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Chapitre1: Quantification de l'affinité, réponse, sélectivité
Évolution des concepts et modèles
Cible: lieu de fixation du médicament interagissant avec des récepteurs, des enzymes etc.
Affinité: interaction entre le médicament et sa cible.
Médicament + Cible
Réponse
Réponse: somme des réponses des cellules, modification d’une fonction de l’organisme =
effet thérapeutique.
1. L’affinité et la loi d’action de masse
C'est un modèle mathématique qui sert de base pour quantifier l'affinité des médicaments.
La puissance de l'interaction physico-chimique entre le liguant et son récepteur correspond à
l'affinité réciproque des 2 partenaires. Cette affinité dépend de leur structure chimique
permettant l'établissement de liaisons non covalentes multiples (hydrophobes, ioniques, van
der walls…).
k1
L + R ←→
LR
k
-1
L = ligand
R = récepteur
LR = complexe ligand récepteur
k1 = constante cinétique d’association
k-1 = constante cinétique de dissociation
L’analyse de la liaison des ligands aux récepteurs utilise un modèle mathématique simple dit
loi d’action de masse, équilibre dynamique entre les formes libres et associées du ligand et du
récepteur.
Ce modèle suppose que la liaison intervient lorsque le ligand et le récepteur se rencontrent en
fonction d’une simple diffusion, avec une orientation spatiale favorable des deux partenaires
et une énergie suffisante.
L’équilibre est atteint quand la vitesse d’association est égale à la vitesse de dissociation.
Vitesse d’association : L x R x k1 nombre de phénomènes de liaison par unité de temps
Vitesse de dissociation : LR x k-1 nombre de phénomènes de dissociation par unité de temps
A l’équilibre on a donc : L x R x k1= LR x k-1, soit :
L × R k −1
=
= K D = constante de dissociation à l’équilibre, exprimée en concentration
LR
k1
molaire (M).
Elle sert à quantifier l'affinité du liguant pour le récepteur.
Selon la nomenclature actuelle, la constante KD est dénommée KA pour les agoniste et KB
pour les antagonistes.
Strictement l’affinité est définie par la constante d’association à l’équilibre, Ka pour un
agoniste, ou Kb pour un antagoniste.
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affinité = K a ⋅ ou ⋅ K b =
k1
1
=
k −1 K D
Toutefois, on utilise plus souvent KA ou KB que Ka et Kb car elles sont exprimées sous forme
molaire M.
Si le médoc A a un KD=10-3M et B a un KD = 10-9M. L'affinité est plus forte pour B.
Plus le KD est faible, plus l’affinité est élevée.
2. La réponse et la théorie d’occupation des récepteurs
L’affinité réciproque de L et R conduit à la formation du complexe LR.
La conséquence de la formation de LR est exprimée par différents termes relatifs à chaque
membre du complexe. Ainsi sont évoqués l’activité, ou effet de L, et son corollaire, la réponse
de R, termes équivalents en pratique.
La réponse de R peut être appréciée exceptionnellement au niveau des récepteurs eux-même
(ex : mesure d’un flux ionique pour un récepteur-canal), ou plus généralement à un niveau distal (mesure
de la variation du taux d’un messager intracellulaire, réponse contractile ou sécrétoire de la cellule ou réponse
intégrée de l’organisme).
L’interprétation de cette réponse fait appel à la théorie d’occupation des récepteurs qui décrit
les relations quantitatives entre les concentrations de ligand et les réponses biologiques qui
résultent de l’interaction ligand-récepteurs. Cette théorie basée sur la loi d’action de masse
suppose que la réponse est directement proportionnelle au pourcentage de récepteurs occupés
par un agoniste et que la réponse maximale est obtenue avec 100% d’occupation des
récepteurs.
Donc plus on augmenterait la concentration plus il y aurait d'effet, or cette théorie est fausse.
La plupart du temps il faut stimuler un petit nombre de récepteurs pour avoir un effet max.
3. La sélectivité
« Toute substance est un poison et aucune n'est inoffensive. C'est simplement la dose qui fait
qu'une substance n'est pas toxique » Paracelse
Les effets indésirables sont du à la liaison d'un médicament à plusieurs cibles.
La sélectivité dépend de la dose. La sélectivité d’un ligand pour la cible R1 vis-à-vis de la
cible R2 correspond au rapport de son affinité pour R2 sur son affinité pour R1.
L’affinité étant l’inverse du KD, la sélectivité de L pour R1 vis-à-vis de R2 est égale au
rapport de KDR2/KDR1.
Pour être sélectif de R1 vis-à-vis de R2, ce rapport doit être supérieur à 100 (2log)
On utilise alors le rapport des CE50 ou DE50 (dose pour laquelle l’effet correspond à 50% de l’effet max) du
médicament L pour les effets E2 et E1. Ceci correspond à la notion de marge thérapeutique ou
différence entre les doses nécessaires à l’effet recherché et les doses entraînant un effet
secondaire voir toxique.
Aucun médicament n'est spécifique d'une cible.
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4. Technique de liaison spécifique (binding)
Elles permettent de définir l'affinité de nouveaux ligands pour des sites de liaisons.
4.1. Incubation, séparation, mesure de L*R
Incubation : Ligand radioactif dans un tampon (pH, Temp précises) contenant les récepteurs
fixés sur une membrane. Les ligands se lient aux récepteurs avec un équilibre défini par la loi
d’action de masse.
K1
L * +R ⇔ L * R
k-1
Séparation par centrifugation ou filtration pour éliminer L* libre.
On peut déterminer le nombre de ligands liés aux récepteurs.
La membrane est mise dans un filtre à scintillation et on mesure la radioactivité, permettant de
quantifier L*R
Si on a une membrane quelconque le ligand peut se fixer ailleurs que sur le récepteur étudié.
La liaison du ligand à d’autres récepteurs/dans la membrane est appelée liaison no spécifique.
L*
Liaison non-spécifique
L*
L*
L*
L’utilisation d’un ligand radiomarqué est toutefois longue et cher.
•
technique de saturation : on définit KDL*
•
technique de déplacement : on définit Ki
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4.2. Technique de saturation
On prend une série de tubes riches en récepteurs auxquels on ajoute des concentrations
croissantes de ligands radiomarqués (liaison totale).
Une seconde série est préparée parallèlement mais surchargée en ligand froid (liaison non
spécifique.
Le KD = concentration de L pour saturer
50% des récepteurs.
La représentation de Scatchard permet une détermination plus précise de KD et de Bmax (la
densité de sites spécifiques).
Bound/free
Bound = L*R
Free = L*
B max
KD
pente =
−1
KD
Bmax
L * R ( pM )
L * R  −1 
B max
=
L*R +
L *  KD 
KD
4.3. Technique de déplacement : Etude du déplacement d’un L* par un
ligand froid C (non radiomarqué)
Appelé aussi technique de compétition.
L’affinité du ligand non marqué pour son récepteur peut être appréciée en quantifiant son
pouvoir de déplacement d’un radioligand dont l’affinité (en pratique le KD) a été déterminée
préalablement par méthode de saturation.
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On met L* dans différents tubes en même quantité de manière à saturer les récepteurs.
Puis on ajoute un ligand inconnu C (compétiteur non marqué) à des concentrations
différentes.
Plus on augmente la concentration de C, plus C va déplacer L*. On laisse incuber puis on
mesure la radioactivité des L*R restant dans les tubes.
L*R
100%
50%
CI 50
[C ]
CI50 : concentration qu’il faut pour déplacer 50% de L*.
Présence de deux équilibres :
- entre L et R
- entre C et R
Ki est une expression de KD pour une
(C × R )
Ki =
CR
( L * ×R)
KD =
L*R
expérience de compétition
CI50 : valeur expérimentale
KD : paramètre
Avec R =
Ki =
KD × L * R
C×R
et CR =
la valeur recherchée est Ki
L*
Ki
CI 50
L*
1+
KD
La mesure faite est L*R en présence de C
La population totale des récepteurs est Rt = R + CR + L * soit L * R = Rt − ( R + CR )
L* R =
l *.Rt
C
K D (1 + ) + L *
Ki
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Si C est présent à une concentration CI50 pour laquelle la liaison spécifique de L* est réduite
de 50% :
L * R50 =
-
l *.Rt
CI 50
K D (1 +
) + L*
Ki
Ki =
CI 50
L*
1+
KD
Expérience de saturation:
KD =
( L * ×R)
L*R
Expérience de compétions entre L* et C : K i =
CI 50
L*
1+
KD
5. Paramètres de quantification définis par approches fonctionnelles
Les études fonctionnelles ont pour but de caractériser qualitativement et quantitativement
la fonction modifiée par la liaison du ligand aux récepteurs c’est à dire la réponse de la cellule
au ligand.
Les études peuvent être in vitro ou in vivo. La réponse cellulaire peut être appréciée en
mesurant la variation d’un élément de la voie de signalisation mise en jeu de manière plus
distale, en mesurant la réponse globale de cellules isolées ou d’un organisme entier.
5.1. Réponses quantales et graduelles
Les réponses quantales sont régies par le principe du tout ou rien et sont généralement
observées chez l’animal entier
Les réponses quantales sont quantifiées par les paramètres : DE50 qui représente la
dose nécessaire pour produire l’effet chez 50% des animaux et la DL50 . Ce dosage se
fait sur des animaux entiers.
Les réponses graduelles sont des réponses qui augmentent graduellement avec la
concentration ou avec la dose. Elles sont quantifiées par le paramètre DE50 (dose
efficace 50) qui représente la dose ou concentration nécessaire pour observer 50% de
l'effet maximum de la molécule étudiée.
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5.2. Analyse qualitative et quantitative de l’effet d’un agoniste
L’analyse quantitative a reposé d’abord sur la théorie d’occupation des récepteurs qui
selon la loi d’action de masse admettait que l’effet observé était proportionnel au nombre de
récepteurs occupés et que l’effet maximal nécessitait l’occupation de tous les récepteurs. Si
cette théorie était exact, il suffirait de définir la concentration d’agoniste produisant 50% de la
réponse maximale pour calculer le KD de l’agoniste c’est à dire quantifier son affinité pour les
récepteurs.
Cependant l’effet maximal ne nécessite l’occupation que d’une faible partie des
récepteurs. En conséquence, le paramètre fonctionnel CE50 ne doit pas être assimilé au KD,
paramètre représentatif de l’affinité (strictement KA pour l’agoniste).
La CE50 équivaut à une concentration plus faible que la concentration KD ou Ki définit par
méthode de liaison donc en théorie CE50<KD .
DE50 : dose in vivo d'agoniste nécessaire pour obtenir la moitié de la réponse
L'antagoniste neutre s'oppose à l'effet du médiateur endogène soit de manière compétitive en
se fixant sur le même récepteur que le médiateur endogène, soit de manière non compétitive
en se fixant ailleurs.
L'agoniste inverse s'oppose à l'effet du médiateur endogène en provoquant une réponse
inverse que celle provoquée par le médiateur.
[4
Réponse
[2]
[0
[3]
[5
[6]
Effet max
[1]
Temps
Effet max lorsque après rajout, l’effet ne change plus.
CE50 : concentration d’agoniste nécessaire pour obtenir la moitié de la réponse maximale.
pA2 : log négatif de la CE50
DE50 ,CE50 et pA2 sont des valeurs expérimentales empiriques et ne sont pas assimilables à
des constantes d’affinité. Elles ne sont comparables que pour une même expérience.
5.3. Analyse qualitative et quantitative des propriétés d’un antagoniste
Plusieurs types d’antagonistes peuvent être distingués :
antagoniste compétitif : liaison de l’antagoniste au même site de liaison de l’agoniste
antagoniste non compétitif : liaison de l’antagoniste sur un site de liaison au récepteur
distinct du site de liaison de l’agoniste (site allostérique)
antagoniste fonctionnel : interaction résultant de processus biochimiques distincts.
Ex : sur une même cellule, l’agoniste d’un récepteur peut entraîner une contraction
et l’agoniste d’un autre récepteur une relaxation : les deux agonistes ont des effets qui
s’opposent.
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En pratique, il s’agit de comparer deux courbes effet/contraction d’un agoniste en absence et
en présence d’une concentration donnée d’antagoniste. Schématiquement deux cas peuvent se
présenter :
antagoniste surmontable caractérisé par un déplacement vers la droite de la courbe
effet/concentration de l’agoniste, sans diminution de l’effet maximal. Ce profil est
obtenu par des antagonistes compétitifs réversibles.
antagoniste insurmontable caractérisé par une diminution de l’effet maximal de
l’agoniste. Ce profil est obtenu par des antagonistes non compétitifs dans le cas
d’antagoniste fonctionnel ou avec des antagonistes compétitifs dont la vitesse de
dissociation est lente voir nulle.
Seul
Réponse
Antagoniste+
Antagoniste++
Antagoniste insurmontable
[agoniste]
Etude préliminaire de quantification de l’effet d’un antagoniste :
o Déterminer la concentration d’antagoniste nécessaire pour diminuer de 50% l’effet
d’une concentration d’agoniste donnée.
o Ceci permet le calcul de CI50, valeur expérimentale empirique dépendant des
conditions expérimentales.
o pCI50 ou pD’2 est le log négatif de CI50 et n’est pas assimilable à une constante
d’affinité.
Détermination expérimentale du pA2 ou pKB d’un antagoniste (compétitif) :
o Etude de l’effet de plusieurs conc. d’antagonistes sur une gamme de conc d’agonistes.
o Courbes effet-concentration déplacé vers la droite par l’antagoniste.
pA2 = -log[Antagoniste]
avec [Antago] qui nécessite le doublement de la [Ago] pour obtenir l’effet max.
En l’absence d’antagoniste, pour une [agoniste] A, une fraction des récepteurs est occupée
(rA).
KA = (AxR)/AR
Avec Rt = R + AR
ou AR = (AxR)/ KA
et rA = AR/(R+AR)
En présence d’une [antagoniste] B, il faut augmenter la [agoniste] jusqu’à A’ pour obtenir
le même effet.
Pour A
KA = (A’xR)/A’R
Rt = R + A’R + BR
B
KB = (BxR)/BR
rA’ = A’R/(R + A’R + BR)
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rA = rA’ soit
AR
A' R
=
( R + AR ) R + A' R + BR
ou AR × ( R + A' R + BR ) = A' R × ( R + AR )
AR ( R + BR ) = A' R × R
A'
B
−1 =
= dose − ratio − 1
A
KB
log(dose − ratio − 1) = log B − log K B
-------Attention :
Constante de dissociation KD : KA pour ago et KB pour antago
Constante d’association : Ka pour ago et Kb pour antago.