................................. 57 2 Rôle des LTγδ producteurs d’IL-17 dans l’efficacité thérapeutique de thérapies anticancéreuses conventionelles ........................................................................................................... 60 DISCUSSION ......................................................................................................................... 62 1 Importance des modèles de tumeurs établies ............................................................................ 62 2 Rôle de l’ATP extra-cellulaire dans le développement de réponses immunitaires spécifiques
.......................................................................................................................................................... 63 3 Rôle de l’IL-1β dans le développement de réponses Th1 et Tc1 spécifiques .......................... 65 4 Rôle de l’IL-17 dans le développement de réponses Th1 et Tc1 spécifiques .......................... 66 5 Rôle de l’IL-17 et de l’IL-1β dans la progression tumorale ..................................................... 69 CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................................................................. 70 REFERENCES ....................................................................................................................... 73 ANNEXES .............................................................................................................................. 88 5
INTRODUCTION
1 La présence d’un danger : une condition nécessaire à l’activation du système
immunitaire ?
1.1 La théorie du danger et les signaux de danger
1.1.1 Présentation de la théorie du danger
Initialement, la reconnaissance de structures moléculaires étrangères à l’organisme
était considérée comme la principale condition d’activation du système immunitaire.
Cependant, la seule dichotomie entre le « soi » et le « non soi » ne permet pas d’expliquer
toutes les situations d’activation ou de non activation du système immunitaire. Celui-ci est en
effet capable de s’activer dans des conditions exemptes d’agents étrangers, dans certaines
maladies auto-immunes par exemple. A l’inverse, il peut être tolérant à la présence
d’organismes étrangers, tels que les bactéries de la flore commensale. Dans les années 1990,
P Matzinger propose que l’activation du système immunitaire soit déterminée par la
reconnaissance d’un danger pour l’intégrité de l’organisme, lié ou non à la présence d’un
agent étranger 1. Ainsi, les situations de stress ou de destruction tissulaire non contrôlée
mèneraient à la production de signaux de danger, servant d’alerte pour le système
immunitaire. Cette théorie pourrait notamment expliquer pourquoi l’organisme tolère un
fœtus en bonne santé, alors qu’il peut rejeter un greffon, deux entités qui font pourtant partie
du « non soi ».
1.1.2 Les signaux de danger
1.1.2.1 Les signaux de danger liés à une infection par un
microorganisme
Certains signaux de danger sont des molécules de l’organisme (signaux endogènes) et
d’autres viennent de l’extérieur (signaux exogènes). Au cours d’une infection, l’intrusion
d’un microorganisme pathogène constitue un danger exogène. Les signaux de danger liés à
une infection sont appelés PAMPs (« Pathogen Associated Molecular Patterns ») 2. Parmi
ceux-ci, se trouvent des molécules glycolipidopeptidiques des enveloppes microbiennes, des
6
protéines et des acides nucléiques (Tableau 1) 2. Les PAMPs sont des structures moléculaires
spécifiques à des classes de microorganismes et ne font en général pas partie du « soi ».
Types de molécules
structures
glycolipidopeptidiques
de l'enveloppe
protéines
Exemples
acide lipotéichoïque
lipopolysaccharide (LPS)
peptidoglycane
Microorganismes
bactéries gram + (ex: Staphylococcus)
bactéries gram - (ex : Salmonella)
bactéries gram + et gram -
lipoarabinomannanes et lipomannanes
bactéries du genre Mycobacterium
zymosan (polysaccharide)
lipoproteines and lipopeptides
flagelline
porines
ADN non méthylé
levures (Saccharomyces)
bactéries du genre Mycoplasma
bactéries motiles
certaines bactéries (ex : Neisseria)
bactéries, virus à ADN, protozoaires
virus à ARN (ex : reovirus, VRS,
WNV)
certains virus (ex : VIH)
bactérie ou virus endocytés
bactérie ou virus intra-cellulaires
ARN db
acides nucléiques
ARN sb riche en GU
ARN et ADN dans les endosomes
ARN db et ADN db cytosoliques
Tableau 1 : Exemples de signaux de danger liés à une infection microbienne (ADN :
acide désoxyribonucléique ; ARN : acide ribonucléique ; sb : simple brin ; db : double brin ;
VRS : virus respiratoire syncytial ; WNV : virus du Nile occidental ; VIH : virus de
l’immunodéficience humaine).
Les PAMPs sont capables de signaler la présence d’un danger en activant des cellules de
l’immunité innée par l’intermédiaire de récepteurs spécifiques (cf 1.2.1).
1.1.2.2 Les signaux de danger non microbiens
Dans des conditions stériles, exemptes de pathogènes, des signaux de danger exogènes
et endogènes peuvent alerter le système immunitaire (Tableau 2). Alors que les signaux
exogènes proviennent de l’environnement, les signaux endogènes sont libérés dans des
conditions de destruction tissulaire massive et non contrôlée. Parmi les signaux endogènes,
certains sont libérés par les cellules nécrotiques et d’autres résultent de la dégradation de la
matrice extra-cellulaire. Les signaux de danger liés à une destruction tissulaire sont
collectivement appelés « DAMPs » (« Dammage Associated Molecular Patterns ») 3.
7
Type de danger
endogène
exogène
Provenance
Exemples
molécules intra-cellulaires HMGB1, ATP, acide urique, ADN,
libérées par les cellules
ARN, HSP (HSP70, HSP90, GP96),
nécrotiques
protéines S100, SAP130, IL-1α, IL-33
dégradation de la matrice
extra-cellulaire
biglycan , hyaluronane, heparane
sulphate, peptides formylés, versican
environnement
silice, amiante, irritants cutanés (ex
dinitrofluorobenzene), UVB
Tableau 2 : Exemples de signaux de danger non microbiens (HSP : protéines de choc
thermique ; IL : interleukine ; HMGB1 : high mobility group box 1) (d’après Chen GY, 2010
3
).
Différentes agressions extérieures, de nature microbiennes, chimiques ou physiques,
peuvent être à l’origine de dommages tissulaires. Certains irritants chimiques, tels que
l’amiante ou la silice, sont des signaux capables d’activer directement les récepteurs de
danger (cf 1.2.1) (Tableau 2) 4. Des stress endogènes, liés par exemple à une insuffisance
métabolique comme au cours de l’ischémie de reperfusion, peuvent également être à l’origine
d’une destruction tissulaire importante. Dans tous les cas, les protéases libérées par les
cellules mourantes ou impliquées dans le remodelage tissulaire peuvent dégrader la matrice
extra-cellulaire et libérer des signaux de danger, comme le biglycan ou le hyaluronane par
exemple (Tableau 2) 3. Une destruction tissulaire importante est en général associée à un fort
taux de nécrose cellulaire. Ce type de mort se caractérise par une augmentation du volume
cellulaire et de celui des organelles et par la perte de l’intégrité de la membrane plasmique,
entrainant la libération du contenu cellulaire dans le milieu extra-cellulaire, et notamment de
molécules pouvant signaler un danger, comme par exemple HMGB1, l’ATP ou l’acide urique
(Tableau 2). Les cellules nécrotiques peuvent aussi libérer des cytokines inflammatoires
préformées et stockées dans leurs organelles, comme l’IL-1α et l’IL-33 (Tableau 2).
Contrairement à la nécrose, la mort par apoptose se caractérise par la diminution du volume
cellulaire avec condensation de la chromatine, fragmentation nucléaire et bourgeonnement de
la membrane plasmique en petites vésicules appelées corps apoptotiques. La mort par
apoptose est un phénomène programmé impliquant différentes voies de signalisation
cellulaire dont celles utilisant les caspases. Classiquement, l’apoptose est considérée comme
une mort non inflammatoire et non immunogène, surtout impliquée dans des conditions
8
physiologiques liées au développement et à l’homéostasie tissulaire 5. Cependant, la
dichotomie entre nécrose et apoptose a été remise en question par l’observation que des
cellules nécrotiques peuvent induire une tolérance et que des cellules en apoptose peuvent
induire un état inflammatoire et une réponse immunitaire 6 ;7. De plus, il se peut qu’un fort
taux d’apoptose dans un tissu surpasse les capacités d’élimination du système phagocytaire.
Dans ce cas, les cellules peuvent entrer dans un état de nécrose secondaire, avec libération de
signaux de danger inflammatoires dans le milieu.
1.2 Les réponses immunitaires au danger
1.2.1 Les principales familles de récepteurs des signaux de danger
Les récepteurs des signaux de danger peuvent être classés en quatre grandes
catégories : les récepteurs de type Toll (TLR), les récepteurs de type NOD (NLR), les
hélicases de type RIG (RLR) et les lectines de type C 8. Les TLR et certaines lectines de type
C sont des protéines transmembranaires, alors que les NLR et les RLR sont essentiellement
cytosoliques. Ces récepteurs sont exprimés dans différentes cellules de l’immunité innée ainsi
que dans d’autres cellules comme les cellules épithéliales ou endothéliales.
Les TLR font partie d’une famille de molécules phylogénétiquement conservées, dont
le premier membre a été découvert chez la drosophile pour son implication dans le
développement et l’immunité de cet organisme 9. Il existe 10 membres connus de cette
famille chez l’Homme. Certains TLR (TLR-1, -2, -4, -5 et -6) se trouvent sur la membrane
plasmique et d’autres sont présents au niveau de la membrane des endosomes (TLR-3, -7, -8
et -9). Tous les TLR possèdent un domaine de reconnaissance des PAMPs ou des DAMPs qui
est un domaine riche en motifs à répétition de leucines (LRR). Le domaine effecteur des TLR
(domaine TIR), se trouve sur la face cytosolique. Les TLR endosomaux reconnaissent
essentiellement des acides nucléiques, tels que les ARN simple brin pour les TLR-3, -7, -8 et
l’ADN non méthylé pour le TLR-9. En revanche, les TLR de la membrane plasmique
reconnaissent plutôt des ligands présents à la surface des pathogènes, tels que le LPS, la
flagelline ou l’acide lipotéichoïque pour les TLR-4, -5 et -2 respectivement. Les TLR-2 et -4
sont également impliqués dans la reconnaissance de nombreux signaux de danger endogènes,
comme HMGB1, les protéines de choc thermique, le hyaluronane ou le biglycan 3.
9
Les NLR sont une grande famille de protéines comprenant 23 membres chez
l’Homme et 34 chez la souris. Comme les TLR, ces protéines possèdent un domaine de
reconnaissance des DAMPs ou des PAMPs, également caractérisé par la présence de
répétition de leucines (LRR). Le domaine central de la protéine est très conservé au sein de la
grande famille des NLR et constitue une caractéristique de ces molécules. Ce domaine central
est un domaine d’oligomérisation dépendant de l’ATP (NBD). Enfin, les NLR possèdent un
domaine effecteur dont la nature permet de classer les NLR en quatre catégories : les NLRA,
les NLRB, les NLRC et les NLRP. Ces derniers sont une grande famille de 14 protéines, dont
le domaine effecteur est un domaine pyrine (PYD) d’interaction homophilique. L’activation
de certains NLR, comme NLRP3, NLRC4 et NLRP1, induit la formation de grosses
structures moléculaires, appelées inflammasomes. Les inflammasomes sont composés des
NLR et de protéines adaptatrices, telle que la protéine ASC (apoptosis-associated speck-like
protein) pour les NLRP1 et 3, qui permettent le recrutement et l’auto-activation de la procaspase 1 en caspase 1. Une fois activée, la caspase 1 catalyse le clivage des pro-cytokines :
pro-IL-1β et pro-IL-18, en leurs formes matures et actives (Figure 1). Certains NLR sont
activés par un nombre limité de ligands. Ceci est le cas de NOD-1 et NOD-2 (respectivement
NLRC 1 et NLRC 2) qui sont activés par des dipeptides exprimés par différentes bactéries.
En revanche, NLRP3 répond à une grande variété de signaux de danger, parmi lesquels des
activateurs endogènes (ex : ATP, acide urique) et des activateurs exogènes (ex : silice,
amiante, ARN bactérien ou viral) (Figure 1). Les modalités de reconnaissance de tous ces
signaux ne sont pas complètement élucidées mais il est probable que ces activateurs génèrent
un intermédiaire commun reconnu par NLRP3 10.
10
Figure 1 : Structure de l’inflamasomme NLRP3/ASC/caspase 1 et diversité des signaux
de danger activateurs (d’après Davis BK, Ann Rev Immunol, 2011 10).
Les RLR sont une petite famille comprenant notamment les deux protéines
cytosoliques RIG-I et MDA5. Les RLR possèdent un domaine de reconnaissance des ARN
viraux, qui est un domaine hélicase à ARN dépendant de l’ATP. Le domaine effecteur des
RLR est un domaine d’interaction homophilique CARD. Enfin, les lectines de types C sont
une très grande famille de protéines possédant toutes au moins un domaine lectine de type C,
spécialisé dans la reconnaissance des structures glucidiques. Parmi tous les membres de cette
famille, certains sont impliqués dans la reconnaissance des signaux de danger. Par exemple,
la dectine 1 est une protéine transmembranaire exprimée majoritairement sur les cellules
inflammatoires (monocytes, macrophages, neutrophiles, cellules dendritiques) et qui
reconnait les β glucanes de la paroi des champignons et des bactéries. Mincle (CLEC4A), un
autre membre de cette famille présent sur les macrophages activés et sur les cellules
dendritiques, est capable de reconnaitre la protéine SAP130 libérée par les cellules
nécrotiques 11.
11
1.2.2 Signaux de danger et inflammation
1.2.2.1 Principales voies de signalisation des récepteurs des signaux
de danger
L’inflammation est une réponse physiologique à un stimulus perçu comme dangereux
par l’organisme (ex : infection, destruction tissulaire). Cette réponse se caractérise par le
recrutement de cellules de l’immunité innée, le plus souvent les neutrophiles et des
macrophages, dans les tissus. Ceci s’accompagne de la production de cytokines, de
chimiokines et d’autres molécules inflammatoires qui entretiennent ou amplifient le
recrutement des leucocytes. L’activation des récepteurs des signaux de danger mène à
l’expression de gènes de l’inflammation au niveau des cellules immunitaires et d’autres
cellules comme les cellules épithéliales. Les voies de signalisation en aval de la plupart des
récepteurs de signaux de danger convergent vers l’activation des facteurs de transcription
NFκB (nuclear factor-κB) et IRF-3 et -7 8. NFκB induit la transcription de nombreux gènes de
l’inflammation (cytokines, chimiokines, molécules d’adhésion) et IRF-3 et IRF-7 activent la
synthèse d’ARNm d’interferon (IFN) de type 1 (Figure 2).
L’activation et la dimérisation des TLR induisent le recrutement de molécules
adaptatrices, appartenant à 4 grandes familles : Myd88, TRIF, TIRAP et TRAM (Figure 2).
Dans les cellules dendritiques myéloïdes et les macrophages, l’activation de MyD88 et de
TRIF conduit respectivement à l’activation de NFκB et d’IRF-3. Dans les cellules
dendritiques plasmocytoïdes (pDC), l’activation de MyD88 par les TLR-7 et -9 aboutit à la
phosphorylation activatrice d’IRF-7. De même, l’activation de NOD-1 et NOD-2 induit leur
oligomérisation dépendante de l’ATP et le recrutement de la protéine adaptatrice RICK, qui
active NFκB (Figure 2). Les RLR RIG-I et MDA5 recrutent une molécule adaptatrice
mitochondriale présentant un domaine CARD : IPS 1 (également appelée MAVS ou Cardif).
IPS1 peut ensuite activer NFκB et le complexe IRF3/7 (Figure 2). Enfin, certains membres
des lectines de types C, comme les dectines 1 et 2 et Mincle, activent une voie de
signalisation dépendante de Syk et de CARD9, qui aboutit à l’activation de NFκB.
12
TLR
mb plasmique
cytosol
RLR
NLR
mitochondrie
INFLAMASOMME
Figure 2 : Convergence des voies de signalisation des TLR, RLR et NLR, vers
l’activation des facteurs de transcription NFκB et IRF3/7 (seules les molécules
adaptatrices et les facteurs de transcription terminaux sont représentés) (d’après Kumar H,
2011 8).
Les voies de signalisation en aval des récepteurs de signaux de danger convergent
donc vers la production de cytokines inflammatoires. Chaque situation dangereuse pour
l’intégrité de l’organisme déclenchera une réponse inflammatoire particulière, qui dépend de
la nature des signaux de danger, ainsi que de leur intégration par les cellules du tissu. Des
interactions entre ces différentes voies de signalisation peuvent mener à des synergies. Ceci
est notamment le cas pour la production d’IL-1β par l’intermédiaire de l’inflammasome
NLRP3. L’activation de l’inflammasome nécessite en effet une étape de « priming » par un
ligand de TLR, augmentant la synthèse de NLRP3 et de pro-IL-1β
12
. Enfin, certains
récepteurs n’appartenant pas aux catégories décrites ci-dessus sont capables de reconnaitre
des signaux de danger. Parmi ceux-ci, RAGE, qui reconnait HMGB1 ou les protéines S100,
favorise la production de cytokines inflammatoires, alors que CD24, un récepteur de HMGB1
et des HSP, joue un rôle dans le contrôle négatif de l’inflammation 13 ; 14
13
1.2.2.2 Inflammation et danger : entre destruction et préservation
tissulaire
L’inflammation est donc déclenchée lorsque des signaux de danger sont perçus par
l’organisme, et notamment par les cellules de l’immunité innée. En raison de leur manque de
spécificité, les réactions inflammatoires peuvent induire des dommages tissulaires. En effet,
des études chez la souris ont montré que l’activation de certains TLR et NLR pouvait induire
une réponse inflammatoire délétère pour les tissus de l’organisme. Par exemple, les TLR-2 et
-4 ont été impliqués dans la destruction des tissus suite à des ischémies de reperfusion dans de
nombreux organes (foie, rein, cœur, cerveau) 15.
Dans des situations non pathologiques, la réaction inflammatoire est transitoire. A la
fin d’une inflammation aigüe, des mécanismes de réparation et de préservation tissulaires se
mettent en place. Des études chez la souris ont montré qu’au cours d’une inflammation,
l’activation des TLR et des NLR par les signaux de danger peut permettre de limiter la
destruction tissulaire, en favorisant des phénomènes de préservation tissulaires. Les TLR-4 et
-2 et NLRP3 ont tous été impliqués dans la réparation tissulaire de l’épithélium intestinal
suite à des dommages causés par des agents chimiques irritants 16 ; 17. Au niveau pulmonaire,
TLR-2 et -4 sont impliqués dans la résistance des cellules épithéliales à l’apoptose suite à
l’administration de bléomycine
18
. De même, au cours d’une infection par le virus de la
grippe, l’activation de NLRP3 par l’ARN viral semble importante pour limiter la nécrose
tissulaire initiale, pouvant entrainer des complications respiratoires à long terme 19. Enfin, les
TLR sont impliqués dans la formation de tissus fibreux, signe d’un processus de cicatrisation
exacerbé et défectueux, impliquant les fibroblastes et la synthèse de collagène. Chez
l’Homme, un polymorphisme de TLR4 associé à une plus faible activation du récepteur, a
notamment été associé à un risque amoindri de fibrose hépatique chez les patients atteints
d’hépatite C chronique
20
. L’induction d’une réponse inflammatoire favorisant la réparation
tissulaire est notamment importante dans des situations de nécrose tissulaire stérile. Ainsi, les
cellules nécrotiques induisent l’expression de molécules impliquées dans l’inflammation et la
réparation tissulaire dans les macrophages et les fibroblastes, selon un mécanisme dépendant
de TLR2 21. De même, lorsqu’ils sont exposés au hyaluronane, un signal de danger endogène,
les monocytes sécrètent des cytokines impliquées dans la réparation tissulaire comme TGF-β2
(transforming growth factor-β2) et MMP-13 (matrix metalloproteinase-13), et présentent
14
donc une réponse différente de celle au LPS. Bien que le LPS et le hyaluronane se lient tous
les deux au TLR4, ces deux signaux de danger utilisent des corécepteurs différents : MD2 et
CD44 pour le hyaluronane et CD14 pour le LPS
22
. Ainsi, bien que pouvant utiliser les
mêmes récepteurs principaux, les signaux de danger exogènes et endogènes ne sont pas
toujours qualitativement identiques et pourraient même conduire à des résultats opposés sur la
réponse inflammatoire.
1.2.3 Reconnaissance du danger et immunité adaptative
Dans des situations non pathologiques, la réaction inflammatoire permet l’élimination
du stimulus déclencheur et est donc transitoire. Dans certains cas, comme au cours d’une
infection, le système immunitaire inné peut coopérer avec le système adaptatif pour éliminer
le danger. Les cellules dendritiques sont des cellules de l’immunité innée ayant un rôle
important dans l’activation de l’immunité adaptative. L’intégration de différents signaux de
danger par ces cellules est déterminante pour leur activation, leur migration et leur fonction
de présentation antigénique. Des études ont montré que la présence d’un antigène et d’un
ligand de TLR-2 ou -4 dans un même phagosome influençait la maturation de ce dernier et
facilitait la présentation des antigènes sur les complexes majeurs d’histocompatibilité de
classe 2 (CMH II) à la surface des cellules dendritiques. En revanche, les antigènes
phagocytés en l’absence d’un signal TLR sont dégradés par les enzymes lysosomales sans
être présentés par les cellules dendritiques 23. La nature des signaux de danger joue également
un rôle dans le type de cytokines sécrétées par les cellules dendritiques, impliquées dans la
différenciation des lymphocytes T (LT) CD4 auxiliaires (Th) vers un profil Th1, Th2 ou
Th17. Le développement d’une réponse adaptative est favorisé par la présence de signaux de
danger mais dépend également de la nature des antigènes associés à ces signaux de danger.
Ainsi, dans des cas d’inflammation stérile, déclenchée par un fort taux de nécrose tissulaire,
les antigènes potentiels appartiennent au « soi » et sont donc moins susceptibles de
déclencher une réponse immunitaire, en raison des différents mécanismes de tolérance
centrale et périphérique existants
24
. Cependant, dans des cas pathologiques, la présence de
signaux de danger peut favoriser une rupture de tolérance et le développement de pathologies
auto-immunes. Ceci est le cas dans le lupus érythémateux, caractérisé par la présence d’autoanticorps dirigés notamment contre des acides nucléiques
25
. Des modèles animaux ont
montré qu’un défaut d’élimination des corps apoptotiques pouvait favoriser le développement
de la maladie. Ceci suggère que les signaux de danger endogènes libérés par les cellules en
15
nécrose secondaire pourraient jouer un rôle dans la rupture de la tolérance. De plus, les TLR7 et -9 ont respectivement été impliqués dans l’apparition d’auto-anticorps contre l’ARN et
l’ADN endogène (Figure 3). D’autres études indiquent que les acides nucléiques endogènes
peuvent être endocytés par les lymphocytes B (LB) (via leur BCR) et activer ces cellules en
se liant aux TLR-7 et -9 des endosomes. De plus, les complexes immuns formés par ces autoanticorps se déposent au niveau des articulations et du rein et entrainent une inflammation
délétère pour l’intégrité des tissus. Les TLR-7 et -9 sont aussi impliqués dans l’entretien de
cet état inflammatoire (Figure 3). Chez l’Homme, des études in vitro ont montré que les
complexes immuns présents dans le sérum des patients pouvaient stimuler la production
d’IFN-α par les pDC, suite à leur endocytose par le récepteur FcγRII 26.
Figure 3 : Implication des TLR-7 et -9 dans l’activation des LB et des pDC par des
acides nucléiques endogènes (d’après Krieg AM, Immunity, 2007 27).
16
Comme les TLR, certains NLR ont un rôle dans l’induction de réponses immunitaires
spécifiques. Ceci est notamment le cas de NOD-2, important pour l’effet adjuvant du MDP
(muramyl dipeptide)
28
. L’effet de l’activation du NLR NLRP3 sur l’induction de réponses
immunitaires spécifiques est controversé. Par exemple, NLRP3 semble important dans
l’induction de LT spécifiques dans la réaction d’hypersensibilité de contact induite par le
trinitrochlorobenzène
29
. De même, NLRP3 est impliqué dans l’induction d’une immunité
cellulaire spécifique par les adjuvants particulaires de type PLG (poly(lactide-co-glycolide)
30
. L’acide urique, un activateur de NLRP3 libéré par les cellules nécrotiques a une fonction
d’adjuvant pour le développement de réponses CD8 spécifiques
31
. De plus, certaines études
ont montré que l’induction de réponses humorales par l’alun, un des adjuvants les plus utilisé
chez l’Homme, nécessitait l’inflammasome NLRP3
32
. En revanche, d’autres études ont
montré qu’en dépit de la capacité de l’alun à activer l’inflammasome NLRP3, ce dernier
n’était pas indispensable à son effet adjuvant 33. De même, l’activation de NLRP3 au cours
d’une infection par le virus Influenza A entraine une inflammation pulmonaire mais ne
semble pas importante pour le développement d’une réponse cellulaire anti-virale
34 19 35
.
Chez l’Homme, les cryopyropathies (CAPS) sont des pathologies caractérisées par une
mutation gain de fonction dans le gène codant pour NLRP3, ce qui résulte en une surproduction d’IL-1β. Ces pathologies font partie des pathologies auto-inflammatoires,
caractérisées par des phases de réactions inflammatoires imprévisibles. Par définition, ces
maladies ne sont pas associées au développement d’une auto-immunité spécifique
36
. La
goutte est une autre pathologie auto-inflammatoire causée par le dépôt de cristaux d’urate de
sodium au niveau des articulations. Bien que ceci active l’inflammasome NLRP3 et soit à
l’origine d’une sur-production d’IL-1β, aucune immunité adaptative n’est détectée
36
. Ainsi,
la détection de signaux de danger ne mène pas toujours à l’activation de réponses
immunitaires spécifiques. Dans certains cas, les mécanismes de tolérance contre des antigènes
du soi expliquent l’absence de réponse adaptative.
17
► Conclusion de la partie 1 :
La présence d’une situation dangereuse pour l’intégrité de l’organisme déclenche une
réaction inflammatoire, impliquant le recrutement de cellules de l’immunité innée dans le
tissu menacé, et la production de facteurs solubles, comme des cytokines et des chimiokines.
L’induction d’une réponse inflammatoire implique la reconnaissance de signaux de danger
par des récepteurs innés, présents à la fois sur les cellules immunitaires, et sur d’autres
cellules, comme les cellules épithéliales, fibroblastiques ou endothéliales. Les signaux de
danger sont des molécules qui témoignent d’une agression extérieure (pathogène, irritant
chimique) ou d’une destruction anormale des tissus de l’organisme. La réponse inflammatoire
est impliquée dans l’élimination du danger ainsi que dans la réparation tissulaire qui suit.
Bien qu’étant associée au déclenchement d’une réponse immunitaire innée, la présence d’un
danger n’est pas toujours à l’origine de l’induction de réponses spécifiques. Ceci dépend des
caractéristiques des antigènes présents, ainsi que de la nature des signaux de danger et des
récepteurs impliqués.
18
2 Les réponses immunitaires naturelles dans le cancer
2.1 Les tumeurs : tolérance ou immunité ?
2.1.1 Les tumeurs sont-elles tolérées par le système immunitaire ?
Les cellules tumorales, qui dérivent des cellules de l’organisme, se développent dans
la majorité des cas chez des individus immunocompétents. Ce constat a amené l’hypothèse
que les tumeurs pourraient être tolérées par le système immunitaire, au même titre que les
tissus de l’organisme non altérés. La tolérance immunitaire peut résulter de l’absence de
reconnaissance de l’antigène (ignorance), ou bien de l’élimination
(délétion) ou de
l’inactivation (anergie) des lymphocytes spécifiques ayant rencontré l’antigène.
2.1.1.1
Les
tumeurs
sont-elles
ignorées
par
le
système
immunitaire ?
Bien que les tumeurs dérivent des cellules du « soi », elles sont caractérisées par une
grande instabilité génétique à l’origine de la formation de nouvelles protéines (néoantigènes)
ou de l’expression ectopique ou anormalement élevée de molécules, ce qui les rend
différentes du « soi ». Il est ainsi possible de trouver des LT ayant une forte avidité pour les
néoantigènes tumoraux dans la circulation, puisque ces antigènes ne sont pas exprimés dans
le thymus, et qu’ils ne participent donc pas à la sélection négative des LT
37
. Malgré la
présence de LT ayant une avidité importante pour certains antigènes tumoraux, certaines
études chez la souris indiquent que les tumeurs sont parfois ignorées par le système
immunitaire, c'est-à-dire que les lymphocytes spécifiques ne rencontrent pas les antigènes.
Différents paramètres pouvant expliquer cet état d’ignorance ont été proposés, tels que la
localisation de la tumeur et la quantité d’antigènes 38. Ainsi, en utilisant plusieurs modèles de
tumeurs injectées en sous-cutané (fibrosarcomes, lymphomes, carcinomes pulmonaires,
mélanomes, mastocytomes) et exprimant différents néoantigènes viraux, une étude a montré
que la progression tumorale était associée à l’absence de réponse CD8 spécifiques et que ceci
était dû à l’absence de pénétration des cellules tumorales dans les organes lymphatiques
secondaires
39
. Dans ces modèles, le développement tumoral ne s’accompagne pas de
l’anergie ou de la délétion des LT spécifiques. En effet, même en présence d’une grosse
tumeur, ces derniers répondent normalement à une stimulation antigénique. De plus, les
19
auteurs montrent que même au sein des organes lymphatiques, certaines tumeurs peuvent
rester invisibles au système immunitaire en étant histologiquement séparées de celui-ci par la
présence d’une capsule fibreuse. De même, contrairement à une injection sous forme de
suspension cellulaire, l’injection de cellules tumorales sous forme de fragments contenant des
cellules stromales empêche leur accès aux organes lymphatiques et ne permet pas le
développement de réponses immunitaires spécifiques 40.
L’ignorance des tumeurs par le système immunitaire pourrait également s’expliquer
par la faible quantité d’antigènes qu’elles expriment, en tous cas à des stades précoces de
développement. Des études ont montré que des tumeurs solides exprimant faiblement un
antigène, bien que pouvant être reconnues par des LT préalablement activés, ne permettaient
pas d’activer des LT anti-tumoraux spécifiques
41
. Les auteurs ont montré que les cellules
dendritiques permettaient la présentation croisée des antigènes tumoraux, à condition que
ceux-ci dépassent un certain seuil d’expression. Cette étude est en accord avec une étude
montrant l’importance de la destruction tissulaire dans la libération d’une quantité suffisante
d’antigènes, pour leur présentation croisée aux LT CD8
42
. Cette théorie expliquerait que le
développement d’une immunité anti-tumorale augmente avec la progression tumorale, celleci étant associée à une augmentation de la quantité d’antigènes tumoraux 43.
Chez l’Homme, la question de l’ignorance des tumeurs par le système immunitaire est
difficile à appréhender, puisqu’il s’agit par définition d’étudier une absence de réponse
immunitaire à des stades très précoces voire infra-clinique de cancer. Bien que les tumeurs
constituent un danger pour l’intégrité et la survie de l’organisme sur le plan clinique, il se
peut que sur le plan moléculaire, aucun signal de danger ne soit présent au cours des premiers
stades de leur développement. Ceci ne s’applique pas à des tumeurs induites par des agents
pathogènes, mais pourrait concerner certaines tumeurs solides, dont le développement
précoce n’est probablement pas associé à une destruction tissulaire massive et incontrôlée.
20
2.1.1.2 Le développement tumoral est-il associé à l’induction d’une
tolérance immunitaire ?
Chez les patients atteints de cancers à des stades cliniquement visibles, il est possible
de mettre en évidence des LT anti-tumoraux. Dans certains cas, des LT spécifiques de
néoantigènes tumoraux sont détectés, ce qui suggère que la tumeur a été reconnue par le
système immunitaire 44. Bien que présents, ces LT spécifiques ne sont pas toujours efficaces.
Par exemple, les LT CD8 anti-tumoraux, directement isolés de patients atteints de mélanome
ne sont pas fonctionnels in vitro
45
. En effet, ces lymphocytes ne présentent pas d’activité
cytotoxique spécifique, ne sont pas capables de sécréter des cytokines (TNF-α et IFN-γ) en
réponse à des mitogènes et ne présentent pas de phénotype d’activation (CD69) suite à une
stimulation antigénique. Chez ces mêmes patients, les LT CD8 spécifiques du virus EpsteinBarr (EBV) sont tout à fait fonctionnels, ce qui suggère que le déficit est spécifique des
réponses anti-tumorales. Dans cette étude, les auteurs ont caractérisé la fonction des
lymphocytes anti-tumoraux directement après leur isolement, sans amplification ou
restimulation lourde in vitro, ce qui permet de rendre compte de l’état d’activation réel des
lymphocytes in vivo. D’autres études ont montré que les LT infiltrant des carcinomes rénaux
chez l’Homme peuvent présenter un défaut de prolifération en réponse à différents stimuli
(IL-2, IL-2 et α-CD3, mitogènes) 46. Enfin, différentes études ont mis en évidence un défaut
d’expression de la sous-unité ζ du récepteur CD3 dans les LT infiltrant des carcinomes
colorectaux et rénaux chez l’Homme 47 48.
Des travaux chez la souris ont montré que la progression tumorale pouvait être
associée à l’induction active d’une tolérance immunitaire, par délétion des LT spécifiques
49
ou par induction de LT anergiques 50 51 52 53. Dans ces cas, les LT spécifiques rencontrent les
antigènes tumoraux et entrent en apoptose ou deviennent fonctionnellement inactifs sans être
nécessairement éliminés. La réversibilité potentielle de l’état anergique expliquerait la
nécessité de restimuler très lourdement les LT anti-tumoraux chez l’Homme, avant de réaliser
des tests fonctionnels 54. L’induction de LT anergiques anti-tumoraux a été montrée pour les
LT CD8
52
et CD4
50
. De nombreuses études ont montré que l’inactivation des LT CD4
nécessitait les cellules présentatrices de l’antigène de l’hôte
55 56
. Concernant les LT CD8, il
semble qu’en plus de la présentation croisée des antigènes tumoraux par les cellules
dendritiques
57
, la présentation directe des antigènes tumoraux par les cellules tumorales en
l’absence de co-stimulation puissent induire une tolérance 58 59.
21
Ainsi, il existe un certain nombre d’arguments montrant que les tumeurs peuvent être
activement tolérées par le système immunitaire. Bien que certaines études indiquent que des
cellules dendritiques matures puissent induire une tolérance 60, d’autres études montrent que
l’induction d’une tolérance immunitaire résulte de la présentation des antigènes par des
cellules dendritiques immatures
61 62
. L’induction d’une tolérance immunitaire contre les
antigènes tumoraux pourrait donc s’expliquer par l’absence d’une quantité suffisante de
signaux de danger capables d’activer les cellules dendritiques au niveau de la tumeur. Ceci est
en accord avec les études montrant que les cellules dendritiques infiltrant les tumeurs peuvent
présenter un phénotype immature
63 64
. De plus, comme nous le verrons en détails dans la
troisième partie, une immunité anti-tumorale peut être restaurée ou induite par
l’administration de signaux de danger, tels que des ligands de TLR (Figure 4).
Absence de
signaux de danger
ligands de TLR
Restauration
thérapeutique des
signaux de danger
Figure 4 : L’absence de signaux de danger au niveau de la tumeur pourrait expliquer
l’induction d’une tolérance immunitaire par les cellules dendritiques immatures (d’après
Rabinovich GA, Ann Rev Immunol, 2007 65).
22
2.1.2 Les tumeurs sont-elles naturellement immunogènes ?
2.1.2.1 Immunodéficiences et incidence de cancer
Le concept d’immuno-surveillance anti-tumorale est né d’une hypothèse spéculative
de Paul Ehrlich en 1909 et a été réénoncé par Burnet et Thomas dans les années 1970. Ce
concept stipule que le système immunitaire est capable de prévenir l’apparition de tumeurs en
éliminant les cellules tumorales au moment de leur apparition. Ainsi, en cas de déficits
immunitaires, ce modèle prédit que la probabilité de développer un cancer sera plus
importante. A cette époque, le manque de preuves expérimentales et notamment l’observation
que les souris athymiques ne développaient pas plus de cancers induits que les souris
immunocompétentes a conduit au rejet de ce concept par la communauté scientifique. A partir
des années 1990, de nouvelles données expérimentales ont contribué à ressusciter ce concept.
En effet, des souris présentant des déficits dans différents acteurs de l’immunité innée ou
adaptative sont plus sensibles au développement de cancers induits ou spontanés que les
souris immunocompétentes (Tableau 3).
Bien que très utiles, ces modèles animaux pourraient ne pas représenter strictement la
réalité complexe de la carcinogenèse chez l’Homme. La question de l’immuno-surveillance
anti-tumorale naturelle chez l’Homme est beaucoup plus difficile à résoudre. En effet, les cas
d’immunodéficience primaire chez l’Homme sont rares et touchent surtout des enfants dont
l’espérance de vie est largement amoindrie sans l’administration de traitements
immunoréparateurs. De ce fait, les études épidémiologiques de l’apparition de cancers sont
difficiles à réaliser. Par exemple, une mutation biallélique du gène de la perforine est associée
au développement de la lymphohistiocytose hémophagocytique familiale (LHF), maladie
inflammatoire entrainant rapidement le décès du patient sans greffe de moelle autologue.
Chez certains patients présentant la mutation, la LHF ne se développe que plus tard ou bien
pas du tout. Ces patients ont un risque accru de développer des lymphomes 67. Les études des
patients présentant une immunodéficience secondaire (patients infectés par le VIH ou ayant
reçu une greffe) donnent des résultats mitigés et peu d’études sur l’impact de polymorphismes
de gènes de l’immunité sur le développement de cancers ont été réalisées à ce jour (Tableau
4).
23
Souche de souris
Déficit immunitaire
Rag2 -/-
absence de LT, de LB et de NKT
Tcrd -/-
absence de LTγδ
Tcrb -/α asialo-GM1
absence de LTαβ
déplétion des cellules NK
absence de LT dépendant du
CD1d
absence de NKT invariants
Cd1d -/Ja18 -/ΔdblGATA et
CD11-/- IL5-/Ifnar1
ou Ifnar2
↑ sarcomes induits par le MCA
absence d'éosinophiles
Ifngr1 -/-/-
Incidence de cancers
↑ sarcomes induits par le MCA
↑ cancers intestinaux et pulmonaires
spontanés
↑ sarcomes induits par le MCA
↑ tumeurs cutanées induites par
DMBA/TPA
-/-
Pfp -/-
Ifng -/-
insensible à l'IFN-γ
pas de réponse à l'IFN-α et IFN-β
↑ sarcomes induits par le MCA
↑ lymphomes B spontanés
absence de perforine
↑ sarcomes induits par le MCA
↑ lymphomes induits par le MNU
absence d'IFN-γ
↑ lymphomes (C57Bl6) et adénocarcinomes
pulmonaires (Balbc) spontanés
↑ lymphomes induits par le MNU
↑ tumeurs cutanées induites par DMBA/TPA
Il12a -/-
absence d'IL-12
Cd80 -/- ou Cd86 -/-
absence de CD80 et CD86
↑ cancers de la peau induits par les UV
Tableau 3 : Incidence de cancers induits ou spontanés chez des souris présentant
différents déficits immunitaires (MCA : méthylcholantrène ; DMBA/TPA :7,12
dimethylbenz(a)anthracene /12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate ; MNU : N-Methyl-Nnitrosourea ; NK : cellules Natural Killer) (d’après Vesely MD, Ann Rev Immunol, 2011 66).
24
Individus
Caractéristiques immunitaires
patients infectés par
le VIH
déficit immunitaire lié à l'apoptose
des LT CD4
patients ayant reçu
une transplantation
(cœur, foie ou rein)
• pas de risque accru de développer certains
immunodéficience secondaire liée à
cancers non viro-induits et qui prédominent
l'administration de différents agents
dans la population générale (ex : sein,
immunosuppresseurs
prostate) 68
patients présentant
une mutation
biallélique du gène
de la perforine
immunodéficience primaire
(cellules NK et LT CD8 peu
fonctionnels)
population générale
faible activité cytotoxique des
cellules NK liée à un
polymorphisme du gène du
récepteur activateur NKG2D
Incidence de cancers
• ↑ incidence de cancers viro-induits 68
• ↑ risque de développer des lymphomes non
nécessairement viro-induits 67
• ↑ risque de développer des cancers non
viro-induits (poumons, intestins) 69 70
Tableau 4 : Influence de déficits immunitaires sur l’incidence de cancers chez
l’Homme.
2.1.2.2 Détection de réponses immunitaires à des stades précoces de
cancers
Une façon d’étudier la question de l’immunogénicité naturelle des tumeurs chez
l’Homme est d’essayer de détecter des réponses spécifiques de certains antigènes tumoraux
chez des patients atteints de stades précoces de cancer. Concernant les réponses humorales, il
est possible de détecter des anticorps dirigés contre des antigènes tumoraux dans le sérum des
patients. Par exemple, des anticorps dirigés contre p53 sont présents dans 46% des cancers de
l’ovaire et 35% des cancers de l’œsophage, des proportions largement supérieures à celles
trouvées chez des sujets sains (Tableau 5). Un taux sérique anormalement élevé d’anticorps
spécifiques de p53 muté ou natif est également détecté dans beaucoup d’autres types de
cancers, comme les cancers de la bouche, du foie, du sein, du poumon et du colon 71 72. Bien
que plus de 100 antigènes tumoraux aient été identifiés comme cibles de réponses humorales
chez l’Homme, seulement certains d’entre-eux ont particulièrement été étudiés, comme cmyc, NY-ESO-1, MUC1, la cycline B1, p62 et la survivine. Des réponses humorales ont été
observées contre ces antigènes dans différents types de cancers (Tableau 5). A part pour
MUC1, la fréquence d’anticorps contre ces antigènes chez les individus non atteints de
cancers est très faible 72.
25
Antigène
p53
c-myc
NY-ESO-1
Her2/neu
MUC1
cyclin B1
p62
survivine
Types de cancers
(fréquence de détection d'IgG)
ovaire, œsophage (30-50 %)
bouche, foie, sein, poumon, colon (5-30 %)
foie, sein, poumon, colon (5-30 %)
poumon, foie, sein (5-30 %)
sein, poumon (10-30 %)
sein, poumon, colon (30-50 %)
colon, poumon (30-50 %)
foie, sein (5-30 %)
poumon, foie (5-30 %)
poumon, sein, foie, colon (5-30 %)
Fréquence d'IgG
chez les sujets sains
2%
1%
1%
2%
23%
1%
1%
1%
Tableau 5 : Diversité des types de cancers associés au développement de réponses
humorales spécifiques contre certains antigènes tumoraux chez l’Homme (d’après
Reuschenbach M, 2009 72).
Certaines études ont montré qu’il était possible de détecter des anticorps contre les
antigènes tumoraux à des stades précoces du développement de la tumeur. Par exemple, des
anticorps contre p53 ou Her2/neu peuvent être détectés au moment du diagnostique dans des
cancers du poumon et du sein respectivement
73 74
. De même, des anticorps contre p53
peuvent être détectés à des stades prénéoplasiques dans des cancers de l’œsophage et de la
bouche 75 76. Enfin, près de 60% de patients atteints de cancers colorectaux à un stade précoce
(stade II) peuvent présenter des anticorps contre MUC1 77. Il est donc possible de détecter des
réponses humorales anti-cancéreuses au début de la progression tumorale. Des études ont
montré que ces réponses augmentaient au cours de la progression tumorale
78 79
. Ces
observations ont amené l’idée d’utiliser la détection d’anticorps anti-tumoraux comme un
facteur diagnostique. Bien que les réponses anticorps contre un antigène tumoral donné ne
constituent pas une méthode diagnostique suffisamment sensible, il est possible d’utiliser un
ensemble bien choisi d’antigènes tumoraux
80 81
. La valeur pronostique des réponses
humorales ne fait pas l’objet d’un consensus. En effet, la présence d’anticorps contre MUC1
est associée à une meilleure survie des patients atteints de cancers du sein, de l’estomac, du
poumon, de l’ovaire et du pancréas. En revanche, la détection d’anticorps contre p53 et NYESO-1 dans les cancers de sein et de la prostate respectivement, est corrélée à un mauvais
pronostic 72.
26
Concernant les réponses cellulaires, quelques études ont mis en évidence des réponses
spécifiques précoces chez les patients. Par exemple, il existe des antigènes tumoraux qui sont
normalement exprimés par des neurones de diverses régions du système nerveux central.
Certains patients présentent des maladies neuro-dégénératives liées au développement de
réponses CD8 contre ces antigènes onco-neuronaux. La grande majorité de ces patients (90%)
présente une tumeur exprimant ces antigènes onco-neuronaux. Dans 2/3 des cas, ces cancers
sont diagnostiqués après la maladie neuro-dégénénérative, ce qui suggère que le
développement des réponses CD8 anti-tumorales coïncidait avec un stade tumoral infraclinique. En générale, les cancers de ces patients sont moins agressifs que dans la population
générale et il existe un certain nombre de cas d’apparentes régressions spontanées
82
. De
même, des LT CD8 spécifiques ont été détectés dans la moëlle osseuse de patients atteints de
gammapathie monoclonale bénigne, alors que ces réponses étaient absentes chez les patients
ayant progressé vers une néoplasie de type myélome multiple 83.
2.1.2.3 Nature des réponses immunitaires anti-tumorales efficaces
L’étude de l’incidence de cancers spontanés ou induits chez des souris invalidées pour
différents acteurs du système immunitaire a permis de montrer que de nombreuses cellules et
molécules étaient impliquées dans l’immuno-surveillance anti-tumorale 66 (Tableau 3). Parmi
celles-ci, on trouve des cellules de l’immunité innée, telles que les cellules NK, NKT et les
LTγδ, ainsi que des cellules de l’immunité adaptative, surtout représentées par les LTαβ. En
plus des complexes CMH I-antigènes, les cellules tumorales expriment d’autres ligands
permettant leur reconnaissance par les effecteurs immunitaires. Par exemple, MICA et MICB
(Major histocompatibility complex class I Chain-related gene A et B), normalement
exprimées uniquement sur les cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal chez l’individu
sain
84
, sont exprimées par plusieurs tumeurs épithéliales dont les mélanomes
85
. MICA et
MICB activent les cellules exprimant leur récepteur NKG2D, telles que, chez l’Homme, les
cellules NK, les LTγδ périphériques et intestinaux (surtout en IL-15), les LT CD8 naïfs et
mémoires et une population de LT CD4
86
. Un autre ligand de NKG2D chez l’Homme est
ULBP-1 (UL16 binding protein-1), également sur-exprimé par certaines tumeurs, comme les
carcinomes
85
. De même, CD122 et CD155, sur-exprimés sur de nombreuses tumeurs
humaines, comme les tumeurs de l’ovaire et les neuroblastomes, permettent l’activation des
cellules NK et des LT via une interaction avec leur récepteur DNAM1 87 88 89.
27
Suite à leur activation, certaines cellules immunitaires, telles que les cellules NK, les
LTγδ, les LT CD8 et les macrophages, peuvent avoir un effet directement cytotoxique sur les
cellules tumorales
90 85
. Le mécanisme de lyse des cellules tumorales peut impliquer les
granules cytotoxiques de perforine/granzyme ou bien des récepteurs de mort membranaires,
tels que FasL, TRAIL ou TNF-α. Outre cette activité cytotoxique, les cellules NK, NKT et les
LT peuvent produire des cytokines ayant une action anti-tumorale plus ou moins directe.
Parmi ces cytokines, l’IFN-γ est reconnue depuis longtemps comme une cytokine majeure de
l’immunité anti-tumorale naturelle
proliférative
92
ou pro-apoptotique
91
. Cette cytokine peut en effet avoir une action anti-
93
directe sur les cellules tumorales. De plus, l’IFN-γ
augmente l’expression des molécules de CMH I sur les cellules tumorales et facilite ainsi leur
reconnaissance par les LT CD8 effecteurs
91
. L’IFN-γ peut également avoir un effet
angiostatique, limitant l’angiogenèse nécessaire à la progression tumorale. Cet effet
s’explique en partie par la capacité de l’IFN-γ à induire la production de la chimiokine
angiostatique CXCL10
94
. Cette chimiokine limite l’angiogenèse par un mécanisme
impliquant notamment l’apoptose des cellules endothéliales exprimant CXCR3
95 96
. Il est
intéressant de noter que CXCL10 et CXCL9, cette dernière étant également induite par l’IFNγ, permettent le recrutement de LT activés CXCR3+
97
. L’effet anti-tumoral de l’IFN-γ peut
également passer par son action positive sur la différenciation des LT Th1. En effet, l’IFN-γ
peut favoriser la production d’IL-12 par les cellules dendritiques tout en augmentant
l’expression de l’IL-12Rβ sur les LT CD4
98
. Quelques études mettent aussi en évidence le
rôle de l’IFN-γ dans l’activation des LT CD8 in vivo
99
. L’IFN-γ peut aussi activer les
cellules NK ou les macrophages, en augmentant par exemple, l’expression de molécules
cytotoxiques, comme TRAIL 98. Enfin, il est intéressant de noter que dans certains cas, l’IFNγ peut avoir un effet pro-tumoral. Ceci a notamment été montré dans un modèle murin de
cancer cutané induit par un traitement DMBA/TPA, dans lequel l’IFN-γ favorise une
inflammation pro-tumorale de nature Th17
100
. De même, l’IFN-γ peut induire l’apoptose de
LT CD4 induits par un protocole d’immunothérapie anti-cancéreuse, et avoir ainsi un effet
inhibiteur des réponses anti-tumorales à long terme
101
. D’autres cytokines très importantes
pour les réponses anti-tumorales naturelles sont les IFN-α et β
102
. L’IFN de type I peut être
produit aussi bien par des cellules immunitaires que par toute autre cellule en réponse à des
signaux TLR, impliquant par exemple une infection virale. Dans un contexte tumoral, l’IFNα/β semble particulièrement important pour son action sur les cellules immunitaires
103
.
Ainsi, il est capable d’agir sur les cellules dendritiques pour faciliter la présentation croisée
28
des antigènes104 ainsi que la genèse de réponses humorales 105. De plus l’IFN-α/β augmente la
survie des LT activés
106
et favorise l’expression de TRAIL sur les cellules NK
107
. De plus,
l’IFN-α/β peut aussi avoir un effet angiostatique, en limitant entre autres, la motilité des
cellules endothéliales 108. Il est important de noter que l’IFN-α/β est utilisé en clinique pour le
traitement de différents cancers tels que les leucémies et les mélanomes 103.
Les réponses cellulaires de type Th1/Tc1 sont donc particulièrement efficaces pour
limiter le développement de tumeurs. Bien que peut être moins importantes dans un contexte
d’immunité anti-tumorale naturelle, il est intéressant de noter que les réponses humorales
peuvent être très efficaces dans un contexte thérapeutique. Ceci est appuyé par le succès des
immunothérapies anti-cancéreuses basées sur l’utilisation d’anticorps monoclonaux, comme
l’anti-CD20 ou rituximab, utilisé dans le traitement de lymphomes 109.
2.1.2.4 Signaux de danger et immunogénicité des tumeurs
Le développement de certaines tumeurs s’accompagne donc du développement de
réponses immunitaires spécifiques. Ceci indique que des signaux de danger inflammatoires
peuvent alerter le système immunitaire dans un contexte tumoral. Ceci est notamment le cas
de cancers induits par des agents pathogènes, dont l’incidence est nettement augmentée dans
des cas d’immunodéficiences chez l’Homme. Par ailleurs, des signaux de danger endogènes,
tels qu’HMGB1 ou certaines protéines S100 sont sur-exprimés dans différents types de
cancer humains 110. Ces signaux de danger pourraient être libérés par les cellules nécrotiques
présentes dans les zones hypoxiques de certaines tumeurs solides chez l’Homme 111 112. Dans
certains cas, ces signaux de danger pourraient favoriser une rupture de tolérance. Dans le
psoriasis par exemple, le peptide anti-microbien LL37 sécrété par les cellules épithéliales a
été impliqué dans la rupture de tolérance, grâce à sa capacité à rendre l’ADN endogène libéré
par les cellules mourantes capable de stimuler les pDC par l’intermédiaire du TLR9 113. Nous
pouvons imaginer un scénario similaire dans un contexte tumoral, d’autant plus qu’une surexpression de LL37 a été mise en évidence dans des tumeurs de l’ovaire, du sein, du poumon
et de l’estomac chez l’Homme
114
. Une étude chez la souris a également montré que le taux
d’acide urique présent dans la tumeur était associé au développement de réponses
immunitaires anti-tumorales 115. En plus de la nature et de la quantité des antigènes, le taux de
signaux de danger présent dans la tumeur pourrait être un facteur important dans l’induction
d’une tolérance ou d’une immunité anti-tumorale (Figure 5).
29
Tumeur Ganglion drainant
antigène
signaux de danger
Figure 5 : Importance des signaux de danger dans les relations entre système
immunitaires adaptatif et tumeur (d’après Spiotto MT, Curent Opin Immunol, 2003 38).
30
2.2 Environnement tumoral et immunosuppression
2.2.1 Signaux de danger, inflammation et progression tumorale
Comme nous venons de le voir, une tumeur peut être ignorée par le système
immunitaire adaptatif ou induire un état de tolérance immunitaire. Dans certains cas, la
présence de signaux de danger exogènes ou endogènes favorise le développement d’une
réponse immunitaire anti-tumorale efficace. Cependant, beaucoup d’études ont montré qu’un
taux important de nécrose tumorale, à l’origine de signaux de danger endogènes, était corrélé
à un mauvais pronostic. Ceci a par exemple été montré chez l’Homme, dans des cancers
pulmonaires
116
, gastro-intestinaux
112
, ainsi que dans les cancers du sein
117
. La nécrose
cellulaire dans les tumeurs peut résulter d’une privation métabolique des cellules se trouvant
dans les zones hypoxiques
117
. Par ailleurs, le niveau d’expression du signal de danger
HMGB1 et de son récepteur RAGE dans des tumeurs de la prostate et du colon chez
l’Homme a été associé à un mauvais pronostic
118 119
. De même, certaines protéines S100,
constituant d’autres signaux de danger endogènes, sont sur-exprimées dans de nombreux
cancers chez l’Homme, incluant les cancers du sein, du poumon et de la prostate
120
. Enfin,
des études chez la souris ainsi que des polymorphismes chez l’Homme indiquent que les TLR
peuvent favoriser la progression tumorale 121.
Ainsi, la présence de signaux de danger dans la tumeur n’est pas toujours associée à
l’induction d’une réponse anti-tumorale spécifique, celle-ci dépendant également de
caractéristiques antigéniques. En revanche, la présence de signaux de danger est à l’origine
d’une réaction inflammatoire, caractérisée par le recrutement de leucocytes dans les tissus et
par la production de différents médiateurs solubles. Les relations entre inflammation et cancer
sont complexes. Des états d’inflammation chronique sont associés au développement de
cancers
122 123
124
et à l’inverse, la progression tumorale s’accompagne souvent du
développement d’une composante inflammatoire
125
. Historiquement, la présence d’infiltrat
leucocytaire dans des tumeurs solides humaines a été mise en évidence par Rudolph Virchow
en 1863. Des études ultérieures ont montré que dans certains cas, cette inflammation tumorale
ressemblait au processus physiologique de cicatrisation
126
, et était donc plus tournée vers la
préservation du tissu tumoral que vers sa destruction, une dichotomie simplificatrice que nous
avons évoquée en première partie. En effet, les processus qui contribuent à la réparation et à
la régénération tissulaires, tels que la production de facteurs de croissance, l’induction de la
31
migration cellulaire, l’angiogenèse et la résistance à l’apoptose peuvent favoriser la
progression tumorale
127
. Des signatures génétiques caractéristiques du processus de
cicatrisation ont été identifiées dans des tumeurs humaines et sont souvent associées à un
mauvais pronostic
128
. Contrairement au processus de réparation tissulaire physiologique qui
est transitoire, la progression tumorale pourrait être caractérisée par des cycles sans fin de
nécrose et de réparation tissulaire, évoquant l’idée que la mort cellulaire pourrait être un
moteur de la croissance tumorale 129 (Figure 6).
Dommages tissulaires, nécrose tumorale
Progression tumorale
TLR / NLR
Tissu réparé
Programme de réparation tissulaire
Figure 6 : La progression tumorale : une cicatrisation sans fin ? 130 Schéma théorique
des relations entre réparation tissulaire et progression tumorale (d’après Rakoff-Nahoum
S, Nat Rev Cancer, 2009 121).
Les processus physiologiques de réparation tissulaire sont souvent associés à une
immunosuppression
131
. Dans cette partie, nous allons décrire certains acteurs immunitaires
de l’inflammation pro-tumorale, et décrire quelques mécanismes d’immunosuppression liés à
l’environnement tumoral.
32
2.2.2 Les principales cellules immunosuppressives associées à la
progression tumorale
2.2.2.1 Les macrophages
Les macrophages sont très souvent les cellules immunitaires les plus fréquentes parmi
l’infiltrat leucocytaire des tumeurs solides. Ils sont présents dans une diversité de cancers
chez l’Homme, dont les cancers du colon, les mélanomes, les cancers du rein, du poumon, de
l’ovaire et du sein 132. Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) se différencient à partir
des monocytes du sang et sont attirés dans les tissus tumoraux par des chimiokines ou des
cytokines. Parmi celles-ci, CCL2 (MCP-1) et CSF-1 (M-CSF), qui se lient à CCR2 et à MCSFR respectivement, sont les plus fréquentes. Dans le cancer du sein, les niveaux
d’expression de MCP-1 et de CSF-1 dans les tumeurs ont été corrélés au nombre de TAM
133 134
. De nombreuses études, notamment dans les cancers du sein, du col de l’utérus et de la
vessie, ont montré que le degré d’infiltration des tumeurs par les TAM était corrélé à un
mauvais pronostic. Il est cependant important de noter que d’autres études, concernant les
cancers de l’estomac par exemple, ont donné le résultat opposé 135. Les macrophages activés
avec du LPS par exemple peuvent présenter des fonctions cytotoxiques contre les cellules
tumorales. En revanche, l’étude des macrophages infiltrant les tumeurs a montré que très
souvent, ceux-ci présentent un phénotype pro-tumoral
136
. Les TAM ont une faible activité
cytotoxique anti-tumorale et sont de faibles cellules présentatrices d’antigène. Les
macrophages tumoraux ne sécrètent pas beaucoup de molécules pro-inflammatoires comme
l’IL-1β, l’IL-6 ou le TNF-α, ce qui est en relation avec la faible activité du facteur de
transcription NFκB dans ces cellules
137
. De même, l’expression de molécules oxydées de
l’oxygène ou de l’azote est faible dans les macrophages tumoraux 138. En revanche, les TAM
sécrètent des molécules anti-inflammatoires, comme l’IL-10 et le TGF-β, qui inhibent les
réponses Th1 anti-tumorales
139
. Les TAM ressemblent donc aux macrophages anti-
inflammatoires de type « M2 », impliqués dans la cicatrisation et le remodelage tissulaire. Les
TAM, concentrés au niveau des zones hypoxiques des tumeurs, favorisent l’angiogenèse, ce
qui a été associé à un mauvais pronostic dans le cancer du sein
140
. De même, les TAM
favorisent la survie des cellules tumorales, leur prolifération et leur migration, notamment par
la sécrétion de facteurs de croissance (ex : FGF, EGF) et de dégradation de la matrice extracellulaire (MMP)
137
. Les TAM sont donc fortement impliqués dans le phénomène de
perpétuelle cicatrisation qui caractérise certaines tumeurs 130.
33
2.2.2.2 Les cellules myéloïdes immatures
La progression tumorale peut s’accompagner de l’accumulation de cellules myéloïdes
immatures dans le sang des patients. Ces cellules ne sont pas des cellules dendritiques
fonctionnelles, comme l’atteste leur faible capacité à présenter les antigènes et à stimuler des
LT 141. L’accumulation de ces cellules dans le sang périphérique est associée à la progression
tumorale
141
. En effet, des patientes atteintes de cancer du sein métastatique présentent
davantage de cellules myéloïdes immatures que les patientes atteintes de cancer non
métastatique. La présence de VEGF (vascular endothelial growth factor) dans le sang des
patients a été associée à l’accumulation des cellules myéloïdes immatures
142
. Des études in
vitro ont montré que le VEGF pouvait inhiber la différenciation des cellules dendritiques à
partir de progéniteurs médullaires
143
. L’étude ultérieure de ces cellules myéloïdes a révélé
qu’il s’agissait d’un mélange hétérogène de cellules hématopoïétiques plus ou moins
différenciées. Une partie d’entre elles sont des macrophages et des cellules dendritiques
immatures, d’autres sont des cellules à des stades plus précoces de la différenciation
myéloïde. Ces cellules sont directement capables d’inhiber la stimulation antigénique de LT
CD8 in vitro
144
. Chez la souris, une population hétérogène de cellules myéloïdes immatures
immunosupressives (MDSC) s’accumulant dans les organes lymphatiques de souris porteuses
de tumeurs a été mise en évidence
145
. Ces cellules sont définies par l’expression des
marqueurs CD11b et Gr1 et comprennent des précurseurs de macrophages, de cellules
dendritiques et de neutrophiles. Les MDSC inhibent l’activation des LT par des mécanismes
impliquant le contact cellulaire direct ou la sécrétion de facteurs solubles tels que des espèces
oxydantes toxiques (H2O2, NO).
2.2.2.3 Les LT régulateurs
Chez les patients, la progression tumorale peut être associée à l’accumulation de LT
CD4 régulateurs (Treg), exprimant le facteur de transcription FoxP3. Ceci a par exemple été
montré dans les cancers du poumon, du pancréas et du sein
146 147
. La fréquence de Treg
infiltrant les tumeurs a été corrélée à un mauvais pronostic dans les cancers de l’ovaire, du
sein et du foie
148 149
. Chez les patients atteints de cancer de l’ovaire, des Treg CD3+ CD4+
CD25+ sont présents dans l’ascite et dans la tumeur, en proportion plus importante dans les
stades avancés de la maladie
150
. Les auteurs ont montré que les Treg ne s’accumulaient pas
beaucoup dans les ganglions drainant la tumeur et étaient directement attirés à la tumeur par
34
la chimiokine CCL22, sécrétée par les macrophages de l’ascite et les cellules tumorales
(Figure 7). L’étude fonctionnelle de ces Treg a montré qu’ils étaient capables d’inhiber
l’activation de LT autologues spécifiques des antigènes tumoraux. En plus des Treg CD4+
CD25+, des Treg de type Tr1, sécréteurs d’IL-10, infiltrent les lymphomes Hodgkiniens
151
.
Ces cellules inhibent les réponses antigéniques des autres lymphocytes de la tumeur. Des LT
Tr1 peuvent être induits par des cellules dendritiques produisant de l’IL-10 en présence de
lysat de cellules de myélome multiple 152.
2.2.3 Les déficits immunitaires associés à la progression tumorale
2.2.3.1 Déficits numériques et fonctionnels des cellules dendritiques
au cours de la progression tumorale
Les cellules dendritiques sont des cellules de l’immunité innée qui peuvent induire
une réponse immunitaire spécifique. L’activation des cellules dendritiques stimule
l’apprêtement et la présentation des antigènes, l’expression de molécules de co-stimulation
(ex : CD80, CD86, CD40) et la sécrétion de cytokines polarisantes (ex : IL-12, IL-23), trois
signaux nécessaires pour la stimulation de LT naïfs 153. Chez les patients atteints de cancer, il
est fréquent d’observer une diminution du nombre total de cellules dendritiques. Ceci a par
exemple été mis en évidence dans le sang périphérique de patients atteints de cancer du sein,
du poumon, de la tête et du cou, de la prostate ou de gliome
154 141
. Le déficit numérique en
cellules dendritiques est associé à la progression tumorale. Une étude a en effet montré que
les patients atteints de stades tardifs (stades 3 et 4) de cancers de la tête et du cou présentaient
deux fois moins de cellules dendritiques que les sujets atteints de stades précoces de la
maladie (stades 1 et 2)
142
. Des déficits fonctionnels sont également observés au niveau des
cellules dendritiques infiltrant les tumeurs. Dans les tumeurs du rein chez l’Homme, les
cellules dendritiques ne représentent que 10% de l’infiltrat leucocytaire. La grande majorité
de ces cellules (90%) expriment faiblement les molécules de co-stimulation et ne sont pas
capables de stimuler des LT allogéniques
63
. Dans certains cas, les cellules dendritiques
situées au centre de la masse tumorale sont moins matures et moins fonctionnelles que les
cellules localisées dans les zones péri-tumorales 64. De plus, certaines études ont montré que
la résection chirurgicale de la tumeur permettait la restauration partielle des fonctions des
cellules dendritiques
154
. Ces observations suggèrent que la tumeur a un rôle actif dans
35
l’inhibition des fonctions des cellules dendritiques. Une étude sur le mélanome a en effet
montré que la sécrétion d’IL-10 par les cellules tumorales était associée à la présence de
cellules dendritiques tolérogènes dans les lésions métastatiques en progression 155. De même,
de nombreuses tumeurs sur-expriment l’enzyme COX-2 qui catalyse la formation de
prostaglandine E2. Ce facteur favorise la production d’IL-10 par les cellules dendritiques et
diminue leur production d’IL-12. Ces cellules dendritiques tolérogènes stimulent la
différentiation des LT CD4 en Treg de type Tr1, qui produisent de IL-10 et du TGF-β 156. En
plus de son rôle dans la néoangiogenèse tumorale, le VEGF sécrété par les cellules tumorales
a été impliqué dans l’induction de l’expression de la molécule inhibitrice B7-H1 par les
cellules dendritiques myéloïdes chez les patientes atteintes de cancer de l’ovaire
157
(Figure
7).
2.2.3.2 Inhibition de la phase effectrice des LT anti-tumoraux
En plus de perturber les fonctions activatrices des cellules dendritiques,
l’environnement tumoral peut inhiber la phase effectrice des réponses anti-tumorales
spécifiques. Par exemple, le TGF-β sécrété par différentes cellules de l’environnement
tumoral (TAM, Treg), inhibe les fonctions effectrices des LT chez l’Homme 158. La présence
de TGF-β dans le sérum de patients atteints de cancers de la prostate, de l’estomac ou de la
vessie a été corrélée à un mauvais pronostic
159
. De même, beaucoup de tumeurs humaines
expriment la forme sous-glycosylée de la protéine MUC1, qui inhibe de manière réversible la
prolifération des LT humains 160. L’enzyme IDO catalyse le catabolisme du tryptophane et est
exprimée au niveau tumoral dans de nombreux cancers humains, dont les cancers de la
prostate, du colon, du pancréas, du poumon et de la vessie 161. Exprimée également au niveau
de la barrière placentaire, cette enzyme protège les tissus de l’attaque par les LT effecteurs,
probablement par un mécanisme impliquant la déplétion en tryptophane
162
. Dans certains
cas, les cellules tumorales peuvent directement induire l’apoptose des LT effecteurs. Plusieurs
molécules exprimées par les cellules tumorales ont été impliquées, comme par exemple, B7H1, FasL, RANTES, RCAS1, TRAIL ou CD70 163 164 165 166 167 168 (Figure 7).
Dans certains cas, les tumeurs qui se développent sont caractérisées par une plus faible
antigénicité, c'est-à-dire une capacité amoindrie d’être reconnue par les effecteurs de
l’immunité adaptative. Un des mécanismes les plus rapporté est la faible expression des
molécules de CMH de classe 1 (CMH I) à la surface des cellules tumorales. Ceci a été décrit
36
pour une grande variété de cancers chez l’Homme, dont les cancers du sein, de la prostate, du
poumon et du colon
169
. La fréquence des tumeurs sous-exprimant les molécules de CMH I
peut atteindre 96% et 87% dans les cancers du sein et du colon respectivement
170 171
.
Certaines études ont montré une corrélation entre la perte de CMH I par les cellules tumorales
et l’agressivité des tumeurs
172
. Ceci n’est cependant pas généralisable
173
et il arrive que le
niveau d’expression de CMH I sur la tumeur soit positivement corrélé à un mauvais pronostic
malgré la présence d’un infiltrat lymphocytaire plus important
174
. La perte d’expression de
CMH I sur des tumeurs viro-induites, comme celles du col de l’utérus par exemple, est en
revanche très souvent associée à une progression tumorale avec invasion ganglionnaire 175. La
diminution de l’expression des molécules de CMH I devrait rendre les cellules tumorales plus
sensibles à la lyse par les cellules NK. Dans certaines situations, les tumeurs peuvent aussi
présenter une faible expression des ligands de récepteurs activateurs des cellules NK
176
.
Enfin, l’instabilité génétique des cellules tumorales peut être à l’origine de la perte ou de la
modification du niveau d’expression de certains antigènes tumoraux 177.
Figure 7 : Exemples de mécanismes immunosuppresseurs induits par les cellules
tumorales (d’après Rabinovich GA, Ann Rev Immunol, 2007 65).
37
► Conclusion de la partie 2 :
Dans certains cas, la naissance d’une tumeur semble être ignorée ou tolérée par le
système immunitaire adaptatif. Ces états immunitaires pourraient s’expliquer par des
caractéristiques antigéniques, ainsi que par le manque de signaux de danger dans
l’environnement tumoral. Dans d’autres cas en revanche, des réponses anti-tumorales peuvent
se développer. Ceci est notamment illustré par la présence de réponses humorales et
cellulaires spécifiques à des stades très précoces voire infra-cliniques de certains cancers.
L’efficacité de ces réponses est cependant limitée par l’apparition de mécanismes
immunosuppresseurs, liés à la présence d’un environnement inflammatoire pro-tumoral
associé à de nombreuses tumeurs solides. Cette inflammation est entretenue par la libération
chronique d’une faible quantité de signaux de danger par les cellules tumorales nécrotiques.
Dans ce contexte, nous allons maintenant discuter les moyens thérapeutiques ayant pour
objectif de restaurer une réponse immunitaire anti-tumorale efficace. Deux mécanismes
principaux vont être discutés : 1) l’utilisation de molécules adjuvantes mimant les signaux de
dangers faisant défaut dans la tumeur ; 2) l’utilisation de thérapies conventionnelles, telles
que la chimiothérapie et la radiothérapie, visant à dévier la réponse inflammatoire « protumorale » vers un profil « anti-tumoral ».
38
3 Les solutions thérapeutiques pour activer des réponses immunitaires anti-tumorales
efficaces
3.1 L’utilisation de ligands de TLR en immunothérapie anti-cancéreuse
Au début du 20ème siècle, le chirurgien William Coley observa des réponses antitumorales importantes en administrant à ses patients un mélange d’extrait de deux bactéries :
Streptococcus pyogenes et Serratia marcasens, une bactérie à gram négatif. Des études
ultérieures montrèrent que le LPS, composant de la paroi des bactéries à gram négatif,
pouvait entrainer une régression tumorale dans des modèles animaux. Bien que controversés,
les travaux de W. Coley ont inspiré les thérapies cancéreuses actuelles basées sur l’utilisation
de ligands de TLR. Ces ligands sont utilisés et/ou évalués en monothérapies ou en tant
qu’adjuvant dans des protocoles de vaccination.
3.1.1 Les ligands de TLR comme monothérapies anti-cancéreuses
Les ligands de certains TLR, comme les TLR-2, -4, -7, -8 et -9, peuvent présenter des
activités immunostimulantes anti-tumorales. Deux traitements s’appuyant sur ces propriétés,
le BCG et l’imiquimode, sont actuellement utilisés en clinique.
Le BCG est un mélange de souches de Mycobacterium bovis atténuées, utilisé dans le
traitement des carcinomes de la vessie in situ et des cancers superficiels de la vessie. Le BCG
contient des ligands de TLR-2, -4 et -9 et est injecté localement dans la vessie
178
. Ce
traitement présente une efficacité thérapeutique supérieure à celle des chimiothérapies
conventionnelles, comme l’épirubicine ou l’adriamycine
179
. En effet, sur un ensemble
d’environ 300 patients dans chaque groupe, 68% de ceux traités par le BCG présentent une
réponse complète, contre 52% pour les patients ayant reçu une chimiothérapie. De même, le
suivi des patients sur 3,6 ans en moyenne a montré que 47% de ceux ayant reçu le BCG ne
rechutaient pas, contre 26% dans les cas de traitement par chimiothérapie. Le BCG peut aussi
être efficace dans les cancers de la peau comme le mélanome
180
. Bien que le BCG puisse
directement inhiber la prolifération de lignées tumorales in vitro
181
, l’efficacité de ce
traitement repose surtout sur l’induction de réponses immunitaires. Le traitement par le BCG
induit une réaction inflammatoire locale impliquant le recrutement de neutrophiles, de
monocytes et de lymphocytes 182. Les cellules immunitaires infiltrant la tumeur expriment des
39
molécules d’activation telles que HLA-DR, CD25 et ICAM1 et restent dans le tissu tumoral
plusieurs mois après l’arrêt du traitement
183
. Le BCG induit l’expression de cytokines
inflammatoires détectables dans les urines. Le taux de certaines cytokines comme l’IL-2, le
TNF-α, l’IL-6, l’IL-8 et l’IL-10 est corrélé à la réponse clinique. Parmi celles-ci le taux d’IL2 est un facteur indépendant de prédiction de réponse au traitement
184
. Suite au traitement,
des LT spécifiques des antigènes du BCG peuvent être détectés dans le tissu tumoral des
patients
185
. In vitro, des composants du BCG induisent la maturation des cellules
dendritiques humaines, ce qui pourrait expliquer l’effet observé sur les réponses spécifiques
in vivo 178. De plus, des études sur PBMC isolés ont montré que le BCG pouvait stimuler les
fonctions cytotoxiques anti-tumorales des cellules NK par un mécanisme impliquant la
production d’IFN-γ
186
. Des études chez la souris ont en effet montré que l’efficacité
thérapeutique du BCG dépendait de la présence de LT CD4, CD8 et des cellules NK 182. Plus
récemment, il a été montré que le recrutement précoce de neutrophiles, phénomène crucial
pour l’efficacité thérapeutique du BCG, était dépendant de la production d’IL-17 par les
LTγδ 187.
L’imiquimode est un agoniste synthétique du TLR7. Il est actuellement utilisé en
clinique contre les cancers de la peau basocellulaire, ainsi que pour traiter les lésions précancéreuses de type kératose actinique
188 189 190
. En plus de pouvoir présenter un effet
cytotoxique direct sur les cellules tumorales cutanées, l’imiquimode induit une réponse
immunitaire anti-tumorale 191. En effet, l’infiltrat immunitaire présent dans les tumeurs après
traitement est enrichi en LT CD4 et CD8, en cellules cytotoxiques exprimant le granzyme B,
et en pDC 192. Le traitement induit également une diminution du nombre de Treg 193. Le BCG
et l’imiquimode sont des traitements essentiellement locaux, peu adaptés à une injection
systémique. Récemment, un nouvel agoniste du TLR7, le « 852A », injectable en intraveineux a montré une efficacité dans la stabilisation de mélanomes métastatiques
194
. De
l’IFN de type 1, de l’IP10 et des monocytes activés (CD86+) sont retrouvés dans le sang des
patients traités, ce qui reflète l’activation des pDC par cet agoniste
195
. De nos jours, les
recherches se portent sur des traitements combinant des agonistes des TLR-7 et -8. Alors que
les ligands de TLR7 activent les pDC pour la production d’IFN de type 1, les ligands de
TLR8 stimulent la production de cytokines inflammatoires (TNF-α, IL-12, MIP-1) par les
cellules dendritiques myéloïdes et les monocytes
196
. De plus, en agissant directement sur le
TLR8 exprimé par les Treg humains, ces agonistes sont capables d’inhiber la fonction
régulatrice de ces cellules 197.
40
Des agonistes du TLR9, administrés de manière systémique, sont également
développés. La molécule « PF-3512676 » a montré une efficacité dans les cancers
hématologiques (lymphomes T cutanés, lymphomes non Hodgkiniens) et les cancers de la
peau dont les mélanomes 198. Chez l’Homme, le TLR9 est notamment exprimé sur les pDC et
sur les LB. Après un traitement local par PF-3512676, les patients présentent des cytokines
inflammatoires dans leur sérum, telles que l’IL-6, l’IL-12p40, l’IP10 et le TNF-α, ainsi qu’un
infiltrat immunitaire variable au niveau des lésions cancéreuses
199
. Administré après une
résection chirurgicale, PF-3512676 diminue le nombre de Treg dans le ganglion sentinel chez
les patients atteints de mélanomes 200. In vitro, la sécrétion d’IFN-α induite par le CpG active
les LT CD8 et les cellules NK
201
. Ceci est en accord avec la corrélation de l’efficacité
thérapeutique de PF-3512676 avec le niveau d’activation des cellules NK dans le sang de
patients atteints de mélanome
202
. Enfin, les agonistes du TLR3, le poly I:C et son analogue
plus stable le poly ICLC, ont été testés dans les gliomes de l’adulte et dans les cancers du rein
sans grande efficacité thérapeutique 203 204.
3.1.2 Les ligands de TLR comme adjuvants dans les protocoles de
vaccination anti-tumorale
En plus d’être utilisés en tant que monothérapie, les agonistes de TLR peuvent aussi
servir d’adjuvants dans les protocoles de vaccination. Les agonistes des TLR-2, -4, -7 et -9
sont particulièrement étudiés. Différents protocoles de vaccination combinant des ligands de
TLR et des antigènes tumoraux sous forme de cellules entières ou de molécules isolées (NYESO-1, Melan-A, STn) ont permis d’induire des réponses anti-tumorales spécifiques, à la fois
humorales et cellulaires (Tableau 6). Parmi les adjuvants testés, figurent le BCG,
l’imiquimode, le CpG et un mélange de ligands du TLR4, le DETOX. Dans certains cas,
l’intensité des réponses immunitaires induites a été corrélée à la réponse clinique. Ceci a été
montré dans une étude de vaccination avec des cellules tumorales allogéniques de mélanome
utilisant le DETOX comme adjuvant. Tous les patients présentant une réponse clinique ont
développé des réponses anti-tumorales cytotoxiques, alors que ceci n’a été le cas pour aucun
des patients en progression clinique 205.
41
Adjuvant
Cancer
Vaccin
BCG
carcinome urothélial
exprimant NY-ESO-1
NY-ESO-1 + GM-CSF
(TLR-2, -4, -9)
colorectal (stade II)
cellules tumorales
autologues après
chirurgie
DETOX
sein
STn-KLH
ovaire, sein
STn-KLH après greffe
de cellules souches
autologues
(TLR4)
mélanome
Imiquimode
(TLR7)
CpG 7909
mélanome
tumeurs exprimant
NY-ESO-1
(TLR9)
mélanome
Résultats cliniques et/ou
immunitaires
réponses humorales et cellulaires
(CD4) spécifiques chez 80-100 %
des patients
↑ survie sans rechute
réponses humorales spécifiques
(IgM et IgG) chez tous les patients
• ↑ survie et ↓ risque de rechute
• réponses cytotoxiques spécifiques
corrélées aux réponses cliniques
• réponses cytotoxiques spécifiques
pour 50% des patients
lysat de cellules
tumorales allogéniques • association entre les réponses
cytotoxiques et les réponses
cliniques
réponses humorales et cellulaires
NY-ESO-1
CD4 spécifiques pour 77 % des
patients
• réponses humorales et cellulaires
CD4 précoces pour 90-100 % des
NY-ESO-1 + montanide patients
• réponses cellulaires spécifiques
tardives pour 50 % des patients
réponses cellulaires cytotoxiques
spécifiques rapides chez 100 % des
Melan-A
patients (10 x plus importantes que
sans adjuvant)
Tableau 6 : Exemple d’utilisation de ligands de TLR comme adjuvants dans des
protocoles de vaccinations anti-cancéreuses (d’après Adams S, Immunotherapy, 2009 206).
Les ligands de TLR, comme le LPS, sont aussi utilisés pour activer les cellules
dendritiques in vitro avant leur injection aux patients dans des protocoles de vaccination
207
.
Enfin, ces agonistes sont aussi efficaces en combinaison avec des thérapies anti-cancéreuses
cytotoxiques conventionelles (chimiothérapie, radiothérapie) ou ciblées (ex : rituximab) ou
avec d’autres immunothérapies (ex : l’IL-2).
Ainsi, quelques ligands de TLR utilisés en monothérapies peuvent présenter une
efficacité
thérapeutique
supérieure
à
celle
des
traitements
conventionnels.
Ces
immunothérapies s’appliquent pour l’instant à un nombre limité de cancers. De même, des
réponses anti-tumorales peuvent être détectées suite à l’administration d’un vaccin utilisant
des ligands de TLR comme adjuvant. Cependant, les succès thérapeutiques sont globalement
42
rares
208
. Alors que des études pré-cliniques chez la souris donnent des résultats satisfaisant,
leur application à l’Homme est parfois limitée par les différences entre les deux espèces,
notamment en ce qui concerne la nature des cellules exprimant les différents TLR 209.
3.2 Effets immunostimulants des thérapies anti-cancéreuses conventionnelles
En parallèle des immunothérapies spécifiques, des travaux des 10 dernières années
indiquent que des thérapeutiques anti-tumorales dites conventionnelles ont également la
capacité d’activer le système immunitaire et d’agir comme immunostimulants ou
immunomodulateurs. Dans cette partie, nous allons passer en revue certains de ces
mécanismes qui concernent différentes phases des réponses immunitaires en insistant sur leur
mode d’action, afin de guider leur combinaison rationnelle à d’autres stratégies.
3.2.1
Effets
immunostimulant
des
thérapies
anti-cancéreuses
conventionnelles sur la phase effectrice des réponses anti-tumorales
3.2.1.1 Présentation des thérapies conventionnelles anti-cancéreuses
Avec la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie sont les principales thérapies
anti-cancéreuses actuelles. Les chimiothérapies utilisées agissent sur des mécanismes
généraux de la fonction de réplication cellulaire, notamment en inhibant le métabolisme de
l’ADN ou en perturbant celui des microtubules (Tableau 7). De même, le principe d’action
général de la radiothérapie est l’introduction de cassures double brins dans l’ADN. Ces
thérapies visent donc à induire directement la mort ou la sénescence des cellules tumorales,
en endommageant leur ADN de manière irréversible. Bien que tuant préférentiellement les
cellules tumorales, ces agents induisent aussi la mort de cellules ayant un fort taux de
prolifération autre que les cellules tumorales. Au vu de la forte toxicité des chimiothérapies,
des thérapies ciblées se sont développées. Parmi celles-ci on compte par exemple les
inhibiteurs de tyrosine kinase (imatinib, sorafenib, sunitinib) ainsi que des molécules dirigées
contre d’autres cibles tumorales comme le facteur de transcription mTOR (Everolimus,
Temsorilimus).
43
Mécanismes d'action
Exemples
formation de liaisons
covalentes avec l'ADN
modification de la structure
de l'ADN
agents alkylants : cyclophosphamide,
melphalan, ifosfamide, busulfan,
carmustine
sels de platine : cisplatine, oxaliplatine,
carboplatine
bléomycine
radiation ionisante
anthracyclines (doxorubicine,
daunorubicine)
cassure de l'ADN
agents intercalants
inhibition de la synthèse
d'acides nucléiques
poison du fuseau mitotique
inhibiteur de topoisomérases
etoposide, irinotecan, topotecan
anti-métabolites
capecitabine, cytarabine, 5-FU,
floxuridine, gemcitabine, methotrexate
inhibition de la
dépolymérisation des
microtubules
taxanes : docetaxel, paclitaxel
destruction des microtubules
"alcaloides de la pervenche" :
vinblastine, vincristine, vinorelbine
Tableau 7 : Mécanismes d’action des principales
conventionnelles (chimiothérapies et radiothérapies).
thérapies
anti-cancéreuses
Les cellules du système immunitaire se développent à partir de cellules souches de la
moëlle osseuse qui sont en perpétuelle division. De même, au cours d’une réponse
immunitaire, les lymphocytes prolifèrent. Ces cellules sont donc sensibles aux effets antiprolifératifs des traitements anti-cancéreux classiques. Les protocoles actuels sont souvent
très lourds, combinant plusieurs chimiothérapies au cours de plusieurs cycles de traitements.
Les patients ayant reçu de la chimiothérapie ou de la radiothérapie présentent très souvent une
neutropénie, une lymphopénie et une thrombocytopénie d’origine centrale 210. Certains agents
anti-cancéreux sont d’ailleurs utilisés comme traitements immunosupresseurs contre des
pathologies auto-immunes. Ceci est le cas du cyclophosphamide et du methotrexate utilisés
par exemple dans la sclérose en plaque et l’arthrite rhumatoide 211 212.
44
3.2.1.2 Effets immunostimulants de la lymphopénie induite par
certaines thérapies anti-cancéreuses conventionnelles
Le nombre de LT périphériques chez l’adulte est relativement constant au cours du
temps, phénomène que l’on appelle « homéostasie lymphocytaire ». A la fin de la réponse
immunitaire, les LT ayant proliféré suite à la stimulation antigénique meurent (phénomène de
« mort cellulaire induite par l’activation »), ce qui permet le retour du nombre de LT à la
normale. A l’inverse, lorsque le pool de lymphocytes diminue dans un contexte de
lymphopénie, les cellules restantes prolifèrent naturellement jusqu’à rétablir le nombre
adéquat de lymphocytes. Ce phénomène est appelé prolifération homéostatique. Il concerne à
la fois les lymphocytes mémoires et naïfs et dépend de la présence de certaines cytokines (IL7, IL-15) et de l’interaction avec des complexes peptides/CMH, surtout pour les LT naïfs 213.
Des études récentes ont cependant montré que dans un contexte de lymphopénie, des LT CD8
naïfs pouvaient proliférer indépendamment de signaux du TCR, dans un contexte cytokinique
inflammatoire
214
. Les LT qui prolifèrent acquièrent des propriétés phénotypiques et
fonctionnelles de LT mémoires. Ils deviennent transitoirement plus sensibles à une
stimulation antigénique et y répondent en sécrétant de plus grandes quantités d’IFN-γ. De
plus, la prolifération homéostatique favorise les LT ayant une forte affinité pour les molécules
du soi, ce qui peut conduire au développement de maladies auto-immunes
215
. La
lymphopénie transitoire induite par les traitements anti-cancéreux classiques offre une petite
fenêtre de temps durant laquelle une immunité anti-tumorale efficace peut naturellement se
développer. Ainsi, une étude chez la souris a montré qu’une irradiation lymphopéniante
diminuait la cinétique de croissance d’une tumeur implantée le jour suivant. Les auteurs ont
montré que cet effet était dû à l’activation de LT anti-tumoraux au cours de la prolifération
homéostatique et que cet effet dépendait de la présence d’antigène tumoraux dans le ganglion
drainant
216
. Une autre étude a montré l’importance de la présence de l’antigène au moment
de la prolifération homéostatique pour l’activation transitoire de LT CD8 cytotoxiques
217
.
Enfin, cet effet naturel peut servir à améliorer l’efficacité de protocoles d’immunothérapie
active (vaccins) ou passive (transfert adoptif de lymphocytes anti-tumoraux) 218 219.
45
3.2.1.3 Elimination sélective de populations immunosuppressives
par certaines thérapies conventionnelles
Le cyclophosphamide est un agent alkylant qui est très immunosuppresseur à fortes
doses. En revanche, à faibles doses, il inhibe les fonctions des Treg. Ces derniers sont en effet
plus sensibles que les autres LT CD4 à l’apoptose induite par le cyclophosphamide. De plus,
suite à l’administration de cyclophosphamide, les Treg présentent une diminution
d’expression de GITR et de Foxp3 et perdent une grande partie de leur fonction régulatrice.
Ces effets sont transitoires et réversibles
fonction régulatrice des Treg
221
220
. De même, le paclitaxel réduit le nombre et la
. La gemcitabine est un analogue de nucléoside pyrimidique
inhibitant la synthèse de l’ADN, à l’origine d’une neutropénie et d’une lymphopénie chez
l’Homme. La gemcitabine présente une toxicité sélective contre les MDSC de la rate de
souris porteuses de tumeurs
222
. Ceci est également le cas du 5-fluorouracile
223
. Le
cyclophosphamide et la gemcitabine sont tous les deux capables d’améliorer l’efficacité de
vaccins anti-tumoraux
224 225
. Certaines thérapies agissent également sur les réponses Th1
anti-tumorales. La gemcitabine entraine la diminution du nombre de lymphocytes de la rate,
mais fait disparaitre sélectivement les LB, ce qui diminue les réponses humorales et favorise
les réponses cellulaires anti-tumorales 226.
3.2.1.4 Modulation de la reconnaissance des cellules tumorales par
les effecteurs immunitaires
Utilisés à des doses sous cytotoxiques, les agents anti-cancéreux conventionnels
peuvent induire différents stress cellulaires au niveau des cellules tumorales, favorisant leur
reconnaissance par le système immunitaire (Tableau 8). Ainsi, des cellules irradiées peuvent
sur-exprimer Fas et devenir plus sensibles à la lyse induite par FasL, exprimé sur les LT CD8.
Dans ce cas, la radiothérapie peut synergiser avec un vaccin anti-tumoral de manière
dépendante de l’interaction Fas / FasL
227
. De plus, l’irradiation de cellules tumorales peut
augmenter leur répertoire antigénique selon trois mécanismes
228
: 1) l’augmentation la
dégradation des protéines cyctoplasmiques, 2) la traduction de nouvelles protéines via le
facteur mTOR, et 3) l’apparition de nouvelles protéines. Les dommages de l’ADN induits par
des agents cytotoxiques (agents alkylants, irradiation) peuvent induire l’expression de ligands
de NKG2D, selon un mécanisme indépendant de p53, et favoriser la lyse des cellules
tumorales par les cellules NK, NKT, les LTγδ, et les LT CD8
46
229
. De même, via l’activation
de p53, les dommages à l’ADN favorisent la sécrétion de cytokines et de chimiokines,
favorisant le recrutement de neutrophiles, de cellules NK et de macrophages anti-tumoraux
dans le lit tumoral 230. La migration des LT dans le lit tumoral est favorisée par l’induction de
CXCL16 par la tumeur irradiée et l’expression de VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule
1) sur les cellules endothéliales 231.
Effets sur les cellules
tumorales
Agent
Mécanisme
↑dégradation protéique
↑ répertoire antigénique
des cellules tumorales
Irradiation (Reits EA)
↑ synthèse protéique (mTOR)
apparition de nouvelles protéines
↑ lyse par les LT
paclitaxel, cisplatine,
doxorubicine
↑ récepteur au mannose-6-phosphate :↑
lyse par granzyme B 232
227
irradiation
expression de Fas
↑ lyse par les cellules de
l'immunité innée
agents alkylants, irradiation
↑ ligands de NKG2D
attraction des effecteurs
immunitaires
irradiation
agents alkylants, irradiation
229
231
↑ CXCL16
↑ IL-15 230
Tableau 8 : Effets positifs de certaines thérapies conventionnelles sur la reconnaissance
des cellules tumorales par les effecteurs immunitaires.
3.2.2 Effets des thérapies conventionnelles sur la restauration du lien entre
immunité innée et immunité adaptative
Comme nous venons de le voir, certaines thérapies anti-cancéreuses conventionnelles
peuvent stimuler la phase effectrice des réponses anti-tumorales, en inhibant les cellules
immunosuppressives ou en favorisant la prolifération des LT spécifiques et la reconnaissance
des cellules tumorales par les effecteurs immunitaires. Nous allons maintenant décrire l’effet
des thérapies conventionnelles sur l’induction de réponses immunitaires anti-tumorales, par
des mécanismes impliquant une action directe sur les cellules dendritiques ou résultant de la
libération de signaux de danger.
47
3.2.2.1 Action directe des thérapies conventionnelles sur les cellules
présentatrices d’antigène
La progression tumorale peut s’accompagner d’une diminution du nombre de cellules
dendritiques et de l’induction de cellules dendritiques tolérogènes. Certaines chimiothérapies
peuvent induire la maturation des cellules dendritiques. Ainsi, l’effet de 54 chimiothérapies,
chacune à 5 concentrations différentes, a été étudié sur la maturation et la viabilité d’une
lignée de cellules dendritiques murines in vitro
233
. Alors que certaines drogues n’exercent
que peu d’effet sur la maturation des cellules dendritiques, d’autres, et notamment la
vinblastine, s’avèrent très efficaces. In vivo, l’injection d’une faible dose de vinblastine dans
la tumeur favorise la maturation des cellules dendritiques locales et l’induction de réponses
CTL anti-tumorales efficaces
234
. De même, de faibles doses de paclitaxel sur des cellules
dendritiques dérivées de la moëlle osseuse (BM-DC) induisent leur maturation in vitro
(CD40, CD86). In vivo, l’administration d’une seule petite dose de paclitaxel synergise avec
un vaccin anti-tumoral à base de cellules dendritiques dans un modèle de cancer du poumon
chez la souris 235 (Tableau 9).
Effets
Exemples de drogue
vinblastine
↑ fonctions des
cellules
dendritiques
paclitaxel
stimulation des
macrophages
Mécanismes
• ↑ maturation
• ↑ réponses anti-tumorales CD8 234
• ↑ maturation
• synergie avec un vaccin anti-tumoral
à base de cellules dendritiques 235
• production de cytokines
inflammatoires (TNF-α, NO et COX-2)
paclitaxel
236 237
Tableau 9 : Effets immunostimulants de certaines thérapies anti-cancéreuses
conventionnelles sur les fonctions des cellules présentatrices d’antigène (NO : oxyde
nitrique ; COX-2 : cyclo-oxygénase 2).
Le Taxol (paclitaxel) peut induire la sécrétion de molécules pro-inflammatoires (TNFα, NO, COX-2) par les macrophages murins et les monocytes périphériques chez l’Homme
236 237
(Tableau 9). Chez la souris, le taxol peut directement se lier au TLR4 et induire une
signalisation via MyD88
238
. De même, l’anti-angiogénique DMXAA active IRF-3 dans les
48
macrophages murins et induit fortement l’expression de l’ARNm de l’IFN-β, selon une voie
de signalisation différente de celles utilisées par la plupart des TLR 239.
3.2.2.2 Dommages tissulaires induits par les thérapies anticancéreuses conventionnelles et stimulation du système immunitaire
Les thérapies anti-cancéreuses conventionnelles sont cytotoxiques et peuvent induire
des dommages tissulaires au niveau de la tumeur ou au niveau d’autres tissus ayant un taux de
prolifération important, comme l’épithélium intestinal. Suite à ces dommages, les cellules
peuvent libérer des réactifs toxiques de l’oxygène ou des cytokines à l’origine d’une
inflammation aigüe ou chronique, influençant la progression tumorale. La radiothérapie
locale à faible dose est utilisée pour le traitement de différentes pathologies malignes comme
les lymphomes folliculaires
240
. En plus d’induire l’apoptose des cellules tumorales en
induisant des cassures dans leur ADN, l’irradiation peut avoir des effets sur les cellules non
directement irradiées. Les cellules au contact de la zone irradiée, comme les macrophages par
exemple, peuvent libérer des réactifs toxiques de l’oxygène, du NO, ou des cytokines
inflammatoires (TNF-α)
241
. Cette inflammation peut représenter un stress génotoxique
potentiellement carcinogène pour les cellules à distance ou être à l’origine de complications
inflammatoires chroniques dans les tissus sains, comme la fibrose par exemple
242
. En
revanche, une inflammation aigüe au niveau de la tumeur peut favoriser le développement de
réponses anti-tumorales. Ceci est illustré par l’observation rare d’une efficacité anti-tumorale
à distance de la zone irradiée (« effet abscopal »), concernant par exemple des métastases 243.
Des études chez la souris ont montré l’implication des systèmes immunitaires inné et
adaptatif dans cet effet. Ainsi, l’administration de Flt3L, facteur de croissance des cellules
dendritiques, ou de la chimiokines MIP-1α, potentialise fortement l’effet abscopal
244
. De
même, des signaux inflammatoires libérés suite à une irradiation corps entier peuvent induire
une maturation des cellules dendritiques de la rate juste avant leur apoptose
245
. Par ailleurs,
des équipes ont montré qu’une irradiation corporelle totale pouvait entrainer la destruction de
la barrière intestinale et la pénétration de bactéries commensales et de LPS dans l’organisme.
Ceci est à l’origine de la maturation des cellules dendritiques des organes lymphatiques et
augmente l’efficacité anti-tumorale de LT CD8 transférés, dans un contexte de lymphopénie
246
. Enfin, la destruction tissulaire engendrée par certaines chimiothérapies anti-cancéreuses,
en libérant une grande quantité d’antigènes, peut favoriser la présentation croisée des
antigènes tumoraux et le développement de réponses CD8 spécifiques 225.
49
Ainsi, les modifications induites par les thérapies anti-cancéreuses conventionnelles
peuvent contribuer à remplacer l’inflammation chronique immunosuppressive en une
inflammation aigüe et immunogène.
► Conclusion de la partie 3 :
L’activation de réponses immunitaires spécifiques est un enjeu important dans le
développement de solutions thérapeutiques anti-cancéreuses. En plus des immunothérapies
ciblées, visant spécifiquement des acteurs immunitaires comme les TLR, les thérapies antitumorales conventionnelles, comme la chimiothérapie et la radiothérapie, permettent
également de moduler positivement les réponses immunitaires anti-cancéreuses. La
compréhension des mécanismes impliqués dans les effets immunostimulants de ces thérapies
est cruciale pour améliorer leur efficacité en les combinant par exemple à des agents
immunomodulateurs plus classiques.
50
4 Contexte d’étude et objectifs de la thèse
4.1 Les mécanismes moléculaires de l’immunogénicité de la mort cellulaire
induite par certaines thérapies anti-cancéreuses conventionnelles
La mort cellulaire induite par la plupart des thérapies anti-cancéreuses cytotoxiques
conventionnelles est une mort par apoptose. Contrairement à la nécrose, l’apoptose induit
l’expression de molécules qui permettent l’attraction des phagocytes (signaux « find me ») et
l’initiation de la phagocytose (signaux « eat me »). Ces signaux sont contre-balancés par des
molécules de répulsion des phagocytes inflammatoires, comme la lactoferrine et d’inhibition
de la phagocytose (signaux « don’t eat me »), comme CD47 par exemple. La phagocytose des
corps apoptotiques a longtemps été considérée comme un phénomène anti-inflammatoire. Par
exemple, la phosphaditylsérine, exprimée à la surface des cellules apoptotiques peut se lier à
son récepteur CD36 sur les phagocytes et induire la sécrétion d’IL-10 et de TGF-β par ce
dernier. Ceci est maintenant remis en question et certains signaux émis par les cellules
apoptotiques peuvent induire une inflammation et activer le phagocyte.
Plusieurs travaux du laboratoire ont mis en évidence la capacité de certaines
chimiothérapies anti-cancéreuses conventionnelles à induire une mort cellulaire immunogène,
c'est-à-dire capable d’induire une réponse immunitaire spécifique efficace. Parmi ces
chimiothérapies se trouvent les anthracyclines, comme la doxorubicine ou la mithoxanthrone,
et l’oxaliplatine. L’efficacité thérapeutique de ces chimiothérapies immunogènes est plus
faible chez les souris immunodéficientes que chez les animaux immunocompétents. Des
travaux successifs dans le laboratoire ont permis d’élucider quelques paramètres moléculaires
déterminant l’immunogénicité de la mort cellulaire induite par ces chimiothérapies. Ainsi, les
drogues immunogènes induisent l’expression de la calréticuline à la surface des cellules
tumorales mourantes 247. L’exposition précoce de la calréticuline est directement corrélée à la
capacité des cellules dendritiques à phagocyter les cellules tumorales mourantes (Figure 8).
L’induction de l’exposition de la calréticuline par des drogues immunogènes est un
phénomène rapide, dépendant ni de la transcription ni de la traduction. Ceci nécessite trois
modules de signalisation dans la cellule : un stress du réticulum endoplasmique, avec
phosphorylation du facteur eIF2a, un module apoptotique, impliquant la caspase 8, et un
module de transport antérograde du réticulum endoplasmique vers l’appareil de Golgi
248
.
L’exposition précoce de la calréticuline par les cellules tumorales mourantes est un
51
évènement nécessaire à l’immunogénicité de la mort cellulaire induite par certaines
chimiothérapies. En effet, l’inhibition de l’exposition de la calréticuline par des siARN inhibe
l’immunogénicité des drogues immunogènes. A l’inverse, l’addition de calréticuline
recombinante permet de rendre immunogènes des chimiothérapies qui ne le sont pas, comme
la mitomycine C ou l’étoposide.
Bien que nécessaire pour l’immunogénicité de certaines chimiothérapies, l’exposition
précoce de la calréticuline sur les cellules mourantes n’est pas un facteur suffisant. En effet,
l’ajout de calréticuline recombinante sur des cellules vivantes ne les rend pas immunogènes.
Des travaux ultérieurs dans le laboratoire ont permis de mettre en évidence l’importance du
signal de danger HMGB1 dans l’apprêtement des antigènes tumoraux par les cellules
dendritiques 249 (Figure 8). HMGB1 est libéré par les cellules tumorales mourantes, se lie au
récepteur TLR4 et diminue la dégradation lysosomale du matériel phagocyté au niveau des
cellules dendritiques. L’efficacité thérapeutique des chimiothérapies immunogènes est
amoindrie dans des animaux déficients pour Tlr4 ou sa molécule adaptatrice MyD88. Chez
l’Homme, il existe un polymorphisme du gène TLR4, associé à une diminution d’affinité de
ce récepteur pour son ligand HMGB1. La présence de ce polymorphisme a été corrélée à une
progression métastatique plus rapide chez des patientes atteintes de cancer du sein non
métastatique avec invasion ganglionnaire et recevant des anthracyclines et de l’irradiation
locale en traitement adjuvant
249
. De même, la présence de ce même polymorphisme a été
corrélée à une plus faible survie chez des patients atteints de cancer colorectal avancé
recevant de l’oxaliplatine
250
. Pour qu’une drogue soit immunogène, il faut donc qu’elle
entraine l’exposition de la calréticuline sur la membrane plasmique et qu’elle induise la
libération d’HMGB1. Le cisplatine, très proche de l’oxaliplatine, induit la libération
d’HMGB1 mais ne permet pas l’exposition de la calréticuline, ce qui explique son caractère
non immunogène 250.
52
Figure 8 : Mécanismes moléculaires de l’immunogénicité de la mort cellulaire induite
par les anthracyclines, l’oxaliplatine et l’irradiation. L’exposition précoce de la
calréticuline sur la membrane plasmique et la libération d’HMGB1 dans le milieu favorise
respectivement la phagocytose des corps apoptotiques et l’apprêtement des antigènes par les
cellules dendritiques (d’après Zitvogel L, Nat Rev Immunol, 2008 251).
4.2 Problématiques de la thèse
L’exposition précoce de la calréticuline à la surface des cellules tumorales mourantes
et la libération d’HMGB1 constituent respectivement des signaux de phagocytose et de
danger, nécessaires pour l’immunogénicité de la mort induite par les anthracyclines,
l’oxaliplatine et l’irradiation. Cependant, ces deux signaux ne sont pas suffisants, puisque
l’ajout de calréticuline et d’HMGB1 recombinantes sur des cellules vivantes n’induit pas leur
immunogénicité. Ceci suggère l’existence d’autres signaux immunogènes, émis par les
cellules mourantes. Dans ce contexte, les questions adressées au cours de mon travail de thèse
ont été les suivantes :
-
1) En plus de la calréticuline et d’HMGB1, quels sont les signaux immunogènes émis
par les cellules tumorales mourantes exposées aux anthracyclines, à l’oxaliplatine et à
l’irradiation ?
-
2) Quelles sont les modifications induites par ces signaux au niveau des cellules
dendritiques ?
-
3) Quelles sont les conséquences immunitaires de l’activation des cellules
dendritiques en réponse à ces signaux au niveau de l’environnement tumoral ?
53
MATERIEL ET METHODES
Culture des lignées cellulaires tumorales
Les lignées cellulaires tumorales MCA205 (fibrosarcome, syngénique C57BL/6), EL4
(thymome, syngénique C57BL/6), CT26 (adénocarcinome du colon, syngénique BALB/c),
TS/A (adénocarcinome mammaire, syngénique BALB/c) ont été cultivées à 37°C avec 5% de
CO2, dans du RPMI complet contenant 10% de sérum de veau fœtal, 1mM de pyruvate de
sodium, 2mM de L-glutamine, 1% d’acides aminés non essentiels et 1% de
pénicilline/streptomycine. La lignée EG7 (thymome EL4 transfecté avec un ADNc codant
pour l’albumine de poulet) a été cultivée dans le même milieu supplémenté avec 0,5 mg/mL
de néomycine.
Induction de la mort des cellules tumorales par des agents cytotoxiques in vitro
Les cellules adhérentes (CT26, MCA205 et TS/A) ou les cellules flottantes (EL4) ont été
mises à une concentration de 0,01 x 106 par cm2 ou de 0,1 x 106 par mL deux jours avant
l’application des drogues. Les différentes chimiothérapies ont été ajoutées au milieu aux
concentrations et pendant la durée indiquées : mitoxantrone (1µM, 24h), doxorubicine (1µM,
24h), oxaliplatine (5µg/mL, 24h). Les cellules TS/A ont été irradiées à 10 grays. La
détermination de la mort cellulaire a été évaluée par marquage Annexine V/DAPI en
cytométrie de flux.
Vaccination préventive avec des cellules tumorales mourantes
Après l’induction de la mort des cellules tumorales par différents agents cytotoxiques (cf cidessus), 3 x 106 , 5 x 106 ou 3 x 105 CT26, EL4 ou MCA205 respectivement ont été injectées
en sous-cutané dans le flanc des souris. 7 jours plus tard, 5 x 105 , 5 x 105 , 3 x 104 CT26, EL4
ou MCA205 respectivement ont été injectées vivantes dans le flanc opposé de l’animal. Les
souris ont ensuite été surveillées pendant environ 1 mois pour l’apparition de tumeurs.
Traitement d’animaux porteurs de tumeurs avec des chimiothérapies
Avant les injections en sous-cutané des cellules tumorales, celles-ci ont été amplifiées
pendant deux ou trois jours in vitro afin d’atteindre un niveau de confluence supérieur à 70%.
Après lavage du milieu de culture par du PBS, les cellules ont été injectées dans 100µL (5 x
105 CT26, 5 x 105 EL4, 8 x 105 MCA205 et EG7). Les traitements ont été administrés lorsque
54
les tumeurs avaient atteint une surface de 30-40 mm2 pour les CT26 et les MCA205 ou 50-60
mm2 pour les EL4 et les EG7. Les souris porteuses de CT26 ou de MCA205 ont reçu 50 µL
d’une solution à 4mM de doxorubicine en intra-tumoral. Les souris porteuses d’EL4 ou
d’EG7 ont reçu 5mg/kg d’oxaliplatine en intra-péritonéal.
Mise en évidence de l’activation de LT spécifiques par les corps apoptotiques de cellules
tumorales traitées par chimiothérapie
Après induction de la mort des cellules tumorales par les chimiothérapies in vitro, 1 x 106 de
cellules ont été injectées en sous-cutané dans le coussinet plantaire des animaux. 5 jours plus
tard, les ganglions poplités drainant le site d’injection des corps apoptotiques ont été prélevés.
Après obtention d’une suspension cellulaire par écrasage manuelle des ganglions, les cellules
ont été comptées et mises à 1 x 106 par mL dans du RPMI complet dans des plaques 96 puits.
La protéine OVA (ovalbumine) a été ajoutée a 1mg/mL, les peptides SIINFEKL et gp100 à 1
µg/mL. Après 48 h ou 72h de stimulation in vitro, les surnageants ont été prélevés pour un
dosage de l’IFN-γ par ELISA.
Production de cellules dendritiques à partir de moëlle osseuse de souris
Après prélèvement des fémurs et des tibias des souris en conditions stériles, les cellules de la
moëlle ont été « flushées » avec du milieu (IMDM). Les globules rouges ont ensuite été lysés
en utilisant un tampon hypotonique (0.15 M NH4Cl, 10 mM KHC03, 0.1 mM Na2EDTA dans
de l’eau distillée). Après deux lavages en milieu complet (IMDM contenant 10% de sérum de
veau fœtal, 2mM de L-glutamine, 1% de pénicilline/streptomycine, 50µM de betamercaptoéthanol) les cellules ont été mises à 0,5 x 106 par mL dans du milieu complet
contenant du surnageant de cellules J558 (quantité suffisante pour avoir 20 ng de GMCSF,
préalablement dosé par ELISA) dans des grandes boites de Petri. Les cellules ont été
trypsinées et diluées dans de nouvelles boites tous les 3 jours et utilisées entre les jours 7 et
10, lorsque le pourcentage de cellules CD11c+ CMH II+ atteignait 70% minimum.
Chargement des cellules dendritiques avec des corps apoptotiques
Les BM-DC produites in vitro à partir de la moëlle de souris ont été récupérées sans
utilisation de trypsine, mais en faisant quelques lavages doux avec du milieu. Les cellules ont
ensuite été placées dans du RPMI complet ne contenant pas de beta mercaptoethanol à 1 x 106
par mL dans des plaques 24 puits. Les cellules tumorales dont la mort a été induite
55
préalablement sont lavées plusieurs fois afin d’enlever les drogues et mises en co-culture avec
les BM-DC pendant 18h.
Stimulation in vitro des cellules T CD8+
Les LT CD8+ spléniques ont été isolés par tri au MoFlo (CD3+ CD8+) et incubés dans des
plaques 96 puits à fond plat, préalablement recouvertes d’anti-CD3 activateur (1µg/mL) et en
présence d’anticorps anti-CD28 soluble (0,5 µg/mL). Différentes cytokines ont été ajoutées.
Au bout de 48h, les surnageant ont été récupérés et l’IFN-γ a été dosé par ELISA.
Immunofluorescence
Les cellules EG7 ont été incubées pendant 24 h avec de l’oxaliplatine. Ensuite de
l’antimycine (2µg/mL) ou du deoxyglucose (30mM) ont été ajoutés au milieu. Après avoir été
lavées de leurs drogues, les cellules tumorales ont été co-cultivées avec des BM-DC pendant
24h. De l’OxiATP (100µM) a parfois été ajouté à la co-culture. Les cellules dendritiques ont
ensuite été récupérées puis déposées pendant 30 min sur lame de polylysine. Les cellules ont
été fixées et perméabilisées avec le réactif Cytofix/Cytoperm de BD puis marquées avec les
anticorps anti-caspase 1 clivée (fragment p20) (Santa Cruz Biotechnology) et anti-CD11c
(Biolegend).
56
RESULTATS
1 Rôle de l’activation de l’inflammasome NLRP3 et de la production d’IL-1β par les
cellules dendritiques dans l’efficacité des chimiothérapies immunogènes
Nous présenterons ici les principaux résultats du papier de Ghiringhelli F et al :
« Activation of the NLRP3 inflammasome in dendritic cells induces IL-1β-dependent
adaptive immunity against tumors ».
L’efficacité thérapeutique de l’oxaliplatine et des anthracyclines dépend de l’intégrité
de certains acteurs de l’immunité adaptative. Dans des modèles de tumeurs établies chez la
souris (thymome EL4, fibrosarcome MCA), l’efficacité de ces traitements est diminuée chez
les souris présentant notamment un déficit dans la production d’IFN-γ (Ifng -/-) (Fig 1 et Fig
S2). De plus, l’injection de cellules tumorales préalablement exposées à ces chimiothérapies
dans le coussinet plantaire induit une réponse spécifique et protectrice dans le ganglion
drainant
249
. Cette réponse se caractérise par la production d’IFN-γ suite à une restimulation
spécifique in vitro. Les souris sont alors protégées contre le développement de tumeurs induit
par une injection ultérieure de cellules tumorales vivantes. Ceci indique que des signaux
immunogènes provenant directement des cellules mourantes sont suffisants pour induire une
immunité spécifique. Parmi les signaux de danger stériles endogènes libérés par les cellules
tumorales mourantes, HMGB1 a été identifié comme un activateur du TLR4, facilitant
l’apprêtement des antigènes sur les CMH I et II des cellules dendritiques
249
. L’objectif du
présent travail était d’étudier la présence d’autres signaux de danger endogènes pouvant
contribuer à l’immunogénicité de la mort cellulaire induite par l’oxaliplatine et les
anthracyclines.
L’ATP est un signal de danger endogène, libéré par les cellules mourantes et capable
d’activer l’inflammasome NLRP3 en se liant à son récepteur P2RX7. En association avec la
protéine ASC, NLRP3 induit l’activation de la caspase 1 et la production d’IL-1β. Exposées à
des chimiothérapies immunogènes, les cellules tumorales libèrent de l’ATP dans le milieu
(Fig 2a, 2b, 2c). Le traitement des cellules mourantes par des inhibiteurs de la production
d’ATP (Antimycine A, 2,4-dinitrophénol : DNP) ou par une enzyme dégradant l’ATP extracellulaire (Apyrase) supprime leur immunogénicité (Fig 2d, 2g). De plus, des souris
déficientes pour P2rx7 ou des souris non mutées (WT) traitées par des antagonistes de ce
57
récepteur ne développent pas de réponses spécifiques contre les cellules tumorales mourantes
(Fig 3a, 2e, 2g). Ceci explique pourquoi les souris P2rx7
-/-
ne sont pas protégées contre le
développement de tumeurs suite à une vaccination avec des corps apoptotiques et répondent
moins bien à l’administration de chimiothérapies immunogènes que les souris WT (Fig 5d,
1f).
Chez des souris P2rx7 -/-, l’injection de cellules dendritiques WT chargées avec des
corps apoptotiques induit le développement d’une réponse spécifique. Ceci n’est pas le cas si
les cellules dendritiques sont déficientes pour P2rx7 (Fig 3b). L’ajout de corps apototiques
sur des cellules dendritiques, in vitro, induit l’activation de la caspase 1 et la production d’IL1β par ces dernières, selon un mécanisme qui dépend de l’ATP extra-cellulaire et des
protéines NLRP3 et ASC (Fig 4). Les souris Nlrp3
-/-
et Casp1
-/-
ne sont pas capables de
développer des réponses spécifiques contre des cellules tumorales exposées à des agents
cytotoxiques immunogènes (Fig 5a, 5b, 5c). Ceci explique que l’efficacité d’une vaccination
avec des cellules tumorales mourantes chez ces souris soit limitée, de même que l’efficacité
de chimiothérapies immunogènes dans des modèles de tumeurs établies (Fig 5d, 1f). Ainsi,
l’ATP libéré par les cellules tumorales exposées à des chimiothérapies immunogènes active
l’inflammasome NLRP3 en se liant au récepteur P2RX7 sur les cellules dendritiques, ce qui
favorise le développement de réponses immunitaires spécifiques.
Chez les souris ayant reçu l’antagoniste naturel de l’IL-1R (IL-1RA) ou chez les
souris déficientes pour l’Il-1r1, l’immunogénicité des cellules tumorales mourantes est abolie
(Fig 6c, 5a). Ceci a notamment été montré dans le ganglion drainant des tumeurs établies
après administration de chimiothérapies immunogènes. Les souris ayant reçu l’IL-1RA
présentent moins de LT CD8 spécifiques (marquage tétramère) capables de produire de
l’IFN-γ (restimulation spécifique) (Fig 1h, 6e). Par ailleurs, l’IL-1β est capable de restaurer
l’immunogénicité des cellules mourantes dans les souris P2rx7 -/-, Nlrp3
-/-
et Casp1
-/-
(Fig
6f). L’ajout d’IL-1β recombinante sur des LT activés in vitro augmente la production d’IFN-γ
par ces derniers, ce qui n’est pas le cas de l’IL-6 ou du TNF-α (Fig 6b). L’inhibition d’IL-1β
par un anticorps neutralisant élimine la capacité des cellules dendritiques chargées avec des
corps apototiques exprimant l’OVA à stimuler la production d’IFN-γ par des OT-1 naïfs (Fig
6a). Enfin, la neutralisation de l’IL-1β diminue l’efficacité thérapeutique des anthracyclines
dans des modèles de fibrosarcomes transplantés ou induits par le méthylcholantrène (Fig 5e,
5f). Tout ceci indique que l’IL-1β produit suite à l’activation de l’inflammasome NLRP3 par
58
l’ATP dans les cellules dendritiques, contribue à l’activation de LT CD8 producteur d’IFN-γ,
impliqués dans l’efficacité anti-tumorale des thérapies cytotoxiques immunogènes.
Chez l’Homme, il existe un polymorphisme dans le gène P2RX7 (Glu496Ala) qui
diminue la capacité de ce récepteur à se lier à l’ATP. Les monocytes présentant ce
polymorphisme produisent moins d’IL-1β en réponse à une stimulation par l’ATP. Dans une
cohorte de patients atteint de cancer du sein et traités par des anthracyclines, la présence de ce
polymorphisme est associée à une plus faible survie (Fig 6g).
59
Articles
© 2009 Nature America, Inc. All rights reserved.
Activation of the NLRP3 inflammasome in dendritic
cells induces IL-1β–dependent adaptive immunity
against tumors
François Ghiringhelli1–4,18, Lionel Apetoh1,2,5,6,18, Antoine Tesniere2,5,7,18, Laetitia Aymeric1,2,5,18, Yuting Ma1,2,5,
Carla Ortiz1,2,5,8, Karim Vermaelen1,2,5,9, Theocharis Panaretakis2,5,7, Grégoire Mignot1–4, Evelyn Ullrich1,2,5,
Jean-Luc Perfettini2,5,7, Frédéric Schlemmer2,5,7, Ezgi Tasdemir2,5,7, Martin Uhl10, Pierre Génin11, Ahmet Civas11,
Bernhard Ryffel12, Jean Kanellopoulos13, Jürg Tschopp14, Fabrice André1,2,5, Rosette Lidereau15,
Nicole M McLaughlin16, Nicole M Haynes16, Mark J Smyth16,18, Guido Kroemer2,5,7,18 & Laurence Zitvogel1,2,5,17,18
The therapeutic efficacy of anticancer chemotherapies may depend on dendritic cells (DCs), which present antigens from dying
cancer cells to prime tumor-specific interferon- (IFN-)–producing T lymphocytes. Here we show that dying tumor cells release
ATP, which then acts on P2X7 purinergic receptors from DCs and triggers the NOD-like receptor family, pyrin domain containing-3
protein (NLRP3)-dependent caspase-1 activation complex (‘inflammasome’), allowing for the secretion of interleukin-1 (IL-1).
The priming of IFN-–producing CD8+ T cells by dying tumor cells fails in the absence of a functional IL-1 receptor 1 and in
Nlpr3-deficient (Nlrp3–/–) or caspase-1–deficient (Casp-1–/–) mice unless exogenous IL-1 is provided. Accordingly, anticancer
chemotherapy turned out to be inefficient against tumors established in purinergic receptor P2rx7–/–or Nlrp3–/–or Casp1–/–hosts.
Anthracycline-treated individuals with breast cancer carrying a loss-of-function allele of P2RX7 developed metastatic disease
more rapidly than individuals bearing the normal allele. These results indicate that the NLRP3 inflammasome links the innate
and adaptive immune responses against dying tumor cells.
It has been an ongoing conundrum to find which particular biochemical
or metabolic alterations could be used to distinguish between
immuno­genic and nonimmunogenic cell death1,2. Physiological cell
death, which occurs as a continuous byproduct of cellular turnover,
is nonimmunogenic (or even tolerogenic). Avoidance of autoimmunity likewise results from the fact that physiological cell death fails
to activate pattern recognition receptors, including Toll-like receptors (TLRs) and NOD-like receptors (NLRs) that recognize pathogen and/or damage molecular patterns and activate innate immune
effectors3–9. In contrast, cell death elicited by radiotherapy and some
chemotherapeutic agents such as anthracyclines and oxaliplatin elicits
an immune response required for the therapeutic success10,11.
To mount a T cell immune response, DCs must incorporate antigens from stressed or dying cells, acquire the competence of antigen
processing in a maturation step and present antigenic peptides bound
to major histocompatibility complex (MHC) molecules in the context
of co-stimulatory signals and cytokines that allow for the differentiation
of specific T cells12. One of the peculiarities of immunogenic cell
death is early, preapoptotic exposure of calreticulin on the plasma
membrane, which facilitates the uptake of dying cells by DCs13. A
second characteristic of immunogenic cell death is the release of high
mobility group box-1 (HMGB1) protein from the nucleus into the
surroundings of dying cells14. HMGB1 acts on TLR4 on DCs, and this
interaction stimulates the processing of tumor antigens from dying
cells15. However, addition of recombinant calreticulin or HMGB1
to live cancer cells is not sufficient to elicit the presentation of tumor
antigens by DCs16, implying that additional, yet-to-be-identified
signals must be exchanged between dying cells and DCs.
In macrophages, the so-called inflammasome serves as a central sensor for pathogen and/or damage molecular patterns17–19. In response
to danger signals, NLRP3 (also called NALP3 or cryopyrin) interacts
with the adaptor molecule apoptosis-associated speck-like protein
1Institut
National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), U805, Villejuif, France. 2Institut Gustave Roussy, Villejuif, France. 3AVENIR team INSERM
CRI-866, Dijon, France. 4Centre Georges Francois Leclerc, Dijon, France. 5Université Paris-Sud, Villejuif, France. 6Center for Neurological Diseases, Brigham and
Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA. 7INSERM, U848, Villejuif, France. 8Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Químicas
Farmacéuticas, Centro FONDAP Estudios Moleculares de la Célula, Santiago, Chile. 9Laboratory of Immunoregulation, Department of Respiratory Medicine, Ghent
University Hospital, Belgium. 10INSERM, U818, Institut Pasteur, Paris, France. 11UPR 2228-CNRS, Laboratoire de Régulation Transcriptionnelle et Maladies
Génétiques, Biomédicale des Saints-Pères, Université Paris Descartes, Paris Cedex 06, France. 12UMR6218, IEM, CNRS Transgenose Institute, Orleans, France.
13UMR8619, CNRS, Université Paris, Orsay, France. 14Department of Biochemistry, University of Lausanne, Epalinges, Switzerland. 15Centre René Huguenin,
INSERM U735, St. Cloud, France. 16Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Victoria, Australia. 17CICBT507,
Villejuif, France. 18These authors contributed equally to this work. Correspondence should be addressed to L.Z. ([email protected]) or G.K. ([email protected]).
Received 16 July; accepted 18 August; published online 20 september 2009; doi:10.1038/nm.2028
1170
volume 15 | number 10 | october 2009 nature medicine
2
Tumor size (mm )
a
400
b
*
300
*
*
200
WT
PBS
WT –/–
Rag2
Ox
nu/nu
Anti-CD8 Ab
100
0
2
Tumor size (mm )
c
10
EL4
15
100
*
0
*
5
*
*
100
0
0
5
10
EG7
5
10
EL4
*
*
*
*
WT PBS
WT
Pfr1–/– Ox
100
0
20
20
20
200
PBS
WT
WT
Tnfsf10–/–
Ox
Tnfsf10–/–
Pfr1–/– × Ifng–/–
15
15
500
300
f
*
0
400
WT
PBS
WT
–/–
Ifng
Ox
Ifngr –/–
15
200
*
0
*
10
EG7
PBS
WT
WT
–/–
Ifngr1
Ox
Il12r b2 –/–
100
d
*
*
*
200
20
200
0
e
5
*
400
300
0
2
Tumor size (mm )
Figure 1 The tumoricidal activity of oxaliplatin
depends on the NLRP3 inflammasome.
(a–f) EL4 or EG7 thymoma tumor size in syngeneic
mice bearing the indicated genotypes (a–f) or
injected with CD8-specific antibody (Anti-CD8
Ab) and treated with oxaliplatin (Ox) (a). Each
treatment group included five or six mice (data
are means ± s.e.m.), and each experiment was
repeated at least twice with similar results.
*P < 0.05. PBS-treated controls are only shown
for tumors growing on WT mice. For PBS-treated
controls in all genotypes, see Supplementary
Figure 1. Pfr1, gene encoding perforin.
(g,h) IFN-γ secretion by inguinal lymph node
cells draining established EG7 tumors treated or
not with oxaliplatin (Ox) and re-stimulated with
OVA, as measured by ELISA (g). Monitoring by
immunofluorescence detection of intracellular
IFN-γ of the proportion of IFN-γ–positive
CD8+ T cells in inguinal lymph nodes draining
established EL4 or EG7 treated or not with Ox
after ex vivo re-stimulation with antibody to
CD3ε ± SIINFEKL peptides (h). Results (means
of triplicates ± s.e.m., n = 3 per group) are
representative of one typical experiment out of
three. *P < 0.01.
0
5
10
EL4
400
*
300
15
*
*
*
200
PBS
WT
WT
–/–
P2rx7
Ox
Nlrp3 –/–
Casp1 –/–
100
0
0
5
Time (d) after treatment
10
EL4
20
15
20
Anti-CD3 Ab
nature medicine volume 15 | number 10 | october 2009
Intracellular IFN-γ
h
(ASC, encoded by the Pycard gene) to form the g
Anti-CD3 Ab + SIINFEKL
inflammasome, the principal Casp-1 activation
0.7%
0.8%
±0.3%
±0.3%
EL4
WT versus Casp1 –/–
complex20–22. Casp-1 activated by the NLRP3
Ox
PBS
inflammasome is required for the proteolytic
In vitro
PBS
versus
re-stimulation
OVA
maturation of pro–IL-1β and hence IL-1β secreDay 5
oxaliplatin
3.1%
2.6%
±0.9%
±1.1%
tion in response to purinergic P2RX7 ­receptor
1.2
EG7
agonists and TLR4 ligands 23–26. Multiple
*
1.0
distinct bacterial products or endogenous
0.6%
13.0%
0.8
damage signals stimulate the NLRP3 inflamma±0.3%
±2.5%
EG7
Ox
0.6
some, resulting in the proteolytic activation of
caspase-125,27–30. Gain-of-function mutations
0.4
0.5%
in NLRP3 that increase IL-1β secretion account
2.0%
EG7
0.2
±0.2%
±0.2%
Ox
for hereditary inflammatory diseases31,32.
+ IL-1RA
0
Here we report the unexpected finding that
Co
PBS
Ox
Co
PBS
Ox
the activation of the NLRP3 inflammasome
CD8
WT
Casp1 –/–
within DCs is decisive for the immune response
against dying tumor cells, providing a previously
unknown link between the innate and acquired immune systems.
efficacy of ­chemotherapy for mouse CT26 colon cancers and mouse
MCA2 sarcomas treated with doxorubicin (Supplementary Fig. 2 and
RESULTS
Supplementary Methods).
Chemotherapy efficacy relies on the NLRP3 inflammasome
In addition, tumors implanted in mice that lack either of two
Oxaliplatin is efficient in controlling tumor growth in immuno- components of the inflammasome28, NLRP3 or Casp-1, failed to
competent wild-type (WT) mice but loses its therapeutic efficacy on respond to oxaliplatin (Fig. 1f). Systemic oxaliplatin treatment primed
­syngeneic EL4 thymomas in Rag2–/– mice, which lack T and B cells, in T cells from the tumor-draining lymph node for IFN-γ production, and
nu/nu mice, which lack T cells, in mice that have been depleted of CD8+ this chemotherapy-induced T cell priming was deficient in Casp1–/–
T cells by injection of a specific antibody (Fig. 1a; for treated controls, mice (Fig. 1g). Intracellular staining revealed that dying tumor cells
see Supplementary Fig. 1 and Supplementary Methods), and in mice primed CD8+ T cells for IFN-γ production and that an IL-1 recepdeficient in IFN-γ receptor-1 (Ifngr1–/– mice), yet remains ­efficient tor antagonist (IL-1RA33) applied with the chemotherapy abolished
in mice deficient in IL-12 receptor-β2 (Il12rb2–/– mice) (Fig. 1b). this T cell priming (Fig. 1h). Therefore, CD8+ T cell–mediated, IFNThe gene-targeting of Ifngr1 or Ifng also abolished the ­therapeutic γ−dependent antitumor immune responses elicited by chemotherapy
response against EG7 thymomas (EL4 expressing the model ­antigen are controlled at some level by the NLRP3 inflammasome.
ovalbumin, OVA) (Fig. 1c). In contrast, EL4 or EG7 ­ thymomas
fully responded to chemotherapy in mice lacking perforin or ATP released from dying cells engages DC P2RX7 receptors
tumor necrosis factor–related apoptosis-inducing ligand (TRAIL, One of the most pleiotropic activators of the NLRP3 inflammaencoded by Tnfsf10; Fig. 1d,e). We obtained similar data ­indicating some is extracellular ATP, which is released from stressed cells34.
the requirement for IFN-γ (but not perforin or TRAIL) for the Oxaliplatin (and a variety of cytotoxic agents) induced the release
–1
IFN-γ (ng ml )
© 2009 Nature America, Inc. All rights reserved.
Articles
1171
Articles
*
150
ATP (10
30
*
20
–3
–7
M)
M)
*
40
–7
M)
50
ATP (10
b
200
60
100
ATP (10
a
50
10
0
c
0
M)
12 16
20
24 24
24
24
+A/D +DNP +APY
0 1 5 10 20 50
0
4
8
12
Oxaliplatin (µM)
16
20
24
24
*
80
*
*
*
*
100
15
10
*
24
+A/D +DNP
Time (h)
Extracellular ATP
Annexin V + DAPI– cells
+
+
Annexin V DAPI cells
25
*
*
*
*
*
40
*
5
20
0
Co
–1
IFN-γ (ng ml )
2.0
Cadmium
Etoposide
Mitomycin C Oxaliplatin
e
*
PBS
OVA
1.5
–1
IFN-γ (ng ml )
© 2009 Nature America, Inc. All rights reserved.
0
d
1.0
0.5
5
4
Cisplatin
Staurosporin Thapsigargin Mitoxantrone Doxorubicin
PBS
*
OVA
3
CO
*
2
1
Live EG7
–
A/D
Apyrase
DNP
CO
Live EG7
EG7 Ox
g 100
M)
–7
Tumor-free mice (%)
60
50
*
40
*
30
20
10
0
4
8
12
16
20
24
24
–
OxiATP PPADS
EG7 Ox
f
ATP (10
*
0
0
0
60
Percentage of
annV DAPI cells
–8
8
Time (h)
20
ATP (10
4
0
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
24
24
–
OxiATP
OVA C/P
*
*
MTX
DX
PBS
80
60
40
20
0
Co
–
Vehicle
A/D
Apyrase
DNP
OxiATP PPADS
+A/D +DNP +APY
Time (h)
Immunized
Figure 2 ATP release by dying tumor cells dictates the immunogenicity of cell death. (a,b) ATP release into the supernatant (a) or residual
intracellular ATP (b) in EG7 cells treated with oxaliplatin and with antimycin A plus deoxyglucose (A/D), DNP or apyrase (APY). Means ± s.e.m.
of triplicates of one representative experiment out of three are depicted. The graph at right in a depicts the dose-response of ATP release
monitored at 24 h. (c) Quantification of ATP released by EG7 cells treated with various cytotoxic agents using a selected dosage of each drug mediating
cell death. *P < 0.01. (d,e) Quantification of IFN-γ released by OVA-stimulated lymph node cells after immunization with ATP-depleted, oxaliplatintreated EG7 cells (d) or Ox-treated EG7 admixed with oxidized ATP (oxiATP) or PPADS (e) using IFN-γ enzyme immunoassay. Means ± s.e.m. of three
independent experiments are shown. (f) ATP release by CT26 cells exposed to doxorubicin. (g) Percentages of tumor-free mice rechallenged with live
syngeneic CT26 cells after immunization with CT26 cells treated with mitoxanthrone or doxorubicin and ATP scavengers or inhibitors of P2RX receptors
(n = 15 per group). One representative experiment out of three is shown.*P < 0.05.
of ATP from EL4 cells (data not shown), as well as from EG7 cells
(Fig. 2a–c). Simultaneous inhibition of glycolytic ATP generation (with
deoxyglucose) and oxidative phosphorylation (with antimycin A)
or uncoupling of mitochondria with 2,4-dinitrophenol (DNP)
resulted in the depletion of ATP from EG7 cells (Fig. 2b) without
the induction of necrosis (data not shown). ATP depletion or addition of the ATP-degrading enzyme apyrase abolished the capacity of
dying EG7 cells to trigger a local immune response after oxaliplatin
treatment. After injection into the footpad, ATP-containing (but
not ATP-depleted), oxaliplatin-treated EG7 cells primed T cells
from the popliteal lymph node to secrete IFN-γ in response to restimulation with OVA (Fig. 2d). Blockade of purinergic receptors
1172
with the 2′,3′-dialdehyde derivative of ATP (‘oxidized ATP’) or with
PPADS (iso-pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2’,5′-disulphonate,
which inhibits the P2X subclass of purinergic receptors) abolished
T cell priming by DCs exposed to oxaliplatin-treated EG7 cells but
not to OVA protein (Fig. 2e).
We obtained similar results for CT26 mouse colon cancer cells,
which released ATP in response to doxorubicin (Fig. 2f). Blockade
of purinergic receptors or depletion of ATP (Fig. 2f) from doxorubicin- or mitoxanthrone-treated CT26 cells abolished their
­capacity to protect the host against a lethal rechallenge with CT26
(Fig. 2g). Moreover, oxaliplatin-treated EG7 cells failed to prime
T cells for IFN-γ production when they were inoculated into the
volume 15 | number 10 | october 2009 nature medicine
Articles
a
–/–
P2rX7
LiveEG7
WT versus
+/–
P2rX7
EG7 Ox versus
OVA + C/P
In vitro
Day 5
6
–1
*
4
3
2
Priming of CD8+ cells requires a functional NLRP3 inflammasome
The OVA-specific IFN-γ production elicited by dying EG7 cells
was abolished in Nlrp3–/–, Casp1–/– and mice deficient in the IL-1
receptor-1 (but normal in Il12rb2–/– and Il18r1–/– mice) (Fig. 5a).
Moreover, dying CT26 cells primed T cells for IFN-γ production
in response to autologous CT26 lysate (but not control lysates
from a distinct tumor) (Supplementary Fig. 4a). This tumorspecific response was abolished by injecting IL-1RA (Supplementary
Fig. 4a). Cross-priming of MHC class I–restricted CD8+ T cells in
an MHC-incompatible system also depended on caspase-1 because
dying mouse embryonic fibroblasts expressing cell-associated OVA
(fused to the transmembrane domain of MHC Kb protein) primed
T cells only when injected into WT (but not Casp1–/–) mice (Fig. 5b
and Supplementary Fig. 4b,c). DCs from Nlrp3–/– or Casp1–/– mice
were unable to prime T cells to respond to OVA when they were first
nature medicine volume 15 | number 10 | october 2009
b
DC
WT versus
P2rx7 –/–
–
–/
rx
7
P2
+/
rx
7
P2
EG7 Ox
P2rx7
OVA + C/P
–/–
In vitro
Day 5 re-stimulation
7
W
T
–
–
–/
rx
7
P2
W
T
–
+/
–
rx
7
rx
7
Live EG7
Co
Live EG7
EG7 Ox versus
OVA + C/P
P2
P2
P2
rx
7
W
T
–/
–
+/
–/
rx
7
P2
W
T
–
0
PBS
OVA
NS
6
–1
*
5
4
3
2
1
0
WT
P2rx7
Co
Dying tumor cells activate the NLRP3 inflammasome in DCs
DCs incubated with dying EG7 cells activated caspase-1, as ­determined
by immunofluorescence staining with an antibody that recognizes a neoepitope formed by proteolytic maturation of ­caspase-1
(Fig. 4a,b). Caspase-1 activation, as observed in WT DCs, was
inhibited by oxidized ATP (Fig. 4a,b). DCs from P2rx7–/–, Pycard–/–
(ref. 36) or Nlrp3 –/– mice were unable to activate caspase-1
(Fig. 4a,b). The proteolytic maturation of caspase-1 strictly
­correlated with the caspase-1–dependent secretion of IL-1β (but
not IL-18, data not shown). Thus, in contrast to WT DCs, P2rx7–/–,
Pycard–/– or Nlrp3–/– DCs failed to secrete IL-1β in response to dying
tumor cells, and oxidized ATP efficiently suppressed IL-1 β secretion
by WT DCs in these conditions (Fig. 4c). The acquisition of MHC
class II antigen, CD40, CD80 or CD86 molecules by DCs stimulated with dying tumor cells was independent of NLRP3 or Casp1
(data not shown), and the production of the IL-12 p40 subunit by
DCs exposed to dying tumor cells was not affected by the knockout of P2rx7, Nlrp3 or Pycard (Fig. 4d). Accordingly, Nlrp3–/– or
Casp1–/– DCs presented the OVA-derived SIINFEKL peptide to
T cell hybridoma cells as efficiently as WT DCs (Supplementary
Fig. 3 and Supplementary Methods).
NS
NS
1
IFN-γ (ng ml )
© 2009 Nature America, Inc. All rights reserved.
footpad of P2rx7–/– mice (ref. 35), in conditions in which they mediated T cell priming in WT P2rx7+/+ or heterozygous P2rx7+/– controls (Fig. 3a). Bone marrow-derived DCs from WT mice (but not
from P2rx7–/– mice) could prime T cells when they were preincubated with dying EG7 cells and then inoculated into P2rx7–/– mice
(Fig. 3b), indicating that it is indeed the P2RX 7 receptor on DCs
that senses ATP from dying tumor cells as an obligate co-signal of
immunogenicity. EL4 tumors implanted in P2rx7–/– mice responded
less efficiently to oxaliplatin than tumors growing in WT mice
(Fig. 1f), underscoring the importance of P2RX7 for chemo­
therapeutic responses.
PBS
OVA
re-stimulation
5
IFN-γ (ng ml )
Figure 3 Purinergic P2RX7 receptors are mandatory for the DC-mediated
immunogenicity of cell death. (a) Quantification of IFN-γ secretion using
ELISA in popliteal lymph node cells restimulated with OVA after footpad
inoculation of live versus oxaliplatin-treated EG7 cells in C57BL/6 mice
(WT or P2rx7+/– or P2rx7–/–). In parallel, mice were injected with 1 mg of
OVA protein plus 10 µg CpG 28 and 5 µg polyI:C (C/P) as adjuvant. NS,
not significant. (b). Same experiment as in a, but recipient mice were
P2rx7–/– mice treated with an adoptive transfer of WT or P2rx7–/– DCs
loaded with antigen (OVA holoprotein with C/P adjuvant, live or oxaliplatintreated EG7 cells). The experiments included three or four mice per group
and were repeated three times with similar results. *P < 0.05.
–/–
WT
P2rx7
Live EG7
–/–
WT
P2rx7
EG7 Ox
–/–
WT
P2rx7
–/–
OVA + C/P
incubated with oxaliplatin-treated EG7 cells and then injected into
the footpad of normal mice (Supplementary Fig. 5).
Similarly, oxaliplatin-treated B16F10 melanoma cells (which
express the endogenous tumor antigen gp100) induced gp100specific, IFN-γ–producing CD8+ T cells in WT, but not in Casp1–/–,
mice (Fig. 5c). In yet another tumor model, mitoxantrone-treated
mouse MCA205 fibrosarcoma cells elicited a protective immune
response that prevented the growth of live tumor cells in WT
mice but not in mice deficient in P2rx7, Nlrp3 or Casp1 (Fig. 5d).
Neutralizing antibodies to IL-1R1 or IL-1β (but not IL-1α) also
blunted the therapeutic response of two independent transplantable methylcholanthrene (MCA)-induced sarcomas to doxorubicin
(Fig. 5e) and that of CT26 cells to anthracyclines or oxaliplatin
in vivo (data not shown). Notably, the IL-1β–dependent efficacy
of doxorubicin could also be shown in a proportion (8 of 15) of
primary fibrosarcomas elicited by MCA treatment in vivo37 in
C57BL/6 mice (Fig. 5f) and BALB/c mice (data not shown). Together,
these results suggest that the NLRP3 inflammasome–mediated
caspase-1 activation in DCs is stringently required for an IL-1β–
dependent antitumor T cell response.
IL-1 secretion by DCs is mandatory for T cell priming
To directly assess the contribution of IL-1β to the priming of T cells,
we performed in vitro priming assays using bone marrow–derived
DCs (derived from WT or Casp1–/– mice) that were pulsed with dying
tumor cells and then cultured with naive T cells in the presence of
IL-1RA or antibodies that neutralize IL-1β. MHC H-2b–­expressing
Casp1–/– DCs incubated with oxaliplatin-treated EG7 cells failed
to prime naive T cells from OT-1 mice, which express a transgenic
T cell receptor that recognizes the OVA-derived SIINFEKL peptide
presented by H-2b class I molecules (Fig. 6a). In similar ­conditions,
WT DCs did stimulate OVA-specific OT-1 cells to produce IFN-γ,
and this effect was inhibited by addition of IL-1β–specific ­antibodies
(Fig. 6a). Conversely, exogenous recombinant IL-1β (rIL-1β) or
rIL-12 restored the priming capacity of Casp1 –/– DCs in vitro
1173
Articles
a
Co
LPS + ATP
Live EG7
Nlrp3 –/–
10 µm
Percentage of
Casp-1 p20+CD11c+ cells
b
70
*
WT
P2rx7 –/–
60
Nlrp3 –/–
50
Pycard
40
*
*
–/–
30
20
10
LPS + ATP
Live EG7
–
OxiATP
EG7 Ox
*
WT
P2rx7 –/–
*
*
*
Nlrp3 –/–
IL-1β (pg ml–1)
(Fig. 6a). It is noteworthy that OT-1 activa0
Co
tion was promoted by WT and Casp1–/– DCs
with similar efficacies if the DCs were stimc 500
ulated by soluble OVA protein and TLR3
400
and TLR9 agonists instead of dying OVAexpressing cells (Fig. 6a). Upon culturing
300
with WT DCs (but less so with Casp1–/– DCs)
pulsed with dying cells, OT1 cells upregu200
lated messenger RNA specific for IFN-γ (but
not for perforin) (data not shown). To show
100
a direct role of IL-1β in stimulating CD8+
0
T cells, we stimulated CD3 +CD8+ splenic
Co
T cells by simultaneously cross-linking CD3
and CD28 in the absence or presence of
d 2.5
IL-1β. Naive CD8 + T cells (which express
basal amounts of CD121a, the IL-1β receptor,
2
Fig. 6b) failed to produce IFN-γ, unless we
1.5
added rIL-1β (or rIL-12 as a positive ­control,
but not tumor necrosis factor-α or IL-6 as
1
negative controls) (Fig. 6b). Oxaliplatintreated EG7 cells failed to prime OVA0.5
specific T cells in vivo after inoculation
into the footpad if they were injected along
0
Co
with IL-1RA (Fig. 6c). Moreover, in vitro–
+
+
re-stimulated CD3 CD8 T lymphocytes
failed to stain positively for cytoplasmic
IFN-γ in WT mice injected with IL-1RA together with ­oxaliplatintreated EG7 cells, or in Casp1 –/– mice (Fig. 6d). Accordingly,
IL-1RA blocked the expansion of antigen-specific CD8+ T cells that
were induced by dying EG7 (but not EL4) cells in vivo and then
were detected with a SIINFEKL-K b tetramer ex vivo (Fig. 6e). The
P2RX7–NLRP3–Casp-1–dependent antitumor effect also required
CD4+ T cell help (Supplementary Fig. 6a,b).
Immunization with oxaliplatin-treated EG7 cells promoted
T helper type 1 polarization. Expression of CD69 and production
of IFN-γ and IL-2 by CD4 + T cells located in the draining lymph
node occurred in a Casp-1–dependent manner (Supplementary
Fig. 6c,d). In mice bearing a deficient P2RX 7–NLRP3–Casp-1
axis, the oxaliplatin-elicited OVA-specific response was shifted to
a T helper type 2 pattern (with production of IL-10 and IL-13)
(Supplementary Fig. 7). These results underscore the cardinal
1174
EG7 Ox
+ OxiATP
EG7 Ox
WT
Pycard –/–
ND
ND
LPS + ATP
Live EG7
–
OxiATP
EG7 Ox
*
NS
IL-12 p40 (ng ml–1)
© 2009 Nature America, Inc. All rights reserved.
Figure 4 Activation of caspase-1 and IL-1β
secretion in DCs exposed to dying tumor cells.
(a,b) Immunofluorescence staining of active
caspase-1 in bone marrow–derived DCs (a)
and quantification of DCs containing active
caspase-1 (b). DCs (WT or derived from
P2rx7–/–, Nrlp3–/– or Pycard–/– mice) were
exposed to PBS or oxaliplatin or to live or
oxaliplatin-treated EG7 tumor cells in the
presence or absence of oxidized ATP and labeled
with antibody to CD11c, antibody to caspase-1
p20 and DAPI (a,b). Positive controls included
DCs exposed to LPS (50 ng ml–1) for 16 h and
then to ATP (2 mM) for 20 min. (c,d) IL-1β
(c) or IL-12 p40 (d) concentrations measured
by commercial ELISA in the supernatants of
DCs. ND, not determined. The experiments
were performed three times with similar results.
Representative microphotographs or histograms
are depicted. Means ± s.e.m. are shown for
triplicate wells. *P < 0.05.
WT
P2rx7 –/–
Nlrp3 –/–
Pycard –/–
Live EG7
EG7 Ox
contribution of IL-1β to the immune response elicited by dying
tumor cells. In agreement with this interpretation, local injection
of recombinant IL-1β protein (or IL-12, but not IL-6), together
with oxaliplatin-treated EG7 cells, fully restored deficient T cell
priming in Nlrp3–/– or Casp1–/– mice (Fig. 6f). Thus, IL-1β is the
factor that determines the NLRP3-­dependent immunogenicity of
cancer cell death.
P2RX7 mutations in human breast cancer
Loss-of-function alleles of the gene encoding TLR4, a receptor involved
in the perception of immunogenic cell death, negatively affect the prognosis of individuals with breast cancer treated with anthracyclines15.
We sought to determine whether a loss-function polymorphism that
affects P2RX7 (Glu496Ala, rs3751143), lowering its affinity for ATP38
and thus IL-1β release in human monocytes39, would decrease the
volume 15 | number 10 | october 2009 nature medicine
Nlrp3 –/–
Casp1 –/–
–/–
WT versus Il1r1
Il18r –/–
Live EG7
Il12r b2 –/–
EG7 Ox versus
OVA + C/P
a
5.0
d
PBS
OVA
In vitro
re-stimulation
1.0
Live EG7 OVA Live EG7 OVA
Ox + C/P
Ox + C/P
Live EG7 OVA Live EG7 OVA Live EG7 OVA
Ox + C/P
Ox + C/P
Ox + C/P
Nlrp3–/–
WT
Live TS/AOVA
TS/AOVA X-rays versus
OVA C/P
Casp1–/–
Il1r1–/–
c
WT versus Casp1–/–
PBS
SIINFEKL
OVA
In vitro
re-stimulation
5.0
60
40
20
20
0
10
20
Live B16
B16 Ox
gp100 + C/P
30
Il12rb2 –/–
0
40
0
Time (d)
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
10
20
30
40
–/–
WT versus Casp1
20
30
40
P2rx7 –/–
CO
MTX
n = 15 for each group
0
Time (d)
Nlrp3–/–
In vitro
re-stimulation
0
10
10
20
30
40
Casp1–/–
PBS
gp100
1,500
4.0
WT
Casp1–/–
500
*
*
3.0
IFN-γ (ng ml–1)
IFN-γ (ng ml–1)
Il18r –/–
Live EG7 OVA
Ox + C/P
80
40
WT
*
100
60
*
*
0
2.0
1.0
WT
Casp1–/–
f
400
*
300
Dx responders (n = 8)
Dx nonresponders (n = 7)
Dx nonresponders + anti–IL-1β (n = 15)
200
0
Live TS/AOVA OVA Live TS/AOVA OVA Live TS/AOVA OVA
X-rays
C/P
X-rays C/P
C/P
X-rays
PBS
SIINFEKL
PBS (n = 15)
PBS + anti–IL-1β (n = 15)
100
0
MCA challenge
PBS gp100 Live B16 Ox
C/P
OVA
PBS
gp100 Live B16 Ox
C/P
PBS
Day 0
PBS versus Dx
± anti IL-1β
Monitor
tumor growth
Days 63–84
1.6
gp100
1.4
1.4
1.2
1.0
0.8
0.8
Co Ig
Anti–IL-1α
Anti–IL-1β
Co Ig
PBS
Anti–IL-1α
Dx
0.7
0.6
0.5
Anti–IL-1β
0.8
0.2
0.2
0.1
0
10
20
30
0
0
10
20
30
1.2
Co Ig
Anti–IL-1α
Anti–IL-1β
Co Ig
PBS
Anti–IL-1α
Dx
Anti–IL-1β
0.6
0.3
0.4
0
1.0
Anti–IL-1β
0.4
0.6
1.2
Co Ig
Anti–IL-1R
PBS
Anti–IL-1β
Co Ig
Anti–IL-1R Dx
1.0
0.8
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0
0
0
10
20
Time (d)
MCA 4
Tumor size (cm2)
e
Tumor size (cm2)
© 2009 Nature America, Inc. All rights reserved.
*
80
0
0.5
b
100
1.5
Tumor-free mice (%)
IFN-γ (ng ml–1)
2.0
Tumor-free mice (%)
Articles
MCA 2
30
40
50
100
150
200
Time (d)
MCA 2
Figure 5 The NLRP3 inflammasome is required for the elicitation of an adaptive antitumor immune response. (a–c) Quantification of IFN-γ secretion,
using ELISA, by lymph node cells re-stimulated with SIINFEKL peptides (b) with or without OVA holoprotein (a,b) or with gp100-derived peptide
(QVPRNQDWL) (c) after immunization of MHC H-2b+ WT (a–c), Nlrp3–/– (a), Casp1–/– (a–c) or IL1r1–/– (a) mice (five mice per group) with oxaliplatintreated EG7cells (a),irradiated H-2d+ mouse mammary cancer TS/A cells (b) or oxaliplatin-treated B16F10 cells (c). (d) Percentages of tumor-free
mice after rechallenge with syngeneic MCA205 sarcoma after immunization with mitoxantrone (MTX)-treated MCA205 cells in the indicated genetic
backgrounds of C57BL/6 mice (n = 15 per group). (e) Tumor growth kinetics of day 7–established MCA-2 or MCA-4 sarcomas treated with doxorubicin
(Dx) in the presence of control immunoglobulin (Co Ig), neutralizing antibody to IL-1α (Anti–IL-1α), IL-1β (Anti–IL-1β) or IL-R1 (Anti–IL-1R1)
(n = 5 per group). (f) Tumor growth kinetics of spontaneous MCA-induced sarcomas in C57BL/6 mice treated with intravenous doxyrubicin with or
without neutralizing antibodies to IL-1β (n = 15 per group). Tumor growth kinetics of one typical experiment (e) from six different MCA lines assessed
or one experiment (f) separating responders from nonresponders are depicted.
beneficial effect of anthracyclines in breast cancer. We analyzed a
cohort of individuals with sporadic breast cancer that was stratified
according to the P2RX7 genotype (normal versus variant P2RX7). The
frequencies of heterozygous (‘variant’) and homozygous (‘normal’)
germline polymorphisms were 36% and 64%, respectively. We found
no significant differences in classical prognostic factors between
normal and variant group of patients (Supplementary Table 1).
However, the P2RX7 loss-of-function allele had a significant ­negative
prognostic impact on metastatic disease-free survival (log-rank
test; P = 0.02).
nature medicine volume 15 | number 10 | october 2009
The univariate Cox regression analysis confirmed statistically
significant results for the P2RX7 genotype (P = 0.021), with a hazard ratio of 1.6 (95% confidence interval [1.074; 2.398]) for P2RX7
Glu496Ala versus P2RX7 Glu496Glu (Fig. 6g and Supplementary
Table 1). A multivariate Cox regression model revealed a significant effect for tumor grade (tumor grade 1 versus tumor grade 2–3,
hazard ratio 3.243[1.024;4.383], P < 0.05) and for P2RX7 genotype
(Glu496Glu versus Glu496Ala, hazard ratio 1.556[1.017;2.383], P <
0.05). These results lend support to the clinical relevance of the P2RX7
and inflammasome pathway.
1175
Articles
a
–/–
Liv EG7
WT versus Casp1
EG70x versus
DC
OVA + C/P
OT1
activation
CO lg or anti–IL-1β Ab
± exogenous IL-1β or IL-12
OVA
OVA
C/P
CD121a
1.0
IFN-γ (ng ml–1)
NS
Co
Counts
1.5
0.3
0.2
0.1
0
IL-12
e
EG7
Co
0.8%
± 0.1%
d
0.2%
± 0.1%
105
*
In vitro
re-stimulation
IFN-γ+CD3+CD8+ cells (%)
PBS
OVA
*
*
*
NS
EG7
–
IL-1β IL-6 IL-12 EG7
EG7 Ox
WT
–
IL-1β EG7
EG7 Ox
Tlr4 –/–
–
IL-1β EG7
EG7 Ox
P2rx7 –/–
–
IL-1β IL-6 EG7
EG7 Ox
Nlrp3 –/–
–
IL-1β IL-12
EG7 Ox
Casp1–/–
–
g
IL-1RA IL-1RA
(20 µg) (100 µg)
EG7 Ox
EG7
EG7 Ox
EG7 Ox
+IL-1RA
2.1%
8.4%
3.3%
104
103
0
3
5
0 10 104 10
CD8α
8
3
5
0 10 104 10
NS
*
WT
Casp1–/–
6
4
2
ND
0
Co Live EG7
–
IL-1RA
EG7 Ox
Metastasis-free subjects (%)
Tlr4 –/–––/–
Live EG7
WT versus P2rx7–/–
EG7 Ox
Nlrp3
EG7 Ox + IL-1β
Casp1–/–
EG7 Ox + IL-6
EG7 Ox + IL-12
f
IFN-γ (ng ml–1)
IL-1RA Live
(100 µg) EG7
3
5
0 10 104 10
CD8
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
–
OVA C/P
IFN-γ
SIINFEKL tetramers
EG7 Ox
+ IL-1RA
EG7 Ox
0.1%
± 0.1%
0%
© 2009 Nature America, Inc. All rights reserved.
0.5
0
EG7 Ox
EL4
*
1.0
p7
0
Co Ig Anti–IL-1β Ab IL-1β
TN
Fα
–
C
o
Live EG7
PBS
OVA
In vitro
re-stimulation
NS
1.5
0
PBS
WT
± IL-1RA
IL
-1
2
0.5
*
Live EG7
EG7 Ox
OVA + C/P
2.0
IL
-6
1.0
NS
WT
Casp1–/–
IL
-1
β
1.5
7
6
5
4
3
2
1
0
*
*
IFN-γ (ng ml –1)
IFN-γ (ng ml–1)
2.0
c
b
–
IL-1RA
OVA C/P
Glu496Glu (n = 144)
Glu496Ala (n = 81)
100
80
60
40
20
0
Log-rank P = 0.02
0
20
40
60
80 100
Time (months)
120
140
Figure 6 NLRP3 inflammasome-dependent differentiation of tumor specific CD8 + T cells toward IFNγ polarization. (a,b) Monitoring of IFN-γ
concentrations in supernatants of a 4-d coculture of naive OT-1 cells (a) with syngeneic WT or Casp1–/– bone marrow–derived DCs loaded with
oxaliplatin-treated EG7 or OVA in C/P (inset) in the presence of neutralizing monoclonal antibody to IL-1β or exogenous rIL-1 (100 ng ml–1) or IL-12
(10 ng ml–1). Purified CD3+CD8+ T cells (b) were stimulated for 72 h with plastic-immobilized monoclonal antibodies to CD3 and CD28 with
cytokines (10 ng ml–1 for IL-12 p70, 100 ng ml–1 for others). Inset shows CD121a (IL-1R1) expression on naive CD8 + T cells (isotype control in gray).
(c) Quantification of IFN-γ produced by lymph node cells re-stimulated with OVA after immunization with oxaliplatin (Ox)-treated EG7 cells in the
presence of IL-1RA molecules. (d) The frequency of IFN-γ–producing CD8+ T cells after re-stimulation of the lymph node is shown (representative dot
plots at the top, means ± s.e.m. (n = 3) at the bottom). (e) The frequency of CD8+ T cells staining positively with SIINFEKL-Kb tetramers in the draining
lymph node of oxaliplatin-treated EG7 or EL4 cells determined at day 5. (f) Quantification of IFN-γ produced by lymph node cells re-stimulated with
OVA after immunization with oxaliplatin-treated EG7 cells in the presence of the indicated cytokines in the indicated mouse backgrounds. *P < 0.05.
(g) Kaplan-Meier estimates of time to metastasis in two groups of subjects with breast cancer treated with adjuvant anthracyclines (n = 225) bearing the
normal (Glu496Glu) or loss-of-function (Glu496Ala) P2RX7 alleles.
DISCUSSION
Our results identify a new signal that is required for cancer cell death
to be immunogenic, namely the release of ATP. This signal has been
previously shown to increase as a danger signal in severe tissue damage
including myocardial infarction and hepatotoxic insult18, with potent
proinflammatory effects. Because most cells express ATP-degrading
ectoenzymes40, ATP released from stressed or dying cells likewise follows a steep gradient and only activates purinergic receptors in the
immediate vicinity of the lethal event. Our data are compatible with
1176
a scenario in which ATP activates P2RX7 receptors on DCs, thereby
stimulating the aggregation of the NLRP3-ASC–Casp-1 inflammasome, the proteolytic maturation of caspase-1, pro–IL-1β cleavage
and consequent IL-1β release. IL-1β then is required for the priming
of IFN-γ–producing, tumor antigen–specific CD8+ T cells. In accord
with previous studies addressing the capacity of adoptively transferred
or vaccine-induced CD8+ T cells to eradicate established tumors41,42,
IFN-γ, rather than cytolytic activities (that are dependent on ­perforin
or TRAIL), mediates the anticancer activity of T lymphocytes
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that have been primed in a P2RX7–NLRP3–ASC–Casp-1–IL-1β–
dependent fashion.
Each of the individual steps in this linear cascade (ATP to P2RX7 to
NLRP3–ASC–Casp-1 to IL-1β to CD8+ T cell polarization for IFN-γ
production) have been described previously18,25,29,43,44. However, there
are key notions that emerge from our study. First, it was unexpected that,
when activated in DCs, inflammasome activation can establish a link
between the innate (inflammatory) and the acquired (cognate) immune
responses because IL-1β produced by DCs is required for the priming
of T cells. Second, none of the functional entities of this cascade (the
ATP-P2X7 system, the inflammasome and the IL-1β–IL-1βR axis) has
previously been described as involved in anticancer immune responses
that determine the efficacy of chemotherapy.
The NLRP3 inflammasome responds to multiple danger signals,
including a decrease in cytosolic potassium concentrations and an
increase in cytosolic DNA levels, urate and bacterial products24,45–47.
The NLRP3 inflammasome is also controlled by the serial ligation of purinergic receptors and TLRs18,23. In addition to tumor
cell–derived ATP acting on P2RX 7 receptors, HMGB1, a TLR4
agonist released by dying tumor cells treated with doxorubicin
or oxaliplatin15, may contribute to the stimulation of the NLRP3
inflammasome. Indeed, our data indicate that HMGB1 could
synergize with ATP to induce IL-1β release by DCs (Supplementary
Fig. 8a) and that antibody specific for HMGB1 abrogated the
ability of DCs to produce IL-1β in contact with dying tumor cells
(Supplementary Fig. 8b). Hence, both ATP and HMGB1 released
from dying cells contribute to the activation of the NLRP3 inflammasome in DCs.
Notably, not only injured tumor cells but also stressed healthy
tissues may elicit a Casp-1–dependent T cell response. Thus, we
observed that immortalized, nontransformed mouse embryonic
fibroblasts expressing cell-associated OVA and oxaliplatin-treated
peritoneal macrophages pulsed with OVA protein both triggered
OVA-specific immune responses in a Casp-1–dependent manner.
However, anti­cancer chemotherapy does not elicit a ­ generalized
autoimmune response, presumably because tumor cells die
more efficiently than healthy cells, because they express a set of
tumor-specific antigens against which no self-tolerance has been
established, or both.
Although IL-1β could be instrumental at the level of DCs (by contributing to DC activation and migration), our data indicate that
maturation of DCs triggered by dying cells is caspase-1 independent (data not shown), that IL-1β does not affect the capacity of DC
to process cell-associated antigens and that IL-1β can directly act at
the transcriptional level on T cells to polarize CD8+ T cell immune
responses in vitro.
Chronic inflammation including overactivation of the IL-1β–
IL-1βR system48 has been considered a tumor-promoting condition,
arguing in favor of IL-1β inhibition for tumor prevention or therapy49–52. However, as shown here, the production of IL-1β by DCs
and the action of IL-1β on specific CD8+ T cells may contribute to
therapeutically relevant anticancer immune responses.
The clinical study reported here underscores the medical relevance
of the ATP-P2RX7 pathway for anthracycline treated breast cancer
individuals. These results may therefore have major implications by
defining new constitutional markers of chemotherapy efficacy in cancer patients. It will be crucial to determine which chemotherapies have
the capacity to induce immunogenic cell death and which type of
tumors can actually generate immunogenic signals after radiotherapy
or chemotherapy in humans.
nature medicine volume 15 | number 10 | october 2009
Methods
Methods and any associated references are available in the online
­version of the paper at http://www.nature.com/naturemedicine/.
Note: Supplementary information is available on the Nature Medicine website.
Acknowledgments
We thank I. Couillin (CNRS) and A. Mignon (Cochin Hospital) for helpful
discussion and for providing IL-1RA, R. Schreiber (Washington University
School of Medicine) for monoclonal antibodies to IL-1α, IL-1β and IL-1R,
H. Yang (Feinstein Institute for Medical Research) for antibody to HMGB1,
H. Yagita (School of Medicine, Juntendo University) for the N2B2 antibody to
mouse TRAIL, J.-C. Guéry (INSERM) for IL12rb2−/− mice, V. Dixit (Pennington
Biomedical Research Center) for Pycard−/− mice, M. Albert (Pasteur Institute) for
membrane-bound OVA–transfected mouse embryonic fibroblast cells, S. Forget
and J. Bombled for access to the genomics platform, V. Vasseur and the Institut
Gustave Roussy animal facility for breeding of transgenic mice, I. Martins for
help in ATP release screening and A. Boissonnas (INSERM, Curie Institute) for
providing OT1-GFP mice. We are deeply indebted to P. Arveux and S. Dabakuyo for
useful help with the statistical analyses. The authors are supported by grants from
the Ligue Nationale contre le Cancer (to L. Aymeric., G.K. and L.Z.), the Fondation
pour la Recherche Médicale (to L. Apetoh., G.K., E.U., F.S. and L.Z.), the European
Union (INFLACARE grant), the association for International cancer research
(to G.K.) Cancéropôle Ile-de-France, Institut National du Cancer (L.Z., G.K.),
Agence Nationale pour la Recherche (to G.K.), the European Molecular Biology
Organization (L. Apetoh.), INSERM (A.T.), the National Health, Association pour
la recherche sur le cancer RC (to G.M.), National Health and Medical Research
Council of Australia, Cancer Council of Victoria, the China Scholarship Council
(Y.M.) and the Leukemia Foundation (M.J.S., N.M.M. and N.M.H.). K.V. is the
recipient of a European Respiratory Society Fellowship (number 605).
AUTHOR CONTRIBUTIONS
F.G., L. Aymeric., A.T., L. Apetoh., T.P., F.S., G.M., E.U., Y.M., N.M.M., N.M.H.
and M.J.S. performed in vitro and in vivo experiments. C.O., E.T., P.G. and A.C.
performed in vitro experiments. A.T. and T.P. performed immunofluorescence
experiments. M.U., J.-L.P., B.R., J.K. and J.T. provided transgenic cells or mice and
gave scientific advice. K.V., F.A., R.L., F.G. and A.T. performed the single nucleotide
polymorphism analysis on cohorts of subjects with cancer. F.G., L. Apetoh., M.J.S.
and A.T. prepared the figures and drafted the manuscript. G.K. and L.Z. designed
the study and wrote the manuscript. M.J.S., G.K. and L.Z. all contributed equally to
the design of the experiments and to the writing of the manuscript.
Published online at http://www.nature.com/naturemedicine/.
Reprints and permissions information is available online at http://npg.nature.com/
reprintsandpermissions/.
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ONLINE METHODS
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ATP assays. We treated 1 × 105 EG7 or CT26 cells (American Type Culture
Collection) with oxaliplatin (5 µg.ml−1), doxorubicin (20 µM) or other cell
death inducers (all from Sigma-Aldrich), and measured intracellular or extracellular ATP at the time points indicated in Figure 2. Briefly, we collected supernatants and assessed the amount of extracellular ATP with the luciferin-based
ENLITEN ATP Assay (Promega). We added 100 µl of luciferin-luciferase solution to the supernatants and recorded light emission with a Fluostar lumino­
meter (BMG Labtech). We calibrated light emission by using standard samples
furnished by the manufacturer. We measured intracellular ATP with a commercial ATP Assay kit (Calbiochem). We treated cells with a lysis solution containing 1% trichloroacetic acid for 1 min. We then added the luciferin-luciferase
solution and measured ATP. For ATP depletion, we first treated cells with either
oxaliplatin or doxorubicin for 24 h and then incubated them with antimycin A
(2 µg ml−1) and 2-deoxyglucose (30 mM) (Sigma Aldrich) for 20 min, and we
subsequently measured ATP as described above. Alternatively, we treated the
cells with DNP (200 µM) or apyrase (40 international units per ml) (Sigma
Aldrich), for 20 min.
Chemotherapy and radiotherapy of tumors established in mice. We injected
WT C57BL/6 mice or knockout mice subcutaneously with 1 × 106 EL4 (or EG7)
cells into the right flank. Alternatively, we injected WT BALB/c mice with 5 ×
105 CT26 cells or 1 × 105 MCA2 or MCA4 cells subcutaneously into the right
flank. We then randomly assigned mice to treatment groups of four to six mice
each. When tumor size reached 70–90 mm2 for EL4 (9–12 d after injection),
15–25 mm2 for EG7 (7 d after injection), 60–80 mm2 for CT26 (8–10 d after
injection) or 15–20 mm2 for MCA2 and MCA4 (7 d after injection), we gave
the mice chemotherapy. We injected mice bearing EL4 tumors with ­oxaliplatin
(5 mg per kg body weight intraperitoneally), mice bearing CT26 tumors with
oxiplatin (5 mg per kg body weight intraperitoneally) or doxorubicin (50 µl,
4 mM intratumorally) and mice bearing MCA2 or MCA4 tumors with doxorubicin (2 mg per kg body weight intravenously). In some experiments, CT26
tumor-bearing mice received two injections (on day 0 and day 2 after the first
injection of chemotherapeutic treatment) of IL-1RA (100 µg), IL-1–specific
antibody (100 µg) (R&D Systems, clone 30311) or hamster serum as a control. Some CT26 and MCA2 or MCA4 tumor–bearing mice received biweekly
administration of control immunoglobulin, antibody to IL-1α, antibody to
IL-1β or antibody to IL-1R (provided by R. Schreiber) from day 4 to day 21
after tumor inoculation. In individual mice where fibrosarcomas were generated
de novo by MCA, treatment with PBS or doxorubicin in the presence of control or IL-1β–specific antibody began on first palpation of tumors >0.1 cm2 in
size. We administered doxorubicin twice, with injections 1 week apart (2 mg
doi:10.1038/nm.2028
per kg body weight intravenously), and administered ­antibody twice weekly
(250 µg intraperitoneally). Mice were bred and maintained according to both
the Federation of European Laboratory Animal Science Associations and the Val
de Marne Animal Experimental Ethics Committee guidelines.
In vitro stimulation of CD8+ T cells or OT-1 cells by dendritic cells. We ­purified
CD8+ T cells from OT-1 spleens with a CD8+ T Cell Isolation Kit (Miltenyi
Biotec). We cultured these responder cells (2 × 104) with bone marrow–derived
DCs from WT or Casp-1–deficient mice (1 × 104) loaded with live or oxaliplatintreated EG7 cells (1 × 104) in the presence of a control or IL-1β–specific antibody
(10 µg ml–1) in round-bottom 96-well plates. Alternatively, we incubated OT-1 cells
and bone marrow–derived DCs with OVA protein alone or with CpG (10 µg ml–1)
and polyI:C (5 µg ml–1) (Sigma Aldrich). We collected the supernatants after 48 h
and assayed them for IFN-γ by ELISA (BD Biosciences). Alternatively, we isolated
double-positive CD3+ and CD8+ cells from mouse spleen by cell-sorting on a
MoFlo cytofluorometer (Dako) and incubated them in flat-bottom 96-well culture
plates precoated with monoclonal antibodies to CD3ε (1 µg ml–1) (eBioscience,
clone 145-2C11) and CD28 (0.5 µg ml–1) (BD Biosciences, clone 37.51) supplemented with various amounts of cytokines. We collected the supernatants after
48 h and assayed them for IFN-γ by ELISA.
Genotyping of P2RX7 single nucleotide polymorphism. We obtained written
informed consent from subjects entering the study approved by the local Ethical
Committee of Kremlin Bicêtre and the Institut Gustave Roussy Biopathology
Review Board. We isolated DNA from frozen blood leukocytes of each individual.
We used Taqman primers and probe (Applied Biosystems) to amplify a fragment
containing the P2RX7 Glu496Ala single nucleotide polymorphism (rs3751143).
After PCR amplification, we assigned genotypes to each subject by comparing
the signals from the two fluorescent probes, FAM and VIC, and calculating the
–log(FAM/VIC) ratio for each data point.
Additional methodology. Specific reagents, tumor cell lines, mouse strains,
primary DC cultures, anticancer prophylactic vaccines, immunofluorescence
assays for Casp-1 activation, monitoring tumor-specific T cell responses and the
design of the clinical study are all detailed in the Supplementary Methods.
Statistical analyses. We compared continuous data by the Mann-Whitney U test
and compared categorical data by Chi-square or Fisher’s exact test, as appropriate. We used the log-rank test for the analysis of Kaplan-Meier survival curves.
We performed statistical calculations with JMP 5.1 software (SAS Institute). All
P values were two-tailed. A P value < 0.05 was considered statistically significant
for all experiments.
nature medicine
Figure 8S
a
*
IL1-β (pg.ml -1)
250
200
150
PBS
*
100
*
ATP
50
0
CO
LPS
1 µg
0.1 µg
HMGB1
IL-1 β
b
IL-12p40 (ng.ml -1)
IL-1β (pg.ml -1)
NS
*
*
500
IL-1 2 p4 0
400
300
200
100
0
CO
-
Anti-HMGB1 Ab
EG7 Ox
Oxi ATP
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
CO
-
Anti-HMGB1 Ab Oxi ATP
EG7 Ox
Supplemental Fig. 8. Serial stimulation with HMGB1, a TLR4 agonist, and ATP
is required by DC for optimal IL-1β production. a. Synergistic effects of TLR4
agonists with ATP for IL-1β release from DC. BM-DC were pre-incubated for 16 hrs
with either LPS or increasing dosages of HMGB1 and then exposed to a second
stimulation with 2mM ATP. b. Blocking HMGB1 during exposure of DC to dying tumor
cells compromises IL-1β secretion. WT BM-DC were incubated with oxaliplatintreated EG7 tumor cells in the presence of oxidized ATP or anti-HMGB1 (or
irrelevant) neutralizing Ab. The levels of IL-1β and IL-12p40 were monitored in the
culture supernatants at 24 hrs using commercial ELISA. These experiments have
been performed twice, yielding similar results. A representative graph is depicted,
showing the mean+SEM value of IL-12p40 or IL-1β production in triplicate wells.
*p<0.05.
Nature Medicine: doi:10.1038/ng.2028
2 Rôle des LTγδ producteurs d’IL-17 dans l’efficacité thérapeutique de thérapies anticancéreuses conventionelles
Nous présenterons ici les principaux résultats du papier de Ma Y et al : « Contribution
of IL-17-producing γδ T cells to the efficacy of anticancer chemotherapy ».
L’administration de chimiothérapies immunogènes induit la libération de signaux de
danger par les cellules tumorales mourantes. Ces signaux alertent le système immunitaire et
contribuent à l’activation de LT CD8 anti-tumoraux producteurs d’IFN-γ. Une analyse par
micro-array révèle que les chimiothérapies immunogènes modifient le profil d’expression de
nombreux gènes de l’immunité au niveau de l’environnement tumoral (Fig 1A, 1B). Ainsi, le
traitement de tumeurs MCA205 par la doxorubicine induit l’expression de gènes de
l’immunité Th1, comme Eomes et Tbx21, 8 jours après le traitement (Fig 1C). Au niveau
protéique, la doxorubicine induit une augmentation d’IFN-γ et d’IL-17A dans le lit tumoral
(Fig 1D). L’analyse des leucocytes infiltrant les tumeurs indique que les LT produisent 3 fois
plus d’IFN-γ et d’IL-17A chez les souris traitées par la chimiothérapie que chez les souris
ayant reçu du PBS (Fig 1E). Alors que l’IFN-γ est majoritairement produit par les LT CD8+,
les LTγδ des types γ4 et γ6 sont les principaux producteurs d’IL-17A (Fig 1F, 1G, S2). Les
LTγδ commencent à s’accumuler dans le lit tumoral 3 jours après le traitement, et sont suivis
par les LT CD8 IFN-γ
+
qui apparaissent à jour 8 (Fig 2A, 2C). Les deux types cellulaires
s’accumulent et prolifèrent de manière transitoire (Fig 2A, 2B). Leurs proportions
commencent à diminuer 10 jours après le traitement et reviennent aux valeurs de base à jour
15 (Fig 2A). Ces observations ont été faites dans trois modèles différents : le fibrosarcome
MCA205 et le carcinome du colon CT26 traités par la doxorubicine et l’adénocarcinome
mammaire TSA irradié (Fig 3). Dans ce dernier modèle, seules les souris répondant au
traitement présentent une accumulation de LT producteurs d’IFN-γ et d’IL-17A (Fig 3D, 3E,
3F). Dans les trois types de modèles, la proportion de LT CD8 IFN-γ + présents dans le lit
tumoral est corrélée à celle des LTγδ IL-17A+ (Fig 3G).
Les souris ayant reçu un anticorps neutralisant l’IL-17A ou incapables de répondre à
cette cytokine (Il-17ra
-/-
) ne développent pas de réponses IFN-γ spécifiques contre des
cellules tumorales exposées à des chimiothérapies immunogènes (Fig 5A). Ceci explique que
les protocoles de vaccination avec des cellules tumorales mourantes ne soient pas efficaces
chez les souris Il-17ra
-/-
(Fig 5B). De même, l’efficacité thérapeutique de chimiothérapies
60
immunogènes est diminuée chez des souris déficientes pour la production d’IL-17A (Il-17a -/) ou ayant reçu des anticorps neutralisant l’IL-17A ou son récepteur IL-17RA (Fig 4). L’IL17A joue donc un rôle important dans l’efficacité thérapeutique des chimiothérapies
immunogènes.
En réponse à l’administration de traitements immunogènes, les LTγδ sont les
principaux producteurs d’IL-17A dans le lit tumoral. La production d’IL-17A par ces cellules
est stimulée in vitro par l’IL-1β produite par les cellules dendritiques exposées à des corps
apoptotiques immunogènes (Fig 5C, 5D). Chez les souris déficientes pour les LTγδ des types
γ4 et γ6 (Vγ4/6 -/-), les protocoles de vaccination avec des cellules mourantes ainsi que les
traitements de tumeurs établies par des chimiothérapies immunogènes sont moins efficaces
(Fig 5B, 6A). Ceci est en accord avec l’absence d’accumulation de LT CD8 IFN-γ
+
dans le
lit tumoral de ces souris (Fig 6B). Le transfert adoptif de LTγδ WT, mais pas celui de LTγδ
ne pouvant pas produire d’IL-17A ou répondre à l’IL-1β (Il-1r
-/-
), améliore l’efficacité
thérapeutique de traitements immunogènes (Fig 7A, 7B, 7C). Enfin, les LTγδ sont capables
de restaurer l’efficacité thérapeutique de la doxorubicine chez des souris IL-17A -/- (Fig 7D).
Tout ceci indique que les LTγδ producteurs d’IL-17A sont activés par l’IL-1β produite par les
cellules dendritiques exposées à des corps apoptotiques immunogènes et jouent un rôle
important dans l’efficacité thérapeutique de chimiothérapies immunogènes.
61
Published March 7, 2011
Ar ticle
Contribution of IL-17–producing  T cells
to the efficacy of anticancer chemotherapy
Yuting Ma,1,6 Laetitia Aymeric,1,6 Clara Locher,1,6 Stephen R. Mattarollo,8
Nicolas F. Delahaye,1 Pablo Pereira,9 Laurent Boucontet,9
Lionel Apetoh,10,11,12 François Ghiringhelli,10,11,12 Noëlia Casares,13
Juan José Lasarte,13 Goro Matsuzaki,14 Koichi Ikuta,15 Bernard Ryffel,16
Kamel Benlagha,17 Antoine Tesnière,2 Nicolas Ibrahim,5
Julie Déchanet-Merville,18 Nathalie Chaput,1,3 Mark J. Smyth,8
Guido Kroemer,2,4,19,20,21 and Laurence Zitvogel1,3,7
CORRESPONDENCE
Laurence Zitvogel:
[email protected]
OR
Guido Kroemer:
[email protected]
Abbreviations used: AhR, aryl
hydrocarbon receptor; BMDC,
BM-derived DC; CIg, isotype
control Ig; DX, doxorubicin;
 T17, IL-17A–producing 
T cell; MTX, mitoxantrone;
OX, oxaliplatin; Tc1, IFN-–
producing CD8+ T cell; TIL,
tumor-infiltrating lymphocyte;
TR, tumor regression.
By triggering immunogenic cell death, some anticancer compounds, including anthracyclines
and oxaliplatin, elicit tumor-specific, interferon-–producing CD8+  T lymphocytes (Tc1
CTLs) that are pivotal for an optimal therapeutic outcome. Here, we demonstrate that chemo­
therapy induces a rapid and prominent invasion of interleukin (IL)-17–producing  (V4+
and V6+) T lymphocytes ( T17 cells) that precedes the accumulation of Tc1 CTLs within
the tumor bed. In T cell receptor / or V4/6/ mice, the therapeutic efficacy of chemotherapy was compromised, no IL-17 was produced by tumor-infiltrating T cells, and Tc1 CTLs
failed to invade the tumor after treatment. Although  T17 cells could produce both IL-17A
and IL-22, the absence of a functional IL-17A–IL-17R pathway significantly reduced tumorspecific T cell responses elicited by tumor cell death, and the efficacy of chemotherapy in
four independent transplantable tumor models. Adoptive transfer of  T cells restored the
efficacy of chemotherapy in IL-17A/ hosts. The anticancer effect of infused  T cells was
lost when they lacked either IL-1R1 or IL-17A. Conventional helper CD4+  T cells failed to
produce IL-17 after chemotherapy. We conclude that  T17 cells play a decisive role in
chemotherapy-induced anticancer immune responses.
The current management of cancer patients relies upon the therapeutic use of cytotoxic agents
that are supposed to directly destroy cancer cells
through a diverse array of cell death pathways.
The Rockefeller University Press $30.00
J. Exp. Med.
www.jem.org/cgi/doi/10.1084/jem.20100269
© 2011 Ma et al. This article is distributed under the terms of an Attribution–
Noncommercial–Share Alike–No Mirror Sites license for the first six months after
the publication date (see http://www.rupress.org/terms). After six months it is
available under a Creative Commons License (Attribution–Noncommercial–Share
Alike 3.0 Unported license, as described at http://creativecommons.org/licenses/
by-nc-sa/3.0/).
Cite by DOI: 10.1084/jem.20100269 of 13
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National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) U1015, 2INSERM U848, 3Center of Clinical Investigations
in Biotherapies of Cancer (CICBT) 507, 4Metabolomics Platform, 5Department of BioPathology, Institut Gustave Roussy, 94800
Villejuif, France
6École Doctorale de Cancérologie de l’Universite Paris-Sud XI, 94800 Villejuif, France
7Faculté de Médecine de l’Université Paris-Sud XI, 94270 Le Kremlin-Bicêtre, France
8Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, 3002, Victoria, Australia
9Développement des Lymphocytes, INSERM U668, Institut Pasteur, 75015 Paris, France
10INSERM U866, 21000 Dijon, France
11Department of Medical Oncology, Georges François Leclerc Center, 21000, Dijon, France
12Faculty of Medicine and Pharmacy, University of Burgundy, 21000 Dijon, France
13Division of Hepatology and Gene Therapy, Centre for Applied Medical Research (CIMA), University of Navarra, 31008
Pamplona, Spain
14Molecular Microbiology Group, COMB, Tropical Biosphere Research Center, University of the Ryukyus, Okinawa 903-0213, Japan
15Laboratory of Biological Protection, Department of Biological Responses, Institute for Virus Research, Kyoto University,
Kyoto 606-8507, Japan
16Molecular Immunology and Embryology, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), IEM 2815, 45071 Orléans, France
17INSERM Unité 561/Groupe AVENIR, Hôpital Cochin St. Vincent de Paul, Université Descartes, 75014 Paris, France
18CNRS, UMR 5164, Université Bordeaux 2, 33076 Bordeaux, France
19Centre de Recherche des Cordeliers, 75006 Paris, France
20Pôle de Biologie, Hôpital Européen Georges Pompidou, AP-HP, 75015 Paris, France
21Faculté de Médecine, Université Paris René Descartes, Paris, France
The Journal of Experimental Medicine
1Institut
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of 13
(and perhaps the targets) of IL-17 in the tumor microenvironment may determine whether this cytokine negatively or
positively affects tumor growth. Whether conventional anticancer therapies such as chemotherapy and radiotherapy
modulate IL-17 secretion and/or Th17 polarization remains
to be explored (Maniati et al., 2010).
Similarly, the contribution of  T cells in tumor immuno­
surveillance is still elusive (Hayday, 2009). In humans,V1+ 
T cells have been shown to mediate immunosuppressive activities (Peng et al., 2007) or, on the contrary, to be associated
with a reduced occurrence of cancers in transplanted patients
bearing a CMV infection (Déchanet et al., 1999; Couzi et al.,
2010) and with long-term relapse-free survival after BM
transplantation (van Burik et al., 2007).V2+  T cells can be
activated by various synthetic ligands to produce Th1-like cyto­
kines, exhibit cytotoxic functions against tumors (Kabelitz
et al., 2007), and mediate antitumor effects in patients (Wilhelm
et al., 2003; Dieli et al., 2007). Although various  T cell
subsets are capable of producing IL-17 during microbial infection or autoimmune disorders of mice (Shibata et al., 2007;
O’Brien et al., 2009), very little is known about the incidence
and functional relevance of IL-17–producing  T cells (that
we termed  T17) in cancer (Gonçalves-Sousa et al., 2010).
 T17 cells have been reported to share most phenotypic
markers with Th17 cells (expressing CCR6, RORt, aryl hydrocarbon receptor [AhR], IL-23R, IL-17A, and IL-22; Martin
et al., 2009).  T17 cells depend upon TGF- but not IL-23
or IL-6 for their development and maintenance (Do et al.,
2010) and can be activated by IL-1 plus IL-23 (Sutton et al.,
2009). They are unrestricted by V usage (although they are
mostly V4 in the context of mycobacteria [Martin et al.,
2009] and experimental autoimmune encephalitis [Sutton
et al., 2009]). Recent work suggests that thymic selection does
little to constrain  T cell antigen specificities, but instead determines their effector fate.When triggered through the TCR,
ligand-experienced cells secrete IFN-, whereas ligand-naive
 T cells produce IL-17 (Jensen et al., 2008). CD27+  thymocytes expressed LTR and genes associated with a Th1
phenotype, in contrast to CD27  thymocytes which give
rise to IL-17–producing  cells (Ribot et al., 2009).
Therapy-induced immunogenic tumor cell death that
stimulates a therapeutic anticancer immune response can be
expected to influence the composition and/or the architecture of tumor immune infiltrates, which in turn contribute to
the control of residual tumor cells. Here, we demonstrate that
both IL-17A/IL-17RA signaling and  T cells are required
for optimal anticancer responses and that the source of IL-17A
is the  T population during immunogenic chemotherapy
and radiotherapy. We show that an early tumor infiltration by
 T17 cells is a prerequisite for optimal tumor colonization
of IFN-–producing CD8+ T cells.  T cell activation depends on IL-1R1 and IL-1 (but not IL-23) produced by
DCs in response to immunogenic dying tumor cells. Finally,
the adoptive transfer of WT  T17 cells can restore the therapeutic efficacy of anticancer chemotherapy that is compromised in IL-17A/ hosts.
 T17 cells contribute to anticancer chemotherapy | Ma et al.
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Nonetheless, several lines of evidence point to a critical contribution of the host immune system to the therapeutic activity mediated by tumoricidal agents (Nowak et al., 2002, 2003).
Indeed, in some instances, the cell death triggered by chemotherapy or radiotherapy allows recognition of dying (anthracycline-treated or irradiated) tumor cells by antigen-presenting
cells, thus eliciting a tumor-specific cognate immune response
for tumor resolution. Whether cell death is immunogenic or
not depends on the presence of tumor-specific antigens, as
well as on the lethal hit. Thus, oxaliplatin (OX) and anthracyclines induce immunogenic cell death, whereas other chemotherapeutic agents such as cisplatin and alkylating agents tend
to induce nonimmunogenic cell death (Casares et al., 2005;
Obeid et al., 2007). Stressed and dying tumor cells may emit
a particular pattern of “danger signals,” and these cell death–
associated molecules are either exposed on the surface of
dying cells or secreted into the microenvironment. The combined action of “find-me” and “eat-me” signals, together with
the release of hidden molecules that are usually secluded
within live cells may influence the switch between silent
corpse removal and inflammatory reactions that stimulate the
cellular immune response (Zitvogel et al., 2010). We initially
described the crucial importance of an eat-me signal represented
by the early translocation of the endoplasmic reticulum resident calreticulin–ERp57 complex to the plasma membrane
for the immunogenicity of tumor cell death (Obeid et al.,
2007; Panaretakis et al., 2008, 2009). Next, we showed that
the nuclear alarmin HMGB1 must be released into the tumor
microenvironment to engage TLR4 on host DCs to facilitate
antigen processing and presentation (Apetoh et al., 2007). We
also reported that ATP released from dying tumor cells could
trigger the purinergic P2RX7 receptor on host DC, stimulating the release of IL-1, which in turn facilitates the priming
of CD8+ tumor-specific T cells for IFN- production that is
indispensable for the success of chemotherapy (Ghiringhelli
et al., 2009).
Although the contribution of IFN- to tumor surveillance and anticancer immune responses is clearly established,
that of the IL-17A–IL-17R pathway remains controversial
(Martin-Orozco and Dong, 2009; Muranski and Restifo,
2009; Ngiow et al., 2010). In tumor models where CD4+
T cells are the source of IL-17, this cytokine could induce
Th1-type chemokines, recruiting effector cells to the tumor
microenvironment (Kryczek et al., 2009) or promote IL-6–
mediated Stat3 activation, acting as a protumorigenic trigger
(Kortylewski et al., 2009; Wang et al., 2009). Tumor-specific
Th17 exhibited stronger therapeutic efficacy than Th1 cells
upon adoptive transfer, and converted into effective IFN-
producers (Muranski et al., 2008) and/or triggered the expansion, differentiation, and tumor homing of tumor-specific
CD8+ T cells (Martin-Orozco et al., 2009). IL-17–producing
CD8+ T cells also reduced the volume of large established
tumors and could differentiate into long-lasting IFN- producers (Hinrichs et al., 2009). In contrast, Kwong et al.
(2010) described a tumor-promoting, IL-17–producing TCR
+CD8+ cell subset. Therefore, the heterogeneous source
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Ar ticle
JEM
CD8+ T and  T cells were polarized to become potent producers of IFN- and IL-17, respectively. DX-based chemotherapy substantially enhanced IFN- production by CD8+ and
CD4+ TILs, as well as IL-17 production by  TILs (Fig. 1 G).
 T17 cells preceded and predicted the accumulation
of Tc1 CTLs in tumor beds after chemotherapy
Kinetic experiments revealed that  TILs invaded MCA205
tumor beds and produced IL-17 shortly after chemotherapy,
with significant increases (9-fold) over the background 4 d
after DX injection (Fig. 2 A, left).  TILs still rapidly divided
(as indicated by the expression of Ki67) 8 d after DX treatment (Fig. 2 B). This early induction of IL-17–producing 
T cells (Fig. 2 C, left) contrasted with the comparatively late
induction of IFN-–producing CD8+ T cells, which emerged
sharply 8 d after chemotherapy (Fig. 2 C, right) and rapidly
proliferated (Fig. 2 B). Altogether, anthracyclines induced an
early Th17-biased inflammation together with a marked Th1
polarization in MCA205 tumor beds, associated with a brisk
infiltration of  T17 cells followed by Tc1 effectors.
To generalize these findings, we systematically immunophenotyped TILs in CT26 colon cancer treated by a single
intratumoral injection of DX, which significantly retarded
tumor growth (Fig. 3 A). Indeed, the majority of IL-17A+
TILs were CD45+CD3bright. They failed to express CD4, but
were positively stained with anti-TCR –specific antibodies
(Fig. S2 A). Consistently, chemotherapy dramatically increased
the frequency of IFN-–producing CD8+ T lymphocytes
(Tc1; Fig. 3 B) and IL-17A–producing  T cells ( T17;
Fig. 3 C) in the tumor microenvironment. Next, we monitored transplantable TS/A mammary carcinomas treated with
local radiotherapy, which operates in a T cell–dependent
manner (Apetoh et al., 2007). Irradiation of TS/A tumors led
either to tumor regression or to no response, and hence tumor
progression (Fig. 3 D). An accumulation of both Tc1 (Fig. 3 E)
and  T17 (Fig. 3 F) lymphocytes was found in those
tumors that responded to radiotherapy, but not in those that
continued to progress or in untreated controls. Importantly, in
each of the three tumor models that we tested, a clear correlation was observed between tumor invading  T17 and Tc1
cells (Fig. 3 G).
 T17 TILs were preponderantly CD44+ CD62L CD69+
and Granzyme B+. They did not express CD24, c-kit, NKG2D,
CD27 (a thymic determinant for IFN-–producing 
T cells; Ribot et al., 2009), SCART2 (a specific marker for
peripheral IL-17–producing cells which can be down-regulated
upon activation; Kisielow et al., 2008), or CD122 (a marker
for self antigen-experienced  T cells with potential to produce IFN- (Jensen et al., 2008; unpublished data). FACS indicated that 60% of  T17 used V4 chain (nomenclature
of V genes according to Heilig and Tonegawa [1986]), but
expression of V1 and V7 chain was rarely found (Fig. S2 B).
We then sorted V1V4V7  T17 TILs (Fig. S2 C) and
performed single-cell PCRs and sequencing (Pereira and
Boucontet, 2004) to examine their V chain usage. The majority of these cells (21 of 23 clones) contained functional
of 13
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RESULTS
A marked Th1 pattern 8 d after chemotherapy
Anthracyclines induce immune responses that culminate in
CD8+ T cell– and IFN-/IFN-R–dependent antitumor
effects (Ghiringhelli et al., 2009). To further study chemotherapy-induced immune effectors at the site of tumor retardation, we performed quantitative RT-PCR to compare the
transcription profile of 40 immune gene products expressed
in MCA205 tumors, which were controlled by the anthracycline doxorubicin (DX) 8 d after treatment (Fig. 1 A, top),
with that of progressing, sham-treated (PBS) tumors (Fig. 1 A,
bottom). Several Th1-related gene products were specifically
induced in regressing tumors (Fig. 1 B). In particular, the Th1
transcription factors Eomes and Tbx21 (also called T-bet) and
their target, IFN-, were increased by 4–5 fold in DX versus
PBS-treated tumors (Fig. 1 C, left). Unsupervised hierarchical
clustering indicated that IFN- production correlated with
that of the quintessential Th1 transcription factor, Tbx21.
By day 8, the protein levels of IFN- also increased in
DX-treated MCA205 sarcomas (Fig. 1 D, left). Other surrogate markers of Th1 responses (lymphotoxin-, Ccl5,
Cxcl10, Cxcl9, and TNF) were also significantly induced at
the mRNA level after DX treatment (Fig. 1, B and C, left).
Another set of gene products was also overexpressed in the
context of DX-induced tumor regression. These genes encoded IL-7R, IL-21, AhR, Cxcl2, and Foxp3, suggesting
that inflammation and/or tissue repair occurred in the
tumor bed (Fig. 1, B and C, right). Indeed, by day 3 after
chemotherapy, the protein levels of the inflammatory cytokine
IL-17 were significantly increased within tumor homogenates
(Fig. 1 D, right).
Reinforcing this finding, we found that AhR, a sensor of
small chemical compounds, is involved in the success of
anthracycline-based therapy in this model. AhR is recognized
as a transcriptional regulator for the optimal IL-17–associated
immune response, promoting the differentiation and/or maintenance of IL-17–producing cells (Esser et al., 2009). CH-223191
is a pure antagonist of AhR because it does not have any agonist actions up to 100 µM (Kim et al., 2006). Blocking AhR
with CH-223191 markedly reduced the efficacy of DX on
established cancers in vivo (Fig. S1 A). This contrasts with the
observation that CH-223191 had no cell autonomous effects
on the tumor cells, alone or in combination with anthracyclines (Fig. S1 B).
DX (compared with PBS) induced a threefold increase in
the proportions of both IFN-– and IL-17–producing
tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as tested by flow cyto­m­
etry (FACS; Fig. 1 E). To identify the cellular source of IFN-
and IL-17, TILs were immunophenotyped by cell surface
staining and intracellular detection of the cytokines with
FACS. Careful analyses revealed that the major source of
IFN- was CD8+ T cells, whereas that of IL-17 was mostly
TCR + T cells rather than CD4+ Th17 cells 8 d after chemotherapy in MCA205 sarcomas (Fig. 1 F). We further analyzed the IFN- and IL-17 production by each subset of
TILs. CD4+ T cells could secrete IFN-, but rarely IL-17.
Published March 7, 2011
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Figure 1. Th1 and Th17 immune response in tumors after chemotherapy. (A) Mice bearing MCA205 tumors were treated with PBS (solid symbols) or
DX (open symbols) intratumorally at day 7 after tumor inoculation. Tumor growth was monitored at the indicated time points. (B and C) 8 d after chemotherapy (day 15 after tumor inoculation), tumor homogenates in PBS and DX groups were tested by quantitative RT-PCR (qRT-PCR). (B) Fold changes of gene
expression are shown as a heat map. (C) Th1- and Th17-related gene expression in DX versus PBS groups (with a fold change >2) are listed. (D) Measurements
of IFN- and IL-17A protein in tumor homogenates by ELISA at the indicated time points. (E and F) Single-cell suspension of MCA205 tumors (day 8 after DX)
were analyzed by FACS. (E) Expression of IFN- and IL-17A in TILs was tested by intracellular staining gated on live, CD45+ and CD3+ cells. (F) IFN-+ and
IL-17A+ cells were gated, and the proportions of CD3+ CD8+ cells and CD3+ TCR + cells were examined in DX-treated tumors. A typical dot plot analysis (left)
and the absolute numbers of Th17 and  T17 cells in the whole tumors (right) are shown. (G) IFN- and IL-17A production by total CD4+, CD8+, and TCR +
TILs. Representative FACS plots in DX-treated tumors (left) and the percentages in PBS- or DX-treated tumors (right) are shown. Each group contained at least
five mice, and each experiment was performed at least twice, yielding similar results. Graphs depict mean ± SEM of fold change of gene expression (C), protein content (D), percentages, or absolute numbers of positive cells (E and G). *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001.
of 13
 T17 cells contribute to anticancer chemotherapy | Ma et al.
Published March 7, 2011
Ar ticle
Figure 2.  T17 cells preceded Tc1 CTL into tumors
after chemotherapy. (A) The percentages of IL-17– and
IFN-–producing cells among all tumor infiltrating  T
cells and CD8+ T cells, respectively, are plotted before and
at the indicated time points after tumor inoculation. Mice
were treated with PBS (filled symbols) or DX (open symbols) at day 7. (B) Ki67 expression on  T and CD8+ TILs 8 d
after treatment. (C) The percentages of  T17 and Tc1
among all CD3+ TILs at the indicated time points after
tumor inoculation. DX was given at day 7. These experiments were performed twice on 5–10 tumors at each time
point. *, P < 0.05; **, P < 0.01.
The IL-17A–IL-17R pathway is involved
in the immunogenicity of cell death
Because both Tc1 and  T17 cells accumulated within tumors
after chemotherapy or radiotherapy in a coordinated fashion,
we determined whether neutralizing their signature cytokines
IFN- and IL-17A could mitigate the efficacy of anticancer
therapies. Antibody-mediated neutralization of either IFN-
or IL-17A negatively affected the growth-retarding effect of
DX against MCA205 tumors (Fig. 4 A). The mandatory role
of the IL-17A–IL-17RA pathway was confirmed using neutralizing anti–IL-17RA antibodies and IL-17A/ mice in
the same tumor model (Fig. 4 B), in DX-treated MCA2 sarcomas (Fig. 4 C), as well as in OX-treated, OVA-expressing
EG7 thymomas or CT26 colon cancers (Fig. 4, D and E).
To rationalize the sequential recruitment of  T17 and
Tc1 cells into the tumor bed after chemotherapy, we hypothesized that  T17 might act as helper cells for Tc1 priming.
We previously reported that specific antitumor immune responses rely on Tc1 cells primed by tumor cells undergoing
immunogenic cell death by using a system in which IFN-
production by OVA-specific T cells could be triggered by
OX-treated EG7 cells (Ghiringhelli et al., 2009).We used this
system to check whether IL-17 is involved in initiating the
specific antitumor response, comparing normal WT with
IL-17RA/ mice. In this assay, the absence of IL-17RA fully
JEM
IL-1–dependent, but not IL-23-dependent, activation
of  T lymphocytes
The IL-1–IL-1R1 pathway is mandatory for eliciting Tc1
immune responses and for the efficacy of chemotherapy
(Ghiringhelli et al., 2009). Moreover, we found an IL-1–
related gene expression signature after chemotherapy in tumor
beds (Fig. 1 B), prompting us to address its role in the activation of  T17 cells.
To explore the molecular requirements for  T17 activation in situ, we sorted  T cells from the skin-draining LNs
of 13
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V6 rearrangements identical to those found in fetal 
T cells (Lafaille et al., 1989). These experiments show that most
 T17 TILs express V4 or V6 chains (Fig. S2, D and E).
Thus, chemotherapy and radiotherapy could trigger the
accumulation of cytokine producing TILs in the tumor bed.
This applies to distinct subsets of  T cells that rapidly invaded
tumor and become IL-17 producers, correlating with the accu­
mulation of Tc1 cells, which contribute to the chemotherapyinduced anticancer immune response.
abolished antigen-specific T cell priming in response to dying cells, yet had no negative effect
on T cell priming by OVA holoprotein admixed
with CpG oligodeoxynucleotides (Fig. 5 A, left).
Consistently, a neutralizing anti–IL-17A antibody, but not the isotype control Ig (CIg),
markedly impaired the OVA-specific T cell induced by OX-treated EG7 (Fig. 5 A, right). Because Th1/Tc1 immune responses against dying
tumor cells mediate a prophylactic protection against rechallenge with live tumor cells (Apetoh et al., 2007; Ghiringhelli
et al., 2009), we addressed the functional relevance of the
IL-17A–IL-17RA pathway in this setting. Subcutaneous injection of mitoxantrone (MTX)-treated MCA205 sarcoma
cells could protect WT mice, but not athymic nude mice,
against rechallenge with live MCA205 tumor cells (Fig. 5 B).
The efficacy of this vaccination was attenuated in IL-17RA/
mice. Because IL-17 was not significantly produced by CD4+
or CD8+ T cells, neither in tumor beds during chemotherapy
(Fig. 1 G) nor in the tumor draining LNs (unpublished data),
we refrained from investigating Th17 cells and rather focused
on  T and NKT cells as potential IL-17 producers (Mills,
2008; Pichavant et al., 2008) that might contribute to the anti­
cancer vaccination by dying tumor cells. Although CD1d/
mice, which lack all NKT population (Godfrey et al., 2010),
were undistinguishable from WT controls in their ability to
resist live tumor cells rechallenge after a dying tumor cell vaccine,V4/6/ mice (Sunaga et al., 1997) exhibited a reduced
capacity to mount this anticancer immune response (Fig. 5 B).
These results suggest that IL-17A, IL-17R, and  T17 cells
all play a partial role in the afferent phase of the immune response against dying tumor cells, which includes T cell priming for IFN- production.
Published March 7, 2011
of naive mice (around 1–2% of the LN T cell pool). Among
these  T cells, 70% harbored the V4 TCR. Moreover,
these cells vigorously produced IL-17A (but not IFN-) upon
stimulation with PMA/ionomycin (Fig. S2 F; Do et al., 2010).
In contrast to Th17 cells (Ivanov et al., 2006), LN-resident 
T cells failed to produce IL-17 in response to TGF- or IL-6
alone, or in combination with IL-1. However, they potently
secreted IL-17 and IL-22 in response to the combined stimulation of IL-1 plus IL-23 (unpublished data; Sutton et al.,
2009). TCR engagement also synergized with IL-1 (and to
a lesser extent with IL-23) to trigger IL-17 and IL-22 secretion by LN-resident  T cells (unpublished data). It is noteworthy that these stimuli specifically activated IL-17A, but
not IFN- production by  T cells. Because  T17 cells were
activated (as indicated by their Ki67+, GzB+, CD69+, and IL-17+
phenotype) after chemotherapy, we addressed whether dying
tumor cells could directly promote the activation of  T17.
Although DX-treated MCA205 cells failed to directly induce IL-17 secretion by  T cells, they did so indirectly.
of 13
Thus, BM-derived DCs (BMDCs) that had been loaded with
DX-treated MCA205 (Fig. 5 C; or CT26, not depicted), but
not with live tumor cells, produced IL-1 and markedly stimulated the release of IL-17 and IL-22 by  T cells (Fig. 5 C).
As a quality control for in vitro–generated DCs, the expression of CD11c, MHC class II, CD11b, and F4/80 was assessed. Only qualified DC preparations that contain functional
DCs (>80% CD11c+MHCII+) rather than macrophages
(>70% CD11b+F4/80+CD11c) could activate  T cells for
IL-17A production when they encountered DX-treated tumor
cells. CD11b+Gr1+ neutrophils reportedly produce IL-17 and
promote downstream IL-12/IFN- contributing to reperfusion injury (Li et al., 2010). Interestingly, CD11b+Gr1+ cells
sorted from DX-treated tumor beds bearing the IL-1 messenger RNA failed to secrete IL-1 or IL-17A protein and
failed to activate  T cells for IL-17A production in vitro
(unpublished data). IL-17 production by  T cells was dependent on IL-1 because the IL-1R1 antagonist IL-1RA
entirely abrogated the DC/ T cell cross talk in the presence
 T17 cells contribute to anticancer chemotherapy | Ma et al.
Downloaded from jem.rupress.org on March 11, 2011
Figure 3. Recruitment of both Tc1 and  T17 cells in CT26 and TS/A tumors that correlate with better tumor control. (A–C) CT26 colon cancer
treated with anthracyclines. (A) Tumor size before and 8 d after treatment with PBS (filled symbols) or DX (open symbols). (B) The percentage of CD8+ T cells
among CD3+ cells and of IFN-–producing cells among CD8+ T cells. (C) The percentage of  T cells among CD3+ cells and of IL-17A–producing cells among
CD3+  T cells. Data are presented as mean ± SEM with five tumors/group. (D–F) TS/A mammary cancer treated with x rays. (D) Established TS/A tumors were
treated with local irradiation (open symbols) on day 10. Mice were segregated into nonresponders (tumor progression [TP], triangles) and responders (tumor
regression [TR], circles) 22 d after radiotherapy (n = 5). (E) The percentage of CD8+ T cells among CD3+ cells and of IFN--producing cells among CD8+ T cells;
(F) The percentage of  T cells among CD3+ cells and of IL-17A–producing cells among CD3+  T cells are indicated as mean ± SEM. (G) The correlation
between the percentages of  T17 and Tc1 TILs in all tumors (treated or not) was plotted for MCA205, CT26, and TS/A tumors (each dot representing one
mouse). Data are representative of two to three independent experiments. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001.
Published March 7, 2011
Ar ticle
Figure 4. A mandatory role for the IL-17A–IL17RA pathway in the efficacy of chemotherapy.
(A) Mice bearing established MCA205 sarcomas were
treated with local PBS (filled symbols) or DX (open
symbols) 7 d after tumor inoculation and with systemic neutralizing antibodies against mouse IFN-
(left), IL-17A (right), or control Ig (CIg) i.p. every 2 d
(3 injections, 200 µg/mouse) starting on the day of DX.
(B–E) WT (circles or squares) or IL-17A/ (triangles)
mice bearing established MCA205 sarcomas (B),
MCA2 (C), EG7 (D), or CT26 (E) tumors were treated with
PBS (B-E, solid symbols), DX (B and C, open symbols), or
OX (D and E, open symbols) together with systemic
administration of neutralizing antibodies against IL17RA (squares) or CIg. Tumor sizes are plotted as
mean ± SEM for 5–15 mice/group, and each experiment was repeated at least 2 times, yielding similar
results. *, P < 0.05; **, P < 0.01.
JEM
of 13
Downloaded from jem.rupress.org on March 11, 2011
of dying cells. The neutralization of IL-18R, IL-23, or IL-23R
failed to abolish IL-17 production by  T cells co-cultured
with DCs (Fig. 5 D). IL-22 production was completely abolished by blocking the IL-1–IL-1R or IL-23–IL-23R pathways but not affected by IL-18R blockade. Interestingly,
chemotherapy lost part of its anticancer activity in IL-1R1–
deficient mice, yet maintained its efficacy in mice treated with
IL-23p19–neutralizing antibodies or in IL-23p19/ mice
(Fig. 5, E–G). IL-1–activated  T cells produced IL-17 and
IL-22 (Fig. 5, C and D). However, IL-22 did not play an essential role in the antitumor effects promoted by chemotherapy (Fig. S3 A). It is of note that the antibody we used in this
experiment could block the bioactivity of IL-22 in a lung
bacterial infection model (Aujla et al., 2008), and IL-22
mRNA in the bulk TILs was below the detection limit of
quantitative RT-PCR. Collectively, these results underscore
the importance of IL-1 and IL-17 for the immune-dependent
anticancer effects of chemotherapy, yet suggest that both IL-23
and IL-22 are dispensable for such effects.
 T lymphocytes are indispensable
for the immune-dependent effects
of chemotherapy
To further evaluate the contribution of 
T cells to the therapeutic action of DX on established MCA205 sarcomas, such tumors
were implanted into age- and sex-matched
WT, TCR /, V4/6/ mice, and then
subjected to chemotherapy. As compared with
WT controls, the absence of the TCR  chain,
as well as that of V4 and V6  T cells,
greatly reduced the efficacy of chemotherapy
(Fig. 6 A). At day 8 after chemotherapy, when
 T17 and Tc1 massively infiltrated tumor
beds in WT mice, these cytokine-producing
TILs were either absent or greatly reduced in
V4/6/ mice (Fig. 6 B), suggesting that the
presence of V4 and V6  T cells are critical
for the optimal Tc1 response in tumor beds.
Expression of CCR6 is a phenotypic and functional hallmark of Th17 cells (Reboldi et al., 2009) during some inflammatory processes.We therefore analyzed the role of CCR6 in
the efficacy of chemotherapy. Because CCL20 was detectable
in tumor tissues before and after chemotherapy (unpublished
data), we assessed whether  T17 cells could be recruited in
a CCL20/CCR6-dependent manner. The tumoricidal activity of DX against CT26 was not affected by repetitive systemic injections of neutralizing anti-CCL20 antibody before
and during anthracycline treatment (Fig. S3 B). Consistently,
anthracycline treatment against established MCA205 sarcoma
remained efficient in CCR6 loss-of-function mice. Moreover,
CCR6 deficiency did not influence tumor infiltration by 
T17 (unpublished data). Therefore, V4 and V6  T cells
contribute to the immune-mediated action of anticancer
agents in a CCR6-independent fashion.
Next, we determined the contribution of adoptively transferred  T cells to the efficacy of chemotherapy.The infusion
of  T cells derived from skin-draining LNs (from naive
Published March 7, 2011
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Figure 5. Role of  T17 in the priming of T cell responses during an immunogenic cell death and regulation by IL-1. (A) OX-treated EG-7
cells were inoculated in the footpad of WT versus IL-17RA/ mice (n = 5; left) along with anti–IL-17A neutralizing antibody (or CIg; right panel). OVAspecific IFN- secretion by draining LN cells was measured in vitro by ELISA after stimulation with OVA protein (1 mg/ml). OVA/CpG immunization was
used as positive control. (B) Immunization with MTX-treated MCA205 and rechallenge with a tumorigenic dose of live MCA205 were performed at day 0
and day 7, respectively in WT C57Bl6 (n = 10), nude (n = 10), V4/6/ (n = 15), IL-17RA/ (n = 8), and CD1d/ (n = 6) mice. The percentages of tumorfree mice were scored at the indicated time points. Experiments in A and B were performed twice with similar results. (C) Production of IL-1, IL-17A, and
IL-22 from mixed co-cultures of LN-derived  T cells and/or BMDCs loaded or not loaded with live or DX-treated MCA205 was monitored by ELISA. Data
are shown as mean ± SEM (D) Co-cultures of DX-treated MCA205/BMDC/ T were performed in the presence of 20 µg/ml IL-1RA (Amgen), anti–IL-23, or
of 13
 T17 cells contribute to anticancer chemotherapy | Ma et al.
Published March 7, 2011
Ar ticle
Figure 6. The therapeutic activity of anthracyclines and tumor colonization of Tc1 depend
upon V4 V6  T cells. (A) WT, TCR /, or
V4/6/ mice with established MCA205 tumors
were injected intratumorally with PBS or DX. Tumor
size was measured at the indicated time and plotted
as mean ± SEM (n = 8/group). (B) Percentage of IL17A– or IFN-–expressing cells within CD3+ TCR+
and CD3+ CD8+ TILs, respectively, in WT or V4/6/
mice. A typical dot plot is shown (left) and statistical analysis was performed with combined data
from two independent experiments (right). *, P <
0.05; ***, P < 0.001.
DISCUSSION
Our results highlight a role of  T cells, particularly the
V4- and V6-expressing subsets that produce the effector
cytokine IL-17A, in the anticancer immune response induced
by cytotoxic chemotherapeutics. We demonstrated that the
IL-17A–IL-17RA signaling pathway is required for the priming
of IFN-–secreting, antigen-specific T cells by tumor cells exposed to chemotherapy. This tumor-specific, Tc1-mediated immune response is essential for anticancer immunity because the
protective effect of dying tumor cell vaccination is lost in athymic
nude mice or when CD8+ T cells are depleted (Casares et al.,
2005), and chemotherapy fails to work when the IFN-–IFNR system is blocked (Ghiringhelli et al., 2009). Accordingly, we
found that the absence of the IL-17A–IL-17RA pathway reduced
the capacity of mice to mount a protective antitumor response.
IL-23R neutralizing antibodies, or 10 µg/ml IL-18BP. Experiments in C and D were repeated three to six times. (E and G) Tumor size was monitored in WT
(circles), IL-1R1/ (diamonds), and IL-23p19/ (squares) mice treated with PBS (filled symbols) or DX (open symbols; E and F), or in WT mice treated
with systemic anti–IL-23 neutralizing antibodies (squares) or CIg (circles; G). Data are representative of 2 experiments with 6–10 mice/group. *, P < 0.05;
**, P < 0.01; ***, P < 0.001.
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WT mice) into tumor beds 2 d after DX potentiated the
growth-retarding effect of chemotherapy, yet had no effect
on PBS-treated tumors (Fig. 7 A). Importantly, synergistic
antitumor effects of DX and adoptively transferred 
T cells were lost when the  T cells were obtained from
IL-17A/ or IL-1R1/ donors (Fig. 7, B and C), emphasizing the role of IL-1 responses and IL-17 production in the
function of  T cells. Moreover, the adoptive transfer of WT
 T cells could restore the antitumor efficacy of chemotherapy
in IL-17A–deficient mice (Fig. 7 D). Collectively, these results
emphasize the important contribution of  T17 cells to the
immune-dependent effects of anticancer chemotherapy.
When exploring the source of IL-17A
elicited by dying tumor cells, we found that
 T cells were the quantitatively and functionally most important IL-17A producers,
based on several observations. First, in the
context of chemotherapy, IL-17–producing
cells accumulated in tumors, and most of
them were positive for  T markers. Second, antigen-specific CD4+ T cells in LNs
draining the dying tumor cells showed a Th1 (IL-2 and
IFN-) instead of a Th17 cytokine pattern (Ghiringhelli et al.,
2009). CD4+ and CD8+ TILs were polarized to produce
IFN- instead of IL-17. Also, IL-6 and TGF-, two key regulatory cytokines essential for the differentiation of Th17 cells
(Ivanov et al., 2006; Veldhoen et al., 2006), were dispensable
for the efficacy of chemotherapy or vaccination with dying
tumor cells (Fig. S3, C and D), suggesting that Th17 cells may
not be required for the anticancer immune response after
chemotherapy. Third, when popliteal LNs were recovered
from mice that had been injected with dying (but not live)
tumor cells through footpad, the restimulation of LN-resident
cells using anti-CD3 plus IL-23 readily enhanced IL-17
production (unpublished data), a feature common to memory
T cells (van Beelen et al., 2007), innate NKT (Rachitskaya
et al., 2008), and  T cells (Sutton et al., 2009). Fourthly,
the subset of NKT cells capable of producing IL-17 in LNs
(CD103+CD4NK1.1CCR6+CD1d tetramer+; Doisne et al.,
2009) did not appear to be specifically triggered by dying
cells in vivo (unpublished data). Moreover, CD1d/ mice,
which lack NKT cells, were indistinguishable from WT mice
when the efficacy of chemotherapy was assessed in prophylactic vaccination settings. Fifthly, knockout of V4/6 or
TCR  attenuated the protective antitumor vaccination with
dying tumor cells and reduced the efficacy of the anthra­
cycline-based chemotherapy on established tumors. Finally,
the adoptive transfer of WT  T cells into IL-17A/ hosts
could restore the clinical response to chemotherapy and improve
Published March 7, 2011
the response in WT hosts, and this latter effect was lost
when  T cells from IL-17A/ (rather than WT) donors
were used.
In the context of immunogenic chemotherapy, it appears
clear that IL-1 plays a major role in stimulating IL-17 production and the anticancer function of  T cells. The key
role of IL-1 in regulating  T cells function was shown by
using IL-1RA in co-cultures of DCs/ T cells in the presence of dying tumor cells. Also,  T cells that lack IL-1R1
lose the capacity to amplify the tumoricidal action of anthracyclines. Interestingly, inflammasome-dependent IL-1 secretion from DCs was also found to be mandatory for the
polarization of CD8+ T cells toward a Tc1 pattern (Ghiringhelli
et al., 2009), suggesting that a connection between DCs, 
T17 cells, and Tc1 cells might be important for optimal anticancer immune responses. We noticed a strong correlation
between  T17 and Tc1 cells after chemotherapy in three
different tumor models. We also noticed that the production
of IL-17 production preceded that of IFN- by TILs. It is well
possible that besides helping the development of Tc1 response,
 T17 cells might enhance the chemoattraction of effector
Tc1 into the tumor beds. These results are compatible with
observations obtained in a cancer-unrelated context, microbial infection, in which  T17 associated with Th1 responses
exert protective immune response (Umemura et al., 2007).
As IL-17 could not directly induce IFN- production or
enhance proliferation of CD8+ T cells (unpublished data), our
10 of 13
MATERIALS AND METHODS
Mice. WT C57BLl/6 (H-2b) and BALB/c (H-2d) mice aged between 7 and
12 wk were purchased from Harlan. Nude mice were bred in the animal facility of Institut Gustave Roussy. TCR /, IL-1R1/, and IL-17RA/(H-2b)
mice were bred at Cryopréservation, Distribution, Typage, et Archivage Animal (Orléans, France) by B. Ryffel (CNRS, Orleans, France) and P. Pereira
(Institut Pasteur, Paris, France; TCR / was bred in the same manner).
IL-23p19/ and IL-17A/ (H-2b) were provided by M.J. Smyth (Peter MacCallum Cancer Centre,Victoria,Australia).V46/ mice (H-2b) were provided
by G. Matsuzaki (University of the Ryukyus, Okinawa, Japan) and K. Ikuta
(Kyoto University, Kyoto, Japan). CD1d/ and CCR6/ (H-2b) mice were
bred at St. Vincent de Paul Hospital AP-HP (Paris, France) and provided by
K. Benlagha. The experimental protocols were approved by the Animal Care
and Use Committee in the animal facility of Institut Gustave Roussy.
Cell lines and reagents. CT26 (H-2d) colon cancer, MCA205 (H-2b) and
MCA2 (H-2d) sarcoma,TS/A mammalian cancer (H-2d), and EG7 thymoma
(H-2b) were cultured in RPMI 1640 containing 10% FBS, 2 mM l-glutamine,
100 IU/ml penicillin/streptomycin, 1 mM sodium pyruvate, and 10 mM
 T17 cells contribute to anticancer chemotherapy | Ma et al.
Downloaded from jem.rupress.org on March 11, 2011
Figure 7. Role of  T cell–derived IL-17A during chemotherapy.
CD3+ TCR + or CD3+ TCR  T cells from WT mice (A), CD3+ TCR + T cells
from IL-17A/ (B), or IL-1R1/ (C) mice were injected intratumorally
into MCA205-bearing WT mice (A–C) or IL-17A/ mice (D) 2 d after PBS
or DX treatment. Tumor sizes are plotted as mean ± SEM for five mice/
group. Experiments were repeated two to three times with similar results.
*, P < 0.05; **, P < 0.01.
results imply a causal relationship between the presence of 
T17 cells and the recruitment of antitumor effector Tc1 cells
into tumor beds.
 T cells represent a major source of IL-17 during lung
infection by Mycobacterium tuberculosis (Lockhart et al., 2006;
Umemura et al., 2007) and liver infection by Lysteria (Hamada
et al., 2008).  T cell-derived IL-17 is critical for the recruitment of neutrophil recruitment into the peritoneal cavity
after Escherichia coli inoculation (Shibata et al., 2007). 
T cells can be directly stimulated through TLR2,TLR1, and/or
dectin-1 in response to Mycobacterium tuberculosis and Candida
albicans to produce IL-17 in synergy with IL-23 (Martin
et al., 2009). As to the mechanisms that link chemotherapyelicited tumor cell death to the accumulation of  T17 cells,
our data suggest that IL-1 acts as a major trigger. One previous report demonstrated the pivotal function of IL-1 in
regulating  T17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE; Sutton et al., 2009). In that model, IL-1
synergized with IL-23 to promote IL-17 production by  T,
which in turn, stimulated the differentiation of pathogenic
Th17 cells.
Our data can be interpreted to support the contention
that the context and immune orchestration at the site of cell
death may be critical for an optimal contribution of the immune system to the efficacy of anticancer therapies.The present data introduces the idea that  T17 cells are part of the
innate immune response that facilitates the subsequent cognate
anticancer T cell responses. It remains a formidable challenge for
investigating further how the innate and cognate immune effectors develop a dialog within the three-dimensional architecture of the tumor composed of dying and live tumor cells, as
well as multiple stromal elements. Should  T17 cells also be
recruited into human tumor beds after chemotherapy, it would
be of the utmost importance to determine their TCR V
usage to propose combination therapy of phosphoantigens
(for V2+) or other ligands or innate cytokines (for V2) and
anthracyclines to increase therapeutic benefit in neoadjuvant
settings or prevent metastases.
Published March 7, 2011
Ar ticle
Hepes at 37°C, 5% CO2. All media were purchased from Invitrogen. Recombinant mouse IL-1, IL-23, IL-6,TGF-, and IL-18 BPd/Fc were purchased
from R&D Systems. AhR antagonist CH223191 was obtained from EMD.
DX hydrochloride (D1515), MTX dihydrochloride (M6545), and DiOC6(3)
were obtained from Sigma-Aldrich. Mouse IL-17A, IL-1, and IL-23p19
ELISA kits were purchased from eBioscience. Mouse ELISA kits and neutralizing antibody for IL-22 (AF582; AB108C as isotype control) were purchased
from R&D system. Antibodies for CD45.2 (104), CD3 (145-2C11), CD4
(GK1.5), CD8 (53–6.7), TCR  (GL-3), CD69 (H1.2F3), IL-17A (TC1118H10), or IFN- (XMG1.2) were purchased from BD or eBioscience.
Anti-SCART2 polyclonal serum was provided by J. Kisielow (Swiss Federal
Institute of Technology, Zurich, Switzerland). Neutralizing antibodies for IL-17A
(MAB421), IFN- (XMG1.2), CCL20 (MAB760), IL-23 (AF1619), IL-23R
(MAB1686), IL-6 (MAB406), and IL-22 (AF582) were purchased from R&D
Systems. CpG oligodeoxynucleotide 1668 was obtained from MWG Biotech
AG. Anti–TGF- peptide P17 and control peptide were obtained from
J.J. Lasarte (University of Navarra, Pamplona, Spain; Dotor et al., 2007),
DC-tumor mixed lymphocyte cultures. DCs were propagated in Iscoves’s
medium (Sigma-Aldrich) with J558 supernatant (40 ng/ml GM-CSF),
10% FCS, 100 IU/ml penicillin/streptomycin, 2 mM l-glutamine, 50 µM
2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) and used between day 8 and 12 when the
proportion of CD11c/MHC class II+ cells was >80%. In mixed co-cultures,
DCs were seeded at 105/100 µl/well in U-bottom 96-well plates.Tumor cells
were treated overnight with 25 µM DX or left untreated, washed, and used
at 7.5 × 104/100 µl/well. 2 × 104/50 µl  T cells were added 12 h later.
Supernatant was collected 36 h later.
Tumor models and chemo/radiotherapy. 8 × 105 MCA205, EG7,
CT26, TS/A, or MCA2 tumor cells were inoculated s.c. near the thigh into
syngeneic mice. Chemotherapy was performed in MCA205 and CT26 models by intratumoral injection of DX (2 mM, 50 µl) or OX (5 mg/kg body
weight, i.p) when tumors reached 25-45 mm2. Radiotherapy was performed
by local x-ray irradiation (10 Gy; RT250; Phillips) at the unshielded tumor
area when TS/A tumor reached 40–60 mm2.
Statistical analyses of experimental data. All results are expressed as
mean ± SEM, or as ranges when appropriate. For two groups, normal distributions were compared by unpaired Student’s t test. Non-normal samplings
were compared using the Mann-Whitney test or Wilcoxon matched paired
test when appropriate. The log-rank test was used for analysis of KaplanMeier survival curve. Statistical analyses were performed using Prism 5 software (GraphPad). P values of <0.05 were considered significant.
Gene expression assays. Whole RNA was extracted using RNEasy Mini
kit (QIAGEN) from tumor homogenates. 5 µg of RNA from each sample
were reverse-transcribed using QuantiTect Reverse Transcription kit (QIAGEN).
Gene expression assays were performed with custom TaqMan Low Density
Arrays using StepOnePlus Real-Time PCR System. PPIA was chosen as the
endogenous control to perform normalization between different samples.
Online supplemental material. Fig. S1 shows the effect of AhR antagonist on the efficacy of chemotherapy (DX). Fig. S2 depicts the V chain usage
of tumor-infiltrating  T17 and  T cells in the LNs of naive mice. Fig. S3
shows the effect of neutralizing IL-22, CCL20, IL-6, or blocking TGF- on
the efficacy of chemotherapy or vaccine. Online supplemental material is available at http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20100269/DC1.
Tumor dissection and FACS analysis. Tumor burdens were carefully removed, cut into small pieces, and digested in 400 U/ml Collagenase IV and
150 U/ml DNase I for 30 min at 37°C. Single-cell suspension was obtained
by grinding the digested tissue and filtering through a 70-µM cell strainer.
Cells were blocked with 10 µg/ml anti-CD16/CD32 (eBioscience) before
surface staining (2.5 µg/ml of each antibody). LIVE/DEAD Fixable Dead
Cell Stain kit (Invitrogen) was used to distinguish live and dead cells. For
intracellular staining, freshly isolated cells were treated with 50 ng/ml PMA,
1 µg/ml ionomycin, and GolgiStop (BD) for 4 h at 37°C in RPMI containing 2% mouse serum (Janvier). Cells were then stained with anti–IFN- and
anti–IL-17 using a Cytofix/Cytoperm kit (BD).
This work was supported by LIGUE labellisée (L. Zitvogel and G. Kroemer), INFLACARE FP7 EU grant, INCa, Fondation pour la Recherche Médicale ,and Fondation de
France. Y. Ma was supported by the China Scholarship Council. N.F. Delahaye was
supported by INCa and INFLACARE FP7. L. Apetoh was supported by the Agence
Nationale pour la Recherche [ANR-10-PDOC-014-01].
The authors have no conflicting financial interests.
Purification and adoptive transfer of  T cells. The skin-draining LNs
(inguinal, popliteal, superficial cervical, axillary, and brachial LNs) were harvested from naive mice (8–12 wk). Dead cells were removed from single-cell
suspension (Dead Cell Removal kit) before  T cell purification (TCR/+
T Cell Isolation kit) using AutoMACS Separator (Miltenyi Biotec) with recommended programs. Purity of this isolation normally reached >95%. The
TCR  CD3+ cell fraction was also collected and used as control for some
experiments. Day 2 after chemotherapy, 2.5 × 105 cells were injected directly
into the tumor with insulin syringes for the adoptive transfer setting.
T cell priming and tumor vaccination. EG7 cells pretreated with 5 µg/ml
OX overnight or left untreated were washed thoroughly and injected at
1 million/50 µl into the foodpad of naive syngeneic mice. CpG/OVA (5 µg
CpG+1 mg OVA/mouse) and PBS injection were used as positive and negative controls. In some setting, neutralizing antibody (200 µg/mouse) for
JEM
Submitted: 8 February 2010
Accepted: 4 February 2011
REFERENCES
Apetoh, L., F. Ghiringhelli, A. Tesniere, M. Obeid, C. Ortiz, A. Criollo, G.
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(T-PER Tissue Protein Extraction Reagent; Thermo Fisher Scientific) containing protease inhibitor (complete Mini EDTA-free; Roche). Tumor lysate
was then centrifuged at 10000 g for 5 min at 4°C to obtain supernatant.
IL-17A or CIg was injected i.p. 5 d later, the popliteal LN cells were harvested, seeded in a 96-well plate at 3 × 105/well and restimulated with 1 mg/ml
OVA protein. IFN- secretion was measured by OptEIA Mouse IFN-
ELISA kit (BD). MCA205 cells were treated with 2 µM MTX overnight,
washed thoroughly, and injected into left flank s.c. at 3 × 105/mouse. PBS
was used as control. Mice were rechallenged with 5 × 104 live MCA205 cells
in the right flank 7 d later. Tumor growth was monitored every 2–3 d.
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DISCUSSION
1 Importance des modèles de tumeurs établies
Au cours de notre étude, nous avons utilisé deux types de modèles différents : des
modèles de vaccination prophylactique de souris naïves avec des corps apoptotiques et des
modèles de traitement de souris porteuses de tumeurs établies. Dans le premier cas, l’injection
de cellules tumorales mourantes ou de cellules dendritiques chargées avec des corps
apoptotiques en sous-cutané chez des souris naïves nous permet de mettre en évidence des
réponses spécifiques et protectrices. Ces protocoles sont bien appropriés pour élucider les
déterminants moléculaires directement impliqués dans l’immunogénicité de la mort cellulaire
induite par certains agents cytotoxiques. Il est notamment possible de modifier l’expression
de molécules au niveau des cellules tumorales ou des cellules dendritiques servant à la
vaccination. Ceci nous a permis de montrer que l’expression de P2RX7 sur les cellules
dendritiques était suffisante pour induire l’immunogénicité des corps apoptotiques in vivo.
Bien que très utiles, ces protocoles de vaccination ne sont pas aussi proches de la réalité
clinique que les protocoles de tumeurs établies. En effet, un des principaux objectifs de notre
travail est de proposer des solutions thérapeutiques pour des patients déjà atteints de cancer,
et traités par des chimiothérapies. Or, comme nous l’avons vu en introduction, le système
immunitaire réagit à la présence d’une tumeur et son état est différent chez un animal porteur
de tumeur que chez les souris naïves. Des études ont montré que les protocoles de
vaccinations prophylactiques présentaient une efficacité nettement supérieure aux protocoles
de vaccinations thérapeutiques
252
. De plus, contrairement aux protocoles de vaccination
utilisant des cellules tumorales mourantes ayant été lavées des agents cytotoxiques, le
traitement de tumeurs établies peut induire la mort de cellules non tumorales. Ceci est
important car nous avons montré que des fibroblastes ou des macrophages traités avec de
l’oxaliplatine pouvaient induire une réponse immunitaire spécifique, dépendant de l’IL-1β
(Fig 4S, Nat Med). De plus, en agissant sur les tumeurs établies, les chimiothérapies peuvent
induire la libération de signaux de danger liés par exemple à la destruction de la matrice
extra-cellulaire, pouvant jouer un rôle important dans l’inflammation anti-tumorale observée
253
. En utilisant des protocoles de tumeurs établies, nous avons montré que les
chimiothérapies immunogènes permettaient l’induction de réponses Th1 et Tc1 spécifiques
dans le ganglion drainant (Fig 1h, 6e, 6Sd Nat Med). L’étude des LTγδ infiltrant les tumeurs
nous a montré l’importance de l’environnement tumoral dans l’efficacité de certaines
62
thérapies anti-cancéreuses. Enfin, bien que présentant une signification clinique plus
importante que les modèles de vaccination, nos modèles de tumeurs établies présentent aussi
des limites. En effet, la grande majorité sont des modèles de tumeurs implantées en souscutané, pour la plupart de manière non orthotopique (thymome EL-4, carcinome du colon
CT26). Or, la nature du tissu dans lequel se développe une réponse immunitaire peut avoir un
impact important sur la nature et la polarisation de cette réponse 254. En plus des nombreuses
molécules informatives qui peuvent être produites par des cellules spécifiques d’un tissu au
cours d’une inflammation, il existe des cellules immunitaires résidentes, spécifiques de
certains tissus. Une étude a notamment montré l’importance de LTγδ producteurs d’IL-17
présent dans le derme, pour l’activation de réponses immunitaires contre des antigènes
spécifiquement injectés dans la peau
255
. Des différences dans le développement de réponses
immunitaires spécifiques ont également été mises en évidence dans une étude comparant
l’injection orthotopique ou sous-cutanée d’une lignée tumorale pancréatique
256
. Enfin,
l’administration de certaines chimiothérapies en intra-tumoral, bien que permettant d’induire
un taux important de mort cellulaire localement, n’est pas directement comparable à ce qui se
fait en clinique.
2 Rôle de l’ATP extra-cellulaire dans le développement de réponses immunitaires
spécifiques
Nos travaux montrent que l’ATP extra-cellulaire libéré par les cellules tumorales
mourantes induit la production d’IL-1β par les cellules dendritiques suite à l’activation de
l’inflammasome NLRP3. De plus, nous montrons que ceci stimule des réponses Th1 et Tc1
anti-tumorales. D’autres études ont montré une libération d’ATP extra-cellulaire suite à des
lésions tissulaires. Ceci est notamment le cas des irritants chimiques cutanés, comme le
TNCB, utilisé comme sensibilisant dans des modèles murins de dermatite de contact (CHS)
257
. Dans ces modèles, les cellules dendritiques (cellules de Langerhans) capturent l’allergène
et migrent dans le ganglion drainant où elles activent des LT spécifiques producteurs d’IFN-γ.
Les auteurs montrent que les souris P2rx7
-/-
ne développent pas de CHS et que l’expression
de P2RX7 sur des cellules dendritiques sensibilisées au TNCB est suffisante pour restaurer la
maladie chez ces animaux. Comme dans notre étude, l’ATP se lie à P2RX7 et stimule
l’inflammasome NLRP3 et la production d’IL-1β, cytokine essentielle pour le développement
de la pathologie. Seul, l’ATP n’est pas suffisant pour induire la production d’IL-1β, qui
nécessite en plus, la présence d’un ligand de TLR. A l’instar d’HMGB1, impliqué dans la
63
production d’IL-1β dans notre modèle (Fig 8S du Nat Med), le hyaluronane, ligand endogène
des TLR-4 et -2, joue un rôle important dans la phase de sensibilisation de la CHS et pourrait
être impliqué dans la production d’IL-1β 258.
Une augmentation de l’ATP extra-cellulaire est également observée dans les poumons
de patients asthmatiques 24h après l’administration de l’allergène
259
. Des études chez la
souris ont montré que cet ATP extra-cellulaire était impliqué dans l’inflammation Th2
caractéristique de l’asthme. Les cellules dendritiques exposées à l’ATP favorisent l’activation
de LT CD4 Th2, caractérisés par une production d’IL-4, d’IL-5 et d’IL-13 et une faible
production d’IFN-γ. L’ATP augmente l’expression de molécules de co-stimulation sur les
cellules dendritiques (CD40, CD80, CD83, CD86) mais diminue leur production d’IL-12 et
de TNF-α, tout en augmentant leur sécrétion d’IL-10. L’injection de cellules dendritiques
P2rx7 -/- chargées avec de l’OVA induit une pathologie asthmatique moins sévère qu’avec les
cellules dendritiques non mutées. Ceci est associé à une plus faible réponse Th2 dans les
ganglions drainants, notamment caractérisée par une plus faible production d’IL-13 260. Dans
notre modèle en revanche, aucune différence dans la production d’IL-12p40 n’a été observée
pour les cellules dendritiques P2rx7 -/- exposées aux corps apoptotiques (Fig 4d du Nat Med).
De même, l’activation de P2RX7 sur les cellules dendritiques favorise les réponses Th1 antitumorales, mais ne modifie pas la production d’IL-13 et d’IL-10 par les LT spécifiques
(Fig7S du Nat Med). Une des explications de ces différences de polarisation des réponses T
par les cellules dendritiques exposées à l’ATP pourrait être la différence de concentration
extra-cellulaire d’ATP dans les différents modèles. Ceci est appuyé par des études chez
l’Homme qui ont montré que de faibles doses d’ATP induisait une maturation « pro-Th2 »
des cellules dendritiques, alors que de fortes concentrations favorisaient la production d’IL-1β
261 262
.
Enfin, il est important de considérer les effets de l’ATP extra-cellulaire sur d’autres
cellules que les cellules dendritiques. L’ATP peut en effet directement agir sur les cellules
tumorales via le récepteur P2RX7 et favoriser leur prolifération ou induire leur apoptose, en
fonction de sa concentration
263
. Dans le cancer du sein, les cellules tumorales expriment
moins de P2RX7 fonctionnels que les tissus épithéliaux sains, ce qui pourrait leur conférer un
avantage, en les protégeant des effets cytotoxiques de l’ATP extra-cellulaire 264. Ces données
nous invitent à rester prudents quant à l’interprétation de nos résultats concernant la cohorte
64
de patients atteints de cancer du sein. Nous ne pouvons en effet pas exclure que le mauvais
pronostic observé chez les patients présentant un polymorphisme de P2RX7 diminuant la
fonction du récepteur, soit en partie dû à l’expression de cette protéine au niveau des cellules
tumorales.
3 Rôle de l’IL-1β dans le développement de réponses Th1 et Tc1 spécifiques
Nos données montrent que l’IL-1β produit par les cellules dendritiques est nécessaire
pour l’induction de réponses Th1 et Tc1 spécifiques en réponse à des corps apoptotiques
immunogènes. Nous montrons également que l’IL-1β peut directement agir sur les LT CD8
pour induire leur polarisation vers un phénotype Tc1, producteur d’IFN-γ. Quelques études
ont montré le rôle positif de l’IL-1β dans le développement de réponses spécifiques. En plus
de sa capacité à synergiser avec différents agents mitogènes pour la prolifération de
thymocytes in vitro 265, l’IL-1β favorise la prolifération de LT CD4 Th1, Th2 et Th17 in vivo
266
. Concernant la polarisation des réponses T, l’IL-1β est surtout associé au développement
de LT Th17. Cependant, son implication dans la polarisation de réponses Th2 ou Th1 a été
décrite
267 268 269
. Une étude a notamment montré que des cellules de mélanome (B16)
irradiées exprimant l’IL-1β permettaient de protéger des souris contre une injection ultérieure
de cellules tumorales vivantes 270. La protection pouvait être effective plusieurs mois après la
vaccination, ce qui indique l’implication du système immunitaire spécifique. Les auteurs ont
en effet montré que l’expression d’IL-1β par les cellules tumorales servant à la vaccination
permettait l’induction de réponses Tc1 et Th1 plus importantes au niveau de la rate. Les
cellules tumorales exprimant l’IL-1β étaient également capables de ralentir la croissance de
tumeurs établies dans un contexte de vaccination thérapeutique. Bien que quelques études
montrent que l’IL-1β peut favoriser le développement de réponses Tc1, le rôle de cette
cytokine en tant que cytokine polarisante Tc1 agissant directement sur les LT CD8 n’est pas
clairement établi.
65
4 Rôle de l’IL-17 dans le développement et l’efficacité de réponses Th1 et Tc1
spécifiques
Nous avons montré que l’IL-17 produite par les LTγδ qui s’accumulent dans le lit
tumoral quelques jours après le traitement, joue un rôle important dans l’efficacité des
réponses T anti-tumorales, caractérisées par la production d’IFN-γ. Dans notre étude, la
production d’IFN-γ dans le lit tumoral est positivement corrélée à celle d’IL-17. Ceci n’est
pas en accord avec certaines études qui montrent une inhibition réciproque des réponses Th1
et Th17 et donc une corrélation inverse des taux d’IL-17 et d’IFN-γ 271. Par exemple, dans un
modèle murin d’auto-immunité, les souris déficientes pour l’IL-17 développent des réponses
Th1 plus importantes, alors que les réponses Th17 sont augmentées chez les animaux ne
pouvant pas produire d’IFN-γ 272. De même, l’IL-17 peut inhiber les réponses Th1 en agissant
directement sur les LT 273.
En revanche, l’IL-17 peut favoriser la production de chimiokines capables d’attirer les
LT Th1 préalablement activés
274
. Ceci a été montré dans un modèle murin de vaccination
contre Mycobacterium tuberculosis. Les auteurs montrent que la vaccination induit la
différenciation de LT CD4 producteurs d’IL-17 présentant un tropisme privilégié pour les
poumons. Au cours d’une exposition ultérieure à la bactérie, ces LT CD4 sécrètent de l’IL-17
qui favorise la sécrétion des chimiokines CXCL9, CXCL10 et CXCL11, impliquées dans le
recrutement de LT Th1 activés exprimant CXCR3. Les gènes de ces chimiokines présentent
des séquences de liaison à des facteurs de transcription ressemblant à celles présentes en
amont des gènes cibles de l’IL-17. Ceci suggère que dans ce modèle, l’IL-17 pourrait avoir
une action directe sur la production des chimiokines. Cependant, ceci n’est pas clairement
démontré dans le papier et il est aussi possible que l’IL-17 attire d’autres cellules comme les
neutrophiles, à l’origine de la production des chimiokines attirant les LT. Dans notre étude, il
est intéressant de noter que la cinétique d’accumulation de LT CD8 producteurs d’IFN-γ dans
la tumeur après chimiothérapie est très rapide. Nous pouvons donc envisager que l’IL-17
produit par les LTγδ tumoraux favorise le recrutement de LT effecteurs dans la tumeur. Dans
notre modèle, il serait intéressant d’étudier l’implication de différents récepteurs de
chimiokines, comme CXCR3 ou CCR5, par l’utilisation de souris génétiquement modifiées
ou d’anticorps neutralisants.
66
Nos données indiquent cependant que l’IL-17 est directement impliquée dans
l’activation de LT spécifiques producteurs d’IFN-γ. Ceci est en accord avec des études
montrant l’importance de l’IL-17 dans le développement de réponses Th1 ou Tc1. Par
exemple, le transfert adoptif de LT Th17 chez des souris porteuses de tumeurs diminue la
croissance tumorale en favorisant l’activation de LT CD8 spécifiques des antigènes tumoraux
275
. Les auteurs montrent que les LT Th17 infiltrent les tumeurs et favorisent la production de
CCL20, une chimiokine qui attire les cellules dendritiques CD8α+ dans le lit tumoral et qui
stimule ainsi l’induction de réponses T spécifiques. L’observation que l’IL-17 peut
directement induire l’expression de CCL20 par les fibroblastes embryonnaires murins
suggère un rôle direct de l’IL-17 dans ce modèle
276
. Dans notre modèle en revanche, il est
important de noter que les LT Th17 ne sont pas les principaux producteurs d’IL-17 dans le lit
tumoral après le traitement. De plus, aucune production d’IL-17 n’est détectée après une
restimulation antigénique des ganglions drainant le site d’injection des cellules tumorales
mourantes (Fig 7S, Nat Med). Enfin, l’IL-6 et le TGF-β, deux cytokines importantes pour le
développement des Th17 murins, ne sont pas indispensables pour l’effet anti-tumoral observé.
Enfin, contrairement à l’étude sur le transfert adoptif des Th17, CCL20 n’est pas nécessaire à
l’efficacité des chimiothérapies dans nos modèles.
D’autres études ont montré que l’IL-17 pouvait agir directement sur les cellules
dendritiques. Dans un modèle d’infection par Listeria monocytogenes, l’IL-17 est produit
majoritairement par les LTγδ de la rate et favorise l’activation de LT CD8 naïfs
277
. Les
auteurs ont montré que l’IL-17 agissait directement en augmentant l’expression de CMH I et
la production d’IL-1β, d’IL-12 et d’IL-6 par les BM-DC in vitro, favorisant ainsi la
présentation croisée des antigènes microbiens. Les auteurs ont également pu montrer que les
cellules dendritiques CD8+ de la rate de souris il-17a-/- infectées par la bactérie produisaient
moins d’IL-12 que les souris WT. Il est intéressant de noter qu’une action directe de l’IL-17
sur les cellules dendritiques a également été mise en évidence dans un modèle d’activation de
LT Th1 278. Dans cette étude, les auteurs montrent que l’IL-17A seule, contrairement à l’IL22 ou à l’IL-17F, peut induire la production d’IL-12 par des BM-DC in vitro, selon un
mécanisme impliquant une régulation à l’échelle transcriptionnelle. Outre son rôle sur la
production d’IL-12, l’IL-17A peut également induire la sécrétion d’IL-6 et d’IFN-γ par les
cellules dendritiques, selon un mécanisme impliquant l’activation de NF-κB. De manière
intéressante, les auteurs ont montré que les cellules dendritiques du poumon étaient également
67
capables de répondre directement à l’IL-17A par la production d’IL-12 et d’IFN-γ. Dans
notre modèle, il est possible que l’IL-17 agisse sur les cellules dendritiques mais d’autres
expériences sont nécessaires pour répondre à cette question.
L’IL-17 est également impliqué dans le recrutement de neutrophiles et de monocytes
sur les sites inflammatoires. Dans des modèles in vitro, il a été montré que l’IL-17 pouvait
directement agir sur les cellules épithéliales, les fibroblastes ou les cellules endothéliales,
pour induire la sécrétion de chimiokines telles que CXCL1, CXCL8 (chez l’Homme)
CCL2 ou CCL7
280
279
,
. In vivo, l’injection d’IL-17 dans le péritoine est associée à une production
de CXCL1 et à un recrutement massif de neutrophiles
281
. Dans un modèle
d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, la neutralisation de l’IL-17 induit une
diminution du taux cérébral de CCL2, CCL7 et CXCL1, et un plus faible recrutement de
leucocytes
276
. De même, dans un modèle d’infection par Escherichia coli, l’IL-17 permet le
recrutement de neutrophiles protecteurs contre l’infection
sécrétion de G-CSF et favoriser ainsi la granulopoièse
282
283 284
. Enfin, l’IL-17 peut induire la
.
Dans certains modèles, les LTγδ sont les principaux producteurs d’IL-17. Ainsi, des
souris déficientes en LTγδ présentent une plus grande sensibilité à une infection par
Staphylococcus aureus, associée à un défaut de recrutement de neutrophiles
285
. Une étude
récente montre que les LTγδ présents dans le derme sont les principaux producteurs cutanés
d’IL-17 après une injection intra-dermique de BCG
255
. Les auteurs montrent que ces LTγδ
favorisent le recrutement de neutrophiles sur le site de l’infection, le transport d’antigènes
dans le ganglion drainant et l’activation de LT Th1 spécifiques. Cette étude suggère que les
neutrophiles sont impliqués dans la phagocytose des antigènes et dans leur acheminement
vers les ganglions drainants. Il est intéressant de noter que contrairement aux LTγδ
épidermiques, ces LTγδ dermiques ressemblent aux LTγδ que l’on trouve dans nos tumeurs
sous-cutanées, notamment en terme de type de chaine γ exprimée et de niveau d’expression
de CD44 et de CD69. Par ailleurs, des données récentes dans le laboratoire suggèrent que des
neutrophiles sont recrutés dans la tumeur peu de temps après l’administration de
chimiothérapies.
68
5 Rôle de l’IL-17 et de l’IL-1β dans la progression tumorale
Le rôle de l’IL-17 dans le développement et la progression tumorale est controversé.
Certaines études murines ont montré que l’IL-17 pouvait avoir un effet anti-tumoral,
impliquant notamment l’activation de LT spécifiques dans le ganglion drainant
286 275
. En
revanche, la présence de LT Th17 dans les tumeurs gastriques humaines a été associée à un
mauvais pronostic
287
. L’IL-1β et d’autres cytokines comme l’IL-23 et l’IL-6 ont notamment
été impliquées dans l’accumulation de LT Th17 dans les tumeurs humaines
288
. Une étude
chez la souris a mis en évidence le rôle de l’IL-17 dans la production d’IL-6 et l’activation de
STAT3, ce qui favorise la survie des cellules tumorales et l’angiogenèse
289
. L’activation de
STAT3 au niveau des cellules transformées a également été impliquée dans l’effet protumoral de l’IL-17 dans un modèle de carcinogenèse cutanée induite par les agents
DMBA/TPA
290
. Dans notre modèle, l’IL-17 induit une inflammation anti-tumorale
différente, qui n’implique pas les LT Th17 et qui ne dépend ni de l’IL-6 ni de l’IL-23. Une
étude récente a montré que les LTγδ producteurs d’IL-17 pouvaient favoriser la croissance
tumorale en stimulant l’angiogenèse. Les LTγδ infiltrant les tumeurs après chimiothérapie ne
sont cependant pas les mêmes que dans cette étude, puisqu’ils n’expriment pas les chaines γ1
et γ2, ni le récepteur activateur NKG2D.
Le rôle de l’IL-1β dans la progression tumorale est également controversé. Alors que
nous montrons que cette cytokine est impliquée dans l’effet anti-tumoral des chimiothérapies
immunogènes, d’autres études ont montré qu’elle favorisait la carcinogenèse induite par des
agents chimiques inflammatoires
favorisant l’angiogenèse
292
291
. L’Il-1β peut aussi avoir un effet pro-tumoral en
. Le manque de consensus quant au rôle de l’IL-17 et de l’IL-1β
dans la progression tumorale pourrait en partie venir des différences de modèles utilisés. De
plus, des paramètres comme la nature des cellules productrices et la cinétique de production
de ces cytokines inflammatoires pourraient être importants. Enfin, le contexte dans lequel ces
cytokines sont produites est déterminant pour leur effet biologique et il est difficile de réduire
la complexité d’une situation inflammatoire à la présence ou non d’une ou de quelques
cytokines.
69
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Nos travaux ont permis de montrer que l’ATP libéré par les cellules tumorales
mourantes suite à leur exposition à certaines chimiothérapies anti-cancéreuses favorisait la
production d’IL-1β par les cellules dendritiques, une cytokine importante pour la polarisation
des réponses Tc1 anti-tumorales. L’augmentation du taux d’IL-1β dans le lit tumoral stimule
la production d’IL-17 par les LTγδ, et favorise ainsi l’accumulation de LT CD8 producteurs
d’IFN-γ dans la tumeur. Sur le plan fondamental, certaines questions subsistent. En effet,
notre étude montre que les cellules dendritiques dérivées de la moëlle sont capables de
produire de l’IL-1β en présence de corps apoptotiques immunogènes in vitro. Il serait
intéressant d’étudier la nature des cellules présentatrices d’antigène qui produisent l’IL-1β in
vivo. De même, le site d’activation des LT CD8 ainsi que la nature des LT activés (naïfs ou
mémoires) en réponse à la chimiothérapie sont des questions importantes, que des études à
venir dans le laboratoire visent à élucider.
Certaines thérapies cytotoxiques sont donc capables d’induire la production de
signaux de danger, à l’origine du développement de réponses anti-tumorales efficaces. Notre
étude indique qu’en plus de la quantité de signaux de danger, la nature de ces signaux est un
critère important. Par exemple, HMGB1 et l’ATP sont tous les deux nécessaires pour
l’activation de l’inflammasome NLRP3 (Fig 8S de Ghiringhelli F et al, Nat Med, 2007). Ceci
est en accord avec les études montrant la nécessité d’avoir un signal TLR induisant la
transcription des ARN messagers de la pro-IL-1β et de NLRP3, préalablement à l’induction
de la production d’IL-1β par l’ATP 12.
Sur le plan médical, ces travaux pré-cliniques apportent une nouvelle façon de
concevoir et d’utiliser les thérapies anti-cancéreuses cytotoxiques conventionnelles. En effet,
selon la vision traditionnelle, l’efficacité thérapeutique des chimiothérapies anti-cancéreuses
se mesurait en considérant leur cytotoxicité directe sur les cellules tumorales en rapport avec
les effets secondaires endommageant les tissus sains. De nombreuses drogues anticancéreuses sont d’ailleurs testées in vivo en implantant des cellules tumorales humaines chez
des
animaux immunodéficients
251
. Cependant, beaucoup d’études ont montré que des
paramètres immunitaires pouvaient avoir une valeur prédictive des réponses cliniques 293. La
compréhension des mécanismes moléculaires déterminant l’immunogénicité de certains
traitements anti-cancéreux permettra à terme de mieux prédire les réponses cliniques et
70
d’utiliser ainsi des traitements plus adaptés à chaque patient. Les facteurs prédictifs devront
intégrer des caractéristiques de la drogue, de la tumeur et de l’hôte (Figure 9). Par exemple,
dans des cas de cancers du colon avancés traités par chirurgie et chimiothérapie adjuvante,
l’expression de la calréticuline sur les cellules tumorales a été corrélée au degré d’infiltration
de la tumeur par des LT naïfs et à une meilleure survie globale sur 5 ans
294
. Concernant les
facteurs non directement liés à la tumeur, des polymorphismes « perte de fonction » de TLR4
et de P2RX7 ont été associés à une moins bonne survie chez des patients atteints de cancer de
sein, traités par de la radiothérapie et des anthracyclines 293.
Le traitement de tumeurs établies avec des chimiothérapies immunogènes induit des
réponses anti-tumorales contribuant à l’efficacité thérapeutique observée. Cependant, il est
intéressant de noter que dans nos modèles, les cas de régressions tumorales complètes sont
extrêmement rares. Ceci suggère que l’induction de réponses anti-tumorales spécifiques n’est
pas suffisante et que l’inhibition des mécanismes immunosuppresseurs induits par la tumeur
pourrait augmenter l’efficacité thérapeutique des chimiothérapies immunogènes. Certaines
études montrent une augmentation de l’efficacité thérapeutique de thérapies conventionnelles
par la combinaison avec des anticorps neutralisant CTLA-4 ou PD-1
295 296
. De plus, sur le
plan thérapeutique, l’identification des paramètres impliqués dans l’immunogénicité de
certaines chimiothérapies peut permettre de compenser les défauts éventuels chez les patients.
Par exemple, un défaut dans le TLR4 peut être compensé par l’administration des ligands
d’autres TLR, comme les TLR-3 et -9
297
. En revanche, certains adjuvants, pouvant avoir un
effet anti-tumoral seul, ne sont pas capables d’améliorer l’efficacité des chimiothérapies. Ceci
est le cas de l’α-GalCer qui stimule les iNKT 297. Il est donc nécessaire d’étudier de manière
rationnelle les relations entre les chimiothérapies anti-cancéreuses conventionelles et le
système immunitaire de chaque patient, afin d’améliorer l’efficacité globale de ces
traitements, notamment en les combinant avec des immunothérapies appropriées.
71
Figure 9 : Schéma théorique des différents paramètres prédictifs de l’efficacité des
chimiothérapies anti-cancéreuses immunogènes (d’après Zitvogel L, Nat Rev Clin Oncol,
2011 293).
72
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87
ANNEXES
Cette partie contient d’autres papiers publiés au cours de ma thèse, dont un article collaboratif
et une revue.
88
Oncogene (2010) 29, 482–491
& 2010 Macmillan Publishers Limited All rights reserved 0950-9232/10 $32.00
www.nature.com/onc
ORIGINAL ARTICLE
Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin
A Tesniere1,2,3,14, F Schlemmer1,2,3,14, V Boige2,4, O Kepp1,2,3, I Martins1,2,3, F Ghiringhelli5,6,
L Aymeric2,3,7, M Michaud1,2,3, L Apetoh2,3,7, L Barault8,9, J Mendiboure2,10, J-P Pignon2,10,
V Jooste9,11, P van Endert12, M Ducreux2,3,4, L Zitvogel2,3,7,13, F Piard8,9,14 and G Kroemer1,2,3,14
1
INSERM, U848, Villejuif, France; 2Institut Gustave Roussy, Villejuif, France; 3Université Paris-Sud/Paris XI, Orsay, France;
Département de médecine, Institut Gustave Roussy, Villejuif, France; 5AVENIR team INSERM CRI-866, Dijon, France; 6Centre
Georges Francois Leclerc, Dijon, France; 7INSERM, U805, Villejuif, France; 8Service d’Anatomie Pathologique, CHU, Dijon,
France; 9INSERM U866, Dijon, France; 10Service de biostatistiques et d’épidémiologie, Institut Gustave Roussy, Villejuif, France;
11
Registre des cancers digestifs, Dijon, France; 12INSERM, U580, Université Paris Descartes, Paris, France and 13CIC BT507,
Institut Gustave Roussy, Villejuif, France
4
Both the pre-apoptotic exposure of calreticulin (CRT) and
the post-apoptotic release of high-mobility group box 1
protein (HMGB1) are required for immunogenic cell
death elicited by anthracyclins. Here, we show that both
oxaliplatin (OXP) and cisplatin (CDDP) were equally
efficient in triggering HMGB1 release. However, OXP,
but not CDDP, stimulates pre-apoptotic CRT exposure in
a series of murine and human colon cancer cell lines.
Subcutaneous injection of OXP-treated colorectal
cancer (CRC), CT26, cells induced an anticancer immune
response that was reduced by short interfering RNAmediated depletion of CRT or HMGB1. In contrast,
CDDP-treated CT26 cells failed to induce anticancer
immunity, unless recombinant CRT protein was absorbed
into the cells. CT26 tumors implanted in immunocompetent mice responded to OXP treatment in vivo, and this
therapeutic response was lost when CRT exposure by
CT26 cells was inhibited or when CT26 cells were
implanted in immunodeficient mice. The knockout of
toll-like receptor 4 (TLR4), the receptor for HMGB1,
also resulted in a deficient immune response against
OXP-treated CT26 cells. In patients with advanced (stage
IV, Duke D) CRC, who received an OXP-based
chemotherapeutic regimen, the loss-of-function allele of
TLR4 (Asp299Gly in linkage disequilibrium with
Thr399Ile, reducing its affinity for HMGB1) was as
prevalent as in the general population. However, patients
carrying the TLR4 loss-of-function allele exhibited
reduced progression-free and overall survival, as compared
with patients carrying the normal TLR4 allele. In
conclusion, OXP induces immunogenic death of CRC
cells, and this effect determines its therapeutic efficacy in
CRC patients.
Oncogene (2010) 29, 482–491; doi:10.1038/onc.2009.356;
published online 2 November 2009
Correspondence: Dr G Kroemer, INSERM, U848, Institut Gustave
Roussy, PR1 39, rue Camille Desmoulins, F-94805 Villejuif, France.
E-mail: [email protected]
14
These authors contributed equally to this work.
Received 17 July 2009; revised 12 August 2009; accepted 7 September
2009; published online 2 November 2009
Keywords: apoptosis; dendritic cells; OXP; calreticulin;
HMGB1; TLR4
Introduction
Conventional anticancer chemotherapy or radiotherapy
is generally thought to reduce tumor progression by
direct cytostatic and cytotoxic effects on tumor cells.
Although this paradigm undoubtedly holds for human
cancers that are xenografted into immunodeficient mice,
it must be revised for tumors that grow on immunocompetent hosts (Apetoh et al., 2007a, b). Thus, multiple
different murine cancer models, including CT26 colon
cancers, EL4 thymomas, TS/A mammary carcinomas,
MCA205 fibrosarcomas and GOS osteosarcomas
respond more efficiently to conventional anticancer
therapy when they are implanted in syngeneic immunocompetent as opposed to immunodeficient hosts (Apetoh et al., 2007a, b). On the basis of these observations,
we and other researchers have become interested in the
contribution of the immune system to the efficacy of
anticancer chemotherapies.
Many chemotherapeutic agents mediate their cytotoxic effects by the induction of apoptosis, and apoptosis
is generally thought to be non-inflammatory and nonimmunogenic (Savill and Fadok, 2000; Matzinger, 2002).
Recent data, however, suggest that, in spite of its
morphological uniformity, apoptosis can follow biochemically distinct subroutines, some of which may
result in immunogenic cell death (Blachere et al., 2005;
Casares et al., 2005; Sancho et al., 2008; Laane et al.,
2009). When murine tumor cells are treated with distinct
apoptosis inducers and then injected subcutaneously, in
the absence of an adjuvant, they mostly fail to elicit an
immune response that would protect the animals against
subsequent challenge with live tumor cells (Casares et al.,
2005; Obeid et al., 2007b). In contrast to many other
apoptosis-inducing regimens, anthracyclines can induce
immunogenic cell death, meaning that tumor cells
that die in response to anthracyclines constitute
efficient anticancer vaccines and elicit the generation of
Oxaliplatin and anticancer immunity
A Tesniere et al
483
tumor-specific cytotoxic T lymphocytes, in a dendritic
cell (DC)-dependent manner (Apetoh et al., 2007b;
Tesniere et al., 2008; Sancho et al., 2009).
In contrast to cell death elicited by standard protocols
of apoptosis induction (such as treatment with the
general tyrosine kinase inhibitor, staurosporin, or the
topoisomerase inhibitors etoposide and campothecin),
anthracyclin-induced cell death is preceded by the preapoptotic exposure of calreticulin (CRT) on the plasma
membrane surface (Obeid et al., 2007b). Although CRT
is usually located in the lumen of the endoplasmic
reticulum (ER), yet it translocates to the cell surface in
response to anthracyclines. This involves a complex
signal transduction pathway, including an ER stress
response, the subapoptotic activation of caspase-8 and
the exocytosis-dependent co-translocation of CRT,
together with another ER protein, ERp57, to the outer
surface of the plasma membrane (Laane et al., 2009).
Surface CRT serves as an engulfment signal (Obeid
et al., 2007a, b) and similarly targets apoptotic cells for
interaction with DCs and subsequent cross-presentation
of tumor antigens (Zeng et al., 2006). Inhibition of CRT
exposure by knockdown of CRT or ERp57 abolishes
the immunogenicity of cell death (Obeid et al., 2007b;
Panaretakis et al., 2008), and ERp57-deficient cells
implanted into mice form anthracyclin-resistant tumors
(Panaretakis et al., 2008). Importantly, non-immunogenic cell death (without CRT exposure) can be
rendered immunogenic by absorbing recombinant
CRT protein to the cell surface (Obeid et al.,
2007a, b), and chemotherapeutic agents that fail to
induce CRT exposure can be rendered efficient by
injecting CRT into tumors (Obeid et al., 2007b). Local
CRT injection also reverses the chemotherapy resistance
of ERp57-deficient tumors (Panaretakis et al., 2008).
These results establish CRT exposure as a major
checkpoint of immunogenic cell death.
To be detected as immunogenic, dying cells must emit
signals in addition to CRT. Indeed, dying cells release
HMGB1 into the extracellular milieu in response to
most chemotherapeutic agents (Apetoh et al., 2007a, b),
and neutralization or depletion of HMGB1 abolishes
the immunogenicity of cell death (Apetoh et al., 2007b).
HMGB1 can interact with several receptors expressed
on the surface of DCs (Park et al., 2006) including tolllike receptor 4 (TLR4). Mice that lack TLR4 or that
bear a mutant TLR4 fail to mount an immune response
against anthracyclin-treated cancer cells (Apetoh et al.,
2007b). Moreover, tumors growing on TLR4-deficient
mice are largely refractory to anticancer chemotherapy
(Apetoh et al., 2007b). This result can be recapitulated
in humans. Approximately 12–14% of Caucasians bear
an allele of TLR4 in which two residues (amino acids
299 and 399) of the extracellular loop are mutated
(Ferwerda et al., 2007). This results in a mutated TLR4
protein (Asp299Gly, Thr399Ile) that exhibits a reduced
affinity for HMGB1 (Apetoh et al., 2007b). Importantly, breast cancer patients bearing this loss-offunction allele of TLR4 exhibit an accelerated relapse
after anthracyclin-based adjuvant chemotherapy compared with patients bearing the normal TRL4 allele
(Apetoh et al., 2007b), underscoring the importance
of anti-cancer immunity for an optimal response to
anthracyclines (Zitvogel et al., 2008).
Circumstantial evidence suggests that, similar to
anthracyclines, oxaliplatin (OXP) can induce immunogenic cell death. Thus, ovalbumin-expressing thymoma
cells (EG7 cells) were found to efficiently prime popliteal
T cells in vivo when they were treated with OXP and
injected into the footpad of immunocompetent mice
(Apetoh et al., 2007b). This T-cell priming was suppressed
by the neutralization of HMGB1 and required the
expression of TLR4 by DCs (Apetoh et al., 2007b).
Oxaliplatin is mostly used for the treatment of CRC
(Muggia and Fojo, 2004; Kelland, 2007), a tumor type
prognosis of which is profoundly influenced by the type,
density and location of lymphoid infiltrates in tumor beds
(Pages et al., 2005; Galon et al., 2006). Thus, even in
advanced CRC, the presence of markers of cytotoxic T
cells and T helper 1-adaptative responses has a positive
prognostic impact (Galon et al., 2006; Camus et al., 2009).
Driven by these considerations, we decided to
evaluate the possible role of OXP as an immunogenic
cell death inducer in the treatment of CRC. In this
study, we show that OXP (but not cisplatin, CDDP)
induces immunogenic apoptosis accompanied by CRT
exposure, that OXP-mediated chemotherapy of colon
cancers implanted into mice relies on an intact immune
system including the presence of TLR4, and that
advanced CRC patients bearing the loss-of-function
allele of TLR4 had a lower progression-free survival
(PFS) after OXP-based chemotherapy compared with
control patients with a wild-type allele.
Results
Oxaliplatin induces immunogenic colon cancer cell death
In response to CDDP or OXP, CT26 cells underwent
cell death, as indicated by staining with annexin-V
fluorescein isothiocyanate (which detects phosphatidylserine residues on the surface of apoptotic cells) and the
vital dye, propidium iodine (that only penetrates into
dead cells; Figures 1a and b). Kinetic and morphological
analyses indicated that morphologically discernible apoptosis was followed by secondary necrosis (data not
shown). As a positive control (Obeid et al., 2007b),
mitoxantrone was used to induce immunogenic cell death.
Thus, Balb/c mice inoculated with mitoxantrone-treated
CT26 cells as a tumor vaccine, were protected against a
subsequent challenge with live CT26 cells. Although
CDDP-treated tumor cells largely failed to induce an
immune response, OXP-treated CT26 cells vaccinated as
efficiently against cancer as mitoxantrone-treated cells
(Figures 1c and d), pointing to a major difference between
OXP and CDDP, which induced immunogenic versus
non-immunogenic cell death, respectively.
Next, we treated established CT26 colon cancers as
soon as they became palpable with CDDP (50 mg/kg) or
OXP (250 mg/kg). This treatment caused a delay in the
growth of CT26 tumors implanted in immunocompetent
Oncogene
Oxaliplatin and anticancer immunity
A Tesniere et al
484
a
CT26
Control
104
Propidium Iodide
Oxaliplatin
15µM
104
Cisplatin
300µM
104
15µM
150µM
104
104
103
103
103
103
103
2
2
2
2
10
10
10
10
102
101
101
101
101
101
0
0
0
0
10
10
0
10
1
10
2
10
3
10
100
10
101
102
103
10
0
10
1
10
2
3
10
0
10
10
1
10
2
3
10
10
100
0
10
10
150
300
1
2
10
3
10
AnnexinV-FITC
b 100
Annexin V + PI % gated cells
80
Annexin V + PI +
60
40
20
0
0
3
15
75
150
300
450
3
15
30
OXP
CDDP
MTX 1µM
80
n=15
60
OXP 15µM
*
n=20
CDDP 15µM
40
Control
n=11
20
1
MTX
d 100
n=10
0
Tumor free mice (%)
Tumor free mice (%)
c 100
75
80
OXP 300µM
60
CDDP 150µM
*
40
Control
n=15 mice per group
20
0
0
20
40
60
Days after challenge
0
20
40
60
Days after challenge
Figure 1 Oxaliplatin (OXP) induces immunogenic colon cancer cell death. (a, b) Frequency of apoptotic (Annexin V þ PI) and
secondary necrotic (Annexin V þ PI þ ) CT26 cells after 24 h of treatment with OXP, cisplatin (CDDP) and mitoxantrone (MTX). CT26
cells were cultured in complete medium along with chemotherapeutic agents, at the indicated dose, for 24 h, and then stained with
annexin-V fluorescein isothiocyanate (FITC) and with vital dye, propidium iodine, before subsequent analysis by flow cytometry. Data
are represented as dot plot (a) or mean value±s.e.m. of triplicates of one representative experiment (b). (c, d) OXP-treated CT26 cells
vaccinated efficiently against live tumor cells. CT26 cells treated in vitro with OXP, CDDP or MTX were inoculated subcutaneously in
Balb/c mice. After 7–10 days, mice were re-challenged with live 5 106 CT26 cells. The percentages of tumor-free mice are pooled from
three independent experiments. *Po0.05.
Balb/c mice, with OXP yielding a more pronounced
therapeutic response than CDDP (Figure 2a). A dose
escalation using OXP or CDDP by a factor of 10 did not
improve the therapeutic outcome (Supplementary Figure 1). Importantly, no therapeutic effect was observed
when instead of CT26 wild-type cells, CT26 cells,
subjected to a stable knockdown of ERp57 using a
short hairpin RNA, were injected into immunocompetent Balb/c mice and then treated with CDDP or OXP
(Figure 2b). Such ERp57 knockdown cells failed to emit
immunogenic signals (such as CRT exposure) (Panaretakis et al., 2008) and hence become refractory to
chemotherapies whose efficiency relies on the immune
system (Tesniere et al., 2008). To further investigate the
Oncogene
contribution of the immune system to the control of
tumor growth, we treated CT26 tumors that were
expanding in immunodeficient nu/nu mice with CDDP
or OXP. Neither of the two treatments retarded the
growth of tumors implanted in nu/nu mice (Figure 2c),
underscoring the contribution of the immune system to
the therapeutic response elicited by OXP (and to less
extent by CDDP).
Calreticulin exposure determines the immunogenicity of
OXP-induced cell death
After short-term stimulation (4 h) with mitoxantrone
or OXP, CT26 cells exposed CRT on the cell surface,
Oxaliplatin and anticancer immunity
A Tesniere et al
485
CT26 WT
CDDP
OXP
3
*
2
*
1
0
0
5
10 15
20
Days after treatment
2
Co
CDDP
2
Nude mice CT26 WT
OXP
1
0
Tumor size (cm3)
3
Co
Tumor size (cm3)
Tumor size (cm3)
4
CT26 shERp57
Co
CDDP
OXP
1
0
0
5
10
15
20
Days after treatment
0 2 4 6 8 10
Days after treatment
Figure 2 Calreticulin (CRT) exposure and the immune system are critical for the therapeutic effect of oxaliplatin (OXP) on
established tumors in vivo. CT26 colon cancer tumors were subcutaneously established in immunocompetent (wild—type mice) (a, b) or
immunodeficient (nu/nu) mice (c). (b) CT26 cells were previously stably transfected with short hairpin RNA for ERp57, which diminish
the ability of CRT exposure on the cell surface and then the efficacy of immunogenic chemotherapy. When the tumors reached 40–
80 mm2 in size, mice were either left untreated or treated with intratumoral chemotherapy (OXP: 1.25 mg/kg; CDDP: 0.25 mg/kg).
Tumor sizes were monitored every 2 or 3 days using a caliper and tumor volumes were calculated as previously described (35). Each
group included five mice. One representative experiment out of three is depicted. *Po0.05.
as determined by immunofluorescence staining and
microscopic examination (Figure 3a) or cytofluorometric analysis (Figure 3b). In identical conditions,
however, CDDP failed to elicit pre-apoptotic CRT
exposure, over a wide range of different concentrations
(Figures 3a-c). Depletion of CRT using an siRNA
abolished the immunogenicity of OXP-treated CT26
cells in vivo (Figure 3d). Absorbance of recombinant
CRT protein to the plasma membrane restored the lost
immunogenicity of CRT-depleted OXP-treated cells
(Figure 3d), as well as the absent immunogenicity of
CDDP-treated CT26 cells (Figure 3e). Similarly,
CDDP-treated EG7 cells (which express the model
antigen OVA) were unable to prime popliteal T cells for
interferon-g production in vivo, and this defective T-cell
priming was restored by absorbing recombinant CRT
protein onto the surface of cells before they were
injected into the footpad (Figure 3f). These results point
to a fundamental difference in the ability of the two
platinum compounds in eliciting CRT exposure, which
is necessary for signaling immunogenicity. The difference between CDDP and OXP with regard to their
CRT-exposing activity was observed over a range of
different colon cancer cell lines. Thus, the two human
colon cancer cell lines, RKO and HCT116, both of
which were killed by CDDP and OXP (Supplementary
Figure 2), exhibited CRT exposure in response to OXP,
but not in response to CDDP (Supplementary Figure 3).
Altogether, these results support the idea that OXP is a
more efficient inducer of CRT exposure than CDDP,
and that this difference in CRT exposure determines
the divergence in the in vivo anti-tumor efficacy of
both drugs.
The HMGB1–TLR4 axis contributes to the
immunogenicity of OXP-induced cell death
Both OXP and CDDP induced the release of HMGB1
from the nuclei of mouse colon cancer cells (Figure 4a).
HMGB1 appeared in the supernatant of the cells, as
detectable by enzyme-linked immunosorbent assay
(Figure 4b). Similarly, both OXP and CDDP released
HMGB1 from several human colon cancer cell lines
(Supplementary Figure 4). Neutralization of HMGB1
with a specific antibody abolished the capacity of OXPtreated EG7 cells to prime T cells for interferon-g
production (Figure 4c). Similarly, the co-injection of the
neutralizing anti-HMGB1 antibody abolished the capacity of OXP-treated tumor cells to vaccinate against
CT26 cancers. The partial depletion of HMGB1 with a
specific siRNA also reduced the immunogenicity of
OXP-treated tumor cells (Figure 4d). Moreover, OXPtreated dying cells failed to elicit an anti-tumor immune
response in tlr4/ mice, in conditions in which tlr4 þ / þ
controls were protected against challenge with live
cancer cells (Figure 4e). These results corroborate the
importance of the HMGB1–TLR4 axis for the immune
response against tumor cells dying in response to OXP.
The Asp299Gly polymorphism influences PFS in advanced
patients treated with chemotherapy
Next, we investigated whether a loss-of-function allele
of TLR4 (Asp299Gly, in linkage disequilibrium with
Thr399Ile) (Ferwerda et al., 2007) could affect PFS of
metastatic CRC patients (Bouché et al., 2007) (n ¼ 338)
that had been included in the FFCD 2000–05
randomized trial and for whom blood samples were
available. This trial compared the single agent
5-fluorouracil (administered together with folinic acid)
until failure, then combination chemotherapy with
OXP plus 5-fluorouracil versus the latter combination
chemotherapy from the outset. The loss-of-function
allele was approximately as frequent among the
patient population (16.5%) as in the general Caucasian
population (12–14%) (Arbour et al., 2000; Agnese et al.,
2002). Patients that were heterozygous or homozygous
for the TLR4 Asp299Gly/Thr399Ile allele (n ¼ 48) were
similar to patients bearing the normal TLR4 allele
(n ¼ 290) with respect to age, sex, number of disease
sites, the WHO classification, alkaline phosphatase
serum levels and other laboratory parameters (Table 1).
Interestingly, patients bearing the normal TLR4 allele
manifested an increased progression-free survival
Oncogene
Oxaliplatin and anticancer immunity
A Tesniere et al
486
Merge
WGA 633
Hoechst 33342 CRT
CRT + (%)
Merge
CRT + (%)
100
100
80
80
60
Control
60
OXP
40
40
20
10 µm
20
0
0
100
100
80
80
60
40
Control
0
0
80
Control
60
CDDP
10
3
10
80
Control
60
MTX
40
40
20
20
0
2
1
10
0
0
1
10
2
10
3
10
0
1
10
2
10
3
10
20
15
10
5
0
C
on
tro
CRT-Alexa488
25
40
20
Tumor-free mice (%)
Tumor-free mice (%)
60
CDDP
100
OXP siRNA CRT (n=15)
80
CDDP + rCRT
80
n=10 for each group
60
40
20
0
0
20
40
60
Days after challenge
0
20
40
60
Days after challenge
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Li
0
30 150
CDDP
PBS + rCRT
OXP siRNA Co (n=10)
OXP siRNA CRT + rCRT (n=15)
3
OXP
Control
Control (n=10)
100
15 300
rC DP
RT
3
10
+
2
10
DP
1
10
CD
0
30
CD
20
XP
20
35
7
40
OXP
EG
Counts
80
60
40
0
0
ve
Isotype
20
0
IFN-γ (ng/ml)
Control
60
40
20
% surface CRT+ / PI negative cells
80
60
CDDP
l
M
TX
MTX
O
WGA 633
Hoechst 33342 CRT
Figure 3 Calreticulin (CRT) exposure determines the immunogenicity of OXP-induced cell death. CRT exposure on the cell surface of
CT26 cells was assessed after short-term stimulation (4 h) with mitoxantrone (MTX), oxaliplatin (OXP) or cisplatin (CDDP)
treatment, or without treatment (control) by immunofluorescence staining followed by confocal microscopic examination (a) or by
flow cytometric analysis (b, c). Data are presented as means±s.e.m. of three independent experiments (A, B, C). (d, e) CRT exposure
determines the efficacy of in vivo anti-cancer vaccination. (d) CT26 colon cancer cells were transfected with short interfering
RNA(siRNA) for CRT (siRNA CRT) or an irrelevant siRNA (siRNA Co), and then treated with OXP for 24 h in vitro. In one group,
recombinant CRT (rCRT) was coated on cells before the subcutaneous injection of the dying cells in one flank. At day 7, mice (n per
group, as indicated) were inoculated with live syngeneic tumor cells in the opposite flank and tumor growth was monitored. The
percentage of tumor-free mice is indicated. (f) CRT exposure determines the priming of T cells in the draining lymph node. OVAexpressing EG7 tumor cells were treated with medium alone, OXP (5 mM) or CDDP (5 mM) for 16 h and injected into the footpad of
C57BL/6 mice. In some experiments, tumor cells treated with phosphate buffered saline (PBS) or CDDP were incubated with rCRT
before in vivo injection. After 5 days, lymphocytes from the draining popliteal lymph nodes were challenged with PBS or PBS þ OVA
protein, and IFN-g secretion was assessed at 72 h by ELISA. Data are presented as mean±s.e.m. of IFN-g secretion after
re-stimulation with PBS–OVA or PBS alone. A representative out of three independent experiments is depicted. *Po0.05.
(hazard ratio: 0.73; confidence interval ¼ 0.53–1.00;
Pp0.05) and overall survival (hazard ratio ¼ 0.72;
confidence interval ¼ 0.52–1.01); P ¼ 0.05), compared
with patients bearing the loss-of-function allele of
TLR4 (Figure 5). We also investigated the role of the
tlr4Asp299Gly polymorphism in a cohort of stage II
Oncogene
CRC patients (n ¼ 258) that were treated by surgical
removal of the primary tumor in a curative intent,
without any adjuvant chemotherapy. Furthermore, no
differences were found in main patient and tumor
characteristics according to TLR4 genotype (data not
shown). Interestingly, we found no statistical differences
Oxaliplatin and anticancer immunity
A Tesniere et al
487
Nuclear HMGB1
Cytosolic HMGB1
Cytosolic and nuclear HMGB1
HMGB1 negative cells
Live CT26
10 µm
100
80
60
40
20
0
OXP
10 µm
100
80
60
40
20
0
MTX
Hoechst
33342
HMGB1
Merge
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
CDDP
Hoechst
33342
HMGB1 (%)
Merge
HMGB1
HMGB1 (%)
CT26 supernatants
*
140
80
120
IFN-γ (pg/ml)
100
60
40
100
80
60
40
20
20
0
0
Co
5
0
10
25
50 100 200 400 800
5
10
20
OXP (µM)
Control
OXP
n=10 mice/group
75 150 300 600
60
40
20
80
60
40
20
0
20
40
Days after challenge
60
tlr4 –/– mice
80
60
40
20
0
0
0
OXP OXP
+
anti-HMGB1
100
Tumor-free mice (%)
80
Control
OXP
Balb/c mice
n=15 mice/group
100
Tumor-free mice (%)
100
38
CDDP (µM)
OXP
OXP siRNA HMGB1
OXP siRNA HMGB1 + rHMGB1
OXP + anti HMGB1 Ab
Control
Tumor-free mice (%)
HMGB1 (ng/ml)
160
0
20
40
Days after challenge
60
0
20
40
60
Days after challenge
Figure 4 The HMGB1–TLR4 (high-mobility group box 1–toll-like receptor 4) axis contributes to the immunogenicity of oxaliplatin
(OXP)-induced cell death. (a) Immunofluorescence microscopy of HMGB1 release from the nuclei to the cytosol in CT26 cells,
untreated (live) or treated for 24 h with OXP (300 mM), cisplatin (CDDP, 150 mM) or mitoxantrone (MTX, 1 mM). After the indicated
treatments, cells were permeabilized and stained with a rabbit anti-HMGB1 antibody (or an isotype-matched control antibody, data
not shown) and were counterstained with a goat anti-rabbit Alexa 488. Nuclei were stained with Hoechst 33342. Data are presented as
means±s.e.m. of three independent experiments. (b) ELISA detection of HMGB1 release in the supernatants of CT26 cells treated
with different concentrations of OXP and CDDP for 24 h. Data are presented as means±s.e.m. of duplicates of a representative
experiment. (c–e) HMGB1 determines the immunogenicity of dying tumor cells. The depletion of HMGB1 with a specific blocking
antibody abolishes the priming of T cell responses to OXP-treated EG7 cells (see Figure 3f for details) (c) and the capacity of OXPtreated tumor cells to vaccinate against CT26 tumor cells (d). *Po0.05. The knockdown of HMGB1 in CT26 cells transfected with a
specific small interfering RNA reduces the efficacy of antitumor vaccination, which can be restored by addition of recombinant
HMGB1. Loss of the efficacy of antitumor vaccination with OXP-treated CT26 in tlr4/ mice, in condition in which tlr4 þ / þ controls
were protected against challenge with live tumor cells.
Oncogene
Oxaliplatin and anticancer immunity
A Tesniere et al
488
100%
Table 1 Baseline characteristics of patients and prognostic factors
TLR4
Asp299Asp
n
n
%
P-value
%
Sex
Male
Female
34
14
71
29
175
115
60
40
0.17
Age
p60 years
Between 60 and 70 years
>70 years
11
16
21
23
33
44
104
84
102
36
29
35
0.21
WHO Score
0 or 1
2
39
9
81
19
248
42
86
14
0.44
Alcaline phosphatase
Missing
p300 UI/l
>300 UI/l
1
33
14
2
69
29
19
206
65
7
71
22
0.4
White blood counts
Missing
p10 000 /mm3
>10 000 /mm3
1
34
13
2
71
27
11
198
81
4
68
28
0.85
Number of disease sites
1
>1
25
23
52
48
154
136
53
47
0.9
Prior adjuvant chemotherapy
No
Yes
43
5
90
10
255
35
88
12
0.74
Prognostic score
Missing
1
2
3
8
45
103
134
3
16
36
46
1
9
16
22
2
19
33
46
0.94
Treatment
LV5FU2 first
FOLFOX6 first
144
146
46
54
22
26
50
50
0.62
80%
TLR4 Asp299Gly
TLR4 Asp299Asp
60%
Multivariate Cox model : p = 0.05
40%
20%
0%
0
6
12
18
24
30
Months
Abbreviations: TLR4, toll-like receptor 4; WHO, World Health
Organization.
in terms of disease-free survival among patients bearing
the normal or variant allele of TLR4. This result
shows that TLR4Asp299Gly is not a prognostic factor
per se, unless patients receive immunogenic chemotherapy,
thereby underlining the major role of immunogenic cell
death induced by chemotherapy in the participation
of the immune system for the therapeutic outcome.
Altogether, these results indicate that the TLR4 polymorphism Asp299Gly influences the therapeutic
response of metastatic colon cancer patients toward OXP.
Discussion
Oxaliplatin and CDDP are chemically related agents
that induce apoptosis through DNA damage as well as
cytoplasmic effects (Wang and Lippard, 2005), and
Oncogene
Progression-free survival rate
TLR4
Asp299Gly
Figure 5 The Asp299Gly polymorphism influences progressionfree survival in colorectal cancer patients treated with
chemotherapy. Kaplan–Meier analysis of progression-free survival
in metastatic colorectal cancer patients treated with oxaliplatin
(OXP)-based chemotherapy regimen among patients bearing the
tlr4 Asp299Asp and Asp299Gly or Gly299Gly alleles.
against which tumors often (but not always) exhibit
cross-resistance (Castedo et al., 2006). In spite of their
similarity, however, CDDP and OXP differ fundamentally in their capacity to elicit immunogenic cell death, as
shown here. This difference was manifested at several
levels, in different cell lines and species. Although
OXP-treated cancer cells were able to prime T cells
for interferon-g production and to mediate anti-cancer
vaccination, CDDP-treated cells failed to do so. At the
biochemical level, the major difference between OXPand CDDP-triggered cell deaths was found at the level
of CRT exposure. OXP stimulated the translocation of
CRT from the endoplasmic reticulum to the cell surface,
whereas CDDP failed to do. Similarly, absent versus
present CRT exposure explains the difference between
CDDP versus OXP-induced cell death, respectively,
because depletion of CRT rendered OXP-induced cell
death non-immunogenic whereas absorption of CRT to
CDDP-treated cells restored immunogenicity.
In contrast, OXP and CDDP were equipotent in
inducing the release of HMGB1, which is another
determinant of immunogenicity. It is important to note
that failure to emit one single among several immunogenic signals (CRT exposure or HMGB1 release) is
sufficient to abrogate the immunogenicity of cell death
(Tesniere et al., 2008). Hence, the difference in CRT
exposure is sufficient to explain the distinction between
immunogenic versus non-immunogenic cell death
caused by OXP and CDDP, respectively. This difference
in the ability to trigger immunogenic cell death may be
one plausible explanation to understand the lack of
efficacy of CDDP in CRC patients.
It may be argued that only a minor fraction of OXPtreated tumor cells expose CRT at the pre-apoptotic
stage (when the cells lack phosphatidylserine exposure
and are viable), and that the amount of antigen that
would be targeted to the DCs would be rather low.
However, in vivo, when tumors are treated with
Oxaliplatin and anticancer immunity
A Tesniere et al
489
chemotherapy, dying cells were similarly phagocytosed
before they lost the integrity of the plasma membrane
and hence had a high chance of being engulfed by DCs.
Indeed, as we inject oxaliplatin-treated tumor cells
in vivo, a significant fraction of cells are still viable.
As such oxaliplatin-treated CT26 cells do not form
tumors in vivo, they must die after injection and similarly
expose CRT before they lose viability. At this point,
they might be engulfed by DCs that subsequently
present tumor antigens to T lymphocytes.
The aforementioned results underscore the likely
impact of the immune response on OXP-based chemotherapy. If an intact immune system is required for
an optimal therapeutic response to OXP, two major
predictions can be made. First, the chemotherapeutic
response will not only be dictated by the capacity of
tumor cells to undergo apoptosis in response to OXP
but will also be influenced by their intrinsic potential to
emit immunogenic signals (such as CRT exposure and
HMGB1 secretion). In this context, it seems intriguing
that reduced calreticulin expression constitutes a negative prognostic/predictive feature of colon cancers
(Toquet et al., 2007). Reduced calreticulin expression
also has a negative impact on neuroblastoma (Hsu et al.,
2005), cervical carcinoma (Mehta et al., 2008), as well as
on follicular thyroid carcinoma (Netea-Maier et al.,
2008). Hence, it will be important to investigate whether
CRT affects the immunogenicity of such tumors beyond
its role in contributing to optimal peptide loading
into major histocompatibility complex class I antigen
(Wright et al., 2004; Zhang and Williams, 2006).
Second, failure of the immune system to perceive
immunogenic signals would have a negative influence
on the efficacy of chemotherapy. In apparent accordance with this prediction, we found that the knockout
of TLR4 compromised T-cell priming by OXP-treated
EG7 thymoma cells (Apetoh et al., 2007b) and that
TLR4 deficiency abolished the capacity of OXP-treated
CT26 cells to induce a protective anti-cancer immune
response (this study). TLR4 was also required for the
optimal therapeutic response toward OXP in mouse
models for thymoma and osteosarcoma (Apetoh et al.,
2007a). Moreover, as shown here, a loss-of-function
allele of TLR4 was associated with reduced progressionfree survival and overall survival in CRC patients
receiving OXP-based chemotherapy for advanced
disease.
In conclusion, OXP elicits immunogenic cell death in
several rodent models of colon cancer. The immunogenicity of an OXP-induced cell death is governed by the
same rules as applicable to those elicited by anthracyclines thus far that it involves CRT exposure and
HMGB1 release. Moreover, it critically depends on the
presence of functional TLR4 in the immune system.
Correlative evidence suggests that these findings also
apply to CRC patients in which a loss-of-function allele
of TLR4 negatively affects outcomes after OXP-based
chemotherapy. On the basis of our results, we predict
that TLR4 alleles should not affect the therapeutic
response to CDDP treatment, a problem that requires
further investigation.
Materials and methods
Cell lines
CT26 and EG7 cells were cultured in RPMI 1640 medium,
RKO and HCT116 cells in McCoys 5A (Gibco, Carlsbad, CA
USA). All media were supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 10 mM Hepes, 10 U/ml penicillin and
10 mg/ml streptomycin.
Mouse strains
BALB/c (H-2d), C57BL/6 (H-2b) and nu/nu BALB/c mice
were obtained from the Centre d’élevage Janvier (Le Genest
St Isle, France) and from Charles River Laboratories (SaintGermain sur l’Arbresle, France). BALB/c Tlr4/ mice were
kindly provided by Grégoire Lauvau (INSERM, University of
Sofia Antipolis, Valbonne, France), and bred in our animal
facility.
Antibodies and reagents
A rabbit polyclonal antibody against calreticulin (ab2907) and
a rabbit polyclonal antibody against HMGB1 (ab18256)
were purchased from Abcam (Paris, France). An Alexa 633conjugated wheat germ agglutinin (WGA 633) was purchased
from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). In some experiments,
mice were injected with a neutralizing anti-HMGB1 antibody
(50 mg per mice) kindly provided by Huan Yang (Lexington,
MA, USA). HMGB1 enzyme-linked immunosorbent assay II
kits were obtained from SHINO-TEST CORPORATION
(Tokyo, Japan). In some experiments, cells were exposed to
recombinant CRT, at 3 mg per 106 cells in phosphate buffered
saline (PBS) on ice for 30 min, as described earlier (Obeid et al.,
2007b; Panaretakis et al., 2009), followed by three washes.
Recombinant HMGB1 was purchased from R&D systems
(Minneapolis, MN, USA), and 200 ng per mouse was injected
along with dying tumor cells. Mitoxantrone (Sigma-Aldrich,
St Louis, MO, USA), OXP (Sanofi Synthelabo, Paris, France)
and CDDP (Sigma-Aldrich) were used to induce cell death.
Quantification of cell death
Cell death was assessed by annexin V fluorescein isothiocyanate (MACS, Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)
staining. Briefly, 2 105 cells per sample were collected,
washed in PBS, pelleted, and resuspended in an incubation
buffer (10 mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 140 mm NaCl and
5 mM CaCl2) containing annexin V fluorescein isothiocyanate
antibody. Samples were kept in the dark and incubated for
15 min before the addition of another 400 ml of 0.1% propidium iodide incubation buffer and subsequent analysis on a
fluorescence-activated cell sorter Calibur flow cytometer (BectonDickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) using Cell Quest software.
Flow cytometric analysis of CRT on the cell surface
A total of 105 cells were plated in 12-well plates and treated the
day after with the indicated agents for 4 h. Cells were collected,
washed twice with PBS and fixed in 0.25% paraformaldehyde
in PBS for 5 min. After washing again twice in cold PBS, cells
were incubated for 30 min with primary antibody, diluted in
cold blocking buffer (2% fetal bovine serum in PBS), followed
by washing and incubation with the Alexa488-conjugated
monoclonal secondary antibody in a blocking buffer (for
30 min). Each sample was then analysed by FACScan (BectonDickinson) to identify cell surface CRT. Isotype-matched IgG
antibodies were used as a control, and the fluorescent intensity
of stained cells was gated on propidium iodide-negative cells.
Oncogene
Oxaliplatin and anticancer immunity
A Tesniere et al
490
Immunofluorescence
For surface detection of CRT, cells were placed on ice, washed
twice with PBS and fixed in 0.25% paraformaldehyde in PBS for
5 min. Cells were then washed twice in PBS, and a primary
antibody, diluted in cold blocking buffer, was added for 30 min.
After three washes in cold PBS, cells were incubated for 30 min
with the appropriate Alexa 488-conjugated secondary antibody
and the Alexa 633-conjugated wheat germ agglutinin (WGA
633) diluted in a cold blocking buffer. Cells were fixed with 4%
paraformaldehyde for 20 min before nuclear staining with
Hoechst 33342 (1/10000) in PBS for 20 min and then mounted
on slides. For intracellular HMGB1 staining, cells were washed
with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde for 20 min,
permeabilized with 0.1% Triton X-100 (Sigma) for 10 min,
rinsed three times with PBS, and nonspecific binding sites were
blocked with 10% fetal bovine serum in PBS for 30 min. A
primary antibody was added for 1 h. Subsequently, cells were
washed three times with PBS and incubated for 30 min with
an Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibody (1:500,
Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA).
Detection of HMGB1 release
CT26, HCT116 and RKO cells were plated in 6-well plates with
2 ml full medium appropriate for the cell types. The medium was
changed 24 h later and treatment was added onto the cells.
Supernatants were collected at different time points, dying tumor
cells were removed by centrifugation and supernatants were
isolated and frozen immediately. Quantification of HMGB1 in
the supernatants was assessed by enzyme-linked immunosorbent
assay according to the manufacturer’s instructions.
Small interfering RNA transfections
CT26 cells were transfected with small interfering RNA
(siRNA) heteroduplexes specific for calreticulin (50 -rCrCrGr
CUrGrGrGUrCrGrArAUrCrRrArATT-30 ), HMGB1 (50 -rGr
CrArGrCrCrCUrAUrGrArGrArArGrArArATT-30 and rGrC
UrGrArArArArGrArGrCrArArGrArArArATT) or an unrelated control (50 -rGrCrCrGrGUrAUrGrCrCrGrGUUrArAr
GUTT-30 ) designed in our laboratory and synthesized by
Sigma-Proligo (St Louis, MO, USA), at a final concentration
of 100 nM using HiPerFect (Qiagen, Dusseldorf, Germany)
according to the manufacturer’s instructions. At 48 h after
transfection, CT26 cells were assessed for total content of the
respective proteins by immunobloting.
Anti-tumor vaccination
A total of 3 106 CT26 cells, untreated or treated with either
OXP, CDDP or mitoxantrone for 4 h, were inoculated
subcutaneously in 200 ml PBS into 6-week-old female BALB/
c mice (Janvier, Charles River) into the lower flank, whereas
5 105 untreated control cells were inoculated into the
contralateral flank 7 days later (Casares et al., 2005). To
restore ecto-CRT, CT26 cells were incubated with recombinant CRT at 3 mg per 106 cells in PBS on ice for 30 min,
followed by three washes. Animals that bore tumors in excess
of 20–25% of the body mass or were necrotic, were killed. All
animals were maintained in specific pathogen-free conditions,
and all experiments were carried out according to the
Federation of European Laboratory Animal Science Association guidelines. The Ethics Committee of Institut Gustave
Roussy approved all the animal experiments.
Chemotherapy of established tumors in mice
Mice were injected in the flank with 5 105 CT26 cells. The
tumor surface was monitored using calipers. When the tumor
Oncogene
size reached 40–80 mm2, mice were assigned into homogenous groups of 4–6 mice each treated with OXP or
CDDP injected intratumorally in 50 ml PBS. Tumor volume
was then calculated for comparison of tumor growth (Streit
et al., 1999).
Priming assay
A total of 106 EG7 cells either untreated or treated with 300 mm
OXP or 150 mM CDDP for 12 h (note that EG7 and CT26 cells
differ in the kinetics of their response to OXP and CDDP)
were injected into the footpad of the mice. After 5 days,
gangliocytes of popliteal lymph nodes were collected and restimulated with OVA protein. After 72 h, interferon-g secretion was assessed by enzyme-linked immunosorbent assay.
Clinical studies
The first clinical study analysed was the multicenter, prospective,
controlled randomized trial designed to compare the efficacy of
simplified LV5FU2 followed by FOLFOX6 to FOLFOX6 and
by FOLFIRI on PFS after two lines of chemotherapy in
metastatic colon cancer. A total of 410 patients were enrolled in
this study with the following inclusion criteria:
Non-resectable metastases of histologically proven colorectal adenocarcinoma; Evaluable disease (World Health
Organization (WHO) criteria: lesions 42 cm and outside of
the irradiation field); Absence of previous chemotherapy other
than adjuvant with 5-fluorouracil and folinic acid or concomitant to radiotherapy (rectum); WHO performance status
lower or equal to 2.
The main end point of this study was PFS after two lines of
chemotherapy. A total of 388 germline DNAs was prospectively obtained from whole blood samples of the 410 patients
enrolled in this study.
The second clinical study analysed was the retrospective
population-based registry study of non-metastatic colon
cancer (Dukes stage II colon cancer) patients that were treated
by surgical removal of the tumor, without any adjuvant
treatment. A total of 258 stage-II colon cancer patients linked
with a frozen tumor sample were included in the Cote d’Or
digestive registry between 1997 and 2005, and were followed
for progression 5 years after diagnosis. DNA was isolated
from frozen blood leukocytes obtained from all subjects. PCR
primers (Applied Biosystems, Villebon, France) were used to
amplify a 101-bp fragment containing the TLR4 Asp299Gly
mutation (rs4986790) site. After PCR amplification, genotypes were assigned to each subject, by comparing the FAM
signal to its corresponding VIC signal and calculating the
log(FAM/VIC) ratio for each data point.
Statistical analyses
For the analysis of experimental data, comparison of
continuous data was achieved by the Mann–Whitney U test
and comparison of categorical data by w2 or Fisher’s exact test,
as appropriate. For clinical data, the log-rank test was used for
the analysis of the Kaplan–Meier survival curves. A Cox
model was then established to assess the role of tlr4 variation
among the different groups. Statistical analyses were performed with SAS software (SAS Institute Inc, Cary, NC,
USA). All P-values were two tailed. A P-value of 0.05 was
considered statistically significant for all experiments.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
Oxaliplatin and anticancer immunity
A Tesniere et al
491
Acknowledgements
We thank all the investigators who participated in the FFCD
2000–05 clinical trial; Pierre Laurent Puig for help with DNA
extraction and storage; and Patrick Gonin and IGR animal
facility for helping with mouse breeding. This study was
supported by INSERM (AT); FRM (FS); Cancéropôle Ile-de-
France, Institut National du Cancer, Fondation de France,
Association Laurette Fugain, Cent pour Sang la Vie, Agence
National de la Recherche, Association for International
Cancer Research (AICR), and the European Commission
(ApoSys, ChemoRes, Death-Train, RIGHT) (GK); la Ligue
and FRM (LA); a fellowship from La Ligue (IM); a fellowship
from ARC (MM).
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Supplementary Information accompanies the paper on the Oncogene website (http://www.nature.com/onc)
Oncogene
Review
Tumor Cell Death and ATP Release Prime Dendritic Cells
and Efficient Anticancer Immunity
Cancer
Research
Laetitia Aymeric1,2,3, Lionel Apetoh1,2,3, François Ghiringhelli1,2,3,4,5, Antoine Tesniere2,3,6, Isabelle Martins2,3,6,
Guido Kroemer2,3,6, Mark J. Smyth7, and Laurence Zitvogel1,2,3
Abstract
By destroying tumor cells, conventional anticancer therapies may stimulate the host immune system to eliminate residual disease. Anthracyclines, oxaliplatin, and ionizing irradiation activate a type of tumor cell death
that elicits efficient anticancer immune responses depending on interferon γ (IFNγ) and the IFNγ receptor.
Thus, dying tumor cells emit danger signals that are perceived by dendritic cells (DC), which link innate and
cognate immune responses. Recently, we observed that ATP was released by tumor cells succumbing to chemotherapy. ATP activates purinergic P2RX7 receptors on DC, thus activating the NLRP3/ASC/caspase-1 inflammasome and driving the secretion of interleukin-1β (IL-1β). IL-1β then is required for the adequate polarization of
IFNγ-producing CD8+ T cells. These results imply a novel danger signal, ATP, and a novel receptor, P2RX7, in the
chemotherapy-elicited anticancer immune response. Cancer Res; 70(3); 855–8. ©2010 AACR.
Setting the Stage
Results
Some regimens of chemotherapy mediate direct cytotoxic
effects on the tumor and, in addition, elicit indirect antitumor
effects resulting from the immunogenicity of cell death (1, 2).
Anthracyclines, oxaliplatin, and ionizing irradiation can trigger immunogenic cell death, whereas many other anticancer
agents fail to do so. We delineated the molecular mechanisms
underlying the recognition of dying tumor cells by dendritic
cells (DC) and found two major checkpoints that dictate
the immunogenicity of cell death. First, optimal phagocytosis
of chemotherapy or radiotherapy-treated tumor cells by
DC requires the translocation of endoplasmic reticulum
(ER)-resident calreticulin and disulfide isomerase ERp57 to
the plasma membrane of dying tumor cells (3–5). Second,
the chromatin-binding high mobility group box 1 protein
(HMGB1) must be released by dying tumor cells and must
bind to its receptor toll-like receptor 4 (TLR4) on DC to facilitate antigen processing of the phagocytic cargo (6). However,
additional signals emanating from dying tumor cells are
required for the full-blown maturation and differentiation
of DC and T cells, respectively. Therefore, we addressed the contribution of damage-associated molecular patterns (DAMP) to
the efficacy of chemotherapy in mouse tumor models (7).
Components of the immune system required for therapeutic effects. Immunosurveillance of tumors involves lymphocytes and requires an intact interferon γ (IFNγ)/IFNγR
pathway (8–10). To investigate the contribution of these
immune effectors in the efficacy of chemotherapy, we compared chemotherapy-induced tumor growth retardation in
immunocompetent mice and in mice bearing various immunodefects affecting B and/or T cells [Rag−/−, nu/nu, or wildtype (WT) mice treated with a depleting anti-CD8 mAb] or
the IFNγ/IFNγR system (Ifng−/−, IfngR−/−, or WT treated with
neutralizing anti-IFNγ antibodies). The depletion of CD8+
T cells or the removal of the IFNγ/IFNγR pathway reduced
the therapeutic effects of oxaliplatin against CT26 colon cancer, EL4 thymoma, and abolished the antitumor effects of
anthracyclines (doxorubicin or mitoxanthrone) against
CT26 cells or MCA-induced sarcomas. In contrast, other molecules such as IL-12Rβ2, perforin, and TRAIL were dispensable for the efficacy of these cancer chemotherapies in the same
tumor models. Chemotherapy promoted a tumor-specific T-cell
response that was detectable in the tumor-draining lymph
nodes (LN), 7 to 10 days after the systemic administration
of oxaliplatin. After ex vivo restimulation with tumor antigens, oxaliplatin-induced CD4 + T cells mainly produced
interleukin-2 (IL-2), whereas chemotherapy-induced CD8+
T cells produced high levels of IFNγ. These chemotherapyinduced T-cell responses apparently resulted from local cancer cell death because they were detectable in draining LN
(but not distant LN) and because dying (but not living) tumor
cells inoculated in the footpad could mimic these immune
effects (7).
In conclusion, tumor regression promoted by oxaliplatin or
anthracyclines elicits a tumor-specific IFNγ-polarized CD8+
T-cell immune response, which is critical for the efficacy of
chemotherapy.
Authors' Affiliations: 1 INSERM, U805; 2 Institut Gustave Roussy;
3 Université Paris-Sud, Villejuif, France; 4 AVENIR team INSERM CRI866; 5Centre Georges Francois Leclerc, Dijon, France; 6INSERM, U848,
Villejuif, France; and 7Cancer Immunology Program, Peter MacCallum
Cancer Centre, East Melbourne, Victoria, Australia
Note: G. Kroemer, M.J. Smyth, and L. Zitvogel share senior co-authorship.
Corresponding Author: Laurence Zitvogel, U805 and CIC BT507 INSERM, Institut Gustave Roussy, 39 rue Camille Desmoulins, F-94805
Villejuif, France. Phone: 33-1-42-11-50-41; Fax: 33-1-42-11-60-94;
E-mail: [email protected].
doi: 10.1158/0008-5472.CAN-09-3566
©2010 American Association for Cancer Research.
www.aacrjournals.org
855
Aymeric et al.
The inflammasome NLRP3 is mandatory for the efficacy
of chemotherapy. Inoculation of anthracycline or oxaliplatin-treated tumor cells in the footpad induced a potent
IFNγ-polarized CD8+ T-cell response relying on TLR4 signaling in DC (6). We investigated the possible contribution of
other receptors for DAMPs that could account for the priming of IFNγ-producing T cells during anticancer chemotherapy. In addition to TLR, NOD-like receptors (NLR) recognize
DAMPs and link inflammation to innate immunity (11, 12).
In macrophages, the so-called “inflammasome” serves as a
central sensor for DAMPs (13). The NLRP3 (CIAS1/CRYOPYRIN)-inflammasome is a multimeric protein complex that
activates the protease caspase-1, which mediates the processing and secretion of pro-inflammatory cytokines (IL-1β,
IL-18, IL-33). The NLRP3 inflammasome can be activated by
endogenous danger signals (DAMPs) or pathogen-associated
molecular patterns (PAMP), which all act in concert to induce
K+ efflux (14–17). Gain-of-function mutations in the human
NLRP3 gene cause autoinflammatory disease that can be
suppressed by the systemic administration of IL-1R antagonists (18, 19). To investigate the putative role of the NLRP3
inflammasome in anticancer chemotherapy, we compared
tumor growth kinetics of EL4 sarcomas treated with oxaliplatin in WT mice versus mice deficient in each component of
the inflammasome [NLRP3, its adaptor molecule apoptosisassociated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (ASC) or caspase-1] or its final product IL-1β.
Each individual player of this complex was required for the
success of chemotherapy. The key contribution of IL-1β in
the antitumor effects mediated by anthracyclines and/or oxaliplatin was also shown in CT26 colon cancer and more
importantly in spontaneous tumors induced by MCA (7).
To analyze the role of the NLRP3 inflammasome in the
antitumor immune response elicited by chemotherapy, we
inoculated live versus dying tumor cells exposed to chemotherapy ex vivo and determined the capacity of draining LN T
cells to produce IFNγ in response to tumor antigens. In these
circumstances, T cells from mice deficient in individual components of the inflammasome/IL-1β axis (NLRP3, Casp-1,
IL-1R1) failed to mount optimal IFNγ polarized CD8+ T-cell
responses. Moreover, caspase-1-deficiency resulted in deficient IFNγ production by tumor antigen-specific CD8+ T
cells, whereas normal mice mounted such T-cell responses
in the draining LN of established tumors treated by systemic
oxaliplatin injections (7). Hence, we showed that the NLRP3
inflammasome is critical for the immunogenicity of cell
death triggered by anthracyclines, oxaliplatin, or x-rays.
Key contribution of ATP and purinergic receptors.
Multiple distinct bacterial products or endogenous damage
signals (such as toxins, ATP, uric acid crystals, alum, silica)
stimulate the NLRP3 inflammasome resulting in the proteolytic auto-activation of caspase-1 (15, 20, 21). One of the most
pleiotropic activators of the NLRP3 inflammasome is extracellular ATP, which is released from stressed cells and acts on
purinergic receptors, mostly of the P2 × class (22). To our surprise, multiple distinct cell death inducers (cadmium, etoposide, mitomycin C, oxaliplatin, cis-platin, staurosporine,
thapsigargin, mitoxanthrone, doxorubicin) induced the re-
856
Cancer Res; 70(3) February 1, 2010
lease of ATP in vitro from dying tumor cells, by 8 to 20 hours
postexposure (7, 23). This ATP release became undetectable
when cells were incubated with the ATP-degrading enzyme
apyrase or with inhibitors of ATP synthesis such as antimycin
A plus deoxyglucose (A/D) or the oxidative phosphorylation
uncoupler 2,4-dinitrophenol (DNP). When oxaliplatin-treated
EG7 or anthracycline-treated CT26 cells were admixed with
ATP scavengers (A/D, apyrase, DNP) or nonselective P2× receptor antagonists (iso-pyridoxalphosphate-6-azophenyl2′,5′-disulphonate or oxidized ATP), they lost their capacity
to elicit protective antitumor immune responses upon subcutaneous inoculation into normal mice. ATP depletion or P2×
receptor blockade also abolished the capacity of oxaliplatintreated EG7 cells [which express the model antigen ovalbumin (OVA)] to prime OVA-specific cells for IFNγ production
(7). Altogether, we generalized the finding that dying tumor
cells release ATP, which is indispensable for their immunogenicity. In contrast, the immunizing capacity of candidate
antigen proteins admixed in TLR adjuvants is not blocked
by P2× receptor antagonists and hence is likewise independent of endogenous ATP.
Because the high affinity receptor for ATP is the purinergic
receptor P2RX7, we assessed the ability of p2rx7−/− mice to
mount a chemotherapy-induced IFNγ polarized CD8+ T-cell
response and to control the growth of established tumors
after chemotherapy. Importantly, oxaliplatin failed to control
tumor progression in p2rx7−/− mice, and, similarly, oxaliplatin-treated OVA expressing EG7 could not elicit OVA-specific
T-cell responses in LN harvested from p2rx7−/− mice. Next,
we showed that host DC were the cells harboring functional
P2RX7 receptors during chemotherapy. In transgenic mice
expressing the diphtheria toxin receptor on their DC (under
the control of the CD11c promoter), diphtheria toxin depletes
LN DC, and this maneuver readily abolishes the CD8+ T-cell
response elicited by dying EG7 cells. The adoptive transfer of
bone marrow-derived WT (but not in p2rx7−/−) DC loaded
with dying EG7 restored the OVA-specific CD8 + T-cell
response in p2rx7−/− mice. Accordingly, WT DC loaded with
oxaliplatin-treated EG7 cells in vitro produced IL-1β in a
NLRP3-, ASC-, and casp-1-dependent fashion, in conditions
in which IL-12p40 secretion was independent of the NLRP3
inflammasome. The PAMP lipopolysaccharide (a TLR4
ligand) and the DAMP ATP reportedly act in concert to ignite
the NLRP3 inflammasome in macrophages (17). Accordingly,
we found that the TLR4 ligand HMGB1 and ATP, which are
both released by tumor cells exposed to cytotoxic agents,
act in concert to promote IL-1β secretion by DC ex vivo.
The treatment of DC with oxidized ATP or anti-HMGB1neutralizing antibodies prior to loading with dying tumor
cells completely abolished IL-1β secretion (7).
The link between inflammation and cognate immunity.
As discussed above, ATP released by dying tumor cells engages P2RX7 receptors on DC, thereby triggering the NLRP3
inflammasome that culminates in IL-1β production and DCmediated IFNγ polarized CD8+ T-cell response. How then
could IL-1β contribute to the immunogenicity of cell death?
We hypothesized that IL-1β may control and/or switch
the quality of the priming of naive CD8+ T cells during the
Cancer Research
Immune Response against Dying Tumor Cells
treatment of a tumor by chemotherapy (7). We produced
three lines of evidence supporting this contention.
First, DC loaded with dying EG7 cells induced the polarization of naive OT-1 cells (which express a transgenic T-cell
receptor that recognizes an OVA-derived peptide, SIINFEKL)
into IFNγ producing lymphocytes in a caspase-1- and IL-1βdependent manner in vitro and in vivo. IL-1β receptor antagonist or neutralizing anti-IL-1β antibodies suppressed IFNγ
polarization in this in vitro priming system. Similarly, OT-1
cells were activated (CD69 expression) upon their adoptive
transfer into WT mice, but not into casp-1 −/− mice, following
immunization with dying EG7 cells. IL-1RA also prevented
the expansion of SIINFEKL/Kb tetramer-specific T cells
in LN draining the immunization with dying EG7. Second,
activation of naive CD3 + T lymphocytes by a cocktail of
anti-CD3/anti-CD28 mAb in the presence of IL-1β (but not
IL-6 or TNFα) resulted in a IFNγ polarizing effect that was
similar to the one described for IL-12 (7). Third, the failure of
p2rx7−/− and casp-1−/− mice to mount OVA-specific IFNγpolarized CD8+ T-cell response after immunization with
oxaliplatin-treated EG7 could be overcome by recombinant
IL-1β coinjected with the vaccine (7).
In conclusion, IL-1β contributes to the full differentiation
of IFNγ polarized CD8+ T cells during the priming of antitumor immune responses that are elicited as a byproduct
of anticancer chemotherapy.
Discussion
Our results identify tumor-derived ATP as a new DAMP,
which is required for cancer cell death to be immunogenic.
Our data are compatible with a scenario (Fig. 1) in which
ATP activates P2RX7 receptors on DC, thereby stimulating
the aggregation and/or activation of the NLRP3/ASC/Casp-1
inflammasome, the proteolytic maturation of caspase-1, proIL-1β cleavage, and consequent IL-1β release. IL-1β then is
required for the priming of IFNγ-producing tumor antigenspecific CD8+ T cells (7). In accord with previous studies
(24), IFNγ, rather than perforin or TRAIL-dependent cytotoxic activities, mediates the anticancer activity of T lymphocytes that have been primed in a P2RX7/NLRP3/ASC/Casp-1/
IL-1β-dependent fashion.
New links between inflammasomes and cognate immunity
are being progressively unraveled. Eisenbarth and colleagues
Figure 1. The integrity of the NLRP3 inflammasome is required for IFNγ polarized CD8+ T-cell response with dying tumor cells. During a hit with
chemotherapy, dying tumor cells are captured and processed by host DC triggering a tumor-DC crosstalk dictated by ATP/P2RX7 and HMGB1/TLR4
molecular interactions. ATP and HMGB1 act in concert to ignite the NLRP3 inflammasome in DC, culminating in IL-1β processing and secretion in the
extracellular milieu. IL-1β then contributes to the TCR-driven IFNγ polarized CD8+ T-cell response, a mandatory step for the efficacy of chemotherapy.
www.aacrjournals.org
Cancer Res; 70(3) February 1, 2010
857
Aymeric et al.
(25) showed that the NLRP3 inflammasome pathway stimulated by aluminum-based adjuvant (alum) directs a humoral
adaptive immune response. Mice deficient in Nlrp3, ASC, or
caspase-1 failed to mount an antibody response to antigen
administered with alum, yet generated normal responses
against antigens emulsified with complete Freund's adjuvant.
The Nlrp3 inflammasome was required for the production of
IL-1β and IL-18 by macrophages in response to alum (25). It
is noteworthy that in response to dying tumor cells, IL-18
was not produced by P2RX7/NLRP3-activated DC and
IL-18R was not required for the immunogenicity of cell death
in vivo (7). During lung infection with influenza A virus, ASC
and caspase-1 (but not NLRP3) were required for CD4+ and
CD8+ protective T-cell immunity, mucosal IgA production,
and systemic IgG antibody responses (26), suggesting that
each immune response relies on a specific mode of inflammasome activation and perhaps a specific pattern of inflammasome-dependent cytokines.
Importantly, we showed that a loss-of-function allele of
P2RX7 that reduces the affinity of P2RX7 receptor for ATP
compromises the efficacy of anthracycline-based chemotherapy in breast cancer patients, implying that the pathway
we elucidated has clinical relevance and will presumably be
clinically implemented for a better management of “personalized chemotherapy.”
Disclosure of Potential Conflicts of Interest
No potential conflicts of interest were disclosed.
Grant Support
G. Kroemer and L. Zitvogel are supported by grants from the Ligue
Nationale contre le Cancer (équipes labellisées), Fondation pour la Recherche
Médicale, European Union, Cancéropôle Ile-de-France, Institut National du
Cancer, Association for International Cancer Research, and Agence Nationale
pour la Recherche. M.J. Smyth is supported by the National Health and Medical
Research Council of Australia and the Victorian Cancer Agency. A. Tesniere is
supported by INSERM (poste d'accueil).
Received 10/16/09; accepted 10/18/09; published OnlineFirst 1/19/10.
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