détermination du génotype rhd fœtal

5
1
0
2
C Digitale
LaB
PCR
R
E
A
I
L
E
T
Dr Juliette Nectoux
Service de Génétique
GHU Paris Centre
Hôpital Cochin
F
S
Applications au Diagnostic
Prénatal Non Invasif
14 octobre 2015
DIAGNOSTIC PRÉNATAL INVASIF
5
1
CONTEXTE
•
•
•
Antécédents familiaux de maladie génétique
Dépistage combiné trisomie 21 à risque
Signe(s) d’appel échographique(s)
INCONVÉNIENTS
•
•
•
I
L
E
T
R
E
Terme
Fausses-couche
Prématurité, Hémorragie, Infection…
A
 0,5 à 1% de risque de perte fœtale
C
B
F
S
Amniocentèse
(15 SA)
0
2
Biopsie de
Trophoblaste
(11 SA)
DIAGNOSTIC PRÉNATAL NON INVASIF
5
1
SOURCES DE MATÉRIEL FŒTAL
•
•
R
E
ADN FŒTAL LIBRE
•
•
•
•
C
B
F
S
Cellules Fœtales dans la Circulation Maternelle
Acides Nucléiques Fœtaux dans la Circulation Maternelle
- ARN fœtal libre
- ADN fœtal libre
I
L
E
T
Origine trophoblastique
Détectable dès 5 SA
[ADNfl] augmente au cours de la grossesse
Disparait de la circulation maternelle 30 min après
l’accouchement
A
Lo et al, Lancet, 1997
0
2
DÉFIS TECHNIQUES
DÉTECTION DE L’ADNF


Faible quantité absolue d’ADN plasmatique
Faible proportion d’ADNf
R
E
A
I
L
E
T
C
B
F
S
0
2
5
1
DÉFIS TECHNIQUES
DÉTECTION DE L’ADNF


Faible quantité absolue d’ADN plasmatique
Faible proportion d’ADNf
DÉLAI DE PRISE EN CHARGE DES PRÉLÈVEMENTS

Influence sur la proportion d’ADNf
R
E
A
I
L
E
T
C
B
F
S
0
2
5
1
DÉFIS TECHNIQUES
DÉTECTION DE L’ADNF


Faible quantité absolue d’ADN plasmatique
Faible proportion d’ADNf
DÉLAI DE PRISE EN CHARGE DES PRÉLÈVEMENTS

Influence sur la proportion d’ADNf
R
E
TAILLE DES FRAGMENTS D’ADN PLASMATIQUE

I
L
E
T
ADN plasmatique fragmenté
A
C
B
F
S
5
1
0
2
ADN plasmatique total
ADN plasmatique d’origine fœtale
DÉFIS TECHNIQUES
DÉTECTION DE L’ADNF


Faible quantité absolue d’ADN plasmatique
Faible proportion d’ADNf
DÉLAI DE PRISE EN CHARGE DES PRÉLÈVEMENTS

Influence sur la proportion d’ADNf
R
E
TAILLE DES FRAGMENTS D’ADN PLASMATIQUE

I
L
E
T
ADN plasmatique fragmenté
C
B
F
S
PRÉSENCE ET QUANTIFICATION DE L’ADNF

A
Amplification de marqueurs fœtaux
Marqueurs génétiques : microsatellites, SNP
Marqueurs épigénétiques : RASSF1A
0
2
5
1
SOLUTIONS TECHNOLOGIQUES
SÉQUENÇAGE NOUVELLE GÉNÉRATION
NGS
R
E
A
I
L
E
T
PCR DIGITALE
ddPCR
C
B
F
S
0
2
5
1
APPLICATIONS (3)
5
1
0
2
LES SÉQUENCES ABSENTES DU GÉNOME MATERNEL
• Détermination du Sexe Fœtal
• Détermination du Rhésus Fœtal
LES SÉQUENCES DIFFÉRENTES DU GÉNOME MATERNEL
C
B
F
S
• Détection « qualitative » des maladies monogéniques
- lorsqu’elles sont de novo
- lorsqu’elles sont héritées du père
R
E
I
L
E
T
LES SÉQUENCES IDENTIQUES À CELLES DU GÉNOME MATERNEL
• Détection « quantitative » de toute mutation ou anomalie génétique
• Chromosomique ou génique
• D’origine paternelle ou maternelle
A
*
*
*
*
*
*
ALLO IMMUNISATION FŒTO-MATERNELLE
5
1
DÉFINITION
•
Production d’anticorps maternels dirigés
contre les éléments figurés du sang fœtal
 Anémies fœtales et néonatales sévères
•
Système RH à l’origine de la majorité des
allo-immunisations fœto-maternelles
R
E
 Production d’anticorps anti-RH1 (RHD)
I
L
E
T
PRÉVENTION
•
Rhophylac ®: Immunoglobulines anti-RH1
(D) extraites de plasmas de donneurs RH:1 hyperimmunisés
A
C
B
F
S
0
2
DÉTERMINATION DU GÉNOTYPE RHD FŒTAL
A TITRE PROPHYLACTIQUE

Chez les femmes RH:-1 non immunisées
 Détermination des modalités de prise en charge des grossesses
 Limitation du recours aux immunoglobulines anti-D
A TITRE THÉRAPEUTIQUE

C
B
F
S
5
1
0
2
Chez les femmes RH:-1 déjà immunisées
 Détermination des grossesses qui doivent bénéficier d’une prise en charge spécifique
spécialisée
R
E
I
L
E
T
D É T E R M I N AT I O N D U G É N O T Y P E R H D F Œ TA L PA R P R É L È V E M E N T I N V A S I F
 Risque de fausse couche/ accouchement prématuré
 Favorisant les hémorragies fœto-maternelles  Provocation ou aggravation d’une
immunisation maternelle

A
Avantages du diagnostic prénatal non invasif pour la détermination du génotype RHD fœtal
LE SYSTÈME RH
Rh
box
Ex 5
 Le gène RHD code l’antigène RH1 (D)
0
2
RHCE
RHD
Rh
Ex 10
box SMP1
R
E
C
B
F
S
5
1
D+
 Le gène RHCE code les antigènes RH 2 (C), RH 3 (E), RH 4 (c) et RH 5 (e)
I
L
E
T
 RHD et RHCE : 95% d’homologie et orientation « tête bêche »
 Réarrangements géniques entre RHD et RHCE : apparition de gène hybrides, codant pour des
protéines appelées « variants RH »
A
 Modification de l’expression antigénique
LE PHÉNOTYPE RH:-1
 Phénotype RH:-1 = absence de RH1 à la surface de l'érythrocyte
 Fréquence variant en fonction de l’origine ethnique
- origine caucasienne : 15%
- origine africaine : 3 à 5 %
- origine asiatique <0,1 %
 Mécanismes moléculaires aboutissant à un
phénotype RH:-1
R
E
 délétion complète du gène RHD
I
L
E
T
C
B
F
S
RHD délété
 gène présent, mais ne codant pas
l'antigène RH1
 mutations ou insertions géniques
A
RHDΨ
 constitution d'un gène hybride obtenu
par échange d'exons entre les gènes
RHD-CE-DS
RHD et RHCE
0
2
5
1
DÉTERMINATION DU GÉNOTYPE RHD
5
1
R
E
C
B
F
S
I
L
E
T
A
Essai Taqman ex 5
amplification spécifique RHD
Orhant et al, Ann Biol Clin, accepté
Essai Taqman ex 10
amplification RHD et variants
0
2
RHD « sauvage »
RHD délété
RHDΨ
RHD-CE-DS
DÉTERMINATION DU GÉNOTYPE RHD
MISE AU POINT DES ESSAIS TAQMAN RHD-EXON 5/EXON 10 SUR UN ADN RH:1 (D+)

Gradients de température
65°C RH5 (Fam)
C
B
F
S
55°C
R
E
0
2
65°C RH10 (Vic)
I
L
E
T
A
Orhant et al, Ann Biol Clin, accepté
57°C
5
1
57°C
55°C
DÉTERMINATION DU GÉNOTYPE RHD
MISE AU POINT DES ESSAIS TAQMAN RHD-EXON 5/EXON 10 SUR UN ADN RH:1 (D+)
Amplitude 1D

Sonde RH10
(Hex)
Sonde RH5
(Fam)

R
E
I
L
E
T
A
Orhant et al, Ann Biol Clin, accepté
Amplitude 2D
C
B
F
S
0
2
5
1
DÉTERMINATION DU GÉNOTYPE RHD
0
2
DÉTECTION QUALITATIVE DES SÉQUENCES RHD DANS LE PLASMA DE PATIENTE ENCEINTE RH:-1 (D-)
Amplitude 1D

Sonde RH10
(Hex)
Sonde RH5
(Fam)

R
E
A
I
L
E
T
Fœtus
RH:1
Orhant et al, Ann Biol Clin, accepté
Amplitude 2D
C
B
F
S
5
1
DÉTECTION QUALITATIVE
DE L’ADN FŒTAL PLASMATIQUE
MISE AU POINT D’UN ESSAI RASSF1A MÉTHYLATION-DÉPENDANT *
R
E
I
L
E
T
A
* Adapté de Chan et al, 2006
C
B
F
S
0
2
5
1
DÉTECTION QUALITATIVE
DE L’ADN FŒTAL PLASMATIQUE
MISE AU POINT D’UN ESSAI RASSF1A MÉTHYLATION DÉPENDANT
Pré-digestion

Sonde ACTINE B
(Hex)
Sonde RASSF1A
(Fam)

R
E
I
L
E
T
A
Orhant et al, Ann Biol Clin, accepté
0
2
Post digestion BstUI
C
B
F
S
ADN
Maternel
+ fœtal
5
1
ADN
fœtal
DÉTERMINATION PRÉNATALE DU GÉNOTYPE
RHD FŒTAL À PARTIR DE SANG MATERNEL
5
1
ALGORITHME DÉCISIONNEL
R
E
I
L
E
T
A
Orhant et al, Ann Biol Clin, accepté
C
B
F
S
0
2
DÉTERMINATION PRÉNATALE DU GÉNOTYPE
RHD FŒTAL À PARTIR DE SANG MATERNEL
5
1
EXPÉRIENCE COCHINOISE SUR UNE SÉRIE DE 21 CAS
Analyse Génotype RHD Fœtal
Cas
RHD
Exon 5
RHD
Exon 10
RHD
Exon 4
Analyse Génotype RHD Maternel
RHD
Exon 7
RHD
Exon 5
RHD
Exon 10
RHD
Exon 4
RHD
Exon 7
1
-
-
-
-
nd
nd
nd
nd
2
+
+
nd
nd
nd
nd
nd
nd
3
+
+
nd
nd
nd
nd
nd
nd
4
+
+
nd
nd
nd
nd
nd
nd
Détermination
Sexe Fœtal
Présence d'ADN
Fœtal
ZFY
RASSF1A
post-digestion
0
2
Conclusion Statut RHD
Fœtal à partir de Sang
Maternel
C
B
F
S
Confirmation du
Injection de
Génotype RHD Fœtal à Rhophylac®
partir d'ADN Fœtal
Recommandée
-
+
Génotype Fœtal RH: -1
Non
-
nd
Génotype Fœtal RH:1
Oui
+
nd
Génotype Fœtal RH:1
Oui
+
nd
Génotype Fœtal RH:1
Oui
+
nd
Génotype Fœtal RH: -1
Non
+
nd
Génotype Fœtal RH:1
Oui
5
-
-
-
-
nd
nd
nd
nd
6
+
+
nd
nd
nd
nd
nd
nd
7
+
+
nd
nd
nd
nd
nd
nd
+
nd
Génotype Fœtal RH:1
8
-
-
-
-
nd
nd
nd
nd
-
+
Génotype Fœtal RH:-1
9
+
+
nd
nd
nd
nd
nd
nd
-
nd
Génotype Fœtal RH:1
Oui
10
-
-
-
-
nd
nd
nd
nd
-
+
Génotype Fœtal RH: -1
Non
11
-
-
-
-
nd
nd
nd
nd
-
+
Génotype Fœtal RH: -1
12
+
+
nd
nd
nd
nd
nd
nd
+
nd
Génotype Fœtal RH:1
Génotype Fœtal RH:1
Oui
13
-
-
-
-
nd
nd
nd
nd
+
nd
Génotype Fœtal RH: -1
Génotype Fœtal RH: -1
Non
Génotype Fœtal RH: -1
Non
14
-
-
15
+
+
16
+
17
+
18
+
19
-
A
-
20
-
21
-
I
L
E
T
R
E
Génotype Fœtal RH:1
Oui
Non
Génotype Fœtal RH: -1
Non
-
-
nd
nd
nd
nd
-
+
Génotype Fœtal RH: -1
nd
nd
nd
nd
nd
nd
-
nd
Génotype Fœtal RH:1
nd
nd
nd
nd
nd
nd
+
nd
Génotype Fœtal RH:1
nd
nd
nd
nd
nd
nd
-
nd
Génotype Fœtal RH:1
Génotype Fœtal RH:1
+
+
+
+
+
+
nd
nd
nd
Génotype Fœtal RH:1
-
-
nd
nd
nd
nd
+
nd
Génotype Fœtal RH: -1
Non
-
-
-
nd
nd
nd
nd
-
+
Génotype Fœtal RH: -1
Non
-
-
-
nd
nd
nd
nd
+
nd
Génotype Fœtal RH:-1
Non
+
+
+
Orhant et al, Ann Biol Clin, accepté
Oui
Oui
Oui
Oui
5
1
R
E
I
L
E
T
A
http://www.has-sante.fr
C
B
F
S
0
2
APPLICATIONS (2)
5
1
0
2
LES SÉQUENCES ABSENTES DU GÉNOME MATERNEL
• Détermination du Sexe Fœtal
• Détermination du Rhésus Fœtal
LES SÉQUENCES DIFFÉRENTES DU GÉNOME MATERNEL
C
B
F
S
• Détection « qualitative » des maladies monogéniques
- lorsqu’elles sont de novo
- lorsqu’elles sont héritées du père
R
E
I
L
E
T
LES SÉQUENCES IDENTIQUES À CELLES DU GÉNOME MATERNEL
• Détection « quantitative » de toute mutation ou anomalie génétique
• Chromosomique ou génique
• D’origine paternelle ou maternelle
A
*
*
*
*
*
*
DÉTECTION QUALITATIVE DES MUTATIONS DE NOVO
ACHONDROPLASIE
•
Chondrodysplasie non létale la plus fréquente.
- Prévalence : 1 cas sur 66000 naissances
- Mutation de novo FGFR3 c.1138G>A dans 98% des cas
•
Signes échographiques:
- Nanisme d’apparition tardive avec cassure de la
courbe de croissance fémorale après 26 SA
- Fémurs courbes avec extrémités effilées en biseau
- Anomalies possibles des mains (aspect en trident)
- Macrocéphalie, ensellure nasale marquée en coup de
hache
R
E
•
I
L
E
T
C
B
F
S
Mise au point d’un essai de PCRd spécifique de la mutation
c.1138G>A du gène FGFR3
A
0
2
5
1
DÉTECTION QUALITATIVE DES MUTATIONS DE NOVO
ACHONDROPLASIE
5
1
0
2
MISE AU POINT D’UN ESSAI TAQMAN FGFR3 SPÉCIFIQUE DE LA MUTATION C.1138G>A SUR UN ADN HÉTÉROZYGOTE

Gradients de température
65°C FGFR3 G>A
C
B
F
S
55°C
R
E
65°C FGFR3 WT
55°C
I
L
E
T
A
Orhant et al, Prenat Diag, en révision
55°C
55°C
DÉTECTION QUALITATIVE DES MUTATIONS DE NOVO
ACHONDROPLASIE
LIMITES DE DÉTECTION / SENSIBILITÉ

Amplitude 1D
50% 25% 12% 6%
3% 1.5% 0.8% 0.4% 0%
R
E
FGFR3 G>A
C
B
F
S

% théorique allèle mutant
FGFR3 WT
0
2
Gammes de dilution de l’allèle mutant dans de l’allèle WT majoritaire
I
L
E
T
Amplitude 2D
FGFR3 G>A

A
Orhant et al, Prenat Diag, en révision
5
1
FGFR3 WT
DÉTECTION QUALITATIVE DES MUTATIONS DE NOVO
ACHONDROPLASIE
LIMITES DE DÉTECTION / SENSIBILITÉ

Amplitude 1D
% théorique allèle mutant
50% 25% 12% 6%
3% 1.5% 0.8% 0.4% 0%
R
E
FGFR3 G>A
FGFR3 WT
0
2
Gammes de dilution de l’allèle mutant dans de l’allèle WT majoritaire
I
L
E
T
A
C
B
F
S
% observé allèle mutant

5
1
% théorique allèle mutant
Orhant et al, Prenat Diag, en révision
DÉTECTION QUALITATIVE DES MUTATIONS DE NOVO
ACHONDROPLASIE
5
1
R
E
Event number
Orhant et al, Prenat Diag, en révision
0
2
FGFR3 WT
Post-digested BstUI
RASSF1A
Pre-digested
B ACTIN
RASSF1A
I
L
E
T
A
C
B
F
S
FGFR3 G>A
FGFR3 WT FGFR3 G>A
DÉTECTION QUALITATIVE DE LA MUTATION FGFR3 C.1138G>A DANS LE PLASMA DE PATIENTE ENCEINTE
Event number
B ACTIN
DÉTECTION QUALITATIVE DES MUTATIONS DE NOVO
ACHONDROPLASIE
5
1
ALGORITHME DÉCISIONNEL
R
E
I
L
E
T
A
Orhant et al, Prenat Diag, en révision
C
B
F
S
0
2
DIAGNOSTIC PRÉNATAL NON INVASIF DE
L’ACHONDROPLASIE
EXPÉRIENCE COCHINOISE SUR UNE SÉRIE DE 26 CAS
Fetal FGFR3 Genotyping by ddPCR
Case
Indication of FGFR3 prenatal
screening
Pregnancy Term
(weeks of gestation)
FGFR3
Mutant A allele
(droplets Fam+)
FGFR3
WT G allele
(droplets Hex+)
Fetal DNA %
RASSF1A / B-ACTIN
0
2
Fetal FGFR3 Genotyping by
Minisequencing
C
B
F
S
Observed %
Total droplets Mutant A
allele
FGFR3
mutant A allele
5
1
FGFR3
WT G allele
Fetal FGFR3 Status
from non invasive
plasmatic sample
Fetal FGFR3 Status
from invasive sample
Not affected
1
Abnormal ultrasound findings
24+3
0
603
25396
0%
9%
-
+
Not affected
2
Abnormal ultrasound findings
33+6
102
1049
24024
9%
8%
+
+
Affected
Affected
3
Abnormal ultrasound findings
33
0
1412
24072
0%
11%
-
+
Not affected
Not affected
4
Abnormal ultrasound findings
34
41
1144
26696
3%
7%
+
+
Affected
Affected
5
Abnormal ultrasound findings
30
0
983
26227
0%
10%
-
+
Not affected
Not affected
6
Abnormal ultrasound findings
18
1
1006
26037
0%
8%
-
+
Not affected
Not affected
7
Abnormal ultrasound findings
23
0
763
29374
0%
9%
-
+
Not affected
Not affected
Not affected
8
Abnormal ultrasound findings
29
0
9
Abnormal ultrasound findings
30
78
10
Abnormal ultrasound findings
30
0
11
Abnormal ultrasound findings
12
Abnormal ultrasound findings
13
Abnormal ultrasound findings
14
Abnormal ultrasound findings
15
Abnormal ultrasound findings
16
Abnormal ultrasound findings
17
Abnormal ultrasound findings
18
Abnormal ultrasound findings
19
Abnormal ultrasound findings
R
E
A
I
L
E
T
33
0
26
0
34+3
0
34+2
2
32+4
0
33+5
0
1090
29816
0%
12%
-
+
Not affected
1034
26201
7%
7%
+
+
Affected
Affected
659
24762
0%
11%
-
+
Not affected
Not affected
1038
25599
0%
11%
-
+
Not affected
Not affected
557
25088
0%
6%
-
+
Not affected
Not affected
1320
25808
0%
12%
-
+
Not affected
Not affected
1644
25872
0%
11%
-
+
Not affected
Not affected
1024
26193
0%
9%
-
+
Not affected
Not affected
1437
25180
0%
15%
-
+
Not affected
Not affected
Not affected
32
0
902
26754
0%
10%
-
+
Not affected
32+6
0
694
28354
0%
8%
-
+
Not affected
Not affected
30
0
533
22842
0%
8%
-
+
Not affected
Not affected
20
Abnormal ultrasound findings
21
Abnormal ultrasound findings
27
0
518
28889
0%
10%
-
+
Not affected
Not affected
32+3
0
1069
28748
0%
8%
-
+
Not affected
Not affected
22
Family history (Positive Control)
23
Abnormal ultrasound findings
22
366
5107
27598
7%
7%
+
+
Affected
Affected
34+4
65
737
28325
8%
11%
+
+
Affected
24
Abnormal ultrasound findings
12+4
Affected
0
839
24872
0%
6%
-
+
Not affected
Not affected
25
Abnormal ultrasound findings
32
0
1018
26708
0%
12%
-
+
Not affected
Not affected
26
Abnormal ultrasound findings
30+2
0
2002
25862
0%
9%
-
+
Not affected
Not affected
Orhant et al, Prenat Diag, en révision
APPLICATIONS (3)
5
1
0
2
LES SÉQUENCES ABSENTES DU GÉNOME MATERNEL
• Détermination du Sexe Fœtal
• Détermination du Rhésus Fœtal
LES SÉQUENCES DIFFÉRENTES DU GÉNOME MATERNEL
C
B
F
S
• Détection « qualitative » des maladies monogéniques
- lorsqu’elles sont de novo
- lorsqu’elles sont héritées du père
R
E
I
L
E
T
LES SÉQUENCES IDENTIQUES À CELLES DU GÉNOME MATERNEL
• Détection « quantitative » de toute mutation ou anomalie génétique
• Chromosomique ou génique
• D’origine paternelle ou maternelle
A
*
*
*
*
*
*
DÉTECTION QUANTITATIVE
DES MUTATIONS TRANSMISES PAR LA MÈRE
5
1
DOSAGE RELATIF DE MUTATION
• Détermination du Ratio Allélique
N/m
R
E
N/N
A
I
L
E
T
~10%
C
B
F
S
0
2
N/m
N/m
~ 10%
m/m
~ 10%
DÉTECTION QUANTITATIVE
DES MUTATIONS TRANSMISES PAR LA MÈRE
5
1
DOSAGE RELATIF DE MUTATION
•
Détermination du Ratio Allélique
•
Détermination du % ADNf
m/N
R
E
A
I
L
E
T
C
B
F
S
0
2
REMERCIEMENTS
Lucie Orhant
Caroline Beugnet
Nathalie Deburgrave
Gilles Tafuri
Aurélie Vasson
Vassilis Tsatsaris
François Goffinet
Olivia Anselem
Camille Rampon
Françoise Lerhun
Thierry Bienvenu
Emmanuelle Girodon
Dominique Vidaud
Catherine Costa
France Leturcq
Géraldine Viot
I
L
E
T
A
Michel Vidaud
Marc Delpech
R
E
C
B
F
S
Franck Letourneur
Juliana Pipoli
Laila El Khattabi
Jean Michel Dupont
…Et tous les collègues avec qui nous collaborons!
5
1
0
2
Martial Saumier
Eddy Van Collenburg
Annette Tumolo
Keith Hamby
Niels Klitgord