Dosage radioimmunologique des - Archimer

Bases biologiques de l'aquaculture. Montpellier. 1983
IFREMER. Actes de Colloques n. 1, pages 295 à308
DOSAGE RADIOIMMUNOLOGIQUE DES GONADOTROPINES DE POISSONS
B. BRETON, E. SAMBRONI, Y. ZOHAR
Lab. Physiologie des poissons-INRA-Av. Gxl Leclevc- 35042 RENNES Cedex
RESUME
La spécificité immunologique des gonadotropines de Poissons n'autorise généra-
lement pas l'utilisation des systèmes de dosage radioimmunologique (RIA) homologues
existant pour les GtH Carpe et Saumon, à la mesure concentrations de GtH hypophysai-
re et plasmatique d'autres espèces. L'emploi d'un système de dosage utilisant un an-
ticorps dirigé contre la sous-unité 8 de GtH de Carpe a cependant récemment permis
le développement d'une méthode de dosage de la GtH d'Anguille (Dufour et al., 1983).
Nous avons repris un travail similaire à partir de la sous-unité 8 de la GtH glyco-
protéique maturante de Saumon, mais également étudié la possibilité d'employer des
systèmes sous-unitaires mixtes Carpe - Saumon au dosage de la GtH dans des espèces
où elle n'est pas encore purifiée. Dans ce but des sous-unités a et 8 ont été puri-
fiées à partir de GtH de Carpe et Saumon, et été utilisées pour la préparation des
anticorps correspondants. L'analyse en liaison directe en compétition des compor-
tements des différents antigènes iodés et des 6 anticorps confirme la spécificité
zoologique importante des sous-unités de type a. Par contre les systèmes mettant en
jeu un composant de type 8 homologue ou hétérologue reconnaissant aussi bien les
gonadotropines de Carpe et de Saumon et leurs sous-unités 8. Les différentes liaisons
anti (s.GtH - 8 s.GtH - c.GtH - 8 c.GtH) hormones iodées (s.GtH - 6 s.GtH - c.GtH -
8 c.GtH) ont été étudiées par rapport à leur déplacement par des extraits hypophy-
saires totaux ou des GtH partiellement purifiées de Brochets - Perche - Daurade -
Tilapia - Anguille - Milkfish. 11 a toujours été possible de trouver une ou plusiairs
combinaisons antigène anticorps paraissant spécifiquement déplacées par chacune de
ces préparations hypophysaires. La validation du dosage a été réalisée pour la GtH
de Daurade pour laquelle il existe une bonne correspondance entre les activités des
fractions obtenues après gel filtration des glycoprotéines hypophysaires totales,
mesurées par RIA, et par un dosage biologique basé sur la stimulation de la produc-
tion in vitro de 17cc-hydroxy-208-dihydroprogestérone par des follicules ovariens
de Truite arc-en-ciel en présence d'un inhibiteur de la phosphodiesterase l'lBMX.
Pour la Perche, bien que la réaction croisée ne soit que partielle, une mesure re-
lative des niveaux de GtH apparaît possible. Une stimulation in vivo des niveaux
plasmatiques hormonaux théoriques par du LH-RH et du LH-RHa confirme la nature gp-
nadotrope du principe mesuré dans un système anti 8 s.GtH - c.GtH I'*--*.
ABSTRACT
The species specificity of fish gonadotropins generally does not allow the
use of Carp and Salmonid homologous RIA systems for GtH measurement in other spe-
cies. Recently, Dufour et al., (1983) have demonstrated the lack of specificity
of a system directed against the 8 subunit of the Carp GtH, we have developped a
similar system for the 8 subunit of the Salmon GtH, ana equally studied the
possibility offered by heterologous subunits system between Carp and Salmon to
measure the GtH in several other species. Antibody against a and 3 s.GtH from
those two species have been developped. The species specificity of the two i
subunits has been confirmed after studying the direct bindings and competitions
between the 6 iodinated antigens and the corresponding antibodies, but on the
contrary the systems in which a homologous or heterologous 3 component is included
recognized as well c and s.GtH and their 8 subunits. Using the different combina-
tions between anti s.GtH - 8 s.GtH - c.GtH - B c.GtH and the codinated s.GtH -
8 s.GtH - c.GtH - 8 c.GtH, it has always been possible to find one or several
which is specifically competed by partially purified pike and sparus GtH and pitui-
tary extracts from perch - tilapia - eel milkfish. The validation of the assay
has been done for sparus GtH after comparison with a bioassay developped for this
gonadotropin,
MOTS CLES:Gonadotropine - Immunoessais KEY WORDS:G0nadotropin - immunoassays
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INTRODUCTION
L'étude écophysiologique des mécanismes de régulation de la fonction de
reproduction des Poissons nécessite^entre autres outils méthodologiques, de dis-
poser d'hormones gonadotropes purifiées (GtH) et de leur dosage radioimmunologi-
que. Bien que ces outils aient été développés pour deux grandes familles, les
Cyprinidés (Breton et al .. 1971), et les Salmonidés (Crim et al., 1973; Breton et
al., 1975), ils ne peuvent généralement pas être utilisés pour d'autres espèces
à cause d'une spécificité zoologique qui intéresse aussi bien les propriétés im-
munologiques des GtH (Breton et al., 1972; Tan et Dodd 1978; Bye et al., 1980)
que leurs activités biologiques (Breton et al., 1972; Fontaine et al., 1972).
Dans les espèces marines éventuellement candidates à l'aquaculture intensive
(Bar, Daurade, poissons plats...) seule la GtH d'un poisson plat, la plie améri-
caine^ été isolée (Ng et Idler, 1978). Or la reproduction régulière de ces es-
pèces élevées en captivité pose encore de nombreux problèmes (contrôle de la
saison de ponte, déclenchement des mécanismes de maturation et d'ovulation au
moment opportun, mécanisme de reversion sexuelle chez la Daurade par exemple...).
L'étude de la dissociation des GtH de Carpe (Burzawa-Gérard, 1974) et de Saumon
(Breton, 1981) a permis de montrer que>contrairement aux gonadotropines natives,
leurs sous-unités de type 6 présentaient une spécificité immunologique relative-
ment faible (Burzawa-Gérard et Kerdelhue, 1978 ; Dufour et al., 1979; Burzawa-
Gérard et al., 1980). A partir de ces données, ces auteurs ont développé un
dosage radioimmunologique hétérologue de la GtH de l'Anguille européenne Anguilla
anguilla en utilisant un dosage radioimmunologique de la sous-unité 3 de
la GtH de Carpe (Dufour et al., 1983). Dans le travail présent nous avons étudié
les possibilités offertes par l'utilisation d'un système équivalent, préparé à
partir de la GtH de Saumon, mais par des systèmes mixtes Carpe - Saumon pour la
détection de la GtH dans des préparations hypophysaires d'origine zoologique très
diverses dont la Daurade, pour laquelle les premiers stades de purification
de la GtH ont également été définis, l'obtention de l'hormone purifiée étant un
préalable à toute étude de l'action biologique spécifique d'une gonadotropine
dans une espèce donnée.
MATERIEL ET METHODES
1 . - Pré£a^ation_des_CtH ^Ê_Carpe_et_de_Saumon et_de_leurs_sous-unités
Ces hormones ont été préparées par les techniques décrites précédemment pour
la s-GtH (Breton et al., 1978) et ses unités (Breton, 1981). Elles ont servi à
la préparation d'anticorps sur lapin. L'immunisation a été pratiquée par injec-
tion Intradermique multipoints de 100 ug de chaque préparation émulsionnée dans
de l'adjuvent de Freund complet. Chaque lapin a reçu 5 Injections espacées de
15 jours. Le sacrifice de l'animal a lieu 8 jours après la dernière injection.
Deux anticorps ont été préparés contre la s-GtH - 2 contre l'a-s-GtH - 4 contre
la B-s-GtH - 2 contre la c-GtH - 2 contre l'a-c-GtH et 3 contre la 6-c-GtH.
2. - TechnÎ2ues_radioimmunologi^ues
La technique utilisée est identique à celle décrite précédemment pour la
GtH de Carpe (Breton et al.-1971). Les marquages des 2 GtH et de leurs sous-
unités sont réalisés à l'i après oxydation par la Chbramine T, la purification
des traceurs marqués est faite sur colonne d'ultrogel ACA 54 (0,9 x 30 cm). Les
divers anticorps ont été titrés par étude de leur liaison aux antigènes radio-
iodés correspondant. Seul 1'anticorps présentant le plus haut titre de travail
a été retenu pour la poursuite du travail (50% de la liaison maximum).
1/2 10~5
10-5
lu"5
1/3 10"5
anti
ant I
anti
anti
s-GtH
3s-GtH
as-GtH
c-GtH
296

anti Bc-GtH 10
anti ctc-GtH 1/4 10'
Etude en liaison directe : La liaison de chacun des 6 antigènes radioiodés aux 6
types dfanticorps a été étudiée après une incubation de 24 heures à 4°C en tampon
veronal 0.025 M pH 8.6 contenant 10%o de BSA. Le complexe antigène - anticorps
est séparé par immunoprécipitation à l'aide d'un sérum de mouton anti y globuli-
nés de lapin préparé au laboratoire. Après incubation d'une nuit à 4°C, le pré-
cipité formé est séparé par centrifugation (1500 g) pendant 30 minutes. Le sur-
nageant est éliminé par retournement des tubes et les précipités comptés dans un
compteur autogamma 5110 PACKARD.
Etude en compétition : Le déplacement de la liaison à l'équilibre de chaque an-
ticorps aux 6 antigènes radioiodés a été étudié pour les 6 anticorps différents
par les 6 antigènes eux-mêmes et par des extraits hypophysaires d'Anguille euro-
péenne Anguilla anguilla, de Tilapia Sarothérodon mossambica, de Daurade Sparus
auratus, de Milkfish Chanos chanos, et de Brochet Esox lucius, espèces présen-
tant toutes un intérêt aquacole important. La compétition par des GtH partielle-
ment purifiées de Brochet et Daurade a aussi été étudiée. Après incubation de 4
jours à 4°C le complexe hormone anticorps est séparé par la même technique que
précédemment. Pour chaque facteur les caractéristiques de la courbe de compéti-
tion sont déterminées après transformation logit - log des résultats. Dans cha-
que système anticorps-antigène iodé, les pentes des courbes d'inhibition pro-
duites par chaque préparation hypophysaire ont été comparées à celle obtenue en
présence de l'antigène froid correspondant par analyse de covariance selon
Snedecor et Cochran (1957).
3. - 5£égarations_h^goDh^saires
Les extraits hypophysaires bruts ont été préparés par broyage des hypophyses
desséchées à l'acétone dans un homogénéiseur verre teflon. Les broyats ont été
centrifugés 20 minutes à 2500 g, à 4°C. La concentration protéique des surna-
geants est déterminée par colorimétrie à l'aide du réactif de folin ciocalteu
(Lowry et al., 1951). Les contenus en GtH des hypophyses sont exprimés en ng/mg
de protéines hypophysaires. Pour le Brochet et la Daurade nous avons utilisé
des GtH partiellement purifiées. La GtH de Brochet (b-GtH) a été purifiée en
suivant la méthodologie développée pour la s-GtH (Breton et al., 1978) à partir
de 200 hypophyses collectées sur des femelles sacrifiées après un traitement
gonadotrope d'induction de ponte en Février Mars 1980. Les glycoprotéines hypo-
physaires séparées sur colonne de concanavaline A sépharose subissent une chro-
matographic d'exclusion sur colonne d'ultrogel ACA 54 (100 x 1,5 cm). Après con-
centration les fractions actives sur le test de maturation intrafolliculaire des
ovocytes de Truite arc-en-ciel (Jalabert et al., 1974) ont été déposées sur une
colonne de DEAE cellulose biogel A 0,5 x 5 cm équilibrée en tampon tris 0.01M
pH 7.8. Les produits non retenus sont recueillis en une seule fraction. Les pro-
téines retenues sont éluées par une solution de NaCl 0,15M sans être fraction-
nées. La fraction non retenue n'a pas d'activité biologique, alors que les pro-
téines éluées par le NaCl possèdent 38% de l'activité d'un standard de s-GtH
purifiée, sur le test de maturation intrafolliculaire des ovocytes de Truite
arc-en-ciel. Cette fraction n'est pas homogène et présente 4 bandes en électro-
phorèse sur gel de polyacrylamide à 7,5%.
La même procédure a été appliquée à un mélange d'hypophy-
ses liophylisées de Daurade (0.376 g) prélevées à la Station de Mariculture
d'Elat (Israël) pendant la période de reproduction 1980 et de 3.412 g d'hypo-
physes congelées fraîches, prélevées pendant la même période en 1981. Seules
les 2 premiers stades de purification qui ont donné 3,15 mg de protéines biolo-
giqueraent actives ont été réalisés. La concordance entre un dosage biologique
et un dosage radioimmunologique a été recherchée.
297

3ilu)wn MoW* it léMifa/»! O.lu'to* finit* d«
I *n»i{fl'pi
FIGURE 2
COfRJBE DE LIAISONS DES AKTTGENTS IODES, TRAITS COSTTNL'S SA'JMON,
TRAITS DISCCNTIWS. CAAPES ALT ASTI :
CcH
5 CcH
2 CcH
•^
*
1
298

4. - Dosage biologique de la GtH"de Daurade
Le test de maturation intrafolliculaire des ovocytes de Truite n'a pas pu être
utilisé pour la mesure de l'activité biologique des préparations hypophysaires
de Daurade à cause du faible contenu gonadotrope de ce matériel et sans doute
d'un éloignement phylogénétique trop important des espèces donneuse et receveuse.
Un nouveau test basé sur la stimulation gonadotrope In vitro de la sécrétion de
17a-hydroxy-208-dihydroprogestérone par des follicules de Truite a été mis au
point. La sensibilité du dosage a été augmentée en amplifiant le signal du premier
messager de la gonadotropine (AMPc) en empêchant sa dégradation par la phospho-
diesterase à l'aide d'un bloqueur de cet enzyme le 3-isobutyl-1 methylxanthine
(TBMX) (Fostier et Jalabert, 1983). Pratiquement, les follicules sont pré-incubés
2 heures dans un milieu contenant 0.1mM d'IBMX, après addition des extraits gona-
dotropes, l'incubation est poursuivie 48 heures et la 17a-hydroxy-208-dihydro-
progestérone libérée dans le milieu est dosée par radio immunologie (Fostier et
al., 1981). Ce dosage autorise une sensibilité de 5 ng de GtH/ml.
5. - Traitement_avec du LH-RH analogue D_Ala_6 - 5es._Glv__[Û -_LH-RH
Des Perches soleil conservées au Laboratoire ont été traitées par du LH-RHa
seul ou en présence de pimozide. Dans ce cas le traitement pimozide (10 mg/kg)
ast réalisé 3 heures avant l'injection du LH-RHa (50 ug/kg). Un groupe d'animaux
témoins ne reçoit qu'une solution saline. Tous les animaux sont sacrifiés 6
heures après l'injection du LH-RHa. Les hypophyses et les sérums ont été conservés
congelés pour la détermination de leur contenu gonadotrope par radioimmunologie.
RESULTATS
1. - Liaison directe_des antiêènes^aux_anticorD8 (figure 1)
La s-GtH se lie aux anti s-GtH et 3 s-GtH mais aussi à l'anti 8 c-GtH. Les
liaisons maximum sont comprises entre 68 et 76% à Ta dilution 10~3. La hiérarchie
de liaison décroissante est la suivante anti s-GtH - 6 s-GtH - 8 c-GtH. Par contre
la liaison de cet antigène à l'anti c-GtH est faible 23,5% ainsi qu'aux immunsé-
rums anti sous-unité et des 2 espèces. Les courbes de liaison de la 8 s-GtH
(figure 2) aux anticorps sont comparables à celles obtenues avec la s-GtH native.
Les liaisons maximum sont comprises entre 90 et 75%, avec une hiérarchie décrois-
sante suivante, anti 6 s-GtH - S c-GtH - s-GtH. De plus contrairement à la
s-GtH elle se lie à 65% sur un anti c-GtH, mais ne se lie que faiblement aux anti
et c-GtH. L'a - s-GtH (figure 3) se lie à 80% avec l'anticorps homologue, la
liaison à l'anti s-GtH n'est que de 35% et pratiquement nulle avec tous les
autres immunsérums.
Des résultats comparables ont été obtenus avec la c-GtH et ses unités. La
figure 4 montre les courbes de liaison de la c-GtH, on retrouve une hiérarchie
de liaison parallèle à celle obtenue avec la s-GtH, soit en ordre décroissant
anti c-GtH - 8 s-GtH - S c-GtH - a c-GtH - s-GtH - a s-GtH. Les hiérarchies de
liaison de la 8 c-GtH sont similaires à celles de la 8 s-GtH. Elle se lie aussi
à l'anti s-GtH contrairement à l'hormone native. L'a c-GtH ne se lie qu'à l'anti
c-GtH et l'anti a c-GtH.
2. - Etude des compétitions
- par les antigènes purifiés
systèmes IS - s-GtH I^ (tableau 1)
12^
Dans le système homologue anti s-GtH - s-GtH I la pente de la droite de
compétition par l'hormone correspondante froide (logit B/gQ = f (log dose) est
de - 0.79. Seules les sous-unités 6 s et c déplacent spécifiquement le système.
Par contre la c-GtH n'induit pas de compétition spécifique.
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