Dosage radioimmunologique des - Archimer

Bases biologiques de l'aquaculture. Montpellier. 1983
IFREMER. Actes de Colloques n. 1, pages 295 à308
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DOSAGE RADIOIMMUNOLOGIQUE DES GONADOTROPINES DE POISSONS
Lab.
Physiologie
B. BRETON, E. SAMBRONI, Y. ZOHAR
des poissons-INRA-Av.
Gxl Leclevc- 35042 RENNES Cedex
R E S U M E
La spécificité immunologique des gonadotropines de Poissons n'autorise généralement pas l'utilisation des systèmes de dosage radioimmunologique (RIA) homologues
existant pour les GtH Carpe et Saumon, à la mesure concentrations de GtH hypophysaire et plasmatique d'autres espèces. L'emploi d'un système de dosage utilisant un anticorps dirigé contre la sous-unité 8 de GtH de Carpe a cependant récemment permis
le développement d'une méthode de dosage de la GtH d'Anguille (Dufour et al., 1983).
Nous avons repris un travail similaire à partir de la sous-unité 8 de la GtH glycoprotéique maturante de Saumon, mais également étudié la possibilité d'employer des
systèmes sous-unitaires mixtes Carpe - Saumon au dosage de la GtH dans des espèces
où elle n'est pas encore purifiée. Dans ce but des sous-unités a et 8 ont été purifiées à partir de GtH de Carpe et Saumon, et été utilisées pour la préparation des
anticorps correspondants. L'analyse en liaison directe en compétition des comportements des différents antigènes iodés et des 6 anticorps confirme la spécificité
zoologique importante des sous-unités de type a. Par contre les systèmes mettant en
jeu un composant de type 8 homologue ou hétérologue reconnaissant aussi bien les
gonadotropines de Carpe et de Saumon et leurs sous-unités 8. Les différentes liaisons
anti (s.GtH - 8 s.GtH - c.GtH - 8 c.GtH) hormones iodées (s.GtH - 6 s.GtH - c.GtH 8 c.GtH) ont été étudiées par rapport à leur déplacement par des extraits hypophysaires totaux ou des GtH partiellement purifiées de Brochets - Perche - Daurade Tilapia - Anguille - Milkfish. 11 a toujours été possible de trouver une ou plusiairs
combinaisons antigène anticorps paraissant spécifiquement déplacées par chacune de
ces préparations hypophysaires. La validation du dosage a été réalisée pour la GtH
de Daurade pour laquelle il existe une bonne correspondance entre les activités des
fractions obtenues après gel filtration des glycoprotéines hypophysaires totales,
mesurées par RIA, et par un dosage biologique basé sur la stimulation de la production in vitro de 17cc-hydroxy-208-dihydroprogestérone par des follicules ovariens
de Truite arc-en-ciel en présence d'un inhibiteur de la phosphodiesterase l'lBMX.
Pour la Perche, bien que la réaction croisée ne soit que partielle, une mesure relative des niveaux de GtH apparaît possible. Une stimulation in vivo des niveaux
plasmatiques hormonaux théoriques par du LH-RH et du LH-RHa confirme la nature gpnadotrope du principe mesuré dans un système anti 8 s.GtH - c.GtH I'*--*.
A B S T R A C T
The species specificity of fish gonadotropins generally does not allow the
use of Carp and Salmonid homologous RIA systems for GtH measurement in other species. Recently, Dufour et al., (1983) have demonstrated the lack of specificity
of a system directed against the 8 subunit of the Carp GtH, we have developped a
similar system for the 8 subunit of the Salmon GtH, ana
equally studied the
possibility offered by heterologous subunits system between Carp and Salmon to
measure the GtH in several other species. Antibody against a and 3 s.GtH from
those two species have been developped. The species specificity of the two i
subunits has been confirmed after studying the direct bindings and competitions
between the 6 iodinated antigens and the corresponding antibodies, but on the
contrary the systems in which a homologous or heterologous 3 component is included
recognized as well c and s.GtH and their 8 subunits. Using the different combinations between anti s.GtH - 8 s.GtH - c.GtH - B c.GtH and the codinated s.GtH 8 s.GtH - c.GtH - 8 c.GtH, it has always been possible to find one or several
which is specifically competed by partially purified pike and sparus GtH and pituitary extracts from perch - tilapia - eel milkfish. The validation of the assay
has been done for sparus GtH after comparison with a bioassay developped for this
gonadotropin,
MOTS CLES:Gonadotropine - Immunoessais
KEY WORDS:G0nadotropin - immunoassays
295
I N T R O D U C T I O N
L'étude écophysiologique des mécanismes de régulation de la fonction de
reproduction des Poissons nécessite^entre autres outils méthodologiques, de disposer d'hormones gonadotropes purifiées (GtH) et de leur dosage radioimmunologique. Bien que ces outils aient été développés pour deux grandes familles, les
Cyprinidés (Breton et al .. 1971), et les Salmonidés (Crim et al., 1973; Breton et
al., 1975), ils ne peuvent généralement pas être utilisés pour d'autres espèces
à cause d'une spécificité zoologique qui intéresse aussi bien les propriétés immunologiques des GtH (Breton et al., 1972; Tan et Dodd 1978; Bye et al., 1980)
que leurs activités biologiques (Breton et al., 1972; Fontaine et al., 1972).
Dans les espèces marines éventuellement candidates à l'aquaculture intensive
(Bar, Daurade, poissons plats...) seule la GtH d'un poisson plat, la plie améric a i n e ^ été isolée (Ng et Idler, 1978). Or la reproduction régulière de ces espèces élevées en captivité pose encore de nombreux problèmes (contrôle de la
saison de ponte, déclenchement des mécanismes de maturation et d'ovulation au
moment opportun, mécanisme de reversion sexuelle chez la Daurade par exemple...).
L'étude de la dissociation des GtH de Carpe (Burzawa-Gérard, 1974) et de Saumon
(Breton, 1981) a permis de montrer que>contrairement aux gonadotropines natives,
leurs sous-unités de type 6 présentaient une spécificité immunologique relativement faible (Burzawa-Gérard et Kerdelhue, 1978 ; Dufour et al., 1979; BurzawaGérard et al., 1980). A partir de ces données, ces auteurs ont développé un
dosage radioimmunologique hétérologue de la GtH de l'Anguille européenne Anguilla
anguilla en utilisant
un dosage radioimmunologique de la sous-unité 3 de
la GtH de Carpe (Dufour et al., 1983). Dans le travail présent nous avons étudié
les possibilités offertes par l'utilisation d'un système équivalent, préparé à
partir de la GtH de Saumon, mais par des systèmes mixtes Carpe - Saumon pour la
détection de la GtH dans des préparations hypophysaires d'origine zoologique très
diverses dont la Daurade, pour laquelle les premiers stades de purification
de la GtH ont également été définis, l'obtention de l'hormone purifiée étant un
préalable à toute étude de l'action biologique spécifique d'une gonadotropine
dans une espèce donnée.
M A T E R I E L
ET
M E T H O D E S
1 . - P r é£a^ation_des_CtH ^Ê_Carpe_et_de_Saumon
e
t_de_leurs_sous-unités
Ces hormones ont été préparées par les techniques décrites précédemment pour
la s-GtH (Breton et al., 1978) et ses unités (Breton, 1981). Elles ont servi à
la préparation d'anticorps sur lapin. L'immunisation a été pratiquée par injection Intradermique multipoints de 100 ug de chaque préparation émulsionnée dans
de l'adjuvent de Freund complet. Chaque lapin a reçu 5 Injections espacées de
15 jours. Le sacrifice de l'animal a lieu 8 jours après la dernière injection.
Deux anticorps ont été préparés contre la s-GtH - 2 contre l'a-s-GtH - 4 contre
la B-s-GtH - 2 contre la c-GtH - 2 contre l'a-c-GtH et 3 contre la 6-c-GtH.
2. - TechnÎ2ues_radioimmunologi^ues
La technique utilisée est identique à celle décrite précédemment pour la
GtH de Carpe (Breton et a l . - 1 9 7 1 ) . Les marquages des 2 GtH et de leurs sousunités sont réalisés à l'i
après oxydation par la Chbramine T, la purification
des traceurs marqués est faite sur colonne d'ultrogel ACA 54 (0,9 x 30 c m ) . Les
divers anticorps ont été titrés par étude de leur liaison aux antigènes radioiodés correspondant. Seul 1'anticorps présentant le plus haut titre de travail
a été retenu pour la poursuite du travail (50% de la liaison maximum).
anti
ant I
anti
anti
s-GtH
3s-GtH
as-GtH
c-GtH
1/2
10~ 5
10-5
1/3
10" 5
lu" 5
296
anti
anti
Bc-GtH
ctc-GtH
10
10'
1/4
Etude en liaison directe : La liaison de chacun des 6 antigènes radioiodés aux 6
types dfanticorps a été étudiée après une incubation de 24 heures à 4°C en tampon
veronal 0.025 M pH 8.6 contenant 10%o de BSA. Le complexe antigène - anticorps
est séparé par immunoprécipitation à l'aide d'un sérum de mouton anti y globulinés de lapin préparé au laboratoire. Après incubation d'une nuit à 4°C, le précipité formé est séparé par centrifugation (1500 g) pendant 30 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement des tubes et les précipités comptés dans un
compteur autogamma 5110 PACKARD.
Etude en compétition : Le déplacement de la liaison à l'équilibre de chaque anticorps aux 6 antigènes radioiodés a été étudié pour les 6 anticorps différents
par les 6 antigènes eux-mêmes et par des extraits hypophysaires d'Anguille européenne Anguilla anguilla, de Tilapia Sarothérodon mossambica, de Daurade Sparus
auratus, de Milkfish Chanos chanos, et de Brochet Esox lucius, espèces présentant toutes un intérêt aquacole important. La compétition par des GtH partiellement purifiées de Brochet et Daurade a aussi été étudiée. Après incubation de 4
jours à 4°C le complexe hormone anticorps est séparé par la même technique que
précédemment. Pour chaque facteur les caractéristiques de la courbe de compétition sont déterminées après transformation logit - log des résultats. Dans chaque système anticorps-antigène iodé, les pentes des courbes d'inhibition produites par chaque préparation hypophysaire ont été comparées à celle obtenue en
présence de l'antigène froid correspondant par analyse de covariance selon
Snedecor et Cochran (1957).
3. - 5£égarations_h^goDh^saires
Les extraits hypophysaires bruts ont été préparés par broyage des hypophyses
desséchées à l'acétone dans un homogénéiseur verre teflon. Les broyats ont été
centrifugés 20 minutes à 2500 g, à 4°C. La concentration protéique des surnageants est déterminée par colorimétrie à l'aide du réactif de folin ciocalteu
(Lowry et al., 1951). Les contenus en GtH des hypophyses sont exprimés en ng/mg
de protéines hypophysaires. Pour le Brochet et la Daurade nous avons utilisé
des GtH partiellement purifiées. La GtH de Brochet (b-GtH) a été purifiée en
suivant la méthodologie développée pour la s-GtH (Breton et al., 1978) à partir
de 200 hypophyses collectées sur des femelles sacrifiées après un traitement
gonadotrope d'induction de ponte en Février Mars 1980. Les glycoprotéines hypophysaires séparées sur colonne de concanavaline A sépharose subissent une chromatographic d'exclusion sur colonne d'ultrogel ACA 54 (100 x 1,5 cm). Après concentration les fractions actives sur le test de maturation intrafolliculaire des
ovocytes de Truite arc-en-ciel (Jalabert et al., 1974) ont été déposées sur une
colonne de DEAE cellulose biogel A 0,5 x 5 cm équilibrée en tampon tris 0.01M
pH 7.8. Les produits non retenus sont recueillis en une seule fraction. Les protéines retenues sont éluées par une solution de NaCl 0,15M sans être fractionnées. La fraction non retenue n'a pas d'activité biologique, alors que les protéines éluées par le NaCl possèdent 38% de l'activité d'un standard de s-GtH
purifiée, sur le test de maturation intrafolliculaire des ovocytes de Truite
arc-en-ciel. Cette fraction n'est pas homogène et présente 4 bandes en électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 7,5%.
La même procédure a été appliquée à un mélange d'hypophyses liophylisées de Daurade (0.376 g) prélevées à la Station de Mariculture
d'Elat (Israël) pendant la période de reproduction 1980 et de 3.412 g d'hypophyses congelées fraîches, prélevées pendant la même période en 1981. Seules
les 2 premiers stades de purification qui ont donné 3,15 mg de protéines biologiqueraent actives ont été réalisés. La concordance entre un dosage biologique
et un dosage radioimmunologique a été recherchée.
297
3ilu)wn MoW* it
léMifa/»!
O.lu'to* finit* d« I *n»i{fl'pi
FIGURE
COfRJBE DE L I A I S O N S
TRAITS
DES AKTTGENTS
DISCCNTIWS.
CcH
5 CcH
2 CcH
•^
*
IODES,
CAAPES ALT ASTI
:
1
298
TRAITS
COSTTNL'S
SA'JMON,
2
4. - Dosage biologique de la GtH"de Daurade
Le test de maturation intrafolliculaire des ovocytes de Truite n'a pas pu être
utilisé pour la mesure de l'activité biologique des préparations hypophysaires
de Daurade à cause du faible contenu gonadotrope de ce matériel et sans doute
d'un éloignement phylogénétique trop important des espèces donneuse et receveuse.
Un nouveau test basé sur la stimulation gonadotrope In vitro de la sécrétion de
17a-hydroxy-208-dihydroprogestérone par des follicules de Truite a été mis au
point. La sensibilité du dosage a été augmentée en amplifiant le signal du premier
messager de la gonadotropine (AMPc) en empêchant sa dégradation par la phosphodiesterase à l'aide d'un bloqueur de cet enzyme le 3-isobutyl-1 methylxanthine
(TBMX) (Fostier et Jalabert, 1983). Pratiquement, les follicules sont pré-incubés
2 heures dans un milieu contenant 0.1mM d'IBMX, après addition des extraits gonadotropes, l'incubation est poursuivie 48 heures et la 17a-hydroxy-208-dihydroprogestérone libérée dans le milieu est dosée par radio immunologie (Fostier et
al., 1981). Ce dosage autorise une sensibilité de 5 ng de GtH/ml.
5. - Traitement_avec du LH-RH analogue D_Ala_6 - 5es._Glv__[Û -_LH-RH
Des Perches soleil conservées au Laboratoire ont été traitées par du LH-RHa
seul ou en présence de pimozide. Dans ce cas le traitement pimozide (10 mg/kg)
ast réalisé 3 heures avant l'injection du LH-RHa (50 ug/kg). Un groupe d'animaux
témoins ne reçoit qu'une solution saline. Tous les animaux sont sacrifiés 6
heures après l'injection du LH-RHa. Les hypophyses et les sérums ont été conservés
congelés pour la détermination de leur contenu gonadotrope par radioimmunologie.
RESULTATS
1. - Liaison directe_des
ant
iêènes^aux_anticorD8
(figure 1)
La s-GtH se lie aux anti s-GtH et 3 s-GtH mais aussi à l'anti 8 c-GtH. Les
liaisons maximum sont comprises entre 68 et 76% à Ta dilution 10~3. La hiérarchie
de liaison décroissante est la suivante anti s-GtH - 6 s-GtH - 8 c-GtH. Par contre
la liaison de cet antigène à l'anti c-GtH est faible 23,5% ainsi qu'aux immunsérums anti sous-unité et des 2 espèces. Les courbes de liaison de la 8 s-GtH
(figure 2) aux anticorps sont comparables à celles obtenues avec la s-GtH native.
Les liaisons maximum sont comprises entre 90 et 75%, avec une hiérarchie décroissante suivante, anti 6 s-GtH - S c-GtH - s-GtH. De plus contrairement à la
s-GtH elle se lie à 65% sur un anti c-GtH, mais ne se lie que faiblement aux anti
et c-GtH. L'a - s-GtH (figure 3) se lie à 80% avec l'anticorps homologue, la
liaison à l'anti s-GtH n'est que de 35% et pratiquement nulle avec tous les
autres immunsérums.
Des résultats comparables ont été obtenus avec la c-GtH et ses unités. La
figure 4 montre les courbes de liaison de la c-GtH, on retrouve une hiérarchie
de liaison parallèle à celle obtenue avec la s-GtH, soit en ordre décroissant
anti c-GtH - 8 s-GtH - S c-GtH - a c-GtH - s-GtH - a s-GtH. Les hiérarchies de
liaison de la 8 c-GtH sont similaires à celles de la 8 s-GtH. Elle se lie aussi
à l'anti s-GtH contrairement à l'hormone native. L'a c-GtH ne se lie qu'à l'anti
c-GtH et l'anti a c-GtH.
2. - Etude des compétitions
- par les antigènes purifiés
systèmes IS - s-GtH I ^
(tableau 1)
12^
Dans le système homologue anti s-GtH - s-GtH I
la pente de la droite de
compétition par l'hormone correspondante froide (logit B/gQ = f (log dose) est
de - 0.79. Seules les sous-unités 6 s et c déplacent spécifiquement le système.
Par contre la c-GtH n'induit pas de compétition spécifique.
299
FIGURE 5 :
COURBES DE COMPETITION DE PREPARATIONS GONADOTROPES HYPOPHYSAIRES
125
s-GCH I
DANS LE SYSTEME ANTI 8-c-GtH -
• Eitraïf fiypophyiair»
d» perche femtllt
• c-GW -
2
.0,96
0,99
3
i
Logdow rvg/fal GfH
mg/ml hssu frai t
FIGURE
6
:
COURBES DE COMPETITION DE LA c-GtH ET D'UN EXTRAIT HYPOPHYSAIRE
DE PERCHE SOLEIL DANS UN SYSTEME ANTI 3 S-GcH -
300
c-CtH I 1 2 5
Dans le système arrti 8 s-GtH - s-GtH 1
la-liaison de la s-GtH est spécifiquement déplacée par la s-GtH, la 8 s-GtH (p < 0.01) et à un moindre degré
(p < 0.05) par la c et B c-GtH.
125
Dans le système anti 8 c-GtH - s-GtH 1
des droites de competitions parallèles sont obtenues avec les 2 hormones natives et leurs sous-unités 8. Les
t2
liaisons trop faibles de la s-GtH l 5 aux IS ex s-GtH - c-GtH - a c-GtH n'autorisent pas d'études de compétition.
1 25
Systèmes IS 8 s-GtH I
(tableau 2)
Dans tous les systèmes liant initialement la 8 s-GtH; les 2. hormones natives
c-GtH et s-GtH, ainsi que leurs sous-unités 8 déplacent spécifiquement la liaison
de 8 s-GtH 1^5 a u x anti-hormones totales et anti sous-unités 8. Par contre, les
sous-unités a n'entrent pas en compétition avec la 8 s-GtH I'25 dans ces systèmes
pas plus qu'il n'est possible d'étudier les systèmes IS anti a - 8 s-GtH I'25
cette dernière ne se liant pas aux anti a sous-unités.
- Par les GtH partiellement purifiées et les extraits hypophysairea
125
Systèmes IS - s-GtH I
(tableau 3)
La GtH de Brochet partiellement purifiée déplace spécifiquement les systèmes
anti s-GtH - s-GtH I '25 et anti 8 s-GtH - s-GtH I 12 * dans lesquels les teneurs
en GtH de la préparation, exprimée en équivalent s-GtH, sont respectivement de
0,82 et 0,85 ug/ug de protéine hormonale. Ces 2 systèmes sont également spécifiquement déplacés par l'extrait hypophysaire d'Anguille qui contient 2,8 ug d'équivalent s-GtH par mg d'une poudre acétonique. Pour l'extrait hypophysaire de
Daurade seul le système anti s-GtH s-GtH 125 permet de mesurer la GtH hypophysaire dans cette espèce de même qu'un système hétérologue anti B c-GtH - s-GtH
I 125 e s t ie seul spécifiquement déplacé par l'extrait hypophysaire de milkfish.
Aucun de ces systèmes n'est déplacé par l'extrait d'hypophyse de Tilapia. La figure 5 visualise les différentes courbes de compétition obtenues dans le système
hétérologue anti 8 c-GtH - s-GtH 1^25^ qUj_ autorise apparemment la plus grande
diversité de reconnaissance immunologique d'activités de type gonadotrope.
Systèmes IS - 3 s-CtH I 1 2 5 (tableau 4)
La GtH partiellement purifiée déplace spécifiquement la liaison de la 8 s-GtH
I I 2 5 à l'anti s-GtH mais aussi aux anti c et 8 c-GtH. Dans ces 3 systèmes les
contenus en équivalent en s-GtH de la préparation sont voisins 0.59, 0.63 et
0.70 ug/pg de protéine ils sont inférieurs à ceux mesurés dans les systèmes précédents mais restent supérieurs à ceux obtenus lors de la détermination de son
activité biologique 0,38 ± 0,12. Seul le système anti 8 s-GtH - 8 s-GtH I 1 2 5
est spécifiquement déplacé par l'extrait hypophysaire de Daurade, mais aussi par
ceux d'Anguille, de Tilapia et de Xénope.
L'extrait hypophysaire d'Anguille induit aussi une compétition spécifique dans le
système anti 8 c-GtH - 8 s-GtH 1^25. Dans tous les systèmes spécifiquement déplacés par cet extrait, la teneur en GtH mesurée en équivalent s-GtH est comprise
entre 2,708 et 3,088 ug/mg.
3. - Application à la purification de la GtH de Daurade, validation biologique
L'activité gonadotrope des fractions protéiques obtenues après chromatographie
sur ultrogel ACA 54 a été mesurée par dosage biologique et iramunologique dans les
systèmes décrits précédemment. Les résultats sont montrés dans le tableau 4.
C'est dans le système anti 8 s-GtH - 8 s-GtH I 125 que les valeurs obtenues (en
équivalent s-GtH) sont les plus proches de celles mesurées par dosage biologique,
bien que restant la plupart du temps inférieures. Le rapport des activités immunologiques et biologiques est voisin de 0,75 sauf pour la fraction 29 pour laquelle l'activité mesurée par R.I.A. est supérieure à celle déterminée par essai
biologique. Dans ce système les pentes des droites de compétition de chaque fraction restent parallèles à celle de la droite de référence correspondant à la
301
TABLEAU 1 : Pente des courbes d'inhibition de différentes préparations gonadotropes
dans les systèmes IS anti-gonadotrope s-GtH I 125
^ \ ^ C n H P F T ITFUR
:
^"^\^^
: ANTICORPS
fl a-GtH
a s-CtH
- 0 .79
- 0 .92
/
-
0.82
-
-
1 ,08
-
s-GtH
c-ntH
P r-GtH
^ " " * \ ^
' ant.l
s-OtH
; ,mt i
;' s - r . t H
[ .mt t
a
- n.7 r .
-
0.43
0.78
-
0>7
O.M
0.95
-
' .07
-1.02
fl-CtH
[ antt
c-CtH
1 antl
P c-CtH
TABLEAU 2 : Pente des courbes d'inhibition de différentes préparations gonadotropes
dans les systèmes IS anti-gonadotrope £ s-GtH I 125
COMPKTITFUK
B e-GtH
fl-CtH
a
c-CtH
s-GtH
B c-CtH
:ANTICORPS
;
;
anti
s-CtH
-
1 .04
nnti
H s-CtH
-
0.92
ant 1
a
**
-
0.82
-
1.02
0,88
-
/
-
0.73
-
0.94
0.04
-
0.96
-
0.87
/
-
1.14
-1.12
0.23
-
1.08
-
s-CtH
anti
c-CtH
-
0,85*
-
anLl
!'. c-CtH
-
1 .10
-1.12
-
302
t .24
;
;
0.85
;
nntl 8 c-GtH
- 1.08
- 1.07
- 1.03
ug/pg
8
- 1.24
ng/pg
TABLEAU 4 : PENTE DES COURBES D'INHIBITION DE c-CtH PURIFIEES ET D'EXTRAITS HÏPOP
0-9-GtH I 125
LES CONTENUS EN GtH SONT EXPRIMES EN EQUIVALENT s _ctH.
9-CtH
anti s-GtH
- 1.12 :
b-CtH
1.33
- 1.23
DAURADE
ANGUILLE
- 0.74
- 0.61
0,59
antl Bs-CtH
antl
c-CtH
- 1.34*.
- 0.85'
- 0,78
- 1.14
- 1.25
- 1.1.6
- 0.99
- 0.71
29,88
3088
- 0,95
- 0.68
- 0,72
- 0.64
- 0.91
0.63
anti 6c-CtH
-0.96;
- 1,15
- 1.10
0,70
2822
"
TABLEAU 5 :
ACTIVITE IMMUNÛLOCÎQUE EQUIVALENT ne s-CtH/jjg de PROTEINE
; FRACTION N"
ACTIVITE BIOLOGIQUE
EQUIVALENT s-Ctll PATI
ng de PROTEINE
s IS
-
,,25
CtH
IS
s-CtH
18.5
;
:
53
31
43
32
38
33
:
:
:
-
1 . tO
-
0.73
-
0.99
-
0.76
-
0.99
-
0.99
-
0.30
27.7
30
15
34
8.33
35
36.2
pen G de
-
1 .08
-
0.77
-
0.75
-
1 .08
-
0.59
-
0.89
-
ri.77
-
1.04
:
-
1 ,(Hi :
-
1.30"
-
1 .2n\
-
i .
;
28.2
:
11.3
:
IA;
6.21
•9.98
N.D.
:
:
36.64
1 1 .83
6.3
fts-CtU
:
40.61
30.8
M .3
T1?5
31 .5
37.1
23.7
référence
IS
33.05
30
«r-ntll
33.6
17.5
' 6
36
fic-CtH
17.9
31
29
P -
:
N.D.
N.D.
-
:
0.83
-1.10
DOSAGE DE LA CtH CHEZ LA PERCHF. SOLEIL APRES STIMULATION PAR LE I.H-RH A SEUL OU EN PRESENCE DE PIMO/IDE
VALEURS ESTIMEES PAR RAPPORT A LA c-CcH DA#S LE SYSTEME IS 6 s-CtH - c-CtH - c-CtH
PENTE DE LA DROITE DE REFERENCE - 0,99
P
N°
1
2
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$
7
8
spermiant
0.55
a
M
A
PiiNiE DROITE DE
REGRESSION
-
0.63
0.5S
0.62
0.69
0.50
-
0.58
0.90
-
0.55
0
0.37
0.90
-
0.65
9
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0.83
1 .51
-
0.67
1.54
-
0.78
2
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14.71
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4
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2 4 . |9
2.08
apermiant
304
1 .23
s-GtH. Dans tous les autres systèmes'à un degré moindre dans le système anti
s-GtH - s-GtH I 125 dont la "spécificité" pour un facteur hypophysaire de Daurade a été démontré précédemment, les pentes de ces droites ne sont pas constantes
tout au long du chromatogramme, et les concentrations en GtH des fractions sont
sous-estimées comparées aux résultats des dosages biologiques. Le dosage n'a pas
été validé pour le dosage de la GtH dans le plasma de la Daurade, c'est-à-dire
par la mesure de modifications naturelles ou expérimentales des concentrations
périphériques de GtH. Ces systèmes le permettent cependant. Ainsi le système anti
3 s-GtH - c-GtH 1**5 s'est révélé être déplacé spécifiquement par un extrait hypophysaire de Perche soleil (figure 6). Les pentes des droites de régression logit B/g0 = f logdose correspondant à la c-GtH et l'extrait sont respectivement
de - 0.99 et - 0.96. Le tableau 6 montre les mesures de GtH plasmatique dans un
groupe de Perches traitées par une solution saline : animaux 1.2.3., un d Ala ^
DesGly tO - LH-RH : animaux 4, 5 ; et une combinaison de pimozide LH-RHa : animaux 6.7.8. Les pentes des droites de régression correspondant au plasma de chacun de ces animaux ne sont pas statistiquement différentes entre elles, mais
différent de la droite de référence correspondant à la c-GtH et de celle, caractéristique du déplacement induit par l'extrait hypophysaire. Les plus fortes valeurs de GtH plasmatique sont obtenues chez les animaux traités par le pimozide
et le LH-RHa et les plus faibles chez les animaux qui ne reçoivent que la solution saline.
D I S C U S S I O N
Ces résultats apportent à la fois de nouveaux éléments fondamentaux sur les
relations structure - activité immunologique des gonadotropines de poissons, et
élargissent a d'autres espèces, les possibilités d'utiliser des systèmes de dosages hétérologues pour le dosage de leurs GtH spécifiques à condition toutefois
de valider les systèmes retenus, démarche qui n'a pu être conduite à son terme
chez la Daurade par manque de matériel biologique. Une approche comparable à celle mise en oeuvre chez la Perche est envisagée.
Ainsi que l'avaient démontré Dufour et al., 1979 ; Burzawa-Gerard et al.t
1980 pour les sous-unités de la c-GtH, nous retrouvons des caractéristiques immunologiques comparables pour les sous-unités a et 0 de la GtH de Saumon. La
sous-unité ci possède une spécificité zoologique très stricte alors que celle des
déterminants antigéniques des sous-unités $ l'est beaucoup moins. Il ne s'agit
cependant pas d'une aspécificité totale, il doit exister des différences à l'intérieur même du groupe des poissons, les divers extraits hypophysaires s'ils
entrent tous en compétition ne le font pas tous de la même façon dans les systèmes anti 8 ou qui mettent en jeu un seul de ces composants. Une telle étude ne
permet aucune évaluation des distances phylogénitiques entre les espèces considérées, comme l'ont d'ailleurs montré d'autres travaux ( Bye et al., 1980 - revue
de Licht et al., 1977). Ces travaux montrent également qu'il existe une parenté
immunologique entre la sous-unité 6 de s-GtH et un facteur "gonadotrope" présent
dans l'hypophyse d'un amphibien le Xénope, laissant supposer une certaine conservation des déterminants antigéniques 8 entre ces 2 classes de vertébrés comme
entre poissons et mammifères (Burzawa-Gerard et al., 1980). Les hormones s-GtH
et c-GtH bien que purifiées à partir d'un test biologique sur poisson sont actives à la fois sur l'induction in vitro de la maturation d'ovocytes de Xénope
(Breton et Schuetz, données non publiées) et sur la stimulation de la stéroidogénèse testiculaire dans cette même espèce (Boujard, 1982), ce qui fait apparaître des analogies fonctionnelles de ces hormones chez les Amphibiens et les Poissons (revue de Idler, 1982). Si comme on l'admet chez les mammifères la spécificité d'action biologique fonctionnelle est liée à la sous-unité 6, cette caractéristique est préservée dans les GtH de poissons, et d'amphibiens, les communautés
antigéniques entre sous-unités £ pourraient aussi être le reflet de communautés
d'action biologique,
305
Sur un plan plus pratique, il a été possible en utilisant des systèmes hétérologues homospécifique Saumon ou hétérospécifique Saumon - Carpe d'en trouver un
ou plusieurs spécifiquement déplacés par chacun des 5 extraits hypophysaires de
poissons téléostéens utilisés. Quand plusieurs systèmes reconnaissent un facteur
hypophysaire, les teneurs hypophysaires en ce facteur mesurées sur les différents
systèmes sont voisines : cas de l'extrait hypophysaire d'Anguille et des GtH
partiellement purifiées de Brochet et Daurade. Dans ce dernier cas la constance
de la pente des droites de régression, traduisant les compétitions induites par
chaque fraction, laisse supposer que c'est bien le même facteur qui est mesuré
par R.I.A. tout le long du chromatogramme et qu'il n'y a pas interférence
d'autres facteurs hormonaux hypophysaires de type TSH en particulier, que le gel
filtration sur ultrogel ACA 54 ne permet pas de séparer de la GtH. La comparaison
des activités biologiques et immunologiquea renforce cette hypothèse. La validation du dosage pour la détermination de la GtH hypophysaire, n'implique pas
obligatoirement une validation dans le plasma. Ainsi le système anti 6 s-GtH c-GtH 1*25 e s t spécifiquement déplacé par un extrait hypophysaire de Perche,
mais les droites de régression traduisant les compétitions en présence de dilutions sériées des plasmas ne sont pas parallèles aux références. Ce résultat traduit sans doute l'existence d'une réaction d'aspécificité constante en présence
de plasma, les pentes étant parallèles entre tous les plasmas. Ce dernier élément
pourrait cependant autoriser, à la condition de travailler a une dilution constante des plasmas, une "estimation" de leurs concentrations en GtH que le sens des
variations induites après traitements LH-RHa peut aussi corroborer. Ces variations
sont en accord avec celles observées dans d'autres espèces (Chang et Peter, 1982;
Billard et al., 1983), mais leur amplitude est plus faible aboutissant cependant
à un triplement des niveaux de base. On pourrait supposer que comme chez le
poisson rouge (Gillet et al., 1981) le jeune auquel les Perches ont été soumises
durant leurs 3 semaines de captivité aboutit à une diminution de la sécrétion de
GtH, mais aussi à celle de la réceptivité hypophysaire à des stimulations par le
LH-RHa. En conclusion ce travail montre qu'il paraît sans doute possible parmi
tous les systèmes proposés, d'en trouver un suffisamment spécifique pour la détermination de GtH d'espèces chez lequelles elle n'est pas encore purifiée, cependant la validation du dosage dans le plasma pourrait nécessiter l'utilisation
de sérum d'animaux hypophysectomisés, opération difficilement réalisable dans
certaines espèces.
R E M E R C I E M E N T S
Ce travail a été supporté par l'I.N.R.A., le C.N.E.X.O., contrat 82/2678Y.
Il a aussi bénéficié de l'aide de la Fondation Rotschild qui a permis le séjour
de l'un des auteurs (Y. Zchar) au laboratoire.
Nous remercions le Docteur E. Gordin, Directeur de la Station de Mariculture
de l'I.O.L.R. à Eilat (Israël) qui a organisé la collecte des hypophyses de
Daurade, ainsi que les Docteurs A. Fostier et B. Jalabert pour les déterminations
des activités biologiques des préparations, Mademoiselle Bougoussa et Monsieur
Thomas ont assuré la réalisation technique de ce travail, Madame Bouix a réalisé
la dactylographie de ce manuscrit, nous les en remercions.
L'expérimentation sur Perche a été réalisée dans le laboratoire du Docteur
R.E. Peter avec l'aide du N.R.C.S. du Canada.
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